專利名稱：：具有抗腫瘤活性的2,3,4,7,8-多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶衍生物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一類具有抗腫瘤活性的2，3，4，7，8—多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶衍生物。
背景技術：
：吡啶并[4，3-d]嘧啶類化合物是近年來國內外研究得非常熱門的一類雜環(huán)化合物。該類化合物既具有醫(yī)藥活性又具有農藥活性，特別是在醫(yī)藥研究方面顯示了廣泛的生理和藥理活性，可用于治療各種類型的腫瘤，癌癥，白血病，艾滋病及許多神經性疾病，另外亦可用于止痛、消炎、抗過敏等保健性醫(yī)療方面。我們在前期工作中研究發(fā)明了具有通式I的新穎的吡啶并[4,3-d]嘧啶類化合物合成方法，研究發(fā)現(xiàn)該類化合物具有良好的殺菌或除草活性，可作為殺菌劑或除草劑的先導體。如利用氮雜維悌希反應合成具有通式1-1的化合物，生物活性測試表明其具有良好的殺菌活性(中國發(fā)明專利具有殺菌活性的噻吩并[3'，2',5,6]吡啶并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮及制備，專利號CN1727343A，申請?zhí)?00510019153.1);通式1-2的化合物可經由中間體醚脒合成得到，生物活性測試結果表明其具有優(yōu)良的殺菌和除草活性(中國發(fā)明專利一類具有殺菌除草活性的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶及制備，ZL200510019576.3;以及中國發(fā)明專利:具有殺菌活性的2，3,4，7—多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶衍生物及制備，申請?zhí)?00810047941,5)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>本發(fā)明通過對前期合成的具有通式I的化合物進行細胞毒性試驗，研究其抗腫瘤活性以及可能的作用靶點，以期擴展該類化合物在醫(yī)藥領域的應用范圍。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于探索具有通式I的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物在抗腫瘤活性方面的應用。本發(fā)明的一類多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶衍生物的結構通式如I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式I中，R表示d-C2的垸基，苯基或取代苯基，苯基d-C4烷基或取代苯基d-C4垸基，所涉及的苯環(huán)上的取代基主要為鹵素、d-C3的垸基或垸氧基，取代基在苯環(huán)任一位置上的單取代或多取代，在苯環(huán)上的取代基相同或不相同；R'表示H;六氫吡啶基，嗎啡啉基，苯氧基或取代苯氧基，單取代或雙取代烷氨基，烷氨基上的取代基主要為CrC6的烷基，芐基或取代芐基，苯乙基或者取代苯乙基；所涉及的苯環(huán)上的取代基主要為鹵素、垸基或烷氧基，取代基在苯環(huán)任一位置上單取代；X表示CN時，Y表示直鏈垸硫基或芳垸硫基，其中芳基指苯基，烷基指d-C2的烷基；或X、Y共同表示2，3—一甲基噻吩或六氫吡啶[b]噻吩；Z表示O，亞甲基；其中，通式I涵蓋了如下通式1-1、通式I-2所示兩類化合物；通式I-1中的R'和通式I中的含義相同；R表示苯基或取代苯基，所涉及的苯環(huán)上的取代基主要為鹵素、C-C3的垸基或烷氧基，取代基在苯環(huán)任一位置上的單取代或多取代，在苯環(huán)上的取代基相同或不相同；當X表示CN時，Y僅表示甲硫基；或X、Y共同表示2，3—二甲基噻吩或六氫吡啶[b]噻吩；通式1-2中的R和通式I中的含義相同；Y表示直鏈烷硫基或芳烷硫基，其中烷基指d-C2的烷基，芳基指苯基。本發(fā)明人試驗表明具有結構通式I的化合物對人口腔底癌細胞KB、對長春新堿耐藥的人口腔底癌細胞KBv200、人乳腺癌細胞株MCF-7、對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株MCF-7/Adr、人肺癌細胞株SW1573、對阿霉素耐藥的人腫癌細胞株SW1573/2R12、人肝癌細胞株H印G2、人卵巢癌細胞株0VCAR3和人結腸癌細胞株LoVo等多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，可用作抗腫瘤藥劑的有效成分?？