專利名稱：無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白轉導域融合人表皮生長因子的融合蛋白及其核酸，包括構建表達 純化等一系列的技術工藝。
背景技術：
表皮生長因子是1962年Cohen和Montalcini教授在小鼠頌下腺中發(fā)現的一種蛋 白，其具有促使新生小鼠眼瞼早開、牙齒早萌的作用。將這一活性成分加入培養(yǎng)皮膚表皮的 基質中，發(fā)現它可直接促進皮膚表皮的生長，因此，將這一活性組分命名為“表皮生長因子 (epidermal growth factor,EGF)0表皮生長因子(EGF)是由53個氨基酸殘基組成的單鏈 多肽，含3個鏈內二硫鍵。等電點(PI)為4.6，分子量為60450&1975年Gregory從人尿中提取得到一種物質，其可抑制胃酸分泌而被稱為尿抑胃 素(urogastrone，UG)。后來證明這兩種物質在結構與生理功能上極為相似，于是人們把 EGF和UG這兩種多肽看成是同一類物質，稱之為“表皮生長因子-尿抑胃素(EGF-UG)”。人 尿中EGF含量很少(每10萬公升尿液中只能提取1克)，并且存在污染和活性損失的可能 性。近年來利用基因工程方法已有成功表達EGF的報道及相關專利。體外實驗證實EGF可調節(jié)神經前體細胞分裂增殖。加入EGF可使BrdU標記的神經 前體細胞明顯增加。胚胎鼠的視網膜前體細胞在EGF作用下可分化成神經元和膠質細胞。 EGF對鼠嗅球內的神經前體細胞也有促增殖作用。EGF能刺激從鼠紋狀體和腦室下區(qū)分離 的干細胞增殖。EGF參與腦梗死后早期神經結構和功能的重建。EGF是一種常用于體外細 胞培養(yǎng)、促進細胞增殖的神經營養(yǎng)因子，其促細胞有絲分裂和增強神經元軸突生長的強效 作用已得到公認。成年動物腦損傷后，室管膜下區(qū)的NSC雖然有增殖和遷徙反應，但由于分 化為神經元細胞的數量太少而難以改善神經功能。Craigig等將EGF注入老鼠的側腦室，結 果發(fā)現室管膜區(qū)巢蛋白呈陽性的細胞數明顯增多，表明在哺乳動物中樞神經系統的神經元 再生能力很有限并非是由于缺乏足夠神經干細胞，而是由于缺少刺激神經干細胞分化的必 須的神經因子。EGF在發(fā)育較晚期起作用，而且在神經干細胞的增殖和分化中起作用。激發(fā) 內源性NSC增殖來彌補神經元細胞的損失有可能成為今后治療AD等神經退行性疾病的研 究方向。但EGF在常溫狀態(tài)下非常不穩(wěn)定，很容易降解而失去活性，很難越過細胞膜等結 構，而使藥效損失，限制了在臨床上的應用。

發(fā)明內容
研究發(fā)現，在一些蛋白質上具有被稱為蛋白轉導區(qū)(proteintransduction domain, PTD)的小片段，又稱為細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)能夠有效 地通過生物膜，進入各種類型的細胞。外源蛋白質、DNA或復合物與PTD連接后，能夠進入 細胞和通過血腦屏障。因此，PTD在運送蛋白質、DNA或復合物，并進而在治療病毒感染，特 異性殺傷腫瘤細胞及神經退行性疾病等方面有巨大的潛力。
人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)反義激活轉 i (trans-activator transcription, TAT) ^ 白 PTD (TAT-PTD) i 巨 ItT PTD 白勺一禾中 * 源。TAT中的11個氨基酸(第47-57位氨基酸)是具有蛋白轉導功能的肽段，其序列為 YGRKKRRQRRR(SEQ IDN0. 1)。TAT_PTD可以將與之相連的多肽和全長蛋白在數分鐘內轉導進 入細胞，而且可以通過血液循環(huán)運輸至腦組織，從而可跨越血腦屏障進入神經元或膠質細 胞內。本發(fā)明人通過將表皮生長因子與PTD融合獲得了表皮生長因子變構體。實驗證 明，本發(fā)明的表皮生長因子變構體可通過粘膜吸收，無創(chuàng)性地穿透粘膜進入體內，進而可用 于治療病毒感染、特異性殺傷腫瘤細胞以及神經退行性疾病等。因此，本發(fā)明的表皮生長因 子變構體也稱為無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子。所以，本發(fā)明一方面提供了一種無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子，其包含選自如下 的序列a) SEQ ID NO. 5中所示的氨基酸序列；或b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸且保留 取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子為a) SEQ ID NO. 5中所示的氨基酸序列；和b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸且保留 取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。本發(fā)明所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1個或幾個的氨基酸，是指 在序列中的任意且1個或幾個氨基酸序列中的位置上取代、缺失、插入或添加1個或幾個氨 基酸殘基(例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個)，并且取代、缺失、插入和添加 中的2種或兩種以上可同時發(fā)生。本發(fā)明所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1個或幾個的氨基酸可通 過使用《Molecular Cloning 3》(分子克隆 3)和《Current Protocols in Molecular Biology))(現代分子生物學操作規(guī)程)等記載的定點誘變法獲得。對于本發(fā)明所述的取代，優(yōu)選在下列各組之內進行氨基酸殘基的相互取代1 亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、甘氨酸；2:天冬氨酸、谷氨酸；3 天冬酰胺、谷氨酰胺；4:賴氨酸、精氨酸；5 脯氨酸、羥基脯氨酸；6:絲氨酸、蘇氨酸；和7 苯丙氨酸、酪氨酸。