專利名稱：：猴耳環(huán)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥制品中測定有效成分的方法，具體是測定猴耳環(huán)提取物及其制劑中7-氧-沒食子?；?5，3'，4，5'-四羥基黃烷含量的方法。
背景技術(shù)：
：猴耳環(huán)為豆科含羞草亞科圍涎樹屬植物猴耳環(huán)[PithecellibiumclypeariaBenth]。猴耳環(huán)為喬木，藥用部分為其嫩枝葉，猴耳環(huán)又名圍涎樹、雞三樹等，民間用于燒傷、燙傷的治療。由猴耳環(huán)植物的水提物制成的猴耳環(huán)消炎膠囊和猴耳環(huán)消炎片已收載于"中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)"中，在臨床上用于治療上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃體炎和急性腸炎等，根據(jù)國家衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第6冊(猴耳環(huán)消炎膠囊WS3-B-1249-92和猴耳環(huán)消考片WS3-B-1248-92)，控制猴耳環(huán)藥品的質(zhì)量方法是測定沒食子酸的含量，但沒食子酸并不是猴耳環(huán)提取物中特有的有效成分，沒食子酸是可水解鞣質(zhì)的組成部分，在大多數(shù)植物中都存在，用其含量指標(biāo)作為控制猴耳環(huán)藥品質(zhì)量沒有專屬性，要測定猴耳環(huán)提取物中抗菌消炎的有效成分含量才能反應(yīng)其產(chǎn)品的質(zhì)量，根據(jù)研究猴耳環(huán)提取物中的主要有效成分是7-氧-沒食子?；?5,3'，4'，5'-四羥基黃垸，在專利zL200410051988.0中簡稱猴耳環(huán)酚I，為此，有必要尋找一種更有效的作為控制猴耳環(huán)制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是測定猴耳環(huán)提取物及其制劑中7-氧-沒食子?；?，3'，4'，5-四羥基黃垸的含量，作為控制猴耳環(huán)產(chǎn)品質(zhì)量的方法。7-氧-沒食子?；?5，3',4'，5'-四羥基黃烷的英文名為7-O-gallloyltricetifavan，簡稱猴耳環(huán)酚I(以下同)結(jié)構(gòu)為OHOH;為實(shí)施本發(fā)明的目的，控制猴耳環(huán)水提取物及其制劑質(zhì)量的方法，是用高效液相色譜法測定產(chǎn)品中7-氧-沒食子?；?5，3'，4'，5'-四羥基黃烷的含量，具體是按下述步驟進(jìn)行一、色譜條件.色譜柱用十八垸基鍵合硅膠作填充料，簡稱C18色譜柱，具體可采用型號為zorbaxEclipseXDB-C18的色譜柱或ZorbaxSB-C18色譜柱或zorbax300Extend色譜柱或zorbaxsb-aq，其中以zorbaxEclipseXDB-C18Analytical的色譜柱為佳。流動相用0.4%(w/v)磷酸水溶液和甲醇進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長275±5nm;檢測溫度1525°C;流速lml/min;-理論塔板數(shù)按7-氧-沒食子?；?5，3'，4'，5'-四羥基黃烷計(jì)算，應(yīng)不低于2000;二、對照品溶液的制備精密稱取7-氧-沒食子酰基-5，3'，4'，5'-四羥基黃烷,加甲醇溶解配成每0.2mg/ml濃度的溶液，搖勻，即得，具體操作時可以稱取7-氧-沒食子?；?5，3'，4'，5'-四羥基黃垸5mg，加甲醇溶解定容至25ml，搖勻，即得；三、供試品溶液的制備1、猴耳環(huán)提取物供試品溶液制備取猴耳環(huán)水提取物干品280380mg至25ml容量瓶中，加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲30分鐘，補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，即得；或2、猴耳環(huán)消炎膠囊供試品溶液的制備取本品10粒，除去膠囊殼，內(nèi)容物混合均勻，精密稱取330430mgmg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲30分鐘，補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，即得；'或3、猴耳環(huán)消炎片供試品溶液的制備取本品20片，研成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取380480mg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲2050分鐘，甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)消炎片供試品溶液；或4、猴耳環(huán)消炎顆粒供試品溶液的制備取本品5袋，研成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取38004800mg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲2050分鐘，甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)消炎顆粒供試品溶液；'四、測定分別精密吸取對照品溶液510ix1及供試品溶液510y1，注入液相色譜儀，依法測定，用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算，即得。