魚(yú)類nkef-a重組蛋白對(duì)適應(yīng)性體液免疫的活化效應(yīng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物技術(shù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治領(lǐng)域，特別涉及一種天然殺傷細(xì)胞 增強(qiáng)因子A(Natural Killer Enhancer Factor A，NKEF_A)促進(jìn)魚(yú)類適應(yīng)性體液免疫的新 功能及其應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著漁業(yè)生產(chǎn)迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物病害日益突出，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)業(yè)健康可 持續(xù)發(fā)展。長(zhǎng)期來(lái)由于缺乏有效的病害防治方法，各種抗生素、殺蟲(chóng)劑廣泛使用，造成養(yǎng)殖 環(huán)境和水產(chǎn)品污染，水產(chǎn)食品安全受到威脅，同時(shí)抗生素產(chǎn)生的耐藥性又加劇了水產(chǎn)動(dòng)物 病害發(fā)生。因此，研制開(kāi)發(fā)天然、安全和高效的水產(chǎn)動(dòng)物病害防治制劑及其應(yīng)用技術(shù)是一項(xiàng) 十分緊迫的任務(wù)。魚(yú)類免疫抗病基因的開(kāi)發(fā)利用是從根本上解決水產(chǎn)動(dòng)物病害防治，保障 水產(chǎn)食品安全的有效途徑，代表了當(dāng)前發(fā)展綠色和環(huán)境友好型水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的主要方向。 但長(zhǎng)期來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫抗病基因的研宄相對(duì)薄弱，因此所開(kāi)發(fā)的免疫抗病基因數(shù) 量尚十分有限。
[0003] 天然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子（NKEF)最初在人紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，因其能增強(qiáng)天然殺傷 細(xì)胞（Natural Killer，NK)的細(xì)胞毒效應(yīng)而得以命名。近年來(lái)研宄表明，NKEF除了具有增 強(qiáng)NK細(xì)胞活性外，還具有抗氧化等功能。但對(duì)其是否具有其他的生物學(xué)功能，如是否對(duì)適 應(yīng)性免疫具有調(diào)節(jié)功能尚不清楚。
[0004] 本發(fā)明首次揭示NKEF-A具有促進(jìn)魚(yú)類適應(yīng)性體液免疫的新功能，發(fā)現(xiàn)其可以顯 著提高魚(yú)類適應(yīng)性體液免疫，實(shí)現(xiàn)對(duì)魚(yú)類病害的有效防治。功能機(jī)制研宄表明，NKEF-A能 通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞（APC)表面的TLR4受體激活NF- κ B炎癥信號(hào)通路，上調(diào)共刺激信號(hào)分 子CD40、CD80/86和CD83等的表達(dá)，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖活化以及IgM抗體的產(chǎn)生，從而發(fā) 揮增強(qiáng)適應(yīng)性體液免疫功能。本發(fā)明不僅豐富了魚(yú)類免疫學(xué)知識(shí)，而且為魚(yú)類病害的免疫 防治開(kāi)辟了新途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種魚(yú)類NKEF-A重組蛋白的新應(yīng)用，具體為魚(yú)類NKEF-A重組 蛋白促進(jìn)魚(yú)類體液免疫能力的應(yīng)用，將NKEF-A重組蛋白與嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗配合 使用，從而提高預(yù)防魚(yú)類細(xì)菌性出血性敗血癥的效果。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種魚(yú)類NKEF-A重組蛋白在制備增強(qiáng)魚(yú)類體液免疫能力的免疫增強(qiáng) 劑中的應(yīng)用，所述魚(yú)類NKEF-A重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1所示（核苷酸序列為 SEQ ID N0:2所示），其用途是促進(jìn)疫苗制劑的適應(yīng)性體液免疫應(yīng)答，包括但并不限于蛋白 抗原疫苗、細(xì)菌全菌滅活疫苗等誘導(dǎo)的適應(yīng)性體液免疫應(yīng)答。所述的增強(qiáng)魚(yú)類體液免疫的 免疫增強(qiáng)劑為治療魚(yú)類敗血癥的制劑，所述制劑由嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗和具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的重組蛋白構(gòu)成；所述制劑的給藥途徑采用皮下注射的方式，所述具 有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的重組蛋白用量為0.1?0.25 μ g/尾，所述嗜水氣單胞菌 全細(xì)胞疫苗用量為5 X IO5?5 X 10 6CFU/尾，在35天內(nèi)產(chǎn)生效力。