膳c任何一種藥劑學上所述的輔料混合制成的任何一種藥劑學上所說的劑型，用于治療腫瘤病癥。所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作為對于人口腔底癌細胞株KB具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作為對于對常春新堿耐藥的人口腔底癌細胞KBv200具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作為對于人肝癌細胞株HepG2具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式1-1、I-2表示的化合物可作為對于人卵巢癌細胞株OVCAR3具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式I-1、1-2表示的化合物可作為對于對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株5MCF-7/Adr具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式1-1表示的化合物可作為對于人肺癌細胞株SW1573具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式1-1表示的化合物可作為對于對阿霉素耐藥的人肺癌細胞株SW1573/2R120具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式1-2表示的化合物可作為對于人結腸癌細胞株LoVo具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。所述的以通式1-2表示的化合物可作為對于人乳腺癌細胞株MCF-7具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。圖1是化合物89對KB細胞的裸鼠移植瘤模型體內抗腫瘤結果其結果表明，化合物89具有明顯的體內抗腫瘤活性。圖2是化合物89對EGFR酪氨酸激酶磷酸化及其下游信號通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用其結果表明，化合物89明顯抑制了EGFR酪氨酸激酶磷酸化，對下游信號通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化也具有顯著抑制作用。具體實施例方式下面通過部分實例來具體地說明本發(fā)明的式I化合物的制備方法，這些實施例僅對本發(fā)明進行說明，而不是對本發(fā)明進行限制。更多實例請參考中國發(fā)明專利具有殺菌活性的噻吩并[3',2':5,6]吡啶并[4，3-d]嘧啶-4(3H)-酮及制備，專利號CN1727343A;—類具有殺菌除草活性的多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶及制備，專利號ZL200510019576.3;以及具有殺菌活性的2，3,4，7—多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物及制備，申請?zhí)?00810047941.5。實施例l化合物82-正丁胺基-3-對氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-S-氰基-3,4-二氫吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制備在100毫升三口瓶中加入IO毫摩爾2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升乙醇，IO毫摩爾三苯基膦，保持溫度在O'C以下逐滴加入IO毫摩爾六氯乙烷，滴加完畢后固體消失溶液變澄清，逐滴滴加IO毫摩爾三乙胺，滴加完畢出現(xiàn)大量固體，室溫攪拌12小時后，大部分固體消失，所得反應液脫溶除掉大部分溶劑,再加入無水乙醇與水重結晶，得到白色固體即膦亞胺，熔點為153~155°C，收率為75.6%。'H麵R(400MHzCDC13)5(ppm):1.09(t,J-7.2Hz,3H,CH3),2.37(s,3H,SCH3),2.51(s,3H,CH3),3.95(q,J=7.2Hz,2H,CH2)，4.46(s,1H，NH),7.447.71(m,15H，Ph-H)。在反應瓶中加入1.0毫摩爾膦亞胺和15毫升無水二氯甲垸，通氬氣5分鐘以趕凈空氣，室溫快速加入1.1毫摩爾對氟苯基異氰酸酯，靜置反應20小時。