專利名稱：一種納米載體組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及納米材料在基因治療中的應(yīng)用，具體 涉及一種納米載體組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)部，通過恢復(fù)或增添基因表達(dá)以糾正 人體自身基因的結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂，抑制外源性病原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，殺 滅病變的細(xì)胞，阻止病變的發(fā)展，從而達(dá)到治療的目的?；蛑委熥鳛橹委熌[ 瘤的一種新的輔助手段，逐漸受到人們的重視和關(guān)注?；蛑委熤凶铌P(guān)鍵的是
將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，而后進(jìn)入細(xì)胞核；單純質(zhì)粒DNA很難直接進(jìn)入細(xì)胞，因 此，基因治療的成功實(shí)施除了需要安全、有效的目的基因外，高效、安全的基 因傳輸載體也是關(guān)鍵因素。
納米顆粒(nanoparticle， NP)是一種粒徑在l 100nm之間的超微粒子， 具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等。納米顆?；蜣D(zhuǎn)移載體是 目前最為有效的非病毒載體，其轉(zhuǎn)染效率較傳統(tǒng)方法高上百倍。
目前用于腫瘤診斷和治療的藥物載體主要由金屬納米顆粒、無機(jī)非金屬納 米顆粒、生物降解性高分子納米顆粒和生物性顆粒構(gòu)成，其中生物降解性是藥 物載體或基因載體的重要特征之一，通過降解，載體與藥物/基因片段定向進(jìn) 入靶細(xì)胞之后，表層的載體被生物降解，芯部的藥物釋放出來發(fā)揮療效，避免 了藥物在其他組織中釋放。
3將藥物、DNA和RNA等基因治療分子和可降解性高分子生物材料形成生 物性高分子納米顆粒，同時(shí)再耦聯(lián)特異性的靶向分子，通過革巴向分子與細(xì)胞表 面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性藥 物和基因治療。
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，許多基因在不同環(huán)節(jié)和水平上 參與這一過程。目前的基因治療多為單基因，同時(shí)基因的表達(dá)和調(diào)控以及基因 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)也不夠完善。不同單基因系統(tǒng)治療腫瘤的療效不同，長期治療后腫瘤 細(xì)胞可產(chǎn)生耐藥性，而且單基因系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞效率不高，這些均表明單 基因系統(tǒng)治療腫癉存在一定的局限性，因此人們必須從多方面著手腫瘤的治 療，而聯(lián)合基因療法則可能減少或避免這些不足。
聯(lián)合基因是利用基因工程技術(shù)將兩種或多種基因共同表達(dá)，目的是為兩者 或多者共同聯(lián)合發(fā)揮抑制腫瘤作用。目前尚未見到有用生物降解性高分子納米 顆粒協(xié)同聯(lián)合基因一起作用于腫瘤治療的相關(guān)研究報(bào)道。
自殺基因，又稱為前藥敏感基因，是病毒和細(xì)菌等原核生物含有的一類基 因，其編碼的酶能將原來無毒的或微毒的藥物前體轉(zhuǎn)化具有細(xì)胞毒性的代謝物 而殺傷宿主細(xì)胞。
將自殺基因?qū)霅盒阅[瘤細(xì)胞是人類基因治療的一種重要方法。目前研究 較多的選擇性的自殺基因?yàn)閱渭儼捳畈《鞠佘占っ?無環(huán)鳥苷系統(tǒng) (HSVtk/GCV),是一種很常見的自殺基因治療系統(tǒng)，但是這種殺傷基因治療 系統(tǒng)在臨床實(shí)驗(yàn)中仍顯示出局限性，而且基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低。 '
近年來發(fā)現(xiàn)另外一種自殺基因大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因(E-coli cytosine deaminase, EC-CD)在腫瘤殺傷作用方面較HSV具有更大的優(yōu)勢，在一些臨床前實(shí)驗(yàn)中CD/5-FC系統(tǒng)被認(rèn)為比HSV-tk/GCV系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺滅率。
CD基因是大腸桿菌中一段3.1kb基因，包含兩個(gè)閱讀框架codA (編碼胞 嘧啶脫氨酶)和codB (編碼胞嘧啶脫氨酶通透酶)(M. Bentires-Alj, A.C. Hellin, C. Lechanteur, F. Princen, M. Lopez, G. Fillet,丄Gielen, M.P. Merville, V. Bours, Cytosine deaminase suicide gene therapy for peritoneal carcinomatosis, Cancer Gene Ther 7 (2000) 20-26.)。
CD基因治療腫瘤的作用不僅僅是引起導(dǎo)入基因的腫瘤細(xì)胞"自殺"，還可 通過"旁觀者"效應(yīng)殺傷未導(dǎo)入基因的臨近分裂細(xì)胞，顯著擴(kuò)大其殺傷效應(yīng)。
