專(zhuān)利名稱(chēng)：一種納米粒子組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療癌癥的納米粒子組合物，特別是涉及表達(dá)人類(lèi)白 細(xì)胞介素-2細(xì)胞因子或者表達(dá)人類(lèi)干擾素α細(xì)胞因子的質(zhì)粒和納米聚陽(yáng)離子載體(Hl) 的納米粒子組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用生物制劑治療腫瘤的生物治療方案正在興起。與 化療相比較，對(duì)于晚期腫瘤患者來(lái)說(shuō)，生物治療是一種更具生理性、可耐受性和有效性。目 前，應(yīng)用最廣泛的腫瘤生物治療制劑是重組的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是一組低分子量的調(diào)節(jié) 蛋白，具有多效性、受體特異性和短暫性的功能特點(diǎn)，是免疫系統(tǒng)的信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。臨床和 實(shí)驗(yàn)資料已經(jīng)證實(shí)，多種細(xì)胞因子能刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，打破腫瘤引起的免疫耐受， 從而產(chǎn)生抗腫瘤效果。白細(xì)胞介素-2 (interleukin-2) IL-2是一個(gè)15000-kDa的α螺旋細(xì)胞因子，人類(lèi) IL-2基因定位于4號(hào)染色體4q^_q27，其蛋白編碼系列是由462個(gè)堿基組成mRNA。自1976 年，IL-2首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其生物學(xué)功能已經(jīng)被廣泛的研究。內(nèi)源性IL-2主要是由激活的 輔助T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。它和T細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，快速 而又短暫的激活T淋巴細(xì)胞，刺激其增殖和成熟，對(duì)T細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)具有關(guān)鍵性作 用。1980年后，隨著體外重組的IL-2細(xì)胞因子的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，它的抗腫瘤機(jī)制被進(jìn) 一步的闡明。這些包括刺激T細(xì)胞的增值、激活細(xì)胞殺傷T細(xì)胞，刺激自然殺傷細(xì)胞(NK) 細(xì)胞的增值和細(xì)胞殺傷活性，顯著增強(qiáng)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的免疫功能，能誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞LAK 細(xì)胞和激活腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)等等。這些使IL-2成為一個(gè)極有價(jià)值的抗腫瘤候 選藥物。1990年后，多種細(xì)胞因子，包括干擾素α (interferon-α)、IL-2、粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、IL-6、IL-12、IL-18等，被用于惡性黑色素瘤、腎癌患者 的臨床測(cè)試。其中，高劑量的IL-2和IFNa顯示了最好的抗腫瘤效果。據(jù)此，1998年美國(guó) 食物和藥物管理部批準(zhǔn)了高劑量的IL-2細(xì)胞因子和IFNa作為中、晚期惡性黑色素瘤或腎 癌患者的治療藥物。2004年隨訪的資料確認(rèn)，部分IL-2治療的惡性黑色素瘤患者產(chǎn)生持 續(xù)了臨床反應(yīng)(Atkins MB. Cytokine-based therapy and biochemotherapy foradvanced melanoma. Clin Cancer Res 2006 Apr 1 ；12(7Pt2) :2353s_2358s)。然而，不幸的是，由于細(xì)胞因子在體內(nèi)的半衰期很短，要達(dá)到治療效果需要大劑量 的重復(fù)注射IL-2細(xì)胞因子。例如，美國(guó)食物和藥物管理部批準(zhǔn)的使用IL-2細(xì)胞因子治療 晚期惡性黑色素瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是治療前5天和治療開(kāi)始后的15到19天，每位患者每 8小時(shí)接受一次靜脈推注60000到72000U/Kg的IL-2細(xì)胞因子。這種高劑量的IL-2治療 方案在病人身上產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒副作用，比如低血壓、毛細(xì)血管滲漏綜合癥，心肌炎，短暫 性腎功能不全和導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥等。為了克服這些直接注射細(xì)胞因子引起的毒副反應(yīng)，通過(guò)基因治療方法，傳遞編碼 IL-2細(xì)胞因子的基因到患者體內(nèi)，利用患者自身的細(xì)胞來(lái)持續(xù)、高效地合成、分泌IL-2細(xì)胞因子。既能減少反復(fù)高劑量注射引起的嚴(yán)重毒副反應(yīng)，同時(shí)又能達(dá)到抗腫瘤的目的。實(shí) 現(xiàn)這一設(shè)想主要包括兩方面的內(nèi)容。一是克隆治療基因的系列；二是高效、安全地傳遞治療 基因。1983年，Taniguchi等已經(jīng)克隆了編碼人類(lèi)IL-2的基因序列并且表達(dá)了具有生物活 性的IL-2細(xì)胞因子。因此，實(shí)現(xiàn)這一治療方案的關(guān)鍵在于研發(fā)一種靶向、安全、有效地傳遞 技術(shù)。目前傳遞治療基因的載體主要包括病毒和非病毒兩類(lèi)。一般來(lái)說(shuō)，病毒類(lèi)載體在 表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)空性方面比非病毒類(lèi)載體更優(yōu)越。以腺病毒(Adv)為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-2基因的 治療方案，已經(jīng)在多個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上顯示了良好的抗腫瘤效果。最近，Dummer等報(bào)道了 他們經(jīng)腫瘤內(nèi)注射表達(dá)IL-2基因的腺病毒治療多種晚期癌癥的I/II臨床測(cè)試結(jié)果。他們 發(fā)現(xiàn)，重復(fù)瘤內(nèi)注射腺病毒介導(dǎo)的IL-2顯示了 17%的目標(biāo)反應(yīng)(Dummer R, Rochlitz C， Velu T, Acres B, Limacher JM, Bleuzen P, et al. Intralesional adenovirus—mediated interleukin-2 gene transferfor advanced solid cancers and melanoma. Mol Ther 008 ；16 :985-94)。然而，由病毒載體表面蛋白引發(fā)的非期待的宿主免疫反應(yīng)和潛在的生物 安全性問(wèn)題一直限制著病毒載體的臨床應(yīng)用。這促使很多基因治療學(xué)家將目光轉(zhuǎn)移到非病 毒載體?；瘜W(xué)合成的非病毒載體主要包括正電子脂質(zhì)體和聚合物。他們具有非免疫原性、 相對(duì)安全、容易修飾、制作價(jià)格低、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。