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單快速，準(zhǔn)確可靠，靈敏度，精密度和回收率高，重現(xiàn)性好，采用本發(fā)明能更有效的控制猴耳環(huán)提取物及其制劑產(chǎn)品的質(zhì)量。圖1用Zorbax300A300Extend(4.6X250跳5um)色譜柱的HPLC色譜圖。圖2用Zorbaxsb-aq(4.6X250咖，5um)色譜柱的HPLC色譜圖。圖3用EclipseXDB-C18(4.6X150mm，5um)色譜柱的HPLC色譜圖。圖4用ZorbaxSB-C18(4.6X150mm，5um)色譜柱的HPLC色譜圖。圖5猴耳環(huán)水提取物供試品梯度洗脫的HPLC色譜圖。圖6猴耳環(huán)酚I標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。下面通過實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、高效液相色譜法測定猴耳環(huán)水提取物中猴耳環(huán)酚I含量的方法研究1、儀器與樣品儀器AgilentIIOO系列高效液相色譜儀，自動進(jìn)樣器，檢測器二極管陣列檢測器。試劑超純水，甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，其它均為分析純。樣品沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；猴耳環(huán)酚I由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供，純度98.3%;猴耳環(huán)水提取物由廣州萊泰制藥公司自制，按猴耳環(huán)消炎片(WS3-B-1248-92)干浸膏制備方法制備。干膏收率為18%2、方法與結(jié)果2.l溶液的制備2.1.1對照品溶液的制備2.1.1.1猴耳環(huán)酚I對照品溶液的制備精密稱取猴耳環(huán)酚I5mg，加甲醇溶解定容至25ml，搖勻，即得。2.1.1.2沒食子酸對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸2mg，加甲醇溶解定容至25ml，搖勻，即得。2.1.2供試品溶液的制備取猴耳環(huán)水提取物干品300mg至25ml容量瓶中，加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲30分鐘(50-250W，40-100Hz)，加甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)水提取物供試品溶液；2.2檢測波長的選擇紫外全波長掃描，二極管陣列檢測器檢測猴耳環(huán)供試品的三D圖譜，在275.16nm處，各主要色譜峰均有最大吸收，故選擇其為本含量測定方法的檢測波長。2.3色譜柱的選擇因不同的色譜柱柱效可能有差異，因此進(jìn)行了色譜柱的比較，對不同型號的RPC18柱進(jìn)行比較。共試驗(yàn)了四種C18色譜柱，包括zorbax300Extend(4.6X250咖)，zorbaxsb-aq(4.6X250咖)，zorbaxEclipseXDB-C18Analytical(4.6X150mm，5Mm)，ZorbaxSB-Cl8(4.6X150咖)。從中選了分離度較好、出峰較快的zorbaxEclipseXDB-C18Analytical(4.6X150mm)。分離效果分別見附圖1附圖4。2.4流動相的選擇經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，采用流動相A:0.4%磷酸水溶液，B:甲醇，線性梯度洗脫條件分離效果最好，分析時間也比較合理，分離效果見圖5時間(min)03811141922173045B%15152525353540405050A%858575756565606050502.5、色譜條件的確定色譜柱；zorbaxEclipseXDB-C18Analytical(4.6X150咖)；檢測波長275nm:檢測溫度15-25°C;流速lml/min;進(jìn)樣量510叱；流動相A:甲醇；B:0.4%磷酸水溶液；梯度洗脫:時間(min)03811141922273035A%15152525353540405050B%858575756565606050502.6線性關(guān)系考察將已配好的猴耳環(huán)酚I對照品溶液，分別以l、3、5、7、9ri注入色譜儀，按色譜條件測定各峰峰面積。以進(jìn)樣量(Pg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=6947.4X-10.643，結(jié)果見圖6。Y=6947.4X-10.643，R2=0.9995，猴耳環(huán)酚I在0.0970.872l^g之間與峰面積有良好的線性關(guān)系。2.7精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣5W，各色譜峰面積比例及RSD如表1所示表l精密度試驗(yàn)峰面積與RSD表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法精密度良好。2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品供試液室溫放置，分別于0小時、3小時、6小時、12小時、18小時及24小時進(jìn)樣，每次進(jìn)樣5ul，測得樣品中猴耳環(huán)酚I峰面積及RSD如表2所示表2穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積與RSDG表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本品在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.9回收率試驗(yàn)稱取已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的猴耳環(huán)酚I對照品，按供試品溶液制備方法操作，測定結(jié)果見表3。