[0008] NKEF-A重組蛋白促進(jìn)魚(yú)類適應(yīng)性體液免疫的功能機(jī)制是，該因子能促進(jìn)抗原遞呈 細(xì)胞（APC)表達(dá)⑶40、⑶80/86和⑶83等共刺激信號(hào)分子，增強(qiáng)⑶4+T細(xì)胞增殖活化以及 IgM抗體的產(chǎn)生。
[0009] 本發(fā)明利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)（pET28a和Rosetta BL21)體外表達(dá)獲得河豚 NKEF-A重組蛋白，將此重組蛋白分別與外源抗原蛋白和細(xì)菌全菌滅活疫苗共同免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物斑馬魚(yú)。利用熒光定量PCR(qPCR)和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，檢測(cè)抗原遞呈細(xì)胞（APC)以及 T、B淋巴細(xì)胞活性，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測(cè)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體（IgM)的變化。發(fā) 現(xiàn)NKEF-A重組蛋白能顯著促進(jìn)APC以及T、B淋巴細(xì)胞活性標(biāo)志分子的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞增殖以及B細(xì)胞產(chǎn)生抗體（IgM)的滴度。證明NKEF-A重組蛋白可以通過(guò)促進(jìn)免 疫細(xì)胞的活化和抗體產(chǎn)生等途徑，激活機(jī)體的適應(yīng)性體液免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高對(duì)細(xì) 菌感染的抵御功能，增加機(jī)體存活率。
[0010]目前在人類和哺乳動(dòng)物中使用的適應(yīng)性免疫增強(qiáng)劑有白細(xì)胞介素、干擾素等細(xì)胞 因子，鋁鹽、皂苷、鯊烯、脂質(zhì)體、礦物油等化合物，百日咳桿菌、胞壁酰二肽、單磷酸脂質(zhì)A、 細(xì)菌毒素（如霍亂弧菌腸毒素和大腸桿菌腸毒素）等細(xì)菌結(jié)構(gòu)組分或代謝分泌產(chǎn)物等。理 想的免疫增強(qiáng)劑應(yīng)該是無(wú)毒副作用，對(duì)免疫系統(tǒng)具有顯著的激活作用，便于生產(chǎn)和使用。事 實(shí)上，上述制劑還沒(méi)有任何一種類型能完全滿足這些要求，由于大多數(shù)制劑來(lái)源于細(xì)菌產(chǎn) 物或化合物，因此使用中存在不同程度的安全性問(wèn)題。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的NKEF-A重組蛋白作為適應(yīng)性體液免疫增強(qiáng)劑，其 優(yōu)點(diǎn)在于：（1)使用劑量小，效率高；以質(zhì)量比1:100 (NKEF-A蛋白：抗原）的NKEF-A重組 蛋白劑量即可發(fā)揮顯著的免疫促進(jìn)作用，而傳統(tǒng)礦物油乳劑類制劑與抗原的質(zhì)量比例為 1:1 ; (2)易于制備免疫混合液；NKEF-A重組蛋白是可溶性蛋白，容易與抗原混合，克服了傳 統(tǒng)礦物油乳劑類制劑不易乳化抗原的缺點(diǎn)；（3)安全性高；與細(xì)菌毒素或化合物制劑不同， NKEF-A是宿主自身的蛋白，不存在外源物質(zhì)導(dǎo)入產(chǎn)生的潛在毒副作用。 (四）【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為NKEF-A重組蛋白的cDNA分子克隆的PCR檢測(cè)結(jié)果。M :DNA Marker，第1? 6泳道為實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，均得到預(yù)期的擴(kuò)增條帶。
[0013] 圖2為NKEF-A重組蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果；M :標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker，泳道 1為未誘導(dǎo)對(duì)照，泳道2為NKEF-A重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，預(yù)期大小22. 3KDa。
[0014] 圖3為NKEF-A重組蛋白促進(jìn)KLH抗原活化APC的結(jié)果。上：實(shí)時(shí)熒光定量分析 PBS、KLH、KLH+NKEF-A分別刺激后MHC-II和CD80/86的改變結(jié)果。下：流式細(xì)胞術(shù)分析PBS、 KLH、KLH+NKEF-A分別刺激后APC的活化結(jié)果。
[0015] 圖4為NKEF-A重組蛋白促進(jìn)KLH抗原活化T淋巴細(xì)胞的結(jié)果。上：實(shí)時(shí)熒光定 量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分別刺激后Lck和⑶154的改變結(jié)果。下：流式細(xì)胞術(shù)分析 PBS、KLH、KLH+NKEF-A分別刺激后T細(xì)胞的活化結(jié)果。
[0016] 圖5為NKEF-A重組蛋白促進(jìn)KLH抗原活化B淋巴細(xì)胞的結(jié)果。上：實(shí)時(shí)熒光定 量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分別刺激后⑶40和mlgM的改變結(jié)果。下：流式細(xì)胞術(shù)分析 PBS、KLH、KLH+NKEF-A分別刺激后B細(xì)胞的活化結(jié)果。