對于本文中所述的保守取代、缺失、插入或添加前活性，可表示在取代、缺失、插入 或添加后的蛋白質或氨基酸序列的活性是取代、缺失、插入或添加前的10%以上、20%以 上、40%以上、60%以上、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、 99%以上、或100%或更高。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸殘基的個數，一般優(yōu)選小的數目。并且此類蛋白質還可以為蛋白質，其具有與序列號5的氨基酸序列有約60%或以上、約70%或 以上、71%或以上、72%或以上、73%或以上、74%或以上、75%或以上、76%或以上、77%或 以上、78%或以上、79%或以上、80%或以上、81%或以上、82%或以上、83%或以上、84%或 以上、85%或以上、86%或以上、87%或以上、88%或以上、89%或以上、90%或以上、91%或 以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或 以上、99%或以上、99. 或以上、99. 2%或以上、99. 3%或以上、99. 4%或以上、99. 5%或 以上、99. 6%或以上、99. 7%或以上、99. 8%或以上、或99. 9%或以上的同一性的氨基酸序 列、且具有序列號5所具有的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子活性。上述同源性的數值一般 優(yōu)選大的數值。優(yōu)選地，上述取代、缺失、插入或添加發(fā)生在SEQ ID NO. 5中所示的氨基酸序列第 12位及其以后氨基酸殘疾。本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子除通過基因工程方法(如下述實施例所 述)來獲得之外，也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化 學合成法制造，或通過肽合成儀進行化學合成。本發(fā)明的另一方面還提供了編碼本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子的核苷 酸序列。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子的核苷酸序列包含a) SEQ ID NO. 6中所示的核苷酸序列；b)在嚴緊條件下與由序列號6的核苷酸序列進行雜交、且編碼具有無創(chuàng)性高穿透 性表皮生長因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或c)上述a)或b)的互補序列。本文中，具有無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子活性是指某一蛋白質或氨基酸序列的 活性是SEQ ID NO. 5的10%以上、20%以上、40%以上、60%以上、80%以上、90%以上、95% 以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、或100%或更高。進一步優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子的核苷酸序列為a) SEQ ID NO. 6中所示的核苷酸序列；b)在嚴緊條件下與由序列號6的核苷酸序列進行雜交、且編碼具有無創(chuàng)性高穿透 性表皮生長因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；c)上述a)或b)的互補序列。本文所述的“嚴緊條件”，可以為低嚴緊條件、中嚴緊條件、高嚴緊條件中的任一 種，優(yōu)選為高嚴緊條件。示例性地，“低嚴緊條件”可為30°C、5XSSC、5XDenhardt液、0. 5% SDS、52% 甲酰胺的條件；“中嚴緊條件”可為 40°C、5 X SSC、5 XDenhardt 液、0. 5% SDS、52% 甲酰胺的條件；“高嚴緊條件”可為50°C、5XSSC、5XDenhardt液、0. 5% SDS、52%甲酰胺的 條件。本領域技術人員應當理解溫度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本領域技 術人員可以選擇影響雜交的嚴緊度的溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等 多個因素形成的綜合結果來實現相應的的嚴緊度。除此之外可雜交的多核苷酸還可以為，通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟件用 系統設定的默認參數進行計算時，與編碼序列號6的多核苷酸具有約60%或以上、約70% 或以上、71%或以上、72%或以上、73%或以上、74%或以上、75%或以上、76%或以上、77%或以上、78%或以上、79%或以上、80%或以上、81%或以上、82%或以上、83%或以上、84% 或以上、85%或以上、86%或以上、87%或以上、88%或以上、89%或以上、90%或以上、91% 或以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98% 或以上、99%或以上、99. 1或以上、99. 2或以上、99. 3%或以上、99. 4%或以上、99. 5%或以 上、99. 6%或以上、99. 7%或以上、99. 8%或以上、或99. 9%或以上同一性的多核苷酸。氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法規(guī)則 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 =2264-2268,1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873,1993)來確定?