專利名稱：：川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥材的指紋圖譜
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù)：
：中藥雖然已有幾千年的應(yīng)用發(fā)展歷史，但如何有效地評(píng)價(jià)中藥/中藥材質(zhì)量的好壞，一直是中藥研究與應(yīng)用的重點(diǎn)與難點(diǎn)問題。隨著科技的發(fā)展，指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)在中藥領(lǐng)域被提出并得到廣泛認(rèn)可，其在中藥材及其提取物/制劑等質(zhì)控中的應(yīng)用也越來越多，它為中藥材及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供了新的思路和方法。就如每個(gè)人都有指紋，但每個(gè)人的指紋卻各不相同；每一味中藥材也都具有自己的"指紋"。但中藥材的指紋卻并不是直觀的，并且由于每一味中藥材的特性和有效成分千差萬(wàn)別，對(duì)其指紋圖譜的構(gòu)建方法顯然也不可能一概而論，而是需要針對(duì)其不同中藥材不同的特性及有效成分甚至所含雜質(zhì)等情況，設(shè)計(jì)特定的4是:取分離等前處理方法及相應(yīng)的指紋圖譜測(cè)定方法，從而分別確立適合每一味中藥材的指紋圖譜構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其所獲得的指紋圖語(yǔ)必然也是千差萬(wàn)別。目前獲得指紋圖譜的主要手段是色i普法和光i普法，其中比較常用的有以下幾種(1)薄層色譜法常用于中藥中各種成分的鑒定。(2)高效液相色譜法是構(gòu)建指紋圖i普的主要方法之一。由于中藥成分的復(fù)雜性，構(gòu)建指紋圖譜一般采用梯度洗脫，因?yàn)橹鸩教岣吡鲃?dòng)相洗脫能力可獲得較多色譜峰，提供更多指紋信息。(3)氣相色譜法適合于揮發(fā)性藥材及制劑的指紋圖譜研究。(4)毛細(xì)管電泳技術(shù)已用于中草藥中生物堿、黃酮/黃酮苷、酚酸、香豆素、醌類、強(qiáng)心苷、葡萄糖異硫氰酸鹽等物質(zhì)的分析。(5)紅外光語(yǔ)法可用于藥材鑒定和成藥鑒別。但紅外光譜是由分子的振動(dòng)一轉(zhuǎn)動(dòng)躍遷引起的，確定其專屬性和特征性有較大困難。(6)紫外光語(yǔ)法是電子光譜，形狀變化不大，有時(shí)不同的化合物有相似的圖譜，專屬性差。(7)分子生物學(xué)方法不同生物體有各自相對(duì)穩(wěn)定的DNA序列，因而可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建而A指紋圖譜。限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)是目前最常用的構(gòu)建DNA指紋圖語(yǔ)的方法。但RFLP技術(shù)繁瑣，要求的DNA量大，實(shí)驗(yàn)材料必須新鮮，因此其應(yīng)用受到限制；而RAPD法可以在特異DNA序列尚不清楚的情況下^f全測(cè)DNA的多態(tài)性，具有靈敏度高、多態(tài)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)分析的是基因型而非表現(xiàn)型，結(jié)果不受材料來源、環(huán)境因素、樣品形態(tài)等影響，為干燥藥材鑒定提供了更加準(zhǔn)確的手段。但RAPD法的重復(fù)性差等問題引起了許多爭(zhēng)議。色譜法與DNA指紋圖譜相比其優(yōu)點(diǎn)在于不但有特征的體現(xiàn)((各種化學(xué)成分的個(gè)數(shù)和相對(duì)位置--保留時(shí)間)可作定性鑒別使用，還可體現(xiàn)量的概念。但是，應(yīng)用色譜技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜時(shí)，色語(yǔ)圖中各色譜峰的保留值通常會(huì)受各種因素的影響，包括一系列的操作因素，甚至色譜柱本身在實(shí)驗(yàn)過程中的變化等。并且因?yàn)橹兴幉氖巧飿悠罚嬖诿黠@的個(gè)體差異，再加上產(chǎn)地、批次、運(yùn)輸、貯存等的不同，即使同種中藥也會(huì)出現(xiàn)不同的色譜峰，不同種中藥有時(shí)會(huì)出現(xiàn)相同的色譜峰。所有這些都給指紋圖語(yǔ)的分析帶來了巨大的困難。解決這一難題就需要進(jìn)行大批量實(shí)驗(yàn)研究、收集大批量?jī)x器分析數(shù)據(jù)，并對(duì)大批量?jī)x器分析數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從中提取特征信息，進(jìn)而加以識(shí)別，從而確立專屬性強(qiáng)、并且穩(wěn)定有效的指紋圖譜構(gòu)建方法，得到可有效用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖鐠。川牛膝(CyathulaofficinalisKuan.)為莧科(Amaranthaceae)杯莧屬(CyathulaBl腿e)多年生草本植物，別名甜膝。主要分布于四川、云南和貴州，野生或栽培，生長(zhǎng)于海拔1500米以上的地區(qū)，為著名的川產(chǎn)地道中藥材，是極常用且是重要的出口品種。1977年以后各版《中國(guó)藥典》確定川牛膝植物來源為C.officinalisKuan.。川牛膝的主要成分為生物堿和甾醇類物質(zhì)，如杯莧甾酮(cyastelone)、頭花蒽草甾酮、促脫皮甾酮、紅甾酮等，另外還有阿魏酸；現(xiàn)代研究還從川牛膝根中提取出一種生物活性多糖--牛膝多糖(AchyranthesbideiUataPolysaccharides,ABP)。