專利名稱：納米級(jí)對(duì)比劑和使用方法
納米級(jí)對(duì)比劑和使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用根據(jù)35U. S.C. § 120，本申請(qǐng)要求于2007年12月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申 請(qǐng)No. 60/922，481的優(yōu)先權(quán)。此外，本申請(qǐng)是2006年11月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng) No. 11/595，808和2007年12月27日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/568,936的部分繼續(xù)，這 兩個(gè)是2004年4月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/830, 190的部分繼續(xù)。上面提到的案 列全文在此結(jié)合作為參考。關(guān)于政府資助的研究或開(kāi)發(fā)的聲明在美國(guó)政府的均由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)授予的NSF資金No. 0401627和NSF ERC 資金No. EEC9731643支持下完成了本發(fā)明。美國(guó)政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
在受損脈管系統(tǒng)和微脈管系統(tǒng)中，血管可能顯示通過(guò)血管壁增加的泄漏。其中脈 管系統(tǒng)可能受損的疾病可包括癌癥、中風(fēng)、動(dòng)脈瘤和內(nèi)出血。對(duì)用于識(shí)別泄漏脈管的組合物 和方法的開(kāi)發(fā)將有益于這種狀況的早期檢測(cè)和預(yù)測(cè)。目前，缺乏清楚地且非侵入地識(shí)別和 刻畫泄漏和受損脈管系統(tǒng)的特征的適當(dāng)?shù)呐R床工具。存在對(duì)可用于病人特定的、定制的腫瘤描繪和治療的組合物和方法的相關(guān)需要。 存在用于許多疾病，特別是腫瘤的診斷和治療的納米系統(tǒng)。納米系統(tǒng)提供多功能的可能性， 并且正被積極開(kāi)發(fā)用于活體成像、生物標(biāo)記的生物分子仿形(profiling)和靶向給藥。這 種系統(tǒng)通過(guò)增加在腫瘤點(diǎn)的藥物聚集、減少健康組織的曝光或兩者，提供增強(qiáng)抗癌試劑的 治療指數(shù)的可能性。大多數(shù)固態(tài)腫瘤需要復(fù)雜的微脈管系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)用于它們的生長(zhǎng)。該微血管網(wǎng)絡(luò)包括 密集的發(fā)育不完全的血管系統(tǒng)，具有高扭曲度和通過(guò)脈管壁的增加的泄漏。對(duì)于固態(tài)腫瘤 的化學(xué)治療納米試劑治療的成功至少部分依賴于這些試劑必須經(jīng)由所謂的腫瘤的泄漏脈 管系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤。目前，上述納米系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和有效性是有限的，因?yàn)槿狈m當(dāng)?shù)呐R床工 具，其用于清楚地和非侵入地預(yù)測(cè)腫瘤的血管是否經(jīng)得起以個(gè)體的、病人特定的方式的納 米載體介導(dǎo)的治療，即，確定腫瘤是否具有泄漏脈管系統(tǒng)。此外，缺乏適當(dāng)?shù)呐R床工具，其用于將治療劑或抗癌試劑與非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑 共同封裝，以允許對(duì)治療劑或抗癌試劑在對(duì)象身體內(nèi)的生物分布進(jìn)行直接X(jué)射線可視化。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種用于評(píng)估對(duì)象的脈管系統(tǒng)完整性的方法，該方法 包括將組合物引入對(duì)象的脈管系統(tǒng)，該組合物包括脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體封裝一個(gè)或多個(gè)非 放射性對(duì)比增強(qiáng)劑，并且該脂質(zhì)體包括膽固醇，至少一種磷脂，他至少一種聚合物鏈衍生 的磷脂，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm ；生成對(duì)象的脈管系統(tǒng)的圖像；以及分析該圖像 以檢測(cè)對(duì)象的脈管系統(tǒng)中的泄漏。