；贐LAST算法規(guī)則的程序BLASTN、BLASTX已被開發(fā)(AltschulSF， et al J Mol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，如使參數為score = 100、wordlength = 12 ；此外使用BLASTX分析氨基酸序列時，如使參數為score = 50、 wordlength = 3 ；使用BLAST和GappedBLAST程序時，采用各程序的系統可設定默認參數 值。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核苷酸序列的載體，例如質粒載體。另外，本發(fā)明還 提供了導入本發(fā)明所述的載體的微生物，例如大腸桿菌和酵母。本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子的方法，其包括 培養(yǎng)本發(fā)明所述的微生物。本發(fā)明的再一方面提供了一種藥物組合物或藥物制劑，其包含本發(fā)明的無創(chuàng)性高 穿透性表皮生長因子或其核苷酸序列。對于本發(fā)明的藥物組合物或藥物制劑，其可用于治 療神經退行性疾病，如阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥及黑質退行性病變等。本發(fā)明的又一方面提供了本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子及其核苷酸序 列在制備用于神經退行性疾病(如阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、黑質退行性病變)的藥 物中或用于神經干細胞增值的藥物中的用途。對于本發(fā)明的藥物組合物，其可通過注射、舌下含服、肺吸入、鼻粘膜及肛栓或皮 膚吸收、滴眼液等多種方式進行施用。


圖1 :NcoI和EcoR I雙酶切載體pUC57，2 %低熔點膠回收目的片段 OmpA-PTD-hEGF。其中泳道M，DNA Marker ；泳道 1，pUC57-0mpA-PTD_hEGF。圖2 =NcoI和EcoR I雙酶切載體pET_28a(+)，回收5400bp的載體片段。泳道M, DNA Marker ；泳道 1，pET_28a(+)。圖3 菌落PCR鑒定圖。其中泳道M，DNA Marker ；泳道1-5，5個單菌落。圖4 :PTD-hEGF分泌表達圖。其中泳道M，肽Marker ；泳道1，PTD_h EGF ；泳道2，未誘導。圖5 分泌表達PTD-hEGF融合蛋白的蛋白質印跡鑒定圖，其中1，PTD-hEGF融合蛋白；2，陰性對照。圖6 =NcoI和BamHI雙酶切載體pET_28a(+)，回收5400bp的載體片段。其中泳道M, DNA Marker ；泳道 1，pET_28a (+)。
圖7 =PCR方法釣取PTD-hEGF基因，片段用NcoI和BamHI雙酶切，并用低熔點瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體和目的基因片段。其中泳道M，DNA Marker ；泳道 1，PTD-hEGF 基因。圖8 包涵體表達PTD-h E G F圖。其中1，2，3泳道，分別誘導l、3、5h ；M JiMarker ；泳道4，未誘導。圖9 包涵體表達PTD-h EGF的蛋白質印跡鑒定圖。其中1，PTD-hEGF融合蛋 白；2，陰性對照。圖10 融合蛋白血腦屏障穿透實驗，其中1，PTD-hEGF ；2，hEGF ；3，陰性對照。圖11 水迷宮實驗，其中A，AD模型鼠靜脈給藥；B，自然老化鼠靜脈給藥；C，AD模 型鼠直腸給藥；D，自然老化鼠直腸給藥。圖12 穿梭箱實驗，其中A，AD模型鼠靜脈給藥；B，自然老化鼠靜脈給藥；C，AD模 型鼠直腸給藥；D，自然老化鼠直腸給藥。圖13 神經干細胞實驗，小鼠海馬巢蛋白(Nestin)表達圖，其中A，AD模型小鼠； B，PTD-hEGF治療小鼠；C，假手術小鼠。圖14 神經干細胞實驗，小鼠海馬神經纖維酸性蛋白(GFAP)表達圖，其中A，AD 模型小鼠；B，PTD-hEGF治療小鼠；C，假手術小鼠。圖15 神經干細胞實驗，小鼠海馬溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)摻入量圖，其中A，AD 模型小鼠；B，PTD-hEGF治療小鼠；C，假手術小鼠。圖16 :PET腦成像實驗，其中A，AD模型大鼠；B，hEGF治療的AD模型大鼠；C， PTD-hEGF治療的AD模型大鼠；D，假手術大鼠。下面將通過借助以下實施例來更詳細地說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的， 應該明白，本發(fā)明并不受下述實施例的限制。 實施例1分泌型表達載體OmpA-PTD-hEGF的構建 根據人表皮生長因子序列在氨基酸序列不變的情況下調整核酸序列，在EGF序列 N端直接融合PTD序列(中間不加任何堿基)，在PTD前再加OMPA序列(SEQ ID NO. 7)，為了 連接在pET-28a (+)原核表達載體上，再在OMPA序列前加入NcoI酶切位點(CCATGG)，利用 NcoI酶切位點內的ATG起始密碼子，為了不移碼在CAATGG后加堿基GC，也就是在OMPA前加 了蛋氨酸和甘氨酸。hEGF的C末端加入了 TAA TAA(終止密碼子序列)，終止密碼子后面接 EcoRI 酶切位點(GAATTC)。整體基因序列是 CAATGGGC+0MPA 序列(SEQ ID NO. 7) +PTD (SEQ IDN0.3)+hEGF序列(SEQ ID NO. 4) +TAA TAA+GAATTC(該整體基因序列由上海生物工程公司 合成)，并構建于PUC57載體上。轉化DH5ci大腸桿菌，挑取單菌落，搖菌提質粒。pUC57質 粒載體用NcoI和EcoR I雙酶切回收目的基因片段。其中，所述的回收是使用如下反應體
系NcoI1 μ 1EcoR I1 μ 1NcoI和EcoR I通用緩沖液 2 μ 1BSA0. 2 μ 1Puc 57(pET-28a(+))8μ 1H2O7· 8 μ 1