向反應液中加入1.2毫摩爾正丁胺，靜置反應6~8小時后脫去溶劑，向殘余物中加入25毫升無水乙醇和催化量的乙醇鈉，室溫反應1.5小時，有大量固體析出，過濾后用二氯甲垸和石油醚重結晶得純品白色固體，收率65%,m.p.〉280°C?；衔飈，2，4，5，6，9按照化合物8類似的的方法制備。實施例2化合物102-異丁胺基-3-對氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3,4-二氫吡啶并[4,3-d]嘧啶-4-酮制備在100毫升三口瓶中加入10毫摩爾2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升丙酮，30毫摩爾三苯基膦，保持溫度在0。C以下逐滴加入30毫摩爾六氯乙烷，滴加完畢后固體消失溶液變澄清，逐滴滴加60毫摩爾三乙胺，滴加完畢出現(xiàn)大量固體，室溫攪拌20小時后，大部分固體消失，所得反應液脫溶除掉大部分溶劑,再加入無水乙醇與水重結晶，得到白色固體即膦亞胺。在反應瓶中加入1.0毫摩爾膦亞胺和15毫升無水二氯甲烷，通氬氣5分鐘以趕凈空氣，室溫快速加入1.5毫摩爾對氟苯基異氰酸酯，靜置反應12小時。向反應液中加入1.5毫摩爾異丁胺，靜置反應6~8小時后脫去溶劑，向殘余物中加入25毫升無水乙醇和催化量的乙醇鈉，室溫反應2小時，有大量固體析出，過濾后用二氯甲垸和石油醚重結晶得純品。所得純品為白色固體，收率71%,m.p.>280°C.化合物12，13，14，15，16，17按照化合物IO類似的的方法制備。實施例3化合物72-正丙胺基-3-對氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氫吡啶并[4,3-d]嘧啶-4-酮制備在100毫升三口瓶中加入10毫摩爾2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升二氯甲垸，20毫摩爾三苯基膦，保持溫度在0'C以下逐滴加入30毫摩爾六氯乙垸，滴加完畢后固體消失溶液變澄清，逐滴滴加30毫摩爾三乙胺，滴加完畢出現(xiàn)大量固體，室溫攪拌24小時后，大部分固體消失，所得反應液脫溶除掉大部分溶劑,再加入無水乙醇與水重結晶，得到白色固體即膦亞胺。在反應瓶中加入1.0亳摩爾膦亞胺和15毫升無水二氯甲烷，通氬氣5分鐘以趕凈空氣，室溫快速加入1.2毫摩爾對氟苯基異氰酸酯，靜置反應16小時。向反應液中加入1.2毫摩爾正丙胺，靜置反應6~8小時后脫去溶劑，向殘余物中加入25毫升無水乙醇和催化量的乙醇鈉，室溫反應3小時，有大量固體析出，過濾后用二氯甲烷和石油醚重結晶得純品為白色固體，收率55°/。，m.p.270.5~272.0°C?；衔?8,19，20，21，22，23,24，25按照化合物7類似的的方法制備。2-二異丙胺基-3-對氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氫吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制備在100毫升三口瓶中加入10毫摩爾2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升二氯甲烷30毫摩爾三苯基膦，保持溫度在5'C以下逐滴加入30毫摩爾六氯乙烷，滴加完畢后固體消失溶液變澄清，逐滴滴加60毫摩爾三乙胺，滴加完畢出現(xiàn)大量固體，室溫攪拌24小時后，大部分固體消失，所得反應液脫溶除掉大部分溶劑,再加入無水乙醇與水重結晶，得到白色固體即膦亞胺。在反應瓶中加入1.0毫摩爾膦亞胺和15毫升無水二氯甲垸，通氬氣5分鐘以趕凈空氣，室溫快速加入1.1毫摩爾對氟苯基異氰酸酯，靜置反應24小時。向反應液中加入1.2毫摩爾二異丙胺，靜置反應68小時后脫去溶劑，向殘余物中加入25毫升無水乙醇和催化量實施例4化合物3的乙醇鈉，室溫反應3小時，有大量固體析出，過濾后用二氯甲烷和石油醚重結晶得純品白色固體，收率66%，m.p.241.0~243.0°C。化合物26，27，28，29，30,31，32，33按照化合物3類似的的方法制備。實施例5化合物112-六氫吡啶基-3-對氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3,4-二氫吡啶并[4,3-d]嘧啶-4-酮制備在100毫升三口瓶中加入10毫摩爾2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升二氯甲垸20毫摩爾三苯基膦，保持溫度在i(rc以下逐滴加入20毫摩爾六氯乙烷，滴加完畢后固體消失溶液變澄清，逐滴滴加40毫摩爾三乙胺，滴加完畢出現(xiàn)大量固體，室溫攪拌48小時后，大部分固體消失，所得反應液脫溶除掉大部分溶劑,再加入無水乙醇與水重結晶，得到白色固體即膦亞胺。