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種用于區(qū)分惡性損害和良性損害的方法，該方法包括將組合物引入感興趣的損害中，該組合物包括脂質(zhì)體，多個(gè)脂質(zhì)體包括至少一種 第一類脂或磷脂；至少一種由一種或多種聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一種能 夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑(stericallybulky excipient)，其中脂質(zhì)體的平均直 徑小于150nm，并且其中多個(gè)脂質(zhì)體封裝至少一種非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑；生成感興趣的損 害的圖像；以及分析該圖像以確定組合物在感興趣的損害中的聚集程度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種用于評(píng)估腫瘤對(duì)納米尺寸的治療劑的可達(dá)性的 方法，該方法包括將組合物引入腫瘤中，該組合物包括脂質(zhì)體，各脂質(zhì)體包括至少一種 第一類脂或磷脂；至少一種由一種或多種聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一種能 夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm，并且其中各脂質(zhì)體 封裝至少一種非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑；生成腫瘤的圖像；以及分析該圖像以確定組合物在腫 瘤中的聚集程度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種組合物，該組合物包括具有平均直徑小于 150nm的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包括第一類脂或磷脂；由一種聚合物衍生的第二類脂或磷脂； 以及能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑；其中脂質(zhì)體將非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑和至少一種 生物活性劑共同封裝。


附示了各種示意性組合物、方法、結(jié)果等等，并僅僅用于圖示各種示意性實(shí)施 方式，所述附圖并入說(shuō)明書中并構(gòu)成說(shuō)明書的一部分。圖1示出費(fèi)希爾344大鼠中的13762MAT BIII乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)曲線。圖2示出在施用導(dǎo)致腫瘤點(diǎn)和正常組織的脈管系統(tǒng)可視化的“高”劑量 (1，244mgl/kg)的示意性納米探針之前(a)和1分鐘之后(b)，使用臨床數(shù)字乳腺X光成像 系統(tǒng)獲得的在其右肋有胸部腫瘤的大鼠的全身圖像。采用“低”劑量(455mgl/kg)的示意 性納米探針注射的不同大鼠的72小時(shí)后對(duì)比圖像(c)顯示腫瘤和脾中的納米探針的聚集， 同時(shí)脈管系統(tǒng)不可見(jiàn)。圖3示出在施用“低”劑量(455mgl/kg)的示意性納米探針之前和24、72和120小 時(shí)之后，使用臨床數(shù)字乳腺X光成像系統(tǒng)獲得的大鼠(圖4所標(biāo)的大鼠3)的全身圖像。圖4示出通過(guò)臨床乳腺X光成像系統(tǒng)成像的在5天中7只大鼠的胸部腫瘤吸收示 意性納米探針(a)與在相同期限中相同7只大鼠的正常組織吸收示意性納米探針(b)的比較。圖5示出對(duì)示意性納米探針具有高吸收性的胸部腫瘤(大鼠3)和對(duì)示意性納米 探針具有中等吸收性的胸部腫瘤(大鼠4)在5天的時(shí)間內(nèi)的乳腺X光成像圖像的示例。圖6示出使用臨床數(shù)字乳腺X光成像系統(tǒng)獲得的大鼠的全身圖像，該大鼠注射有 容量與示意性納米探針的容量相同的鹽水。時(shí)間點(diǎn)與納米探針的大鼠的前和后對(duì)比圖像一致。圖7示出使用臨床數(shù)字乳腺X光成像系統(tǒng)獲得的、在施用“高”劑量的(1，344mgl/ kg)的常規(guī)對(duì)比劑(碘海醇)之前和10、32、63、125、182、315、430和578秒之后的大鼠的全
身圖像。圖8示出將“高”劑量的(1，344mgl/kg)的常規(guī)對(duì)比劑(碘海醇)施用到大鼠上的示意性結(jié)果，其顯示出由于快速腎清除率而可忽略的腫瘤增強(qiáng)。圖9示出由臨床乳腺X光成像系統(tǒng)成像的、在3天的時(shí)段內(nèi)15只大鼠的胸部腫瘤 吸收示意性納米探針的比較。圖10示出對(duì)照(未治療)組和利用脂質(zhì)體阿霉素治療的組的腫瘤生長(zhǎng)曲線。圖11示出對(duì)照(未治療)組和利用脂質(zhì)體阿霉素治療的組的腫瘤生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式提供了納米刻度對(duì)比劑(或“納米探針”)的設(shè)計(jì)、制造、描述和應(yīng)用。通常的納米探針包括脂質(zhì)體組合物，其包括類脂或磷脂、如膽固醇的穩(wěn)定賦形 劑和聚合物衍生的類脂或磷脂。例如，在美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/830，190、11/595，808和 11/568，936中提到了類脂或磷脂、穩(wěn)定賦形劑和聚合物衍生的類脂或磷脂的適當(dāng)示例。脂質(zhì)體組合物通常地封裝對(duì)比增強(qiáng)劑。適當(dāng)?shù)膶?duì)比增強(qiáng)劑例如包括非放射性的碘 化化合物，例如為在美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/830，190、11/595，808和11/568,936中所述的碘 海醇和碘克沙醇。納米探針可以攜帶大量的碘化對(duì)比劑。例如，納米探針可以攜帶高達(dá)每 mL脂質(zhì)體組合物130-200mg的碘化化合物。碘化化合物的通常的濃度可以是大約155mg/