川牛膝的主要藥J里作用有活血通經(jīng)、祛風(fēng)濕、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋，以及對(duì)高血壓性心臟病和痛經(jīng)等疾病的治療作用。由于在栽培過程中容易產(chǎn)生品種混雜，不同地區(qū)用藥習(xí)慣的不同造成品種混亂、以及采收/運(yùn)輸/貯存條件等原因，川牛膝的商品品種較為混亂，其質(zhì)量各不統(tǒng)一，有時(shí)差異甚大。另一方面，中華人民共和國(guó)藥典2005年版一部收載的"川牛膝"品種項(xiàng)下，對(duì)川牛膝的質(zhì)量控制也顯得非常薄弱，只包括顯微鑒別以及水分、灰分、浸出物等常規(guī)性檢查，缺乏完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，難以達(dá)到對(duì)川牛膝質(zhì)量的有效控制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述川牛膝缺乏完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，難以有效控制其質(zhì)量的問題，提供一種川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，以此達(dá)到完善其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系、有效控制川牛膝藥材質(zhì)量的目的。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步的目的還提供了一種基于上述指紋圖譜構(gòu)建方法得到的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括下述主要步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備以杯莧甾酮為標(biāo)準(zhǔn)品，稱取杯莧甾酮標(biāo)準(zhǔn)品，置于容量瓶中，加75%-100°/。曱醇(當(dāng)其溶液低于100%時(shí)，均是指體積百分比濃度的曱醇水溶液，下同)溶解并定容，橫j農(nóng)度為0.4mg/ml-0.6mg/ml，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(2)樣品供試溶液的制備取川牛膝藥材粉末0.9g-l.lg,加入75%-100%曱醇5ni1,振蕩均勻，超聲提取20min-40min,離心(使固液分離)，取上清液以微孔濾膜(主要是為了去除可能堵塞色譜柱的大分子物質(zhì)，目前常用的各種規(guī)格的微孔濾膜均可使用)濾過，濾液作為川牛膝樣品供試溶液；由于指紋圖譜中均是采用相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積來表征各特征峰，主要和藥材中各成分之間的含量比例、HPLC條件等相關(guān)，對(duì)樣品供試溶液制備過程中的取樣量、提取溶劑的加入量、提取時(shí)間、離心時(shí)間、微孔直徑等可能輕微影響到提取率及含量測(cè)定準(zhǔn)確度的一些參數(shù)條件，無需過于嚴(yán)格要求。(3)HPLC檢測(cè):分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品供試溶液，分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色i普檢測(cè)，記錄39min內(nèi)的HPLC圖i普；其中，色譜條件為色譜柱為ds反相色譜柱；柱溫為30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為266nm;流動(dòng)相為不同濃度的曱醇-水溶液，流速為0.8ml/min;采用非線性梯度洗脫方式，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)、不同時(shí)間段的流動(dòng)相變化如下05min:曱醇濃度(體積百分比濃度，下同)由5%勻速變至46%,532min:曱醇濃度由46%勻速變至66%,32~40min:曱醇濃度由66%勻速變至100%。通過對(duì)上述構(gòu)建方法中步驟(3)記錄得到的大量樣品的HPLC圖諳進(jìn)行解析，確定共有指紋特征(主要包括特征峰的確定、與標(biāo)準(zhǔn)品相比其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積等)，即可得到川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜?；谏鲜龃ㄅＯニ幉闹讣y圖i普的構(gòu)建方法，發(fā)明人采集了大量川牛膝藥材樣品，通過大批量實(shí)驗(yàn)研究、收集大批量?jī)x器分析數(shù)據(jù)，并對(duì)大批量?jī)x器分析數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從中提取特征信息，進(jìn)而加以識(shí)別、計(jì)算，不僅進(jìn)一步確立、驗(yàn)證了該專屬性強(qiáng)、且穩(wěn)定有效的川牛膝藥材指紋圖譜構(gòu)建方法，并且得到了可有效用于川牛膝藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。通過分析比較，確定了川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖語(yǔ)具有如下1Q個(gè)共有特征峰，其中第8個(gè)為杯莧甾酮的特征峰，以此杯莧甾酮特征峰為參照，計(jì)算其余9個(gè)特征峰相對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。