表3猴耳環(huán)酚I回收率表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的回收率良好.2.IO樣品測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5yL，依上述色譜條件依法測定，經(jīng)計(jì)算，猴耳環(huán)水提取物中猴耳環(huán)酚1含量為1.52%(干品計(jì))，實(shí)施例2、猴爾環(huán)消炎膠囊劑中猴耳環(huán)酚I的測定1、儀器與樣品儀器Agilent1100系列高效液相色譜儀，自動進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器。試劑超純水，甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，其它均為分析純。樣品猴耳環(huán)酚I由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供，純度98.3%;猴耳環(huán)膠囊由廣州萊泰制藥有限公司生產(chǎn)；批號為080101、080102、080201。2、方法與結(jié)果2.l色譜條件色譜柱；zorbaxEclipseXDB-C18Analytical(4.6X150mm);檢測波長275nm;檢測溫度18°C;流速lml/min;進(jìn)樣量:5叱；流動相A:甲醇；B:0.4%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時間(min)03811141922273035A%15152525353540405050B%858575756565606050502.2對照品溶液的制備精密稱取猴耳環(huán)酚I5mg，加甲醇溶解定容至25ml，搖勻，即得。2.3供試品溶液的制備取本品10粒，除去膠囊殼，內(nèi)容物混合均勻，精密稱取380mg,轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲30分鐘，補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，用0.45Mm微孔濾膜過濾，即得.2.4樣品測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5pL，依法測定，外標(biāo)法計(jì)算3批猴耳環(huán)膠囊猴耳環(huán)酚I含量(批號080101、080102、080201)，結(jié)果見表4。表4猴耳環(huán)消炎膠囊含量測定結(jié)果藥品名稱批號規(guī)格稱樣量(mg)峰面積含量(mg/粒)猴耳環(huán)消炎膠囊0801010.4g/粒368.6296.558296.8685.04297.169猴耳環(huán)消炎膠囊0801020.4g/粒390.9287.910287.2434.88286.677猴耳環(huán)消炎膠囊0802010.4g/粒383.4269.312263.3244.48258.237實(shí)施例3、猴爾環(huán)消炎片中猴耳環(huán)酚I的測定1、儀器與樣品8儀器Agilent1100系列高效液相色譜儀，自動進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器。試劑超純水，甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，其它均為分析純。樣品猴耳環(huán)酚I由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供，純度98.3%;猴耳環(huán)消炎片由廣州萊泰制藥有限公司生產(chǎn);批號為060501、060502、060503。2、方法與結(jié)果2.1色譜條件同實(shí)施例22.2對照品溶液的制備同實(shí)施例22.3供試品溶液的制備取本品20片，研成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取430mg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲20--50分鐘，甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)消炎片供試品溶液；2.4樣品測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5^L,依法測定，計(jì)算3批猴耳環(huán)消炎片猴耳環(huán)酚I含量(批號060501、060502、060503)，結(jié)果見表5。表5猴耳環(huán)消炎片含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例4、猴爾環(huán)消炎顆粒中猴耳環(huán)酚I的含量測定1、儀器與樣品儀器AgilentIIOO系列高效液相色譜儀，自動進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器。試劑超純水，甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，其它均為分析純。