魚類蛋白質(zhì)吸收相關(guān)因子的調(diào)控方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種魚類蛋白質(zhì)吸收相關(guān)基因表達的調(diào)控方法。本發(fā)明的方法是通過腹腔注射不同濃度的hCG，應(yīng)用實時定量PCR，檢測注射后不同的時間段魚類免疫因子的表達。這些基因包括有氨基肽酶N(APN)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、小肽轉(zhuǎn)運蛋白(PepT1)、轉(zhuǎn)錄因子SP1和尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)。通過本發(fā)明的方法，能夠調(diào)控魚類蛋白質(zhì)相關(guān)吸收因子的表達，用于魚類養(yǎng)殖中，調(diào)整魚類的營養(yǎng)代謝平衡。
【專利說明】魚類蛋白質(zhì)吸收相關(guān)因子的調(diào)控方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種魚類蛋白質(zhì)吸收相關(guān)基因表達的調(diào)控方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在硬骨魚類中，腸道中氨基酸的代謝和利用分為兩個步驟。首先，蛋白質(zhì)酶解，得到的氨基酸脫去氨基，轉(zhuǎn)化為中間代謝產(chǎn)物。隨后，中間代謝產(chǎn)物被合成蛋白質(zhì)。氨基肽酶N(APN)和谷氨酸脫氫酶(OTH)在多肽的降解過程中發(fā)揮著重要的作用。APN參與激活氨基酸N-端的酶解反應(yīng)，在小肽轉(zhuǎn)變?yōu)榘被岬倪^程中表現(xiàn)出降解的活性。GDH能夠可逆地催化谷氨酸的去氨基反應(yīng)，生產(chǎn)的副產(chǎn)物氨氣能參與氮循環(huán)。一系列的研究表明，蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物，如小肽和氨基酸，被特異的轉(zhuǎn)運因子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。P印Tl已經(jīng)被證實為肽的轉(zhuǎn)運因子，參與二肽和三肽的轉(zhuǎn)運。同時，P印Tl受轉(zhuǎn)錄因子SPl和CDX2的調(diào)控。這些因子都有助于基底，腸道特異性以及禁食引起的PepTl的表達。LAT2屬于與通透相關(guān)的蛋白質(zhì)，包含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)運氨基酸跨過上皮細胞的特殊功能。這些蛋白質(zhì)吸收因子的調(diào)節(jié)機制能夠幫助研究者規(guī)劃飲食，在水產(chǎn)和魚類育種中有潛在的應(yīng)用性。
[0003]在以前的研究中，硬骨魚類的蛋白質(zhì)吸收因子的功能、機理和調(diào)節(jié)已經(jīng)進行了廣泛的研究。Bakke認為在硬骨魚類中，營養(yǎng)物的供給、消化和吸收能夠有助于改善飲食規(guī)律和供給模式。同時，基于魚類喂養(yǎng)和生殖的經(jīng)驗，研究者發(fā)現(xiàn)有助于提高生長速度的飲食習(xí)慣通常并不適合性腺發(fā)育。硬骨魚類的腸道蛋白質(zhì)的吸收屬性在很大程度上仍然不清楚。
[0004]與其他脊椎動物相似，硬骨魚類的生殖由下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)調(diào)控的。然而，在人工池塘中，由于垂體中LH的分泌不充足，雌性個體的生殖機能失調(diào)。作為LH的類似物，人絨毛膜促性腺激素(hCG)在魚類的催產(chǎn)中發(fā)揮著作用。另外，通過注射hCG來刺激魚類已經(jīng)被證實為有用的手段研究在排卵過程中基因的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及一種鯽魚免疫相關(guān)基因表達的調(diào)控方法，其特征在于給鯽魚注射
0.6-3.0IU/ghCG，其中g(shù)代表羅非魚的體重克數(shù)。
[0006]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，其特征在于給鯽魚注射0.6-3.0IU/g hCG，使得免疫相關(guān)的基因如P印T1、CDX2、CREB、⑶H、LAT2、APN和SPl等的表達量發(fā)生變化。
[0007]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的鯽魚為性成熟的雄性和雌性鯽魚。
[0008]本發(fā)明另一方面涉及hCG的應(yīng)用，所述的hCG用于提聞觸魚免疫相關(guān)基因的表達量或者在制備提高鯽魚免疫相關(guān)基因的表達量藥物中的應(yīng)用，所述的免疫相關(guān)的基因選自⑶H、PepTU LAT、CDX2和/或CREB，優(yōu)選地，hCG用于同時提高的⑶H、P印T1、LAT、CDX2和CREB的表達量。
[0009]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的hCG為注射劑形式。
[0010]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的鯽魚為性成熟的雄性鯽魚，所述的hCG還用于提高APN的表達量。
[0011]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的鯽魚為性成熟的雌性鯽魚，所述的hCG還用于提高SPl的表達量。