總的反應體系為20 μ 1，于37°C溫浴3小時。酶切產物OmpA-PTD-hEGF經2%低熔點瓊脂糖凝膠電泳(見圖1)，回收泳道1中 的220bp左右的基因片段。pET-28a(+)載體片段用1. 2%低熔點瓊脂糖凝膠電泳(見圖 2)，回收5400bp左右的基因片段，在紫外燈下確定目的片段的位置，用刀片切下該位置的 凝膠。將膠塊放于1. 5ml離心管中，用低熔點瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。將pET_28a(+)載體也用NcoI和EcoR I進行雙酶切，并回收目的載體片段。為了 將目的基因片段連接到pET-28a(+)載體上，進行在如下反應體系下進行反應。反應體系如下DNA (目的基因片段)5μ1DNA (pET-28a (+)載體片段)2 μ 1Τ4 連接酶1 μ 1IOX連接酶緩沖液Ιμ H2O1 μ 1總的反應體系為10μ 1，于4°C過夜。將連接產物(即連接后的pET_28a(+)載體)轉化大腸桿菌DH5 α，并對其進行培 養(yǎng)。然后挑取單菌落，并對其進行PCR鑒定，挑取了 5個單菌落，圖3是鑒定結果(均完全 正確)。對PCR鑒定正確的基因進行DNA序列測定。從測序正確的大腸桿菌中提取質粒以 用于轉化BL21(DE3)大腸桿菌。本實施例中所用的各種酶以及相關菌種，其來源信息如下NcoI和EcoR I酶購自 賽百盛公司，pET_28a(+)載體購自Novagen公司，T4連接酶購自Promega公司，DH5 α和 BL2KDE3)菌種購自天為時代公司。實施例2分泌型表達載體的誘導表達液體培養(yǎng)基(LB配方)2 15g 胰蛋白胨，2 IOg 酵母提取物，2 8g NaCl，IOgNaH2PO4 · 12H20，0. 33g Na2HPO4 · 2H20溶于IOOOml雙蒸水中，15磅滅菌25分鐘；配制5 30%葡萄糖，8磅滅菌20分鐘，添加至上述LB中；卡那霉素采用50 60 μ g/ml工作濃度；誘導劑IPTG母液1M/L。將實施例1中重組構建的質粒轉化BL21 (DE3)大腸桿菌并進行培養(yǎng)。挑選單菌 落并接種至LB培養(yǎng)基(葡萄糖0.2% +卡那霉素50-60 μ g/ml)中，并于25 35°C下搖 床培養(yǎng)5至15小時。取種子液加至液體LB培養(yǎng)基(加葡萄糖至終濃度0.2%，卡那霉素 50-60 μ g/ml)，并在25 37°C下培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5 1. 0左右。然后添加IPTG至終濃度 0. Ι-lmM/L,同時再補充一次新的卡那霉素至50-60 μ g/ml，并于25 35°C下誘導表達2 10小時(見圖4)。圖4是表達蛋白的SDS-Page電泳圖，從圖上可以看出，表達蛋白的大小 與理論值是一致的。實施例3分泌表達蛋白的純化1)、從實施例2中誘導表達的培養(yǎng)基中通過離心收集菌體，用溶液(10 30mM Tris-HClUO 30%蔗糖0. 5 ImM EDTA pH7. 0 9. 0，按每克菌體50 100毫升計算) 懸浮，冰浴，輕輕振蕩10分鐘；
2)、4°C下SOOOg離心，去除上清，沉淀用MgSO4溶液懸浮，冰浴，輕輕振蕩；3)、12000g離心15分鐘，取上清，上清即為蛋白粗產品；4)、苯基疏水層析將溶漲好的苯基疏水介質裝入層析柱，用溶液(1 5M硫酸銨，20 70mMTris-HCl PH7.0 9.0)平衡苯基疏水介質，將上一步得到的上清(即蛋白粗產品)上樣，再用溶液 (0. 5 5M硫酸銨，20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)平衡苯基疏水介質至電導穩(wěn)定，用溶 液(50mMTris-HCl pH pH 7. 0 9. 0)洗脫，收集洗脫峰；5)、透析上步收集的洗脫峰裝入透析袋，放入透析液(20 70mMTris-HClpH7. 0 9. 0)中 透析過夜；6)、DEAE陰離子交換層析首先用溶液(20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)平衡DEAE陰離子介質；接著在 透析液中加入一倍體積的溶液(20 70mMTris-HCl pH7 9. 0)并上樣，再用溶液(20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)平衡,然后用溶液(20 70mMTris_HCl pH7. 0 9. 0，0. 5 2MNaCl)梯度洗脫，收集洗脫峰，即為目的蛋白樣品。純化蛋白通過蛋白質印跡鑒定，表明是 正確的(見圖5)。實施例4包涵體表達載體pET PTD-hEGF的構建在上述實施例1中構建的分泌表達質粒的基礎上，利用PCR方法釣取PTD-hEGF基 因片段。在其前端加NcoI酶切位點(CCATGG)及其保護性堿基，利用NcoI位點內的ATG起 始密碼子，為了不移碼加堿基GC，也就是在PTD前加了兩個氨基酸(蛋氨酸和甘氨酸)。在 hEGF后加TAA TAA兩個終止密碼子之后加BamHI酶切位點及其保護堿基序列。引物設計如下Pl 5，-CCCATGGGCTACGGTCGTAAGAAACG-3，(SEQ ID NO. 8)P2 5，-CGGGATCCTTATTAACGCAGTTCCCAC-3，(SEQ ID NO. 9)PCR反應體系Pl1 μ 1Ρ21 μ 1模板(OmpA-PTD-hEGF)O. 5μ 1(來源于實施例1中所述的連接后的pET_28a(+)載 體)2 X DNAMix10 μ 1Η207. 5μ 1總體系20 μ 1反應條件95 "C預變性 7min 72 °C7min