在反應瓶中加入1.0毫摩爾膦亞胺和15毫升無水二氯甲垸，通氬氣5分鐘以趕凈空氣，室溫快速加入1.3毫摩爾對氟苯基異氰酸酯，靜置反應18小時。向反應液中加入l.l毫摩爾六氫吡啶，靜置反應68小時后脫去溶劑，向殘余物中加入25毫升無水乙醇和催化量的乙醇鈉，室溫反應3小時，有大量固體析出，過濾后用二氯甲烷和石油醚重結晶得純品白色固體，收率32%，熔點216.0~217.0°C。化合物34，35，36，37，38，39，40，41按照化合物11類似的的方法制備。實施例6化合物422-對甲苯氧基-3-對氟苯基-5,8,9-三甲基-噻吩并[3',2':5，6]吡啶并[4,3-d]嘧啶-4-酮在干燥圓底燒瓶中，加入2毫摩爾膦亞胺，再加入IO毫升DMSO(二甲基亞砜)溶解，逐滴加入對氯苯基異氰酸酯1.7毫摩爾，在5(TC以下反應5小時后，加入1.7毫摩爾4-溴苯酚，再加入20毫升乙腈與0.3毫摩爾固體碳酸鉀，在3(TC以F，攪拌反應4小時，減壓除去乙腈，殘余物用DMS0/H20重結品，得純品白色固體，收率78%，熔點.254.7~255.3。C。化合物4347，6480按照化合物42類似的方法制備。2-正丁氨基-3-苯基-5-甲基-4H-8，9，10，11一四氫苯并[4',5']噻吩并[3'，2':5,6]吡啶并[4,3-d]嘧啶-4-酮在干燥圓底燒瓶中，加入l毫摩爾膦亞胺，再加入15毫升無水二氯乙烷溶解，逐滴加入苯基異氰酸酯l.l毫摩爾，在1(TC以下靜置6小時后，再加入l.l毫摩爾正丙胺，攪拌反應l小時，反應完全之后，在減壓下脫去大部分溶劑，再加入15毫升無水乙醇與0.6毫摩爾醇鈉溶液，在15。C以下，攪拌反應12小時，有沉淀析出，過濾，用二氯乙垸/石油醚重結晶，所得純品為淺黃色固體，產率為72%，熔點233.6233.7'C。化合物4963按照化合物42類似的方法制備。采用上述類似的方法，可以制備通式I-1其他的化合物。表l-l，l-2中所列的為本發(fā)明實施例7化合物48合成的通式I-1部分化合物。表中省略的符號的含義Me-甲基Ph-苯基allyl—烯丙基Imidazole-咪唑基R11-1表1-1已合成的部分化合物化合XYRR1化合XYRR11CNSMe4-FPh/~\ON—\_/21CNSMePh4-FPhCH2NH2CNSMe4-PThN(C2H5)222CNSMePh2-MePhCH2NH3CNSMe4-FPhN(C3H7)223CNSMePh3-MePhCH2NH4CNSMe4-FPhN—-C3H7)224CNSMePh4-MePhCH2NHCNSMe4-FPhN(C4H9)225CNSMePh4-MeOPhCH2NH6CNSMe4-FPhN(C5H)226CNSMePh3-MeOPhCH2CH2NH7CNSMe4-FPhCH3(CH2)2NH27CNSMePh4-MePhCH2CH2NH8CNSMe4-FPhCH3(CH2)3NH28CNSMePh4-ClPhCH2CH2NH9CNSMe4-FPhfert-CH3(CH2)3NH29CNSMePh4-FPhCH2CH2NH10CNSMe4-FPh加-CH3(CH2)3NH30CNSMePhPhCH2CH2CH2NH11CNSMe4-FPh<^~31CNSMePhPhCH2CH2NH12CNSMe4-FPhCH3(CH2)4NH32CNSMePhPhCH(CH3)NH13CNSMe4-FPhCH3(CH2)5NH33CNSMePhiso-CH3(CH2)2NH14CNSMe4-FPhCyclohexaneamin34CNSMePhN(C2H5)215CNSMe4-FPhN(C6HI3)235CNSMePhN(C3H7)216CNSMe4-FPhallylamine36CNSMePhN—-C3H7)217CNSMePh2-ClPhCH2NH37CNSMePhN(C4H9)218CNSMePh4-ClPhCH2NH38CNSMe4-ClPhOC2H519CNSMePh2-FPhCH2NH39CNSMe4-ClPhCH3(CH2)2NH20CNSMePh3-FPhCH2NH40CNSMe4-ClPhCH3(CH2)3NH41CNSMe4-ClPhN(C3H7)2表1-2已合成的部分化合物11化合XYRR1化合XYRR142H3C人S,4-FPh4-甲基苯氧基61Ph4硝基苯氧基43H3C人sZ4-FPh2-硝基苯氧基62Ph3，5-二氟苯氧基44H3C人sZ4-FPh2-甲基苯氧基63Ph對甲氧苯氧基45H3C人S"^4-FPh3-甲基苯氧基64H3C人s"^PhN(C4H9)246H3C人sZ4-FPh2氯4-氟苯氧基65h3c人sZ4-ClPh2-MePhO47H3C,H3C人S乂4-MePh正丁胺基66H3C人sZ4-ClPhC3"^~~NH48Ph正丁胺基674-ClPh^~^N一49Ph正丙胺基68H:jC人sZ4-ClPh/~\0N—\_/50Ph4氯3-甲苯氧基69H;JC