專利名稱：：一種抗腫瘤藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物組合物，具體涉及一種主要用于非小細(xì)胞肺癌藥物治療聯(lián)合用藥的藥物組合物，也可用于黑素瘤、纖維素瘤、血管內(nèi)皮瘤、腎細(xì)胞癌等腫瘤治療的聯(lián)合用藥，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：1971年，F(xiàn)olkman首次提出"腫瘤依賴血管生成"的學(xué)說，即腫瘤細(xì)胞通過血管供應(yīng)方式獲得生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)血管也為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了通道。因此，抑制腫瘤新生血管形成可以成為治療腫瘤的一種新的方法(HainingTan等，/歷oc/ew2008)。血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)是1997年哈佛大學(xué)的，Reilly等發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)有力的血管新生抑制因子，其化學(xué)本質(zhì)上是膠原XVIII的一個(gè)片段，可以通過抑制腫瘤血管的生成從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且作為一種內(nèi)源物質(zhì)，幾乎沒有毒副作用和藥物抵抗作用(O'ReillyMS等，Ce//1997;88(2),277-285)。ThomasBoehm等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，血管內(nèi)皮抑素可以抑制小鼠肺癌，纖維肉瘤和黑色素瘤的生長(zhǎng)甚至消除了腫瘤(ThomasBoehm等，Nature,1997;3卯(27)，404-407)。2000年，羅永章教授更改了其血管內(nèi)皮抑素上的七個(gè)氨基酸序列，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，使其成為臨床藥物成為可能。這種重組血管內(nèi)皮抑素(即恩度)己開發(fā)為一種新的抗腫瘤藥物，正處于臨床II期試驗(yàn)階段，但是作為一種蛋白質(zhì)藥物，其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性嚴(yán)重影響了其療效。人體生理環(huán)境中的一些不穩(wěn)定因素(如局部過酸，尿素濃度增加等)會(huì)造成血管內(nèi)皮抑素的變性及聚集，而影響其生物功能。由于其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性和較短的半衰期，需要較高的劑量才能達(dá)到和維持臨床療效，且價(jià)格昂貴，這些都限制了血管內(nèi)皮抑素的大規(guī)模臨床應(yīng)用。設(shè)法緩解血管內(nèi)皮抑素的變性反應(yīng)，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并提高其臨床療效具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗腫瘤藥物組合物，該組合物配方合理，體內(nèi)穩(wěn)定性高，療效顯著。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種抗腫瘤藥物組合物，該組合物是將4080份規(guī)格為5mg/3ml的恩度注射液和20~60份甘油混勻，于低溫離心機(jī)中在4'C室溫條件下以1000~5000轉(zhuǎn)/秒充分離心，取上清液所得到，該組合物pH值為5.5±0.5。所述腫瘤為非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、纖維素瘤和血管內(nèi)皮瘤。重組人血管內(nèi)皮抑素是一種球蛋白，它的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)a螺旋結(jié)構(gòu)，而且有兩對(duì)二硫鍵，這兩對(duì)二硫鍵對(duì)穩(wěn)定它的空間構(gòu)象起著至關(guān)重要的作用。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)甘油能夠保護(hù)重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性、保護(hù)其生物學(xué)活性，此外，甘油作為一種多元醇并不影響溶液的pH值和介電常數(shù)。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果1.本發(fā)明的抗腫瘤藥物組合物能有效地提高有效成分的穩(wěn)定性，使之能在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下仍然具有生物學(xué)活性。通過熒光淬滅光譜分析和圓二色光譜分析(圖l和圖2)，抗腫瘤組合物與恩度相比，能在更酸的環(huán)境下保護(hù)有效成分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象。通過流式細(xì)胞儀分析，抗腫瘤藥物組合物比恩度能在更酸的條件下保護(hù)有效成分蛋白的生物學(xué)活性。2.本發(fā)明的藥物組合物能有效提高藥物的抗腫瘤效應(yīng)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，注射抗腫瘤藥物組合物組和單純恩度組的荷瘤鼠的腫瘤體積與對(duì)照組相比都有顯著降低；抗腫瘤藥物組合物組和單純恩度組相比，給藥21天后腫瘤體積減小有顯著性差異(P<0.05)，說明本發(fā)明藥物組合物能更有效的減小荷瘤鼠的腫瘤體積。