[0017] 圖6為NKEF-A重組蛋白促進(jìn)抗體（IgM)產(chǎn)生的結(jié)果。
[0018] 圖7為NKEF-A重組蛋白對(duì)細(xì)菌疫苗免疫保護(hù)的存活率變化曲線圖。 (五）【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0020] 實(shí)施例1、編碼NKEF-A蛋白的cDNA分子克隆
[0021] 依照Trizol試劑盒（TaKaRa)的說(shuō)明從河豚脾臟提取RNA，采用3' -Full RACE Core Set試劑盒（TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板，使用正向引物Fl : 5' -CCATGGCTGCAGGCAAAGCTC-3' 和反向引物 Rl :5' -CTCGAGGTGCTTGGAGAAGAACTC-3' 進(jìn)行 PCR(體系見(jiàn)表1)擴(kuò)增，獲得NKEF-A重組蛋白的編碼核苷酸序列。PCR條件為：94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，72°C延伸 lOmin，共 35 個(gè)循環(huán)，PCR 產(chǎn)物 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示得到了與預(yù)期相吻合的NKEF-A cDNA條帶（圖1)。
[0022] 利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒（Axygen)回收上述擴(kuò)增的NKEF-A cDNA片段，將回收片 段連接（體系見(jiàn)表2)到pUCm-T質(zhì)粒載體（TaKaRa)中，42°C熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于含Amp (氨芐青霉素，終濃度50 μ g/ml)、IPTG (異丙基硫代半乳糖苷，終濃度 200mM)和X-gal ( β -半乳糖苷酶，終濃度40 μ g/ml)的LB平板上，37°C恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，挑 取白色陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，借助PCR和酶切（體系見(jiàn)表3)鑒定，并送公司（上海英駿）進(jìn) 行序列分析。結(jié)果表明，NKEF-A的cDNA序列全長(zhǎng)602bp，編碼200個(gè)氨基酸殘基，與預(yù)期吻 合，重組質(zhì)粒命名為pT/NKEF-A。
[0023] 表I NKEF-A cDNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種魚(yú)類NKEF-A重組蛋白在制備增強(qiáng)魚(yú)類體液免疫的增強(qiáng)劑中的應(yīng)用，其特征在 于所述魚(yú)類NKEF-A重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述增強(qiáng)魚(yú)類體液免疫的增強(qiáng)劑為治療魚(yú) 類敗血癥的制劑。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述制劑由嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗和具 有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的重組蛋白構(gòu)成。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列 的重組蛋白用量為0. 1?0.25 μ g/尾，所述嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗用量為5X IO5? 5 X IO6CFU/尾。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類NKEF-A重組蛋白對(duì)適應(yīng)性體液免疫的活化效應(yīng)及其應(yīng)用，所述的應(yīng)用為用于制備能夠促進(jìn)魚(yú)類體液免疫能力的免疫增強(qiáng)劑，所述魚(yú)類NKEF-A重組蛋白的氨基酸序列為SEQID NO:1所示；本發(fā)明提供的NKEF-A重組蛋白作為適應(yīng)性體液免疫增強(qiáng)劑，其優(yōu)點(diǎn)在于：(1)使用劑量小，效率高；以1:100(NKEF-A蛋白:抗原)的NKEF-A重組蛋白劑量即可發(fā)揮顯著的免疫促進(jìn)作用；(2)易于制備免疫混合液：NKEF-A重組蛋白是可溶性蛋白，容易與抗原混合，克服了傳統(tǒng)礦物油乳劑類制劑不易乳化抗原的缺點(diǎn)；(3)安全性高；與細(xì)菌毒素或化合物制劑不同，NKEF-A是宿主自身的蛋白，不存在外源物質(zhì)導(dǎo)入產(chǎn)生的潛在毒副作用。
【IPC分類】A61K39-106, A61P31-04, A61P37-04, A61K38-19, A61P7-00, A61K39-39
【公開(kāi)號(hào)】CN104587463
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410830137
【發(fā)明人】邵建忠, 劉廣平, 項(xiàng)黎新, 董偉仁, 聶力
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年12月27日