mLo根據(jù)需要或期望，可以包括本領(lǐng)域已知的其它適合的對(duì)比增強(qiáng)劑以通過(guò)其它 成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)成像，如例如超聲波成像、電子束(EBT)、磁共振成像(MRI)、磁共振脈管 成像(MRA)、定位發(fā)射X射線成像和光學(xué)成像，包括熒光和生物發(fā)光。例如，在某些實(shí)施 方式中，適當(dāng)?shù)膶?duì)比劑可以包括熒光染料(如例如熒光素同族硫氰酸鹽(fluorescein iso-thiocynate))和MRI對(duì)比劑，包括鑭系元素氨基羧化物配合物(如釓(III)DTPA及其 變體)。納米探針的平均直徑通常地大約或近似為lOOnm，但是平均直徑可位于從大約15 到大約150nm的范圍內(nèi)。因此，適當(dāng)?shù)闹|(zhì)體平均直徑可以小于大約150nm，小于大約120nm 和小于大約lOOnm。納米探針通常地具有長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間(例如，在大鼠為t1/2 ^ 18h)。例如可以通過(guò)美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/830, 190、11/595，808和11/568，936中以及下 面的實(shí)施例1中公開(kāi)的方法準(zhǔn)備納米探針。一般來(lái)說(shuō)，納米探針可以使用以下X射線診斷技術(shù)的至少一個(gè)來(lái)檢測(cè)計(jì)算機(jī)斷 層成像(CT)、微CT、乳腺X射線成像和胸部X射線。在其它實(shí)施方式中，納米探針可以使用 MRI、磁共振波譜學(xué)、生物發(fā)光成像、超聲、光學(xué)成像和光譜學(xué)的至少一個(gè)來(lái)成像。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種用于評(píng)估對(duì)象的脈管系統(tǒng)完整性的方法。在下面 的實(shí)施例2中例示的方法包括將組合物(納米探針)引入對(duì)象的脈管系統(tǒng)，該組合物包 括脂質(zhì)體，各脂質(zhì)體封裝一個(gè)或多個(gè)非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑，并且各脂質(zhì)體包括膽固醇、 至少一種磷脂，并且至少一種由聚合物鏈衍生的磷脂，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm ； 生成對(duì)象的脈管系統(tǒng)的X射線圖像；以及分析該X射線圖像以檢測(cè)對(duì)象的脈管系統(tǒng)中的泄 漏。根據(jù)該方法的一個(gè)實(shí)施方式，納米探針可以使用基于X射線的成像技術(shù)，非侵入地探詢 并量化血管完整性的程度。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，分析X射線圖像包括從具有很少或沒(méi)有X射線信號(hào) 的區(qū)域區(qū)分具有增強(qiáng)的X射線信號(hào)的區(qū)域。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物的特
6征在于當(dāng)在對(duì)象的脈管系統(tǒng)中存在泄漏時(shí)，與對(duì)象的脈管系統(tǒng)的脈管內(nèi)區(qū)域相比，該組合 物聚集在對(duì)象的脈管系統(tǒng)的脈管外區(qū)域，從而在脈管外區(qū)域中獲得增強(qiáng)的X射線信號(hào)。在 該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，包含少量非放射性碘化化合物的低納米探針劑量可以實(shí)現(xiàn)泄漏 脈管系統(tǒng)的脈管外空間的X射線信號(hào)增強(qiáng)，同時(shí)碘化納米探針的低脈管內(nèi)水平產(chǎn)生很少或 不產(chǎn)生信號(hào)增強(qiáng)。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，生成X射線圖像包括使用CT、微CT、乳腺X射線成 像和胸部X射線的至少一個(gè)生成X射線圖像。在一個(gè)實(shí)施方式中，泄漏指示腫瘤、炎癥、中風(fēng)、動(dòng)脈瘤、傷口恢復(fù)或其它修復(fù)過(guò) 程、以及外傷的至少一個(gè)。這樣，在一個(gè)實(shí)施方式中，納米探針可便于檢測(cè)由各種疾病(如 癌癥、炎癥、中風(fēng)、動(dòng)脈瘤)、由于外傷的內(nèi)出血和由于再生過(guò)程(如傷口恢復(fù))的血管新生 產(chǎn)生的受傷的、泄漏的血管。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種用于區(qū)分惡性損害和良性損害。該方法包括將組 合物(例如，納米探針)引入感興趣的損害中，該組合物包括脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包括至少 一種第一類脂或磷脂；至少一種由一種或多種聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一 種能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm，并且其中該脂 質(zhì)體封裝至少一種非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，組合物特征可在于 該組合物在惡性損害中比良性損害中聚集程度更大，因?yàn)閻盒阅[瘤對(duì)5-200nm大型的微粒 具有增加的滲透性。