TRAIL,即腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligan.d， TRAIL),又稱凋亡素-2配體。它是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族的成員，是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡誘導(dǎo)配體。近年來研究發(fā)現(xiàn) TRAIL具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的特性，而對正常組織無損傷作用， 因此在腫瘤的治療中具有巨大潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種革巴向性的、可生物降解 的、對病變組織表現(xiàn)高度特異性、轉(zhuǎn)染效率高、自身毒性小、能夠安全高效地 進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，且可實(shí)現(xiàn)雙基因聯(lián)合治療的納米載體組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述納米載體組合物在制備抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種納米載體組合物，該組合物是以納米顆粒作為載體將CD基因和TRAIL基因均運(yùn)送到人體內(nèi)病變部位，然后通過CD基因和TRAIL基因一起聯(lián) 合作用從而取得比傳統(tǒng)單基因治療更好的治療效果。
本發(fā)明的納米載體組合物可以采取兩種形式， 一種是將分別包含CD基因 和TRAIL基因的質(zhì)粒與納米顆粒結(jié)合制備而得，這種形式具體的制備過程如 下
(1) 制備包含CD基因的質(zhì)粒；
(2) 制備包含TRAIL基因的質(zhì)粒；
(3) 將上述步驟(1)和步驟(2)制備的兩種質(zhì)粒一起與納米顆粒結(jié)合， 從而形成"CD基因-TRAIL基因-納米顆粒"，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并實(shí)現(xiàn)雙基因?qū)Σ?變位置的聯(lián)合治療。
本發(fā)明的納米載體組合物還可以采用另外一種形式，就是由納米顆粒和包 含CD基因的質(zhì)粒結(jié)合得到組分l，再由納米顆粒和包含TRAIL基因的質(zhì)粒結(jié)合 得到組分2，組分1和組分2混合得到納米載體組合物，其具體制備過程如下
(1) 制備包含CD基因的質(zhì)粒；用納米顆粒和該質(zhì)粒結(jié)合得到組分l，即"CD 基因-納米顆粒";
(2) 制備包含TRAIL基因的質(zhì)粒；用納米顆粒和該質(zhì)粒結(jié)合得到組分2， 即"TRAIL基因-納米顆粒"；
(3) 將上述步驟(1)所得組分l和步驟(2)所得組分2分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從 而實(shí)現(xiàn)雙基因?qū)Σ∽兾恢玫穆?lián)合治療。
N/P是指作為載體的納米顆粒中的氨基基團(tuán)與DNA中的磷酸基團(tuán)的摩爾 比，本發(fā)明納米載體組合物中，包含CD基因的質(zhì)粒、包含TRAIL基因的質(zhì)粒 與作為載體的納米顆粒，其三者的比例用N/P來表示作為載體的納米顆粒與包含CD基因的質(zhì)粒的N/P比為(5: 1)~G0: 1)，優(yōu)選為15: 1;作為載體的 納米顆粒與包含TRAIL基因的質(zhì)粒的N/P比為(5: 1) (30: 1)，優(yōu)選為15:
在本發(fā)明納米載體組合物中作為載體的納米顆粒，可選擇任何一種本領(lǐng)域
常用的作為輸送藥物進(jìn)入靶細(xì)胞的納米顆粒，優(yōu)選PEG-PEI或FA-PEG-PEI，更 加優(yōu)選FA-PEG-PEI。
本發(fā)明人中的梁兵等人在已經(jīng)公開的文章"新型靶向納米材料介導(dǎo)基因治 療膠質(zhì)瘤的體外研究"中，設(shè)計(jì)并通過化學(xué)方法合成了可降解性PEG-PEI和F A-PEG-PEI，并研究了這兩種納米顆粒負(fù)載質(zhì)粒DNA的能力，比較所形成納 米材料/DNA復(fù)合物在體外對細(xì)胞的毒性大小及其轉(zhuǎn)染效率，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 這兩種納米顆粒的納米材料/DNA復(fù)合物其細(xì)胞毒性比常用的PEI 5kd低，而 且在N/P比二15時(shí)，這兩種納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率都表現(xiàn)為最好，F(xiàn)A-PEG-PEI 中FA的耙向效果也最好(B. Liang, M丄.He, Z.P. Xiao, Y. Li, C.Y. Chan, H.F. Kung, X.T. Shuai,Y.Peng.Synthesis and characterization of folate-PEG-gr afted-hyperbranched-PEI for tumor-targeted gene delivery, Biochem Biophys Res Commun, 367, (2008) : 874-880)。
本發(fā)明的納米載體組合物是采用先分別制備含有CD基因和TRAIL基因的 質(zhì)粒，然后再結(jié)合納米顆粒的，所述包含CD基因的質(zhì)粒和包含TRAIL的質(zhì)粒 均采用真核表達(dá)載體，從而更加有利于后期轉(zhuǎn)染效率的提高。