[0012]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的提高是指提高鯽魚的腸道組織中的免疫相關(guān)基因的表達量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:觸魚消化吸收 相關(guān)基因表達量的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】:
[0014]下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明并不局限于以下實例。實施例I
[0015]實驗用魚
[0016]性成熟的鯽魚養(yǎng)殖在循環(huán)水養(yǎng)殖箱中(26 ± I °C ),體長11.6 ± 0.6cm,體重320.1 ±44.5克。12尾雌性成熟個體和12尾雄性成熟個體隨機的分成6組，包括有雌性對照組(n = 4) ；0.6IU/g hCGl天后注射組；0.6IU/g hCG7天后注射組；3IU/g hCGl天后注射組；3IU/g hCG7天后注射組。對照組和hCG實驗組分別注射生理鹽水、0.6IU/g和3IU/g體重的hCG。每組在獨立養(yǎng)殖箱分開養(yǎng)殖，在注射后的第一天和第七天解剖收集腸道組織。在冰上解剖獲得組織后，立即放入液氮中，再保存于_80°C超低溫冰箱。
[0017]實時定量PCR分析
[0018]實時熒光定量PCR在ABI公司提供的ABI7500Real_Time PCR System進行。提取RNA后，用分光光度計和凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和數(shù)量級。進行反轉(zhuǎn)錄前用DNase I去除 DNA 污染。IygS RNA 用 AMV reverse transcriptase (Fermentas)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNAo 引物設(shè)計根據(jù) Ensembl database (www.ensembl.0rg)上 Piwil-1 和 Piwil-2 的序列設(shè)計(表1)，并采用P -actin作為內(nèi)參。所用試劑為ABI提供的Power SYBR Green PCRMaster Mix。模板為稀釋40倍的反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，反應(yīng)體系為:2.5 cDNA，正反向引物各 0.1，Power SYBR Green PCR Master Mix5 u 1，加水至 IOy I 體系。反應(yīng)條件為:50°C 2min ；95°C IOmin后進入循環(huán)；95°C 15s,60°C 45s，40個循環(huán)。實驗結(jié)果按照Taact進行數(shù)據(jù)分析。最后做熔解曲線以檢測擴增是否特異。每組用SPSS13.0軟件包中的單因素方差多重比較LSD Duncan法分析檢測是否有顯著性差異。
[0019]表1RT-PCR所用引物
[0020]Table3-lPrimers for quantitative RT-PCR
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種魚類蛋白質(zhì)吸收相關(guān)因子的調(diào)控方法，其特征在于給魚類注射hCG，在注射后檢測蛋白質(zhì)吸收相關(guān)基因的表達，優(yōu)選地，所述的魚類為鯽魚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的調(diào)控方法，其特征在于所注射的hCG的濃度為0.6-3.0IU/g，其中g(shù)代表魚的體重。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控方法，其特征在于在注射hCG的I天后檢測相關(guān)基因的表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控方法，其特征在于在注射hCG的I天后檢測相關(guān)基因的表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控方法，其特征在于所檢測的與蛋白質(zhì)吸收相關(guān)的基因，包括有氨基肽酶N(APN)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、小肽轉(zhuǎn)運蛋白(PepTl)、轉(zhuǎn)錄因子SPl和尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)。
6.hCG的應(yīng)用，所述的hCG用于提高鯽魚免疫相關(guān)基因的表達量或者在制備提高鯽魚免疫相關(guān)基因的表達量藥物中的應(yīng)用，所述的免疫相關(guān)的基因選自GDH、PepTU LAT、CDX2和/或CREB，優(yōu)選地，hCG用于同時提高的⑶和CREB的表達量，優(yōu)選地，所述的hCG為注射劑形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的鯽魚為性成熟的雄性鯽魚，所述的hCG還用于提高APN的表達量。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的鯽魚為性成熟的雌性鯽魚，所述的hCG還用于提高SPl的表達量。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任意一項所述的應(yīng)用，所述的提高是指提高鯽魚的腸道組織中的免疫相關(guān)基因的表達量。
【文檔編號】C12Q1/68GK103520709SQ201310428284
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】鐘歡, 肖俊, 周毅, 甘西, 張明, 羅永巨, 于凡, 楊弘, 唐瞻楊, 郭忠寶, 郭恩彥, 雷燕 申請人:廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院