4 "C延伸⑴將pET_28a (+)載體和PCR片段分別用NcoI和BamHI進行雙酶切，用低熔點瓊脂糖 凝膠DNA回收試劑盒(購自天為時代公司)回收載體和目的基因片段。圖6是pET-28a(+) 載體用NcoI和BamHI雙酶切圖，回收5400bp左右基因片段。圖7是PCR片段用NcoI和 BamHI雙酶切圖，回收220bp左右的基因片段。在如下反應體系下將載體片段和目的基因片段連接。反應體系pET_28a(+)載體片段 Ιμ 目的基因片段PTD-hEGF 1μ 1Τ4 連接酶Ιμ 連接酶緩沖液Ιμ H2O6μ 1總的反應體系為10μ 1，于4°C連接過夜。將連接產物(即連接后的pET_28a(+)載體)轉化大腸桿菌DH5 α，并對其進行培 養(yǎng)。然后挑取單菌落，并對其進行PCR鑒定和DNA序列測定。從測序正確的大腸桿菌中提 取質粒以用于轉化BL21(DE3)大腸桿菌。本實施例中所用的各種酶以及相關菌種，其來源信息如下=NcoI和BamHI酶購于 賽百盛公司，pET_28a(+)載體購于Novagen公司，T4 Iigase購于Promega公司，DH5 α和 BL21 (DE3)菌種購于天為時代公司。一、工程菌的發(fā)酵1.種子菌培養(yǎng)甘油保存的菌種按1 %的接種量接入LB培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml卡那霉素)，于 25 37°C和200rpm下培養(yǎng)一天，再按0. 5%的接種量接入LB培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml卡那 霉素)，于25 37°C和200rpm下培養(yǎng)過夜。2.發(fā)酵及誘導表達將上步種子培養(yǎng)物按1 10%接入LB培養(yǎng)基，并于37°C和200rpm下開始培養(yǎng)。 當OD6tltl為1. O左右，加入終濃度為0. 1 1. OmM的IPTG誘導，繼續(xù)發(fā)酵3_5小時。之后停 止發(fā)酵，離心收集菌體并稱重。SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。3.包涵體的收集、洗滌和變性破碎菌體，將菌體用TE (Tris-HCl, ImMEDTA, pH7. O 9. 0)溶解加入適量PMSF和 TritonX-100，充分混勻后超聲破菌(超聲強度為70% X500赫茲，超聲時間30min)。在 12000rpm和4°C下離心30min，收集沉淀(圖8顯示了不同時間點包涵體表達情況，1,2,3泳 道分別是表達1，3，5小時的包涵體)。用尿素溶液(2M尿素，50mMTris-HCl，pH7. O 9. 0) 充分懸浮沉淀，并于12000rpm和4°C下離心30min，從而去除其它雜蛋白，以獲得較純的目 的蛋白沉淀。用變性溶液(8 IOM尿素，50mMTris-HCl，2mM EDTA pH7. 0 9. 0)溶解沉 淀包涵體(即所獲得的沉淀)，再加入IM DTT至終濃度20mM，室溫攪拌至全部溶解，然后于 12000rpm和4°C下離心30min，收集上清。二、稀釋復性1.制復性液(0. 5 2. 5M尿素，20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0，1 10%甘油，0. 1 5%甘氨酸，1. 5 2. 5mM氧化型谷胱甘肽，1 5mM還原型谷胱甘肽)。2.上步包涵體上清中滴加復性液充分混勻，直至剛要出現沉淀停止滴加，4°C放置 至少20小時。三、苯基疏水層析1.將上步溶液在12000rpm和4°C下離心30min，然后在上清中加入硫酸銨至終濃 度為2M，再于12000rpm和4°C下離心30min，以收集上清。2.將溶漲好的苯基疏水介質裝入層析柱，用溶液(1 5M硫酸銨，20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)平衡苯基疏水介質，將上一步得到的上清上樣，再用溶液 (0. 5 5M硫酸銨，20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)平衡苯基疏水介質至電導穩(wěn)定，用溶 液(50mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)洗脫，收集洗脫峰。3.透析上步收集的洗脫峰裝入透析袋，放入透析液(20 70mMTris-HClpH7. 0 9. 0)中 透析過夜。4. DEAE陰離子交換層析4. 1.用溶液(20 70mMTris-HCl ρΗ7· 0 9. 0)平衡 DEAE 陰離子介質。4. 2.透析液中加入一倍體積的溶液(20 70mMTris-HCl pH7 9. 0)，上樣。再用 溶液(20 70mMTris-HCl pH7. 0 9. 0)平衡,然后用溶液(20 70mMTris_HCl pH7. 0 9.0，0.5 2MNaCl)梯度洗脫，收集洗脫峰，即為目的蛋白樣品。將純化蛋白通過蛋白質印 跡鑒定，結果是完全正確的(見圖9，1是目的蛋白，2是陰性對照)。實施例5血腦屏障穿透活性將實施例3和4純化獲得的的PTD-hEGF和hEGF(購自Sigma，以下實施例與此相 同)按等摩爾數配制成溶液。對小鼠尾靜脈分別注射PTD-hEGF和hEGF，其中將注射生理鹽 水的小鼠作為對照。注射4h后引頸處死，取腦立即放入甲醛溶液中固定。組織切片、洗滌 和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、免疫組化分析均按常規(guī)方法進行，結果見附圖 10。尾靜脈注射PTD-hEGF的小鼠腦切片的組化實驗顯示很深的著色，而hEGF小鼠及 對照組切片著色淺。表明PTD-hEGF能夠穿越血腦屏障進入小鼠腦中，而hEGF未能進入腦 內。實施例6對AD模型鼠及自然老化鼠的治療作用(1)水迷宮實驗本實驗使用的水迷宮是中國醫(yī)學科學院藥物研究所生產的Morris水迷宮。實驗前將水槽灌以清水至預定的水池高度。實驗室溫度保持在23°C 25°C， Morris水槽中加入水(溫度調至23士 1°C )至高過安全平臺1cm，水溫保持在23士 1°C。將 站臺放置在水池的第II象限預定部位，作為老鼠入水后搜索的目標。將安裝好的攝像裝置 與計算機、監(jiān)視器及打印機連接。先打開計算機，再打開其它設備，開始實驗。每只老鼠每 天訓練2次。老鼠入水點在第I和IV象限。計算機自動記錄動物自入水到找到站臺所需 時間，作為潛伏期。老鼠爬上站臺后，讓老鼠在站臺上站立30s。如果老鼠在入水120s以內 未能找到水池中的站臺，可將老鼠放置于站臺上休息30s，之后再進行下一次訓練。共訓練 5天。將老鼠從入水至找到平臺的時間(即潛伏期)為定量標準來衡量其空間記憶能力。潛伏期小于120s為正常鼠。結果顯示，對AD模型小鼠和自然老化小鼠靜脈注射實施例3和4所純化獲得的 PTD-hEGF(hEGF凈含量4 40 μ g/只/天，連續(xù)5 10天)能顯著縮短其小鼠找到平臺 的時間(潛伏期)，且與AD模型組和自然老化未給藥組比較差異極為顯著(ρ <0.01)；而 hEGF組未能改善AD模型小鼠和自然老化小鼠的潛伏期，與AD模型組和未給藥自然老化鼠 比較無顯著性差異(P > 0. 