本發(fā)明的納米載體組合物可用于制備抗腫瘤藥物，如抗腦惡性膠質(zhì)瘤藥 物、抗乳腺癌藥物、抗胃癌藥物、抗皮膚癌藥物、抗大腸癌藥物或抗肺癌藥物 等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果-
1. 雖然CD基因和TRAIL基因各自都對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但是由于 腫瘤的產(chǎn)生多存在異源性，即涉及到多個(gè)基因(有時(shí)還涉及到未明基因)，單 純地阻斷或下調(diào)某一種(有時(shí)甚至幾種)癌基因的表達(dá)，往往仍然不能獲得理 想的效果，本發(fā)明的納米載體組合物，采用將CD基因和TRAIL基因聯(lián)合作用 于病變位置，即可發(fā)揮CD基因能夠?qū)o細(xì)胞毒性的前體藥物5-FC轉(zhuǎn)化為5-FC 來實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞殺傷的作用，又可發(fā)揮TRAIL誘導(dǎo)多種細(xì)胞核腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋 亡的作用，彌補(bǔ)單一基因治療的不足，使兩種基因優(yōu)勢互補(bǔ)，發(fā)揮了1+1〉2的 效果，其對腫瘤細(xì)胞的抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單基因的分別作用，是膠質(zhì)瘤基因治 療的趨勢之一；
2. 目前基因治療在全世界范圍內(nèi)已有多種治療方案進(jìn)入臨床，但療效尚 不能令人滿意， 一方面是因?yàn)槿狈σ环N高效、靶向的載體系統(tǒng)，另一方面是因 為腫瘤是一種多基因、多步驟變化的復(fù)雜疾病，而目前常用的單一基因治療顯 然是不夠的。本發(fā)明的納米載體組合物選擇PEG-PEI和FA-PEG-PEI作為傳輸基 因治療藥物的載體，不但充分利用了PEI可有效復(fù)合DNA，具有獨(dú)特的"質(zhì)子緩 沖"功能，能夠破壞酸性溶酶體并釋放所負(fù)載的DNA，從而可獲得理想的DNA 傳送效果和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢，而且FA的加入也使得載體具有了更高的靶向 性。


圖1為重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳其中，l為Marker， 2為真核表達(dá)載體？1處82- EGFP/CD， 3為真核表達(dá)載 體pIRES2- EGFP/TRAIL;圖2為重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳其中，l為Marker， 2為目的基因TRAIL， 3為目的基因CD;
圖3為CD及TRAIL蛋白表達(dá)的Westem blot檢測電泳其中，1為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組的C6細(xì)胞，2為轉(zhuǎn)染單基因TRAIL對照組的 C6細(xì)胞，3為轉(zhuǎn)染單基因CD對照組的C6細(xì)胞，4為轉(zhuǎn)染CD-TRAIL聯(lián)合治療組 的C6細(xì)胞；
圖4為不同試驗(yàn)組大鼠腫瘤的病理解剖學(xué)檢査；
其中，1為PBS腦內(nèi)處理對照組背面觀，2為PBS腦內(nèi)處理對照組腫瘤組織 切面，3為pIRES2-EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組腫瘤組織切面，4為單基因CD 腦內(nèi)治療組腫瘤組織切面，5為單基因TRAIL腦內(nèi)治療組腫瘤組織切面，6為 CD-TRAIL聯(lián)合治療組腫瘤組織切面，箭頭所指部位是腫瘤；
圖5為不同處理組大鼠的腫瘤平均體積；
其中，1為PBS腦內(nèi)處理對照組，2為pIRES2- EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組， 3為單基因CD腦內(nèi)治療組，4為單基因TRAIL腦內(nèi)治療組，5為CD-TRAIL聯(lián)合
治療組；
圖6為不同試驗(yàn)組大鼠腫瘤的HE染色圖片；
其中，l為正常組，2為pIRES2-EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組，3為單基因 .CD腦內(nèi)治療組，4為單基因TRAIL腦內(nèi)治療組，5為CD-TRAIL聯(lián)合治療組； 圖7為不同試驗(yàn)組大鼠腫瘤的免疫組化照片;
其中，l為正常組，2為pIRES2-EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組，3為單基因 CD腦內(nèi)治療組，4為單基因TRAIL腦內(nèi)治療組，5為CD-TRAIL聯(lián)合治療組。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地闡述，但具體實(shí)施例并不對本發(fā) 明做任何限定。
實(shí)施例l納米載體組合物的制備
本實(shí)施例所用到的pCMV/CD質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)/TRAIL質(zhì)粒分別來自德 國柏林Max-Delbriick分子醫(yī)學(xué)中心和香港中文大學(xué)。.