圖l-A為恩度的有效成分蛋白的酸滴定熒光光譜圖，其中，曲線1~8分別代表pH濃度為l.O、1.5、2.0、2.5、3.5、4.0、4.5、5.5時(shí)所得光譜;圖l-B為實(shí)施例2抗腫瘤藥物組合物的有效成分蛋白的酸滴定熒光光譜圖，其中，曲線18分別代表pH濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、4.0、4.5、5.5時(shí)所得光譜；圖l-C為實(shí)施例3抗腫瘤藥物組合物的有效成分蛋白的酸滴定熒光光譜圖，其中，曲線17分別代表pH濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、5.5時(shí)所得光譜；圖l-D為恩度與實(shí)施例2抗腫瘤藥物組合物的參數(shù)A對(duì)比分析圖，參數(shù)A代表365tim處的熒光強(qiáng)度與320nm處的熒光強(qiáng)度的比值(其中pH5.5處恩度的參數(shù)A的值設(shè)定為l)，其值能反映蛋白的構(gòu)象變化程度。圖2-A為恩度的有效成分蛋白的酸滴定圓二色光譜圖，其中，曲線110分別4代表pH濃度為l.O、1.5、2.0、2.5、3,0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)所得光譜;圖2-B為實(shí)施例2抗腫瘤藥物組合物的有效成分蛋白的酸滴定圓二色光譜圖，其中，曲線110分別代表pH濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)所得光譜；圖2-C為實(shí)施例3抗腫瘤藥物組合物的有效成分蛋白的酸滴定圓二色光譜圖，其中，曲線110分別代表pH濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)所得光譜；圖2-D為恩度與實(shí)施例2抗腫瘤藥物組合物的酸滴定圓二色光譜曲線峰值參數(shù)對(duì)比圖3-A為恩度對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果圖3-B為實(shí)施例2抗腫瘤藥物組合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果圖；圖3-C為實(shí)施例3抗腫瘤藥物組合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)步驟中采用恩度注射液的規(guī)格均為5mg/3ml，甘油型號(hào)為SAK33-GA-99.5，含量為99.5%以上。實(shí)施例1取甘油1.6ml于離心管內(nèi)，吸取0.4ml恩度注射液加入甘油中，反復(fù)抽吸十次混勻，于4。C低溫離心機(jī)中以2000轉(zhuǎn)/秒離心IO分鐘，取上清液，即得到抗腫瘤藥物組合物。實(shí)施例2~5的制備方法均與實(shí)施例1相似，是將恩度注射液與甘油按比例(其體積配比用量見表1)混勻后，于低溫離心機(jī)中在4。C室溫條件下以1000~5000轉(zhuǎn)/秒充分離心，取上清液即得到抗腫瘤藥物組合物。表l.實(shí)施例2~5中各組分體積配比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>采用實(shí)施例2和3制備的抗腫瘤藥物組合物進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)1.抗腫瘤藥物組合物活性蛋白結(jié)構(gòu)變化將恩度注射液(以下均簡(jiǎn)稱為恩度)和實(shí)施例2、3制備的抗腫瘤藥物組合物加入pH為l.O、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的緩沖液中,有效蛋白的終濃度為0.6pM，在24'C條件下作用2小時(shí)以上，再使用熒光光譜分析儀測(cè)定了不同pH條件下恩度中活性蛋白結(jié)構(gòu)和抗腫瘤藥物組合物活性蛋白結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見圖1-A、l-B、l-C和l-D。另外還使用了遠(yuǎn)紫外圓二色光譜法測(cè)定了不同pH條件下恩度和抗腫瘤藥物組合物中活性蛋白結(jié)構(gòu)變化，使用的有效蛋白終濃度均為2.3pM，結(jié)果見圖2-A、2-B、2-C和2-D。從上述熒光光譜中可以發(fā)現(xiàn)與恩度相比，抗腫瘤藥物組合物的有效成分蛋白能夠在更低的pH環(huán)境下維持其空間構(gòu)象。從上述圓二色光譜中可以發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物組合物比恩度能在更低的pH環(huán)境中維持有效成分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以上分析從不同方面均說明抗腫瘤藥物組合物比恩度具有更好的穩(wěn)定性。2.抗腫瘤藥物組合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響常規(guī)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)，分別用有效成分濃度為1、6、11^M的恩度和有效成分濃度為l、6、11^M的實(shí)施例2所得抗腫瘤藥物組合物處理，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)作用，用酶標(biāo)儀分析細(xì)胞增殖的抑制率，其結(jié)果見表2(組l、2、3對(duì)應(yīng)的有效成分濃度分別為1、6、llpM)。