樣品猴耳環(huán)酚I由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供，純度98.3%;猴耳環(huán)消炎顆粒由廣州萊泰制藥有限公司生產(chǎn)；批號為080801、080802、080901。2、方法與結(jié)果2.1色譜條件同實(shí)施例22.2對照品溶液的制備同實(shí)施例22.3供試品溶液的制備取本品5袋，研成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取4000mg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲2050分鐘，甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45Mm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)消炎顆粒供試品溶液。2.4樣品測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液5wL，依法測定，外標(biāo)法計(jì)算3批猴耳環(huán)消炎顆粒猴耳環(huán)酚I含量(批號080801、080802、080901)，結(jié)果見表6。表6猴耳環(huán)消炎顆粒含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種猴耳環(huán)提取物及其固體制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于用高效液相色譜法測定產(chǎn)品中7-氧-沒食子?；?5，3’，4’，5’-四羥基黃烷的的含量，具體是按下述步驟進(jìn)行一、色譜條件色譜柱C18色譜柱流動相0.4％(w/v)磷酸水溶液和甲醇進(jìn)行梯度洗脫檢測波長275±5nm檢測溫度15～25℃流速1ml/min理論塔板數(shù)按7-氧-沒食子?；?5，3’，4’，5’-四羥基黃烷計(jì)算，應(yīng)不低于2000；二、對照品溶液的制備精密稱取7-氧-沒食子?；?5，3’，4’，5’-四羥基黃烷，加甲醇溶解配成每0.2mg/ml濃度的溶液，搖勻，即得；三、供試品溶液的制備1、猴耳環(huán)水提取物供試品溶液制備取猴耳環(huán)水提取物干品280～380mg至25ml容量瓶中，加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲30分鐘，補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜過濾，即得；或2、猴耳環(huán)消炎膠囊供試品溶液的制備取本品10粒，除去膠囊殼，內(nèi)容物混合均勻，精密稱取330～430mgmg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲30分鐘，補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜過濾，即得；或3、猴耳環(huán)消炎片供試品溶液的制備取本品20片，研成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取380～480mg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲20～50分鐘，甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)消炎片供試品溶液；或4、猴耳環(huán)消炎顆粒供試品溶液的制備取本品5袋，研成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取3800～4800mg，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，閉塞，超聲20～50分鐘，甲醇補(bǔ)足至25mL，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜過濾，制成猴耳環(huán)消炎顆粒供試品溶液；四、測定分別精密吸取對照品溶液5～10μl及供試品溶液5～10μl，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算，即得。2、根據(jù)權(quán)利要求1所說的猴耳環(huán)水提取物及其固體制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于色譜條件中色譜柱的型號為zorbaxEclipseXDB-C18的色譜柱。全文摘要猴耳環(huán)提取物及其固體制劑的質(zhì)量控制方法，涉及藥品中測定有效成分的方法，是用高效液相色譜法測定猴耳環(huán)提取物及其制劑中7-氧-沒食子酰基-5，3′，4′，5′-四羥基黃烷的含量，色譜條件C18色譜柱，0.4％(w/v)磷酸水溶液和甲醇作流動相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為275±5nm，檢測溫度為15～25℃，流速為1ml/min，理論塔板數(shù)按7-氧-沒食子?；?5，3′，4′，5′-四羥基黃烷計(jì)算，應(yīng)不低于2000；用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算測定值，該方法操作簡單快速，準(zhǔn)確可靠，靈敏度，精密度和回收率高，重現(xiàn)性好，能更有效的控制猴耳環(huán)提取物及其制劑產(chǎn)品的質(zhì)量。文檔編號A61P1/00GK101596229SQ20091003864公開日2009年12月9日申請日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者唐芝岳,徐建紅,陳志利,佳雷申請人:廣州萊泰制藥有限公司