質(zhì)粒pIRES2-EGFP是一種帶綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體，市售。
1 、真核表達(dá)載體？11^82- EGFP/TRAIL和pIRES2- EGFP/CD的構(gòu)建和鑒定
a.真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/CD的構(gòu)建和鑒定
將pCMV/CD質(zhì)粒和pIRES2- EGFP質(zhì)粒分別用Sac II / Xho I雙酶切，酶切產(chǎn) 物經(jīng)凝膠電泳后切膠回收純化，得到目的基因00片段和線性化 1虹82- EGFP 質(zhì)粒片段，然后用T4連接酶將兩個(gè)片段連接起來，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽 提后對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(SacII/Xho1)鑒定、PCR鑒定(上游引物序列 如SEQIDNO: l所示，下游引物序列如SEQIDNO: 2所示)以及序列分析。
重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果如圖l所示，雙酶切后凝膠電泳結(jié)果顯示所構(gòu) 建的真核表達(dá)載體 1虹82- EGFP/CD經(jīng)Sac II / Xho I雙酶切后其回收片段分別 為1.3kb (CD基因片段)和5.2kb。
重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果如圖2所示，凝膠電泳圖上可見擴(kuò)增片段位于 1000bp-1500bp之間，與目的片段一致。
對重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，目的基因已插入，并證實(shí)質(zhì)粒的開 放閱讀框架正確。
由此說明本實(shí)施例的真核表達(dá)載體 1虹52- EGFP/CD構(gòu)建成功。b.真核表達(dá)載體？111￡82- EGFP/TRAIL的構(gòu)建和鑒定
將pcDNA3.1(+)-TRAIL質(zhì)粒和pIRES2- EGFP質(zhì)粒分別用BamH I / Xho I雙 酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后切膠回收純化，得到目的基因TRAIL片段和線性 化pIRES2- EGFP質(zhì)粒片段，然后用T4連接酶將兩個(gè)片段連接起來，連接產(chǎn)物 經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提后對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(BamHI/Xho1)鑒定、PCR鑒 定(上游引物序列如SEQIDNO: 3所示，下游引物序列如SEQIDNO: 4所示) 以及序列分析。
重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果如圖l所示，雙酶切后凝膠電泳結(jié)果顯示所構(gòu) 建的真核表達(dá)載體？1虹82- EGFP/TRAIL經(jīng)BamH I / Xho I雙酶切后其回收片 段分別為1.0kb (TRAIL基因片段)禾口5.2kb。
重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果如圖2所示，凝膠電泳圖上可見擴(kuò)增片段位于 1000bp-1500bp之間，與目的片段一致。
對重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，目的基因已插入，并證實(shí)質(zhì)粒的開 放閱讀框架正確。
由此說明本實(shí)施例的真核表達(dá)載體pIRES2- EGFP/TRAIL構(gòu)建成功。
本實(shí)施例的真核表達(dá)載體pIRES2- EGFP/TRAII^nPIRES2- EGFP/CD的構(gòu) 建和鑒定實(shí)驗(yàn)中，所涉及到的雙酶切、凝膠電泳、切膠純化回收、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒 抽提、PCR鑒定等實(shí)驗(yàn)均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作，按照相關(guān)操作說明書或者試劑 盒說明書進(jìn)行即可。
2、納米載體組合物的制備