所得結(jié)果見下述表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中確定的上述10個(gè)共有特征峰具有廣泛的代表性，在發(fā)明人自行采集的大量川牛膝藥材和市場(chǎng)購(gòu)得的川牛膝藥材/飲片樣品檢測(cè)結(jié)果中均得到了證實(shí)，因此該指紋圖i普可用于正品川牛膝藥材或飲片質(zhì)量的評(píng)價(jià)和控制。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明確立了川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，通過該方法可獲得川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖語(yǔ)，完善了川牛膝藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為川牛膝藥材及其飲片質(zhì)量的全面有效控制提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。在此指紋圖譜構(gòu)建方法基礎(chǔ)得到的川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖語(yǔ)，進(jìn)一步完善了川牛膝藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，有利于川牛膝藥材及其飲片的質(zhì)量控制。圖l是利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(A版)處理所得的本發(fā)明川牛膝藥材共有模式特征指紋圖鐠，圖中的1-IO分別對(duì)應(yīng)特征峰編號(hào)1-10;圖2是27批栽培及4批市售川牛膝藥材/々大片的HPLC指紋圖譜；圖3是3批野生川牛膝藥材的HPLC指紋圖語(yǔ)與川牛膝標(biāo)準(zhǔn)指紋圖語(yǔ)的對(duì)比示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例為對(duì)采自不同產(chǎn)區(qū)的27批栽培川牛膝、4批市售川牛膝、及3批野生川牛膝藥材/飲片的指紋圖譜構(gòu)建方法及據(jù)此得到的指紋圖譜，并以此對(duì)所述各批次的川牛膝藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)27批采自不同產(chǎn)區(qū)的川牛膝中包括從雅安天全縣、寶興縣、滎經(jīng)縣、樂山金口河區(qū)等川牛膝主產(chǎn)區(qū)收集來的不同來源的樣品，4批市售川牛膝為從成都大豐藥材市場(chǎng)購(gòu)入的川牛膝藥材和飲片。3批野生川牛膝包括:從會(huì)理收集到的2個(gè)批次，供試樣品批號(hào)分別為Wl和W2(當(dāng)?shù)胤謩e稱之為"白牛膝"和"紅牛膝")；以及從漢源收集到的1個(gè)批次，供試樣品批號(hào)分別為W3(當(dāng)?shù)胤Q之為"紅牛膝")。各川牛膝供試樣品來源等基本信息見下述表2。_表2供試樣品來源等基本信息_~~供試樣品批號(hào)生長(zhǎng)年限采集時(shí)間~"sl寶興崇興村22008.12s2寶興崇興村22007.12s3寶興崇興村32007.12s4寶興崇興村22007.12s5寶興崇興村22007.12s6寶興崇興村32007.12s7寶興崇興村32007.12s8金口河22008.01s9金口河32008.01s10金口河42008.01sll天全兩路鄉(xiāng)32007.12s12天全兩路鄉(xiāng)32007.12s13天全兩^各鄉(xiāng)22007.12s14天全兩3各鄉(xiāng)22007.12s15天全兩路鄉(xiāng)22007.12s16天全兩路鄉(xiāng)32007.12s17天全紫石鄉(xiāng)32008.12s18天全紫石鄉(xiāng)32008.12s19天全紫石鄉(xiāng)32008.12s20天全紫石鄉(xiāng)32008.12s21蒙經(jīng)新建鄉(xiāng)32008.11s22滎經(jīng)新建鄉(xiāng)32008.11s23滎經(jīng)新建鄉(xiāng)32008.11s24滎經(jīng)新建鄉(xiāng)32008.11s25滎經(jīng)新建鄉(xiāng)32008.11s26榮經(jīng)新建鄉(xiāng)32008.11培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培培栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽栽從川牛膝主產(chǎn)區(qū)收集的27批栽培川牛膝供試樣品及3批野生川牛膝供試樣品取回后，經(jīng)去除，頭以上部分、除去泥沙、清洗干凈，切片后置于50。C烘箱中烘烤，并與另4批市售川牛膝供試樣品分別烘干至恒重。將烘千的供試樣品在藥材粉碎機(jī)中粉碎，粉末裝入樣品密封袋中，置于冰箱保鮮室儲(chǔ)藏備用。儀器日本島津LC-2010cHT高效液相色語(yǔ)儀，UV-VIS紫外檢測(cè)器，DiamonsUC18(250mmx4,6mm,5)im)色譜柱，SHIMADZU(10Lx4.6mm)保護(hù)柱，Class-VP化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與處理；德國(guó)艾本德(Eppendorf)5804R冷凍離心機(jī)；Vortex-Genie2渦旋振蕩器；SK250LH超聲波清洗機(jī)；BS224電子天平(Sartoriiis,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限/>司)。標(biāo)準(zhǔn)品杯莧甾酮(Cyasterone)標(biāo)準(zhǔn)品由上海展舒化學(xué)公司提供，純度為99%。