該方法還包括對(duì)感興趣的損害生成X射線圖像，并且分析該X射線圖 像以確定在感興趣的損害中組合物的聚集程度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種用于評(píng)估腫瘤對(duì)納米尺寸的治療劑的可達(dá)性。 在下面的實(shí)施例4中例示的方法包括將組合物(納米探針)引入感興趣的腫瘤中，該組合 物包括脂質(zhì)體，多個(gè)脂質(zhì)體包括至少一種第一類脂或磷脂；至少一種由一種或多種聚合 物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一種能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑，其中脂質(zhì) 體的平均直徑小于150nm，并且其中多個(gè)脂質(zhì)體封裝至少一種非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑；生成 腫瘤的X射線圖像；以及分析該X射線圖像以確定組合物在腫瘤中的聚集程度。在又一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種組合物。該組合物，在下面實(shí)施例5中提供了其 示例，可包括具有小于150nm的平均直徑的脂質(zhì)體，各脂質(zhì)體包括第一類脂或磷脂；由一 種聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一種能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑；其 中各脂質(zhì)體封裝非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑和至少一種生物活性劑，其包括但不限于化療劑、基 因、蛋白質(zhì)、小分子和肽。在組合物的一個(gè)實(shí)施方式中，第一類脂或磷脂包括1，2_ 二棕櫚酰 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)。在組合物的另一個(gè)實(shí)施方式中，能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位 阻大體積賦形劑包括膽固醇。在組合物的另一個(gè)實(shí)施方式中，由聚合物衍生的第二類脂或 磷脂包括1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚(乙二醇))-000] (mPEG2000-DSPE)。在組合物的另一個(gè)實(shí)施方式中，第一類脂或磷脂、由聚合物衍生的第二 類脂或磷脂和能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑以55 40 5的比率存在。在組合物 的另一個(gè)實(shí)施方式中，化療劑包括阿霉素。在組合物的另一個(gè)實(shí)施方式中，脂質(zhì)體具有大約 IOOnm的平均直徑。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可以允許活體或?qū)崟r(shí)監(jiān)視納米探針生物分布，從而允 許患者特定的治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)如上關(guān)于組合物所述將治療劑與對(duì)比劑共同封裝在納米探針內(nèi)時(shí)，與可以實(shí)現(xiàn)治療劑的非侵入式藥物動(dòng)力學(xué)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，納 米探針進(jìn)一步為多功能性的，其中納米探針可以經(jīng)由抗體和肽有效定位。
可適于共同封裝的一種示意性治療劑是蒽環(huán)類抗生素。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了脂質(zhì)體蒽環(huán)類 抗生素以通過(guò)在改進(jìn)安全性的同時(shí)保持抗癌功效來(lái)增加蒽環(huán)類抗生素的治療指數(shù)。包括 阿霉素的蒽環(huán)類抗生素是最有效的化療劑之一。然而，該化療劑族例證了許多有效的抗癌 藥物的局限在于它們受到有嚴(yán)重問(wèn)題的系統(tǒng)毒性的限制，這導(dǎo)致骨髓抑制、急性反胃和嘔 吐、口腔炎和心臟毒性。聚乙二醇覆蓋(PEGylated)的脂質(zhì)體阿霉素，具有長(zhǎng)的血液循環(huán) (t1/2 ^ 55h)的IOOnm類脂囊已經(jīng)在美國(guó)被批準(zhǔn)用于臨床使用，用于治療難治愈的Kaposi 氏肉瘤和卵巢癌。還研究將PEGylated脂質(zhì)體阿霉素用于乳癌治療，并且與常規(guī)阿霉素 相比已經(jīng)顯示類似的功效和顯著較低的心臟毒性。許多裝入脂質(zhì)體中的其它藥物已經(jīng)被 批準(zhǔn)或正進(jìn)行用于癌癥治療的臨床試驗(yàn)，并且可適于在此描述的共同封裝，其包括但不限 于長(zhǎng)春新堿(vineristine)、勒托替康(Iurtotecan)、全反式維甲酸(alltransretinoic acid)、鉬化合物、annamycin和DNA質(zhì)粒編碼HLA-B7和β 2小球蛋白。