在Eppendor滑中，將l嗎上述真核表達(dá)載體？111￡82-EGFP/TRAIL稀釋在 50i!l不含F(xiàn)BS的DMEM中，振蕩均勻，按照N/P45，把相應(yīng)量的FA-PEG-PE加入到另外一管裝有50pl不含F(xiàn)BS的DMEM的Eppendorf管中，然后把兩溶液在室 溫下振蕩5分鐘得到均勻復(fù)合物，即FA-PEG-PEI/ (pIRES2- EGFP/TRAIL)復(fù)合物。
參照上述同樣的操作，制備得到FA-PEG-PEI/ (pIRES2- EGFP/CD)復(fù)合物。
實(shí)施例2 Western blot檢測CD及TRAIL蛋白表達(dá)
本實(shí)施例分以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行平行對比實(shí)驗(yàn).-
1. pIRES2- EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組即FA-PEG-PEI，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 pIRES2- EGFP;
2. 單基因TRAIL對照組即實(shí)施例1制備所得FA-PEG-PEI/ (pIRES2-EGFP/TRAIL)復(fù)合物；
3. 單基因CD對照組即實(shí)施例1制備所得 入- ￡0- ￡1/^1虹82- EGFP/CD) 復(fù)合物；
4. CD-TRAIL聯(lián)合治療組即本發(fā)明的納米載體組合物，也就是實(shí)施例l 制備所得FA-PEG-PEI/( pIRES2- EGFP/TRAIL)復(fù)合物和FA-PEG-PEI/( pI虹S2-EGFP/CD)復(fù)合物的組合；
選擇膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，將細(xì)胞以1 x 105細(xì)胞/孔接種在24孔板上培養(yǎng)至細(xì)胞豐 度70%，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)用不加FBS的DMEM培養(yǎng)基置換培養(yǎng)液，然后把其吸 走后每孔中分別加入上述四個(gè)實(shí)驗(yàn)組(N/P=15:l)各4嗎和lml不含F(xiàn)BS的 DMEM培養(yǎng)基，在37'C下培養(yǎng)4h，吸去轉(zhuǎn)染液，加入DMEM完全培養(yǎng)基；72h 后盡量吸盡培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，棄去，加入lml預(yù)冷的0.01mol/LPBS，平放輕 輕搖動(dòng)洗滌細(xì)胞，lminx3次，棄去洗液，置培養(yǎng)瓶于冰上；按lml RIPA細(xì)胞裂解液加PMSF lOpl的比例，將二者搖勻混合，放置冰上；每孔細(xì)胞加100pl
含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30min;裂解完成后，迅速用干凈的 刮棒刮于培養(yǎng)孔一側(cè)，用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中，4°C 下離心，12,000rpm， 5min;取上清，-20匸保存，可用于檢測蛋白含量和后續(xù) 的Western blot實(shí)驗(yàn)，Western blot實(shí)驗(yàn)的操作采用本領(lǐng)域的常規(guī)做法，按照參 考書或者試劑盒上的說明操作即可。
Western blot的結(jié)果如圖3所示，pIRES2- EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組的 C6細(xì)胞其CD蛋白基因和TRAIL蛋白基因均不表達(dá)，轉(zhuǎn)染單基因TRAIL對 照組的C6細(xì)胞只表達(dá)TRAIL蛋白基因，轉(zhuǎn)染單基因CD對照組的C6細(xì)胞只 表達(dá)CD蛋白基因，只有轉(zhuǎn)染CD-TRAIL聯(lián)合治療組的C6細(xì)胞不但表達(dá)CD 蛋白基因而且表達(dá)TRAIL蛋白基因。
凋亡的最終發(fā)生與一系列caspase蛋白酶級聯(lián)激活密切相關(guān)，caspase-3檢 測結(jié)果也證實(shí)，TRAIL和CD基因轉(zhuǎn)染組有明顯的兩個(gè)條帶，表明細(xì)胞中 caspase-3蛋白被激活，酶解為兩部分，腫瘤細(xì)胞發(fā)生大量凋亡；而對照組第 二條帶很淺，表明機(jī)體對抗腫瘤細(xì)胞時(shí)也有少量的caspase-3蛋白被酶解，但 是酶解量遠(yuǎn)低于TRAIL和CD基因轉(zhuǎn)染組。
實(shí)施例3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