人SZ4-ClPhImidazole51Ph4-溴苯氧基70H3C人s^"4-FPhN(C3H6)252Ph2氯5-甲苯氧基71h3c人s^4-FPh4-氯苯氧基53Ph2,4-二氟苯氧基72H3C人s,4-FPh2,4-二氯苯氧基54Ph苯氧基734-FPh2墨ClPhO55Ph對甲苯氧基74H3C入s"^4-FPhPentaClPhO56Ph3-氟苯氧基75H;jC人sZ4-MePhNH(CH2)2CH357Ph3氯4氟苯氧基76H3C人sZ4-MePhNHC(CH3)358Ph3-甲基苯氧基77H;jC人sZ4-FPhCH3(CH2)2NH59Ph4氯苯氧基784-FPhN(C4H9)260Ph2氯4氟苯氧基794-FPh(CH3)2CHNH80H3C人sZ4-MePhCH3(CH2)3NH實施例8化合物813-正丙基-5-甲基-4-亞甲基-7-甲硫基-3,4-二氫-卩比啶[4,3-d]并嘧啶-8-腈的制備N》N-CH2CH2CH3將15毫摩爾2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺加入到50毫升的反應瓶中，用20毫升二氯甲烷溶解，加入5毫摩爾原甲酸三乙酯，在0'C反應25小時，反應完全后減壓蒸出沒有反應的原甲酸三乙酯和溶劑，殘余物減壓柱層析得白色晶體吡啶醚脒，熔點16,5-16°C，產率65.6%。MS(m/z，%):277(M+，63.21),199(31.34),183(22.45),152(27.81),77(100)。將2毫摩爾2-甲基-3-乙?；?5-氰基-6-甲硫基吡啶-4-亞胺甲叉基乙基醚、15亳升無水乙醇加入到50毫升的反應瓶中，加入3毫摩爾正丙胺，在20'C攪拌反應12小時，析出白色固體，過濾，乙醇重結晶，得到白色晶體，收率為69%。m.p.147~148。C?；衔?2105按照化合物81類似的方法制備。實施例9化合物1083-(3-氟芐基)-5-甲基-4-亞甲基-7-乙硫基-3,4-二氫吡啶幷[4,3-d]嘧啶-8-腈制備將]5毫摩爾2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-乙硫基-4-吡啶胺加入至ij50毫升的反應瓶中，加入45毫摩爾原甲酸三乙酯，加入催化量對甲苯磺酸，在13(TC反應12小時，反應完全后減壓蒸出沒有反應的原甲酸三乙酯，殘余物減壓柱層析得白色晶體吡啶醚脒。將1毫摩爾2-甲基-3-乙?；?5-氰基-6-乙硫基吡啶-4-亞胺甲叉基乙基醚、15毫升乙腈加入到50毫升的反應瓶中，加入2毫摩爾2—氟芐胺水溶液，加熱到405(TC反應2小時，析出固體，抽濾，丙酮與石油醚混合溶劑重結晶，所得純品為白色固體，收率為49%。m.p.145.1~146.1。C?；衔?06，107，109112按照化合物81類似的方法制備。實施例10化合物1133-乙基-5-甲基-4-亞甲基-7-節(jié)硫基-3,4-二氫吡啶幷[4,3-d]嘧啶-8-腈制備將15毫摩爾2-甲基-3-乙?；?5-氰基-6-芐硫基-4-吡啶胺加入到50毫升的反應瓶中，加入60毫摩爾原甲酸三乙酯，加入催化量的濃硫酸，在13(TC左右反應16小時，反應完全后減壓蒸出沒有反應的原甲酸三乙酯，殘余物減壓柱層析得白色晶體吡啶醚脒。將1毫摩爾2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-芐硫基吡啶-4-亞胺甲叉基乙基醚、15毫升甲醇加入到50毫升的反應瓶中，加入3毫摩爾乙胺水溶液，加熱到回流反應2小時，析出固體，抽濾，丙酮與水混合溶劑重結晶，所得純品為白色固體，收率為76%。m.p.142.1143.6°C;化合物114128按照化合物113類似的方法制備。采用上述類似的方法，可以制備通式I-2其他的化合物。表2中所列的為本發(fā)明合成的通式I-2部分化合物。aF！表中省略的符號的含義Me-甲基Ph-苯基表2巳合成的化合物1-2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例ll抗腫瘤活性試驗供試耙標人口腔底癌細胞KB、對長春新堿耐藥的人口腔底癌細胞KBv200、對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株MCF-7/Adr、人肺癌細胞株SW1573、對阿霄素耐藥的人肺癌細胞株SW1573/2R120、人肝癌細胞株H印G2和人卵巢癌細胞株0VCAR3。試驗方法MTT體外細胞毒試驗方法取對數(shù)生長期的人癌細胞制成2xl04個細胞/毫升的細胞懸液，按0.19毫升/孔接種到96孔板，于37。C、5。