在某些實(shí)施方式中，用于檢測(cè)組合物的適當(dāng)?shù)某上窦夹g(shù)可以例如包括下面的X射 線診斷技術(shù)的至少一種計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)、微CT、乳腺X射線成像和胸部X射線。在其 它實(shí)施方式中，納米探針可以使用MRI、超聲和光學(xué)成像的至少一種成像或檢測(cè)，該光學(xué)成 像包括熒光或生物發(fā)光成像。實(shí)施例實(shí)施例1-示意性納米探針的準(zhǔn)備和描繪在70°C連續(xù)攪拌和加熱下，通過(guò)將碘克沙醇粉末(從GE Healthcare的Visapaque 320冷凍脫水)溶解到超純水準(zhǔn)備高濃度碘(600mgl/mL)。脂質(zhì)體酒精溶液在70°C與碘溶 液水合，該脂質(zhì)體酒精溶液包含摩爾比55 40 5的1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷 酸膽堿(DPPC)、膽固醇和1，2_ 二棕櫚酰基-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚 (乙二醇))_2000] (Mpeg2OOO-DSPE)，然后在 LipexThermoline 擠壓機(jī)(Northern Lipids, Vancouver，加拿大)上順序擠壓。這得到聚乙二醇穩(wěn)定(PEGylated)的脂質(zhì)體的中心水核 心內(nèi)的碘溶液的封裝。針對(duì)使用100，000MWC0滲析管的300mM NaCl，通過(guò)使用與脂質(zhì)體的 內(nèi)部碘化相相同滲透壓的鹽溶液(300mM NaCl)進(jìn)行兩天滲析替換自由的未封裝的碘克沙 醇。接下來(lái)通過(guò)使用具有50nm截止孔徑的MicroKros模塊(Spectrum Laboratories，力口禾Ij 福尼亞)滲濾而濃縮，脂質(zhì)體碘和類脂含量分別測(cè)量為155mg/ml (全部封裝的)和165mM。 脂質(zhì)體的平均直徑通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射確定為96mm(sd = 8nm)。配方設(shè)計(jì)的596m0sm/kg水同 滲重摩允許靜脈注射，因?yàn)橹|(zhì)壁可以維持期望在等滲環(huán)境中出現(xiàn)的等滲壓。實(shí)際上，在針 對(duì)等滲的磷酸鹽緩沖鹽水的微晶泄漏體外試驗(yàn)中，顯示了在三天的時(shí)間內(nèi)封裝碘的可忽略 的泄漏(小于初始有效載荷的5% )。實(shí)施例2-使用實(shí)施例1的納米探針的成像研究在通過(guò)將乳腺癌細(xì)胞(來(lái)自ATCC的13762MAT Bill)移植到費(fèi)希爾母大鼠的右肋 形成的大鼠胸部腫瘤模型中測(cè)試實(shí)施例1的納米探針。成像研究在腫瘤移植后七天開(kāi)始 (腫瘤體積大約440mm3，參見(jiàn)圖1的腫瘤生長(zhǎng)曲線)。腫瘤體積(η = 15)通過(guò)測(cè)徑法獲得。利用商業(yè)化的數(shù)字乳腺X光成像系統(tǒng)(Senographe 2000D, GE Healthcare)，在 49kVp和63mAs，利用銠靶和0. 3mm厚度的額外銅過(guò)濾器，進(jìn)行對(duì)比增強(qiáng)的乳腺X光成像。這些設(shè)置用于成形X射線，以具有對(duì)碘優(yōu)化的能量。在這些條件下，獲得優(yōu)化的X射線頻譜，其 包含具有能量在碘的k邊緣上的最大數(shù)量的X射線，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)乳腺X光成像相比，X射線 劑量顯著減少。利用高劑量的納米探針執(zhí)行初始研究以獲得脈管圖像。在尾部靜脈注射納 米探針后1、5、10和15分鐘后，獲取前對(duì)比圖像(圖2(a))和后對(duì)比圖像。在獲得20mgl/ mL的血液濃度的1，300mgl/kg的納米探針體重劑量，血管清楚可見(jiàn)(圖2(b))。在成人的 情況中，這將對(duì)應(yīng)于大約654ml的納米探針的劑量(假設(shè)5升的血管體積)，這是人類使用 的最高限度。然而，該高劑量用于清楚可視化血管使乳腺X光成像系統(tǒng)能夠檢測(cè)。在監(jiān)視納米探針研究結(jié)果的過(guò)程中，在施用455mgl/kg體重劑量的納米探針后 24,72和120小時(shí)后獲得后對(duì)比圖像和前對(duì)比圖像(指示為t = 0)。這對(duì)應(yīng)于195mg類脂 /kg體重，這比用于臨床實(shí)踐中時(shí)的脂質(zhì)體藥物的最高類脂劑量大約高兩倍。圖2(c)示出 注射納米探針72h后的動(dòng)物圖像。在正常組織中看不見(jiàn)血管(與圖2(b)中觀察的增強(qiáng)脈 管系統(tǒng)相比)，同時(shí)脾和腫瘤被增強(qiáng)。脾增強(qiáng)是期望的，因?yàn)槟[瘤的脈管外空間內(nèi)的脂質(zhì)體 提供用于納米探針的檢測(cè)(當(dāng)期望血管循環(huán)中的最大碘時(shí))，因?yàn)檠褐械牡馑皆诳蓹z 測(cè)閾值之下。圖3顯示對(duì)于5天的時(shí)間段納米探針在腫瘤損害內(nèi)的聚集的時(shí)間線。以相同方式， 在顯示類似行為的后_對(duì)比定義的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)一組動(dòng)物(η = 7)進(jìn)行成像和監(jiān)視。圖4(a) 通過(guò)使用ImageJ軟件(NIH，Bechesda，馬里蘭)量化損害的灰度級(jí)概括了腫瘤增強(qiáng)的時(shí)間 過(guò)程。通過(guò)從其腫瘤減去每個(gè)后對(duì)比值(t > 0)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化腫瘤增強(qiáng)，其示出所述增強(qiáng)在 120h時(shí)間過(guò)程期間緩慢逐漸增加(圖4(a)中指示為大鼠2和6)，而其它腫瘤顯示較快的 增加(圖4(a)中指示為大鼠3，4和5)。