Galanis等報(bào)道，I/II期臨床測(cè)試中， 正電子脂質(zhì)體攜帶表達(dá)IL-2的質(zhì)粒通過(guò)瘤內(nèi)注射能治療惡性黑色素瘤。然而，目前所用的 非病毒載體的基因傳遞效率仍然低于腺病毒載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種納米粒子組合物，采用聚陽(yáng)離子載體，具有 低的毒性和高的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明還提出上述納米粒子組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用，尤其是在制備治療皮膚癌藥物中的應(yīng)用。在本申請(qǐng)文件中，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)基因的“同源序列”指與該基因具有至少75%的 核苷酸序列一致性，而且基本上不影響所編碼蛋白的功能?；虻耐葱蛄幸部梢允窃摶?因的片段，只要其編碼的蛋白功能基本沒(méi)有改變。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“預(yù)防或治療癌癥”指所用組合物可以預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，減 輕、緩解、控制、改善或治愈原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥或其相關(guān)的癥狀；也可以延長(zhǎng)癌癥患 者的壽命或活存時(shí)間，降低死亡率。本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)“氮/磷比”中的“氮”是指多聚陽(yáng)離子中含有的氨基分子數(shù)?！傲住?是指質(zhì)粒脫氧核糖核酸(DAN)中的磷酸根分子含量，常規(guī)來(lái)說(shuō)，Iug的質(zhì)粒DNA含有3nmol 的磷酸根。本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)pfu (plaque formation unit)為病毒感染滴度，是有感染性的 “活”的腺病毒的總量，即腺病毒的活性單位。測(cè)定方法是將腺病毒樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度稀 釋后，感染293細(xì)胞并培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞病變空斑數(shù)得到腺病毒樣品中PFU/ml值。發(fā)明人合成一種以環(huán)糊精為交聯(lián)骨架，連接低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)，偶合具 有腫瘤靶向特異性的小分子藥物葉酸的聚陽(yáng)離子載體(命名為HI)。Hl已經(jīng)被證明在液體 環(huán)境中能包裹、濃縮表達(dá)目的基因的質(zhì)粒成一種在100納米左右的納米顆粒。在多種腫瘤 細(xì)胞系，這種納米顆粒顯示了低毒、高效和靶向特異性的基因傳遞能力。尤其在小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10上，這種納米粒子顯示了高的轉(zhuǎn)染效率和低的毒性。在B16-F10細(xì)胞嫁接 的小鼠模型上，通過(guò)腫瘤內(nèi)注射，這種納米粒子顯示了比得上腺病毒載體的基因表達(dá)效率。 而且經(jīng)多次瘤內(nèi)注射，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。因此本發(fā)明的內(nèi)容包括一種納米粒子組合物，包括質(zhì)粒和載體；所述質(zhì)粒為表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞因子的質(zhì)粒，所 述載體為環(huán)糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽(yáng)離子載體，其結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1. 一種納米粒子組合物，其特征在于包括質(zhì)粒和載體；所述質(zhì)粒為表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞因 子的質(zhì)粒，所述載體為環(huán)糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽(yáng)離子載體，其結(jié)構(gòu)式為
2.如權(quán)利要求1所述的納米粒子組合物，其特征在于所述表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞因子質(zhì)粒為 表達(dá)人類(lèi)白細(xì)胞介素-2細(xì)胞因子的質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所述的納米粒子組合物，其特征在于所述表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞因子質(zhì)粒為 表達(dá)人類(lèi)干擾素α細(xì)胞因子的質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的納米粒子組合物的制備方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的質(zhì)粒；(2)構(gòu)建環(huán)糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽(yáng)離子載體；(3)將步驟(1)、(2)中得到的質(zhì)粒和載體分別溶解到2.5-5%的葡萄糖溶液中，再按照 5-40 1的氮/磷比將所得溶液混合，形成直徑在100納米左右的納米粒子組合物。
5.如權(quán)利要求4所述的納米粒子組合物的制備方法，其特征在于所述表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞 因子質(zhì)粒為表達(dá)人類(lèi)白細(xì)胞介素-2細(xì)胞因子的質(zhì)粒或者為表達(dá)人類(lèi)干擾素α細(xì)胞因子的 質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求1所述的納米粒子組合物在制備預(yù)防或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1所述的納米粒子組合物在制備預(yù)防或治療原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥 的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求2或3所述的納米粒子組合物在制備預(yù)防或治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多聚陽(yáng)離子(H1)載體和表達(dá)人類(lèi)白細(xì)胞介素-2質(zhì)粒自組裝成的納米粒子(H1/phIL2)及其在制備治療、控制或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述多聚陽(yáng)離子(H1)載體為環(huán)糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽(yáng)離子載體。
文檔編號(hào)A61K9/14GK102038958SQ20091011063
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者姚宏, 林李家宓 申請(qǐng)人:姚宏