表2.抗腫瘤藥物組合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>抗腫瘤藥物組合物和恩度的作用機(jī)制主要是通過抑制形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移來達(dá)到抑制腫瘤新生血管的生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給，從而達(dá)到抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移目的。表2中的結(jié)果表明，隨著濃度的升高，抗腫瘤藥物組合物與恩度抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力均提高，但在相同濃度條件下，抗腫瘤藥物組合物與恩度相比能更有效的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(P<0.05)。3.抗腫瘤藥物組合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響常規(guī)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)，用有效成分濃度為5pM的恩度、5pM實(shí)施例2所得抗腫瘤藥物組合物和5pM實(shí)施例3所得抗腫瘤藥物組合物處理，作用24小時(shí)后，經(jīng)過PI單染，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見圖3-A、3-B和3-C，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞凋亡率分別為7.0%、14.1%和13.9%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同濃度下抗腫瘤藥物組合物比恩度能更有效的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞，說明抗腫瘤藥物組合物具有更有效的生物學(xué)功能。4.抗腫瘤藥物組合物對(duì)荷瘤鼠腫瘤大小的影響將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株注入黑色Lewis小鼠皮下誘導(dǎo)成瘤，待皮下瘤體積約10mmX10mmX10mm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為三組，每組10只。分別按照20mg/kg的劑量注射恩度和實(shí)施例2所得抗腫瘤藥物組合物，注射部位遠(yuǎn)離腫瘤形成部位，對(duì)照組以同樣方法每日注射生理鹽水.每日測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度和寬度，連續(xù)注射21天。第21天處死小鼠，取下腫瘤，測(cè)量腫瘤的體積大小，結(jié)果見表3。表3.抗腫瘤藥物組合物對(duì)荷瘤鼠腫瘤大小的影響(n=10)分組給藥前腫瘤體積(mm3)給藥21天后腫瘤體積(mm3)單純恩度組99498抗腫瘤藥物組合物組99046生理鹽水組(對(duì)照)9871680由表3可以看出，與對(duì)照組相比，注射抗腫瘤藥物組合物組和單純恩度組的荷瘤鼠的腫瘤體積均有顯著降低，抗腫瘤藥物組合物組與單純恩度組相比給藥21天后腫瘤體積減小有顯著性差異(P<0.05)，以上結(jié)果表明抗腫瘤藥物組合物能更有效的減小荷瘤鼠的腫瘤體積。綜上所述，本發(fā)明的抗腫瘤藥物組合物能有效的保護(hù)有效成分重組人血管內(nèi)皮抑素的分子結(jié)構(gòu)，并且通過細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該抗腫瘤藥物組合物具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和抑制小鼠體內(nèi)瘤塊的生長(zhǎng)，并且比恩度具有更顯效的抑瘤功能。權(quán)利要求1.一種抗腫瘤藥物組合物，其特征在于該組合物是將40～80份規(guī)格為5mg/3ml的恩度注射液和20～60份甘油混勻，于低溫離心機(jī)中在4℃～室溫條件下以1000～5000轉(zhuǎn)/秒充分離心，取上清液所得到，該組合物pH值為5.5±0.5。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于所述腫瘤為非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、纖維素瘤和血管內(nèi)皮瘤。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗腫瘤藥物組合物，該組合物是將規(guī)格為5mg/3ml的恩度注射液40～80份和甘油20～60份混勻，于低溫離心機(jī)中在4℃～室溫條件下以1000～5000轉(zhuǎn)/秒充分離心，取上清液所得到，該組合物pH值為5.5±0.5。該藥物組合物能顯著提高有效成分的穩(wěn)定性和抗腫瘤效應(yīng)，具有增強(qiáng)藥物療效，減少副作用等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)A61K38/17GK101642560SQ200910063690公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年8月24日優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日發(fā)明者純徐,芳楊,楊瑞莉,肖秀鳳,蕾魏申請(qǐng)人:武漢大學(xué)