/oCCh培養(yǎng)24小時后，按0.01毫升/孔加入不同濃度的樣品溶液，另設生理鹽水對照孔，每濃度設4個平行孔，加藥后再培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)結束前3小時按0.01毫升/孔加入濃度為10毫克/毫升的MTT(噻唑蘭MTT-生化試劑)，培養(yǎng)結束時吸出培養(yǎng)液，每孔加O.l毫升的DMSO,于測量波長540納米參比波長655納米下測量OD值。按下式計算細胞生長抑制率(IR)，以簡化概率單位法計算半數(shù)抑制濃度(ICmj)。IR。/。-[l-加藥組平均OD值/對照組平均OD值]><100%測定結果見表3，4，5。表3部分式1-1化合物的抗腫瘤活性數(shù)據(jù)(ICso值)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表4部分式1-1化合物的抗腫瘤活性數(shù)據(jù)acso值)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例12抗腫瘤活性試驗供試靶標人結腸癌細胞株LoVo、人乳腺癌細胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株MCF-7/Adr。試驗方法MTT體外細胞毒試驗方法取對數(shù)生長期的人癌細胞制成2><104個細胞/毫升的細胞懸液，按0.19毫升/孔接種到96孔板，于37。C、5%0)2培養(yǎng)24小時后，按0.01毫升/孔加入不同濃度的樣品溶液，另設生理鹽水對照孔，每濃度設4個平行孔，加藥后再培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)結束前3小時按0.01毫升/孔加入濃度為10毫克/毫升的MTT，培養(yǎng)結束時吸出培養(yǎng)液，每孔加0.1毫升的DMSO，于測量波長540納米參比波長655納米下測量OD值。按下式計算細胞生長抑制率(IR)，以簡化概率單位法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。111%=[1-加藥組平均OD值/對照組平均OD值]xl000/。測定結果見表6。表6部分式1-2化合物的抗腫瘤活性數(shù)據(jù)(ICso值)化合物編號IC50(微摩爾)LoVoMCF-7MCF-7/Adr89LghlII-532.113.47420.6393Mwyl-334.462.29122.48105Mwyl-1514.4612,7520.50實施例13化合物89(Lghin-5)抑制腫瘤生長與抑制EGFR酪氨酸激酶磷酸化的相關性試驗目的耙點篩選發(fā)現(xiàn)化合物89具有抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，同時顯示了強的體外抗腫瘤活性。本研究探討化合物89體內抗腫瘤作用、對EGFR酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用及其下游信號通路的影響。試驗方法建立KB細胞的裸鼠移植瘤模型用以進行體內抗腫瘤作用的研究。給藥方案為對照組(生理鹽水)、CTX陽性對照組(50mg/kg,i.p.,q3dx2)、高劑量化合物89組(80mg/kg:p.o.,qdxl5)、中劑量化合物89組(40mg/kg,p.o.,qdxl5)、低劑量化合物89組(20mg/kg,p.o.,qdxl5)。同時，設以不同濃度的化合物89與人肺腺癌細胞Calu-3共培養(yǎng)48h，收集細胞，抽提蛋白質，進行westernblot測定，研究對EGFR酪氨酸激酶磷酸化的影響。試驗結果見圖l，2。圖1是化合物89對KB細胞的裸鼠移植瘤模型體內抗腫瘤結果。結果表明化合物89具有明顯的體內抗腫瘤活性。圖2是化合物89對EGFR酪氨酸激酶磷酸化及其下游信號通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用，結果表明化合物89明顯抑制了EGFR酪氨酸激酶磷酸化，對下游信號通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化也具有顯著抑制作用。由此得出結論化合物89可能通過抑制EGFR酪氨酸激酶磷酸化，進而抑制腫瘤生長。