一、腦內(nèi)原位接種和重組質(zhì)粒聯(lián)合治療
用1%戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠頭部固定在 腦立體定向儀上，剪去頭頂毛發(fā)，消毒后鋪洞巾。內(nèi)眥連線與頭部正中矢狀面 交點(diǎn)向后縱向切開頭皮約lcm，分離暴露顱骨。在立體定位儀引導(dǎo)下，根據(jù)大 鼠頭部立體定向解剖圖譜確定確定右尾狀核靶點(diǎn)，于冠狀縫后lmm，中線右旁開3mm，用牙科鉆鉆一小孔，勿損傷硬腦膜。
10(^1微量注射器抽取大鼠星形膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞懸液1 Opl( 1 X 106 C6細(xì)胞)， 沿骨孔緩慢垂直進(jìn)針至硬腦膜下5mm，注射速度為lpl/min，共注射10min， 注射完畢后留針5min，緩慢拔針，接種的細(xì)胞量1X109只。骨孔用骨蠟封 閉，縫合切口后消毒皮膚，則完成腦內(nèi)原位接種，整個(gè)接種過程在層流超凈工 作臺進(jìn)行，術(shù)后無需抗感染治療。
腦內(nèi)接種后第三天用原位治療，大鼠重新固定于立體定向臺上，沿原道注 入治療基因。
45只大鼠分五組，每組9只，分別接受如下五組治療基因的注入
(1) 單基因CD腦內(nèi)治療組即實(shí)施例1制備所得FA-PEG-PEI/ (pIRES2-EGFP/CD)復(fù)合物；
(2) 單基因TRAIL腦內(nèi)治療組即實(shí)施例1制備所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/TRAIL)復(fù)合物；
(3) CD-TRAIL聯(lián)合治療組即本發(fā)明的納米載體組合物，也就是實(shí)施例 1制備所得FA-PEG-PEI/ (pIRES2- EGFP/TRAIL)復(fù)合物和FA-PEG-PEI/
(pIRES2-EGFP/CD)復(fù)合物的組合；
(4) pIRES2- EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組；
(5) PBS腦內(nèi)處理對照組。
治療基因注入2天后，再向試驗(yàn)大鼠的腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC) 500 mg/kg ，注射10天，對各組動(dòng)物治療后動(dòng)物行為及荷瘤鼠治療前后生存期進(jìn) 行觀察。
二、實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo) '1、 觀察大鼠生活狀態(tài)及生存周期
大鼠腦內(nèi)原位接種后第3天時(shí)恢復(fù)正常覓食、飲水；
原位基因治療后第2周，PBS腦內(nèi)處理對照組和pIRES2- EGFP空質(zhì)粒腦 內(nèi)處理對照組出現(xiàn)顱內(nèi)高壓癥狀，表現(xiàn)為皮毛不整潔，毛色失去光澤，活動(dòng)、 覓食、飲水減少，體質(zhì)量減輕，反應(yīng)遲鈍。接種2周后癥狀明顯加重，出現(xiàn)眼 周淤血，平均每天進(jìn)食2g左右，體重下降5.5g，部分出現(xiàn)惡液質(zhì)，四肢抽搐， 昏迷，甚至死亡等。接種10天內(nèi)有2例死亡，20天內(nèi)PBS腦內(nèi)處理對照組和 pIRES2- EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組全部死亡。
單基因CD治療組和單基因TRAIL治療組大鼠在接種3周內(nèi)較活潑，無 死亡。第4周各有3只死亡，余6例均于第6周后處于瀕死狀態(tài)并死亡，最長 生存時(shí)間分別為40和44天。
而CD-TRAIL聯(lián)合治療組大鼠術(shù)后2天恢復(fù)正常覓食、飲水，興奮、體 質(zhì)量呈明顯上升趨勢，第32天死亡第1只，40天內(nèi)死亡2只，第43-55天死 亡5只，而有2只一直存活，未見上述癥狀。
大鼠接種后CD-TRAIL聯(lián)合治療組大鼠術(shù)后恢復(fù)快，行為更接近正常，-而且30天內(nèi)無一死亡，.治療效果明顯好于其它四組。
2、 病理解剖學(xué)檢査
大鼠于瀕死前即取全腦，待解剖出大鼠全腦標(biāo)本，按大鼠腦表面的接種刺 刺點(diǎn)做冠狀切口 ，觀察各組腫瘤生長情況，并按垂直和水平方向測量腫瘤大小， 腫瘤體積-aSxbX :n/6 (a為腫瘤的短徑，b為腫瘤的長徑)。
病理解剖學(xué)觀察結(jié)果如圖4所示