另一腫瘤在t = 24h顯示了初始的快速增強(qiáng)，然后 是穩(wěn)定狀態(tài)。在t = 120h，存在具有低增強(qiáng)的損害和具有高很多的增強(qiáng)的損害。該差異表 示泄漏到每個(gè)腫瘤中的不同量的納米探針。由納米探針引起的腫瘤增強(qiáng)的模式繪制在圖4(b)中，并且與相同組中的動(dòng)物的 正常組織或展現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異的對(duì)照組的腫瘤點(diǎn)(不注射試劑)比較。在正常組織中沒(méi)有觀察 到增強(qiáng)，表示血液中的納米探針?biāo)降陀谌橄賆光成像的可檢測(cè)閾值，并且暗示腫瘤組織 的內(nèi)生變化不會(huì)產(chǎn)生這種顯著增強(qiáng)，正如在沒(méi)有探針的損害的情況所見(jiàn)的那樣。圖5示出 了具有高吸收的腫瘤損害和具有中等吸收的腫瘤損害的乳腺X光成像圖像的示例。實(shí)施例3-比較實(shí)施例(對(duì)照組)圖6示出了沒(méi)有注射對(duì)比劑的大鼠(對(duì)照組)的全身乳腺X光成像。另一對(duì)照組 以等效于1，344mgl/mL的高劑量納米探針的碘劑量注射常規(guī)碘化試劑(碘海醇)。(見(jiàn)圖 7)。在注射后的第一分鐘內(nèi)，普通脈管系統(tǒng)和腫瘤損害顯示輕微的增強(qiáng)，但是碘化試劑經(jīng)由 腎快速清除。(見(jiàn)圖8)實(shí)施例4-納米化療成功的非侵入式預(yù)測(cè)在通過(guò)將乳腺癌細(xì)胞(來(lái)自ATCC的13762MAT Bill)移植到費(fèi)希爾母大鼠的右肋 形成的大鼠胸部腫瘤模型中測(cè)試納米探針的預(yù)測(cè)精確度。在腫瘤移植后6天開(kāi)始成像研 究。利用商業(yè)化的數(shù)字乳腺X光成像系統(tǒng)(Senographe2000D，GE Healthcare)，在49kVp和 63mAs，利用銠靶和0.3mm厚度的額外銅過(guò)濾器，執(zhí)行對(duì)比增強(qiáng)的乳腺X光成像。對(duì)動(dòng)物(η =15)注射455mgl/kg體重量的示意性納米探針。圖9從其與對(duì)比值(t = 0)開(kāi)始，通過(guò) 使用ImageJ軟件量化損害的灰度級(jí)來(lái)概括腫瘤增強(qiáng)的時(shí)間過(guò)程(t > 0)?？捎^察到增強(qiáng)曲線顯示不同的模式。緊接在成像期之后(在腫瘤移植后9天)，以IOmg阿霉素每kg體重的 劑量給動(dòng)物注射脂質(zhì)體阿霉素。通過(guò)使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤的大小來(lái)評(píng)估腫瘤對(duì)藥物的反應(yīng)。圖10概括了通過(guò)測(cè) 徑法獲得的所有動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)曲線。各生長(zhǎng)曲線顯示了高可變性，暗示每個(gè)腫瘤對(duì)化療 反應(yīng)不同。顯示較高的納米探針吸收性的動(dòng)物對(duì)治療反應(yīng)較好(較小的腫瘤體積)。為了量化納米探針預(yù)測(cè)對(duì)治療反應(yīng)的關(guān)系，將腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖10)擬合成單一 指數(shù)函數(shù)(即，dv/dt = K—M Xt，其中V是腫瘤體積)，以便計(jì)算生長(zhǎng)率常數(shù)，Kim0 從圖9計(jì)算納米探針吸收曲線的曲線下面積(AUCstt)。在圖11中對(duì)于每個(gè)動(dòng)物的AUC· 繪制每個(gè)動(dòng)物的Kwsi氣高AUCsm意味著納米探針的高腫瘤內(nèi)聚集性，預(yù)測(cè)納米化療的高 成功性，而低K ws^i意味著慢腫瘤生長(zhǎng)或?qū)χ委煹暮玫姆磻?yīng)。棚列5-椒碰丨丨減麵德白句讓本隨細(xì)刮本聯(lián)會(huì)在70°C，包含摩爾比為55 40 5的DPPC、膽固醇和mPEG (2000)-DSPE的脂質(zhì) 體酒精溶液與300mM硫酸銨碘溶液(iohexol :350mgl/ml)水合，然后在Lipex Thermoline 擠壓機(jī)(Northern Lipids，Vancouver，加拿大)上順序擠壓。這得到PEGylated脂質(zhì)體的 中心水核心內(nèi)的碘溶液的封裝。與使用100，000MWC0滲析管的300mM NaCl相反，使用兩 天滲析將與自由的未封裝的碘克沙醇從脂質(zhì)體的外相中移除。然后，針對(duì)磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)溶液，利用IOOkDaMWCO滲析管滲析12h，以建立阿霉素加載的硫酸銨梯度。脂質(zhì)體配方通過(guò)硫酸銨梯度有效地加載阿霉素。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，脂質(zhì)體和阿霉素以 脂質(zhì)體中每Img DPPC有0. Img阿霉素的比率混合。脂質(zhì)體-阿霉素懸浮液在35°C加熱 25分鐘。脂質(zhì)體在室溫下放置一個(gè)晚上，并且在IOOkDa MWCO膜中針對(duì)PBS分析兩次，以 移除未封裝的阿霉素。接下來(lái)通過(guò)使用具有50nm截止孔徑的MicroKros模塊(Spectrum Laboratories，加利福尼亞)滲濾而濃縮，脂質(zhì)體碘和阿霉素含量分別測(cè)量為91mg/mL和 1. 