05)(圖IlA和B)。同時，經直腸給予實施例3和4所純化獲得的PTD-hEGF (hEGF凈含量40 400 μ g/ 只/天，連續(xù)5 10天)也能顯著縮短AD模型小鼠和自然老化小鼠的潛伏期，且與AD模 型組和未給藥自然老化鼠相比差異極顯著(ρ < 0. 01)，而hEGF組未能改善AD模型小鼠和 自然老化小鼠的潛伏期，與AD模型組和未給藥自然老化鼠比較無顯著性差異(ρ > 0. 05)， (圖 IlC 和 D)。(2)穿梭箱實驗穿梭箱實驗的原理是動物接受刺激的同時給予蜂鳴音信號，通過反復刺激，動物 產生聲音條件反射，再聽到蜂鳴音，主動逃避刺激，比水迷宮實驗增加了中樞反應過程。本實驗采用了 10次循環(huán)，通過電擊時間或主動逃避時間來評價動物學習記憶和 反應能力。電擊時間短，主動逃避時間長，證明藥物有效，否則無效。結果顯示，實施例3和 4中所制備的PTD-hEGF無論是靜脈注射或直腸施用，也無論對AD模型小鼠或自然老化小鼠 均有明顯的治療作用，且與未給藥的AD模型小鼠或未給藥的自然老化小鼠相比差異均非 常顯著(P <0.01)，結果見附圖12。水迷宮實驗和穿梭箱實驗表明，PTD-hEGF能夠改善阿爾茲海默病(Alzheimer’ s disease,AD)模型鼠和自然老化鼠學習和記憶能力，對AD具有治療作用。對中樞神經系統 其它進行性退行性疾病也具有治療作用。實施例7神經干細胞實驗巢蛋白(Nestin)屬于第VI類中間絲蛋白，主要由胚胎期和成年的神經前體細胞 中一過性表達，在中樞神經系統各種損傷條件下，腦中反應性神經元又再現其表達。巢蛋 白是神經干細胞的特征性蛋白。實驗發(fā)現AD模型小鼠海馬齒狀回中的巢蛋白表達量(圖 13A)明顯低于正常小鼠(假手術腦室注射生理鹽水)(圖13C)，而PTD-hEGF(實施例3或 4中所制備的目的蛋白樣品)治療后能夠引起AD模型小鼠海馬齒狀回中Nestin表達量增 加(附圖13B)。神經纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞的特征蛋白。實驗發(fā)現AD模型小鼠海 馬齒狀回中GFAP表達量(圖14A)高于正常小鼠(圖14C)，PTD-hEGF (實施例3或4中所 制備的目的蛋白樣品)治療后，AD小鼠模型海馬齒狀回中GFAP的表達減少(附圖14B)。溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)作為胸苷類似物可摻入到新合成的DNA中，通過檢測Brdu 標記的細胞能定性及半定量地反映細胞的增殖狀態(tài)。實驗表明AD模型小鼠海馬齒狀回中 BrdU的參入量比正常小鼠減少(附圖15A)，而PTD-hEGF (實施例3或4中所制備的目的蛋 白樣品)治療能增加AD模型小鼠海馬齒狀回BrdU的參入量(附圖15B)。實施例8PET腦成像正常腦組織要維持其功能，消耗大量葡萄糖。F18標記的脫氧葡萄糖與葡萄糖分 子相似，亦可被腦組織利用，且其發(fā)射的熒光可在PET儀上顯示，故可作為作為耗糖量的標記化合物。正常腦熒光強度大，AD腦熒光強度小，治療有效時，強度又可增大。AD大鼠模型 尾靜脈注射PTD-hEGF (實施例3或4中所制備的目的蛋白樣品)，連續(xù)注射兩周。停藥4_7 天后用水迷宮法檢測治療效果。選取治療成功鼠及陰性對照(AD模型未給藥大鼠)進行 PET檢測。PET腦成像顯示，PTD-hEGF治療大鼠腦的亮區(qū)比未治療的AD模型鼠分布面積大 (圖16C)與假手術對照組接近(圖16D)，表明糖代謝反應活躍。而hEGF處理的AD模型大 鼠(圖16B)與AD模型大鼠(圖16A)接近，無明顯的改變善。另外，本發(fā)明的發(fā)明人通過對SEQ ID NO. 5中所示的氨基酸序列進行取代、缺失、 插入或添加一個或幾個氨基酸后所獲得氨基酸序列或具有相應的同一性氨基酸序列的活 性也進行了如實施例5和6的實驗，結果均證實了其相應的活性。在此，本申請的發(fā)明人示 例性從其中列舉了如下的SEQ ID NO. 5的突變體=SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 14。其對應的核苷酸序列分別為=SEQ ID NO. 11、SEQ IDN0. 13和SEQ ID NO. 15，因此， 也相當于例舉了本文中所述的嚴緊條件下與序列號6的核苷酸序列進行雜交或具有相應 的同一性、且編碼具有無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子活性的氨基酸序列的多核苷酸。雖然用上述實施方式描述了本發(fā)明，應當理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前 提下，本發(fā)明可進行進一步的修飾和變動，且這些修飾和變動均屬于本發(fā)明的保護范圍之 內。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所<120>無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子及其應用<130>IDC080126<160>15<170>PatentIn version 3.5<210>1
<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>PTD氨基酸序列<400>1Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1510<210>2<211>53<212>PRT<213>人工序列<220><223>人表皮生長因子氨基酸序列<400>2Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