圖4 (1)可看出解剖大鼠時(shí)未發(fā)現(xiàn)顱外腫瘤生長；圖4 (2)禾P (3)中，？88腦內(nèi)處理對照組和？111￡82-EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi) 處理對照組大鼠右尾狀核區(qū)均有團(tuán)塊狀腫瘤形成，腫瘤呈不規(guī)則形或橢圓形， 無包膜，邊界較清楚，并向周圍腦組織浸潤性生長，中線結(jié)構(gòu)明顯移位，占位 效應(yīng)明顯，.切開后的腫瘤為實(shí)質(zhì)性，色白呈魚肉狀，瘤內(nèi)出血壞死明顯；
圖4 (4)和圖4 (5)中，單基因CD治療組和單基因TRAIL治療組死亡 較早的大鼠腫瘤標(biāo)本可見腫瘤呈圓形或橢圓形浸潤生長，較周圍正常組織顏色 深，境界清楚，周邊腦組織腫脹，中線結(jié)構(gòu)向?qū)?cè)移位，瘤內(nèi)出血及壞死較對 照組輕；
圖4 (6)中，CD-TRAIL聯(lián)合治療組生存期長的大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)腫瘤 較小，有明顯軟化灶，占位效應(yīng)不明顯。
不同處理組大鼠的腫瘤平均體積如圖5所示
圖5 (1)和(2)中，？88腦內(nèi)處理對照組和？1虹82-EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi) 處理對照組大鼠的腫瘤大小相仿，平均體積分別為(172.28±8.24) mm3和 (172.03±8.48) mm3;
圖5 (3)和(4)中，單基因CD腦內(nèi)治療組和單基因TRAIL腦內(nèi)治療組 腫瘤平均體積分別為(90.37±4.14) mm3和(88.80±6.14) mm3;
圖5 (5)中，CD-TRAIL聯(lián)合治療組腫瘤平均體積為(53.13±3.72) mm3。
圖5中各組的腫瘤體積再次證實(shí)了 CD-TRAIL聯(lián)合治療組的治療效果要 明顯好于對照組和單基因治療組。
三、組織病理學(xué)檢査
當(dāng)腫瘤標(biāo)本取出固定后，進(jìn)行切片處理，每個(gè)標(biāo)本取切片共12張，10張 行免疫組化檢測，兩張做HE染色。HE染色的操作按照HE染色試劑盒說明'書。
HE染色見大鼠腫瘤由包膜、C6膠質(zhì)瘤和中心缺血壞死區(qū)組成，符合膠質(zhì) 瘤的形態(tài)特征，五個(gè)實(shí)驗(yàn)組的HE染色結(jié)果如圖6所示
圖6 (1)為正常大鼠腦組織HE染色。腦組織結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞核染色 鮮艷，核無明顯腫脹，核漿對比度好，無共染現(xiàn)象，未見擴(kuò)張的毛細(xì)血管；
圖6 (2)中，pIRES2-EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理對照組大鼠腫瘤細(xì)胞生長活 躍且呈浸潤性生長，腦組織與腫瘤交界處雖能見到腫瘤細(xì)胞浸潤，但仍能見到 一個(gè)較明顯的界線，瘤細(xì)胞豐富密集，呈長梭形，多數(shù)瘤細(xì)胞分化較低，偶見 瘤巨細(xì)胞，核大深染，病理性核分裂象多見，血管增生較豐富，在腫瘤中心部 位可見大量壞死的腫瘤細(xì)胞，有典型的柵欄狀壞死，周邊圍繞著膠質(zhì)瘤細(xì)胞；
圖6 (3)和(4)中，單基因CD治療組和單基因TRAIL治療組 腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞之間出現(xiàn)大量空泡；
圖6 (5)中，CD-TRAIL聯(lián)合治療組空泡更多，甚至出現(xiàn)大的囊狀空泡， 腫瘤細(xì)胞基本消失，.纖維結(jié)締組織增生明顯。
由圖6可以看出，CD-TRAIL聯(lián)合治療組的治療效果較好，腫瘤細(xì)胞基本. 消失，而其它四組則以腫瘤細(xì)胞多見，對照組更是常見壞死與出血區(qū)。
四、免疫組織化學(xué)檢査
切片常規(guī)脫蠟至水；微波修復(fù)抗原將切片浸入檸檬酸緩沖液，微波爐火 力打至高檔加熱至沸騰后，再將火力降至低檔，加熱15分鐘后，自然冷卻至 室溫；PBS清洗5minx3次；切片入3% 11202/甲醇溶液浸泡15min，消除內(nèi)源 性過氧化物酶；PBS清洗5minx3次；用體積分?jǐn)?shù)10%正常山羊血清室溫封閉 20min，甩去多余液體，不洗；滴加CD或TRAIL—抗(1: 100) ， 4'C孵育過夜，PBS清洗2minx3次;滴加生物素化二抗(1: 100) ， 37。C孵育30min， PBS清洗2minx3次;滴力口 SABC， 37。C孵育30min; PBS清洗5minx4次；新 鮮配制DAB，滴加顯色；流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂 膠封片，光鏡下觀察。.