2mg/mL (完全封裝)。脂質(zhì)體的平均直徑通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射確定為102mm (sd = 6nm)。當(dāng)然，不可能為了描述在此提供的組合物、方法等的目的而描述組合物或方法的 每一種可預(yù)期的組合。另外的優(yōu)點(diǎn)和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯然的。因此，本發(fā)明 在其更寬的方面不限于示出和描述的具體細(xì)節(jié)和說(shuō)明性示例。因此，可以偏離這種細(xì)節(jié)而 不偏離申請(qǐng)人的一般發(fā)明性構(gòu)思的精神或范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，優(yōu)化 或操作這些變量的任何一個(gè)可以或?qū)⒁蠡蚴沟眠@些變量的其它的一個(gè)或多個(gè)變得可能， 并且這種優(yōu)化或操作在本實(shí)施例的精神和范圍內(nèi)。盡管提出本發(fā)明的寬度范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似的，但是盡可能精確地告之 了在具體實(shí)施例中提到的數(shù)值。然而，任何數(shù)值固有地包含由它們各自的測(cè)試測(cè)量結(jié)果中 發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)差必然導(dǎo)致的一定誤差。要注意的是，術(shù)語(yǔ)“大約”可以意味著高達(dá)并且包括所 述值的士 10%。例如，“大約10”可以意味著從9到11。此外，盡管已經(jīng)通過(guò)描述實(shí)施例說(shuō)明了組合物、方法等，并且盡管已經(jīng)相當(dāng)詳細(xì)地 描述了各實(shí)施例，但是申請(qǐng)人意圖不在于將權(quán)利要求的范圍限定，或以任何方式限制為這 么詳細(xì)。因此，本申請(qǐng)意圖在于包括落入權(quán)利要求范圍內(nèi)的替換、修改和變形。前述描述并 非意味著限制本發(fā)明的范圍。而是，本發(fā)明的范圍由隨附權(quán)利要求及其等效體來(lái)確定。最后，對(duì)于在詳細(xì)描述和權(quán)利要求中采用的術(shù)語(yǔ)“包括”或“具有”的程度，意圖在 于以類似于術(shù)語(yǔ)“包含”的方式是包含的，如該術(shù)語(yǔ)在用作權(quán)利要求中的過(guò)渡詞使用時(shí)所解釋的。此外，對(duì)于權(quán)利要求中采用的術(shù)語(yǔ)“或”(例如，A或B)，意圖在于意味著“Α或B或 兩者”。當(dāng)申請(qǐng)人意圖指示“只有A或B，但沒(méi)有兩者”時(shí)，將采用術(shù)語(yǔ)“只有A或B而沒(méi)有 兩者”。類似地，當(dāng)申請(qǐng)人意圖指示A、B或C中的“一個(gè)并只有一個(gè)”時(shí)，申請(qǐng)人將采用短 語(yǔ)“一個(gè)并只有一個(gè)”。因此，在此術(shù)語(yǔ)“或”的使用是包含的，而不是排他使用。見(jiàn)Bryan A. Garmer, ADictionary ofModerη Legal Usage 624 (第二片反，1995)。
權(quán)利要求
一種用于評(píng)估對(duì)象的脈管系統(tǒng)完整性的方法，該方法包括將組合物引入對(duì)象的脈管系統(tǒng)，該組合物包括脂質(zhì)體，多個(gè)脂質(zhì)體封裝一個(gè)或多個(gè)非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑，并且多個(gè)脂質(zhì)體包括膽固醇、至少一種磷脂，和至少一種由聚合物鏈衍生的磷脂，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm；生成對(duì)象的脈管系統(tǒng)的圖像；以及分析該圖像以檢測(cè)對(duì)象的脈管系統(tǒng)中的泄漏。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中生成圖像包括生成X射線圖像。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中生成圖像包括在將組合物引入對(duì)象的脈管系統(tǒng)之前 和之后生成圖像。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中分析圖像包括從具有很少或沒(méi)有信號(hào)的區(qū)域區(qū)分具 有增強(qiáng)的信號(hào)的區(qū)域。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該組合物的特征在于當(dāng)在對(duì)象的脈管系統(tǒng)中存在 泄漏時(shí)，與對(duì)象的脈管系統(tǒng)的脈管內(nèi)區(qū)域相比，該組合物在對(duì)象的脈管系統(tǒng)的脈管外區(qū)域 中聚集，從而增強(qiáng)在脈管外區(qū)域中的信號(hào)。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中生成X射線圖像包括使用計(jì)算機(jī)斷層成像、微型計(jì)算 機(jī)斷層成像、乳腺X光成像和胸部X射線中的至少一個(gè)生成X射線圖像。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中生成圖像包括使用MRI、超聲和光學(xué)成像的至少一種 生成圖像，該光學(xué)成像包括熒光或生物發(fā)光成像。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述泄漏指示癌癥、中風(fēng)、動(dòng)脈瘤、愈合以及外傷的 至少一個(gè)。