13[0198151015[0199Asp Gly ValCysMet Tyr lie GluAla Leu AspLysTyr AlaCys Asn[0200202530[0201Cys Val ValGlyTyr lie Gly GluArg Cys GlnTyrArg AspLeu Lys[0202354045[0203Trp Trp GluLeuArg[020450[0205<210>3[0206<211>33[0207<212>DNA[0208<213>人工序列[0209<220>[0210<223>PTD 核酉髮序列[0211<400>3[0212tacggtcgta agaaacgtcg ccagcgtcgc cgt33[0213<210>4[0214<211>159[0215<212>DNA[0216<213>人工序列[0217<220>[0218<223>人表皮生長因子核酸序列[0219<400>4[0220aattccgact ctgaatgccc gctgtctcacgacggttact gcctacacga tggtgtttgc60[0221atgtatatcg aagctctgga caaatacgcgtgcaactgtg ttgttggtta catcggtgaa120[0222cgttgccagt accgtgacct gaaatggtgggaactgcgt159[0223<210>5[0224<211>64[0225<212>PRT[0226<213>E. Coli[0227<400>5[0228Tyr Gly ArgLysLys Arg Arg GlnArg Arg ArgAsnSer AspSer Glu[0229151015[0230Cys Pro LeuSerHis Asp Gly TyrCys Leu HisAspGly ValCys Met[0231202530[0232Tyr lie GluAlaLeu Asp Lys TyrAla Cys AsnCysVal ValGly Tyr[0233354045[0234lie Gly GluArgCys Gln Tyr ArgAsp Leu LysTrpTrp GluLeu Arg[0235505560[0236<210>6[0237<211>192[0238<212>DNA[0239<213>人工序列[0240<220>[0241<223>表皮生長因子的突變體的核苷酸序列[0242<400>6[0243tacggtcgta agaaacgtcg ccagcgtcgc cgtaattccg actctgaatgcccgctgtct60[0244cacgacggtt actgcctaca cgatggtgtt tgcatgtata tcgaagctctggacaaatac120[0245gcgtgcaact gtgttgttgg ttacatcggt gaacgttgcc agtaccgtgacctgaaatgg180[0246tgggaactgc gt192[0247<210>7[0248<211>60[0249<212>DNA[0250<213>人工序列[0251<220>[0252<223>0MPA 序列[0253<400>7[0254aaaaagacag ctatcgcgat tgcagtggca ctggctggtt tcgctaccgt agcgcaggcc 60[0255<210>8[0256<211>26[0257<212>DNA[0258<213>人工序列[0259<220>[0260<223>引物1[0261<400>8[0262cccatgggct acggtcgtaa gaaacg26[0263<210>9[0264<211>27[0265<212>DNA[0266<213>人工序列[0267<220>[0268<223>引物2[0269<400>9[0270cgggatcctt attaacgcag ttcccac27[0271<210>10[0272<211>53[0273<212>PRT[0274<213>人工序列[0275<220><223>突變體 <400>10
AsnSerAspSerGluSerProLeuSerHisAspGlyTyrSerLeuHis151015AspGlyValSer 20MetTyrlieGluAla 25LeuAspLysTyrAla 30SerAsnSerValValGlyTyrIleGlyGluArgSerGlnTyrArgAspLeuLys
35 Glu
40
45
Leu Arg
Trp Trp 50 <210>11 <211>159 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>突變體 <400>11
aattccgact ctgaatcgcc gctgtctcac atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg cgttcgcagt accgtgacct gaaatggtgg <210>12 <211>53 <212>PRT <213>人工序列 <220>
<223>突變體 <400>12
gacggttact cgctacacga tggtgtttcg 60 tcgaactcgg ttgttggtta catcggtgaa 120 gaactgcgt159
AsnSerAspSerGluAla ProLeuSerHisAspGlyTyrAlaLeuHis151015AspGlyValAlaMetTyr lieGluAlaLeuAspLysTyrAlaAlaAsn202530AlaValValGlyTyrlie GlyGluArgAlaGlnTyrArgAspLeuLys
35 Glu
40
45
Trp Trp 50 <210>13 <211>159 <212>DNA <213>人工序列
Leu Arg
10
CN
77
78
80
276 丨277 丨278 丨279 丨280 丨281 丨282 丨283
284
285
286
287
288
289
290
291
丨292 丨293 丨294 丨295 丨296 丨297 丨298 丨299 丨300 丨301 丨302 丨303 丨304 丨305 丨306 丨307
1308
1309
1310
1311
1312
1313
1314
[0 [0 [0 [0 [0 [0 [0282 [0283 [0284 [0285 [0286 [0287 [0288 [0289 [0290 [0291 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0； [0； [0； [0； [0； [0； [0； [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0<220>