免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖7所示
圖7 (1)和(2)中，正常大鼠腦組織和？111￡82- EGFP空質(zhì)粒腦內(nèi)處理 對照組由于沒有CD-TRAIL兩種蛋白的表達(dá)，因此細(xì)胞呈藍(lán)色；
圖7 (3)和(4)中，單基因CD治療組和單基因TRAIL治療組 腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)見棕色染色，證明分別有CD和TRAIL蛋白表達(dá)；
圖7 (5)中，CD-TRAIL雙基因聯(lián)合治療組，腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)棕色染色 深染，表明有CD和TRAIL蛋白表達(dá)。一種納米載體組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉 中山大學(xué)
<120〉 一種納米載體組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
〈130〉
<160〉 4
<170〉 Patentln version 3.5
<210〉 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400〉 1
tatcccaacg gtgaagcg 18
〈210〉 2
〈211〉 20
<212> 腿
<213> 人工序列
<400〉 2
tcgatgagac ggtcgtattt 20
<210〉 3
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<400> 3
agagtagcag ctcacataa 19
<210〉 4
〈211〉 18
<212> DNA <213>人工序列
〈400〉 4
atgattccca ggagttta 18
19
權(quán)利要求
1、一種納米載體組合物，其特征在于該組合物是由分別包含CD基因和TRAIL基因的質(zhì)粒與納米顆粒結(jié)合制備而得，或該組合物是由納米顆粒和包含CD基因的質(zhì)粒結(jié)合得到組分1，再由納米顆粒和包含TRAIL基因的質(zhì)粒結(jié)合得到組分2，組分1和組分2混合得到納米載體組合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述納米載體組合物，其特征在于所述包含CD基因的 質(zhì)粒與納米顆粒的N/P比為5: 1~30: 1，所述包含TRAIL基因的質(zhì)粒與納米顆 粒的N/P比為5: 1~30: 1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述納米載體組合物，其特征在于所述包含CD基因的 質(zhì)粒與納米顆粒的N/P比為15: 1，所述包含TRAIL基因的質(zhì)粒與納米顆粒的 N/P比為15: 1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述納米載體組合物，其特征在于所述納米顆粒為 FA-PEG-PEI或PEG-PEI 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述納米載體組合物，其特征在于所述納米顆粒為 FA-PEG-PEI。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述納米載體組合物，其特征在于所述包含CD基因的 質(zhì)粒和包含TRAIL的質(zhì)粒均為真核表達(dá)載體。
7、 權(quán)利要求l所述納米載體組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物為抗腦惡性膠質(zhì) 瘤藥物、抗乳腺癌藥物、抗胃癌藥物、抗皮膚癌藥物、抗大腸癌藥物或抗肺癌 藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種納米載體組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，該組合物是由包含CD基因的質(zhì)粒、包含TRAIL基因的質(zhì)粒與納米顆粒結(jié)合制備而得。本發(fā)明的納米載體組合物選擇PEG-PEI和FA-PEG-PEI作為傳輸基因治療藥物的載體，不但充分利用了PEI可有效復(fù)合DNA，具有獨(dú)特的“質(zhì)子緩沖”功能，能夠破壞酸性溶酶體并釋放所負(fù)載的DNA，從而可獲得理想的DNA傳送效果和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢，而且FA的加入也使得載體具有了更高的靶向性。本發(fā)明采用CD基因和TRAIL基因聯(lián)合作用于病變位置，與這兩個(gè)基因分別單獨(dú)治療腫瘤相比，本發(fā)明的聯(lián)合基因治療其腫瘤治療效果更加顯著，因此本發(fā)明可用于制備抗腫瘤藥物，如抗腦惡性膠質(zhì)瘤藥物等。
文檔編號A61P35/00GK101524548SQ20091003878
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者蕾 何, 何明亮, 帥心濤, 英 彭, 兵 梁 申請人:中山大學(xué)