1權利要求1、具有通式I所表示的一類化合物的應用，其特征是作為抗腫瘤藥物的有效成份，式I中，R表示C1-C2的烷基，苯基或取代苯基，苯基C1-C4烷基或取代苯基C1-C4烷基，所涉及的苯環(huán)上的取代基主要為鹵素、C1-C3的烷基或烷氧基，取代基在苯環(huán)任一位置上的單取代或多取代，在苯環(huán)上的取代基相同或不相同；R1表示H，六氫吡啶基，嗎啡啉基，苯氧基或取代苯氧基，單取代或雙取代烷氨基，烷氨基上的取代基主要為C1-C6的烷基，芐基或取代芐基，苯乙基或者取代苯乙基；所涉及的苯環(huán)上的取代基主要為鹵素、烷基或烷氧基，取代基在苯環(huán)任一位置上單取代；X表示CN時，Y表示直鏈烷硫基或芳烷硫基，其中芳基指苯基，烷基指C1-C2的烷基；或X、Y共同表示2，3—二甲基噻吩或六氫吡啶[b]噻吩；Z表示O，亞甲基；其中，通式I涵蓋了如下通式I-1、通式I-2所示兩類化合物；通式I-1中的R1和通式I中的含義相同；R表示苯基或取代苯基，所涉及的苯環(huán)上的取代基主要為鹵素、C1-C3的烷基或烷氧基，取代基在苯環(huán)任一位置上的單取代或多取代，在苯環(huán)上的取代基相同或不相同；當X表示CN時，Y僅表示甲硫基；或X、Y共同表示2，3—二甲基噻吩或六氫吡啶[b]噻吩；通式I-2中的R和通式I中的含義相同；Y表示直鏈烷硫基或芳烷硫基，其中烷基指C1-C2的烷基，芳基指苯基。2、如權利要求1所述的以通式I表示的化合物的應用，其特征是作為對EGFR酪氨酸激酶磷酸化具有抑制作用的抗腫瘤藥物的有效成份。成份，3、如權利要求1所述的以通式1-1、I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于人口腔底癌細胞株KB具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。4、如權利要求1所述的以通式1-1、I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于對常春新堿耐藥的人口腔底癌細胞KBv200具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。5、如權利要求1所述的以通式1-1、I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于人肝癌細胞株HepG2具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。6、如權利要求1所述的以通式I-1、I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于人卵巢癌細胞株OVCAR3具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。7、如權利要求1所述的以通式I-1、I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株MCF-7/Adr具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。8、如權利要求1所述的以通式I-1表示的化合物的應用，其特征是作為對于人肺癌細胞株SW1573具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。9、如權利要求1所述的以通式I-1表示的化合物的應用，其特征是作為對于對阿霉素耐藥的人肺癌細胞株SW1573/2R120具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。10、如權利要求1所述的以通式I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于人結腸癌細胞株LoVo具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。11、如權利要求1所述的以通式I-2表示的化合物的應用，其特征是作為對于人乳腺癌細胞株MCF-7具有細胞毒活性的抗腫瘤藥物的有效成份。全文摘要通式為I的具有抗腫瘤活性的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物，其涵蓋了如下通式I-1、通式I-2所示兩類化合物。該多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物對口腔底癌細胞KB；對常春新堿耐藥的口腔底癌細胞KBv200；人乳腺癌細胞株MCF-7；對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株MCF-7/Adr；人肺癌細胞株SW1573；對阿霉素耐藥的人肺癌細胞株SW1573/2R120；人肝癌細胞株HepG2；人卵巢癌細胞株OVCAR3；人結腸癌細胞株LoVo等多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，可用作抗腫瘤藥物的有效成分，與任何一種藥劑學上所述的輔料混合制成的任何一種藥劑學上所說的劑型，可用于治療腫瘤病癥。文檔編號A61K31/519GK101474186SQ200910060650公開日2009年7月8日申請日期2009年2月1日優(yōu)先權日2009年2月1日發(fā)明者梁永鉅,符立梧,莫文妍,賀紅武申請人:華中師范大學;中山大學腫瘤防治中心