<223>突變體 <400>13
aattccgact ctgaagctcc gctgtctcac gacggttacg ctctacacga tggtgttgct 60 atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg gctaacgctg ttgttggtta catcggtgaa 120 cgtgctcagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt159
<210>14 <211>47 <212>PRT <213>人工序列 <220>
<223>突變體 <400>14
Asn Ser Asp Ser Glu Pro 15
Val Met Tyr lie Glu Ala 20
lie Gly Glu Arg Gln Tyr 35
<210>15 <211>141 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>突變體 <400>15
aattccgact ctgaaccgct gaagctctgg acaaatacgc ctgaaatggt gggaactgcg
Leu Ser His Asp Gly Tyr Leu His Asp 1015
Leu Asp Lys Tyr Ala Asn Val Val Gly
2530
Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 4045
Gly Tyr
gtctcacgac ggttacctac acgatggtgt tatgtatatc 60 gaacgttgtt ggttacatcg gtgaacgtca gtaccgtgac 120 t141
5
6
7
8 9
[03 [03 [03
[03
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1權利要求
一種藥物組合物或藥物制劑，其包含無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子，或編碼所述無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子的核苷酸序列，其中所述無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子包含如下的序列a)SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列；或b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列；其中所述的核苷酸序列包含a)SEQ ID NO.6中所示的核苷酸序列；b)在嚴緊條件下與由序列號6的核苷酸序列進行雜交、且編碼具有無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或c)上述a)或b)的互補序列。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物或藥物制劑，其中所述無創(chuàng)性高穿透性表皮生長 因子為a)SEQ ID NO. 5中所示的氨基酸序列；或b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸且保留取代、 缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的藥物組合物或藥物制劑，其中所述核苷酸序列為a)SEQ ID NO. 6中所示的核苷酸序列；b)在嚴緊條件下與由序列號6的核苷酸序列進行雜交、且編碼具有無創(chuàng)性高穿透性表 皮生長因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或c)上述a)或b)的互補序列。
4.權利要求1-3中任一項中所述的藥物組合物或藥物制劑，其是適于注射、舌下含服、 肺吸入、鼻粘膜途徑、肛栓或皮膚吸收、滴眼液等形式施用的劑型。
5.權利要求1-3中任一項中所述的藥物組合物或藥物制劑，其進一步含有選自如下的 輔料粘合劑、崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、助流劑、乳化_增溶劑、甜味劑、包衣材料和抗菌防 腐劑，例如磺丁基- β -環(huán)糊精和聚乙二醇。
6.權利要求4中所述的藥物組合物或藥物制劑，其施用劑量為30mg無創(chuàng)性高穿透性表 皮生長因子/kg體重-35mg無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子/kg體重。
7.權利要求1-3中任一項中所定義的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子或其相應的核苷 酸序列在制備用于治療或預防神經退行性疾病的藥物中的用途。
8.權利要求7所述的用途，其中所述的神經退行性疾病為阿爾茲海默病、帕金森氏綜 合癥或黑質退行性病變。
9.權利要求1-3中任一項中所定義的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子或其相應的核苷 酸序列在制備用于神經干細胞增值的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子及其應用。具體而言，本發(fā)明涉及一種蛋白轉導肽融合人表皮生長因子活性片段的蛋白以及含有編碼所述片段的核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明涉及含有上述核酸分子的表達載體。本發(fā)明的無創(chuàng)性高穿透性表皮生長因子可治療病毒感染、特異性殺傷腫瘤細胞以及神經退行性疾病等。
文檔編號A61K38/18GK101897953SQ20091014377
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2009年5月27日
發(fā)明者孫曼霽, 李前, 趙寶全 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所