按照下述方法構(gòu)建指紋圖語(yǔ)(為了便于比較，全過程中各參數(shù)條件均盡量按照同樣的要求進(jìn)行操作)(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取杯莧甾酮標(biāo)準(zhǔn)品9mg，置20ml容量容量瓶中，加純曱醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(2)樣品供試溶液的制備取供試樣品藥材粉末約lg,精密稱定，置于20ml具塞試管中，加入純甲醇5ml，稱重，置渦旋振蕩器振蕩均勻，30攝氏度40kHz超聲提取30min,放冷，加純曱醇補(bǔ)足減失重量，10000r/min離心10min,耳又上清液以《效孔濾膜(微孔直徑0.45濾過，濾液作為樣品供試溶液；(3)HPLC檢測(cè):榮經(jīng)新建鄉(xiāng)會(huì)理(白牛膝)會(huì)理(紅牛膝)漢源(紅牛膝)不不不不不不不詳興興興不寶寶寶片培售售售飲生生生栽市市市售野野野市分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品供試溶液15JU1，分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜沖企測(cè)，記錄39min內(nèi)的HPLC圖譜(27批栽培及4批市售的川牛膝藥材的HPLC圖譜如圖2所示；野生川牛膝藥材的HPLC圖i普與川牛膝標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的對(duì)比如圖3所示)；其中，色鐠條件為色i普4主為DiamonsilC18(250mmx4.6mm,5nm)色if;f主；柱溫為30°C;才企測(cè)波長(zhǎng)為266nm;流動(dòng)相為不同濃度的曱醇-水;容液，流速為0.8ml/min;采用非線性梯度洗脫方式，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)、不同時(shí)間段的流動(dòng)相變化如下05min:曱醇濃度(體積百分比濃度，下同)由5%勻速變至46%，5~32min:甲醇濃度由46%勻速變至66%，32~40min:曱醇濃度由66%勻速變至100%;(4)色譜圖解析對(duì)上述步驟(3)記錄得到的HPLC圖譜進(jìn)行解析，以杯莧甾酮峰為參照，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，得到各供試樣品的HPLC指紋圖譜，并與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較。栽培及市售的川牛膝各供試樣品的HPLC指紋圖語(yǔ)均具有標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的10個(gè)共有特征峰，其中第8個(gè)為標(biāo)準(zhǔn)品杯芄甾酮的特征峰，以此杯莧甾酮特征峰為參照，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果見下述表3和表4:表327批栽培及4批市售川牛膝藥材HPLC指紋圖語(yǔ)的相對(duì)保留時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>經(jīng)過分析比較，與川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(以下簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜)相比栽培川牛膝樣品中編號(hào)分別為S3、S8、SIO、S12、S13、S15、S16的樣品、及市售川牛膝藥材中編號(hào)為S28的樣品，其HPLC指紋圖諳中均有部分相對(duì)峰面積小于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖i普中相應(yīng)特征峰相對(duì)峰面積的最低限；野生川牛膝樣品的HPLC指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜具有明顯的不同，如采自會(huì)理的"白牛膝，，(Wl)，其1號(hào)峰的相對(duì)峰面積均小于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積，其4號(hào)峰、5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰、9號(hào)峰、10號(hào)峰的相對(duì)峰面積均大于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積；采自會(huì)理的"紅牛膝"(W2),其1號(hào)峰的相對(duì)峰面積小于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖i普中相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積，而其5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰的相對(duì)峰面積均大于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積；采自漢源的"紅牛膝，，(W3),其1號(hào)峰和6號(hào)峰的相對(duì)峰面積均大于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積，而3號(hào)峰和5號(hào)峰的相對(duì)峰面積小于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積，并且，在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖語(yǔ)9號(hào)峰對(duì)應(yīng)的位置處沒有峰出現(xiàn)；此外，在與標(biāo)準(zhǔn)品杯莧甾酮8號(hào)峰相同的位置及其附近，3批野生的指紋圖譜中均顯示出有至少兩個(gè)無法完全分離的峰同時(shí)存在，表明其還含有與杯莧甾酮極性近似的其它成分；從3批野生的HPLC指紋圖譜中還可以看到一些在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖傳中沒有出現(xiàn)的峰，表明其中還含有一些栽培川牛膝中所不含有的其它成分……因此，通過構(gòu)建HPLC指紋圖譜及解譜分析，可以從川牛膝藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)(所含成分)出發(fā)，有效評(píng)價(jià)川牛膝藥材的質(zhì)量狀況，達(dá)到評(píng)價(jià)和控制藥材質(zhì)量的目的。權(quán)利要求1、川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括下述主要步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備稱取杯莧甾酮標(biāo)準(zhǔn)品，置于容量瓶中，加75％-100％甲醇溶解并定容，使?jié)舛葹?.4mg/ml-0.6mg/ml，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(2)樣品供試溶液的制備取川牛膝藥材粉末0.9g-1.1g，加入75％-100％甲醇5ml，振蕩均勻，超聲提取20min-40min，離心，取上清液以微孔濾膜濾過，濾液作為川牛膝樣品供試溶液；(3)HPLC檢測(cè)分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品供試溶液，分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，記錄39min內(nèi)的HPLC圖譜；其中，色譜條件為色譜柱為C18反相色譜柱；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為266nm；流動(dòng)相為不同濃度的甲醇-水溶液，流速為0.8ml/min；采用非線性梯度洗脫方式，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)、不同時(shí)間段的流動(dòng)相變化如下0～5min甲醇濃度(體積百分比濃度，下同)由5％勻速變至46％，5～32min甲醇濃度由46％勻速變至66％，32～40min甲醇濃度由66％勻速變至100％。2、川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其特征在于以色譜圖中的杯莧甾酮特征峰為參照，計(jì)算得川牛膝藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖i普中各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分別如下相對(duì)保留時(shí)間1號(hào)峰0.3669'-0.3746，2號(hào)峰0.4325~0.4414,3號(hào)峰0.4642--0.4707,4號(hào)峰0.5050-0.5338,5號(hào)峰0.6076--0.6269,6號(hào)峰0.7352~0.7462,7號(hào)峰0.7855--0.8008,8號(hào)峰1,9號(hào)峰1.0383--1.0454,10號(hào)峰:1.1071~1.1279;相對(duì)峰面積1號(hào)峰0.2143--0.8375,3號(hào)峰0.2474--0.7777，5號(hào)峰0.0993--0.3679,7號(hào)峰0.0928--0.2554，9號(hào)峰0.1628--0.4723，2號(hào)峰0.0437~0.2210,4號(hào)峰0.0332-0.4474,6號(hào)峰0.0335~0.1860,8號(hào)峰1,IO號(hào)峰0.1321—0.697全文摘要本發(fā)明公開了一種川牛膝藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，以杯莧甾酮為對(duì)照品，將對(duì)照品溶液與樣品供試溶液在同一色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測(cè)，進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖，即得。通過該方法可獲得川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，完善川牛膝藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為川牛膝藥材及其飲片質(zhì)量的全面有效控制提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。本發(fā)明還公開了根據(jù)上述指紋圖譜構(gòu)建方法得到的川牛膝藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。文檔編號(hào)A61K36/185GK101612177SQ20091006005公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年7月20日優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日發(fā)明者劉天成,莉唐,磊孫,徐攀輝,楊世民,巧王,田孟良,丹胡,胡瑩瑩,范巧佳,袁繼超,鄭順良申請(qǐng)人:雅安三九中藥材科技產(chǎn)業(yè)化有限公司