9.一種用于區(qū)分惡性損害和良性損害的方法，該方法包括將組合物引入感興趣的損害中，該組合物包括脂質(zhì)體，各脂質(zhì)體包括至少一種第一 類脂或磷脂；至少一種由一種或多種聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一種能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm，并 且其中各脂質(zhì)體封裝至少一種非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑；生成感興趣的損害的圖像；以及分析該圖像以確定組合物在感興趣的損害中的聚集程度。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該組合物特征在于該組合物在惡性損害中比良性 損害中聚集程度更大。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中生成圖像包括使用計(jì)算機(jī)斷層成像、微型計(jì)算機(jī)斷 層成像、乳腺X光成像和胸部X射線的至少一個(gè)生成X射線圖像。
12.一種用于評(píng)估腫瘤對(duì)納米尺寸治療劑的可達(dá)性的方法，該方法包括將組合物引入所述腫瘤，該組合物包括脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包括至少一種第一類脂或 磷脂；至少一種由一種或多種聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及至少一種能夠穩(wěn)定脂質(zhì) 體的位阻大體積賦形劑，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于150nm，并且其中脂質(zhì)體封裝至少一種 非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑；生成腫瘤的圖像；以及分析該圖像以確定組合物在腫瘤中的聚集程度。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中生成圖像包括使用計(jì)算機(jī)斷層成像、微型計(jì)算機(jī) 斷層成像、乳腺X光成像和胸部X射線的至少一個(gè)生成X射線圖像。
14.一種組合物，包括具有小于150nm的平均直徑的脂質(zhì)體，多個(gè)脂質(zhì)體包括第一類脂或磷脂；由聚合物衍生的第二類脂或磷脂；以及能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑；其中多個(gè)脂質(zhì)體將非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑和至少一種生物活性劑共同封裝。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中第一類脂或磷脂包括DPPC。
16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中由聚合物衍生的第二類脂或磷脂包括 mPEG (2000)-DSPE。
17.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中第一類脂或磷脂、由聚合物衍生的第二類脂或 磷脂和能夠穩(wěn)定脂質(zhì)體的位阻大體積賦形劑以55 40 5的比率存在。
18.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中生物活性劑包括阿霉素。
19.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中脂質(zhì)體具有大約IOOnm的平均直徑。
20.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中脂質(zhì)體具有小于120nm的平均直徑。
21.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中非放射性對(duì)比增強(qiáng)劑包括碘化合物。
22.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中生物活性劑包括化療劑、基因、蛋白質(zhì)、小分子 和肽的至少一種。
23.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中能夠使用以下的至少一種檢測(cè)該組合物CT、微 CT、乳腺X光成像和胸部X射線、MRI、磁共振頻譜、生物發(fā)光成像、超聲、光學(xué)成像和光譜。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于評(píng)估對(duì)象的脈管系統(tǒng)完整性的組合物和方法，用于區(qū)分惡性損害和良性損害，用于評(píng)估腫瘤對(duì)納米尺寸治療劑的可達(dá)性，用于治療腫瘤，并且用于活體或?qū)崟r(shí)監(jiān)視納米探針的生物分布。
文檔編號(hào)A61B6/00GK101951835SQ200880119329
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者A·安娜普拉加達(dá), E·卡拉薩納西斯, R·M·勒波維奇, R·貝拉姆康達(dá) 申請(qǐng)人:馬維爾生物科學(xué)公司