專利名稱：血小板生成素受體激動劑(TpoRA)殺死急性人骨髓樣白血病細(xì)胞的制作方法
血小板生成素受體激動劑(TpoRA)殺死急性人骨髓樣白血
病細(xì)胞
背景技術(shù)：
2005年在美國診斷出約11,920例急性骨髓性白血病(acute myelogenousleukemia) (AML ； iii 禾爾力 il 個生1 _ Ifi 個生白 il _ (acute myelocytic leukemia)、急性骨髓樣白血病(acute myeloid leukemia)、急性原粒細(xì)胞性白血病 (acutemyeloblastic leukemia)、急'|"生f立細(xì)Ifef生白(acute granulocytic leukemia)
EifflIfiiifiifiI^I (acute nonlymphocytic leukemia))(Surveillance,
Epidemiology and End Results [SEER]Program，2005)。影響成人的最常見急性白血病，即 AML能在任何年齡發(fā)生，但是65歲和更老的成人比年輕人更有可能形成疾病。另外，AML占 兒童急性白血病病例的約15至20%。AML中的惡性細(xì)胞是原粒細(xì)胞。在正常的血細(xì)胞生成中，原粒細(xì)胞是骨髓樣白細(xì)胞 的未成熟前體。然而，在AML中，單一原粒細(xì)胞積累使細(xì)胞“冷凍”于其未成熟狀態(tài)中的遺 傳變化，并阻止分化。單獨(dú)的此類突變不引起白血??；然而，在“分化阻滯”與破壞控制增殖 的基因的其它突變組合時，結(jié)果是細(xì)胞(白血病胚細(xì)胞)的未成熟克隆的不受控制的生長， 所述細(xì)胞不能發(fā)揮正常血細(xì)胞的功能，而且還阻斷正常骨髓細(xì)胞的生成。這導(dǎo)致血液中的 紅細(xì)胞(貧血)、血小板(血小板減少)、和正常白細(xì)胞，特別是嗜中性粒細(xì)胞(嗜中性白血 球減少癥)缺乏，導(dǎo)致AML的臨床呈現(xiàn)。幾乎所有患有AML的患者在診斷后都盡可能快地要求治療。在大多數(shù)患者中，需 要強(qiáng)勢化學(xué)療法(誘導(dǎo)療法)(這期間施用至少兩種不同化療劑)來實(shí)現(xiàn)消退。當(dāng)血細(xì)胞計數(shù)逐漸接近正常且不能在血液或骨髓中鑒定出白血病細(xì)胞時實(shí)現(xiàn)消 退。然而，在消退中，殘留的白血病細(xì)胞仍然存在但沒有活性；它們并不妨礙正常血細(xì)胞發(fā) 育，但是的確具有再次生長并引起白血病復(fù)發(fā)的潛力。為此，通常建議伴有或沒有自體干細(xì) 胞輸注或同種異體干細(xì)胞移植的別的化學(xué)療法。不能在血液中或者通過骨髓檢查檢測出的殘留白血病細(xì)胞在消退期間保留在身 體中。因此，AML的最佳治療通常在實(shí)現(xiàn)了消退后要求另外的強(qiáng)勢療法(鞏固療法)。甚至 在鞏固療法的強(qiáng)勢化學(xué)療法后，一些患者在他們的骨髓中具有殘留的白血病細(xì)胞(頑固性 白血病)，而且其他患者在實(shí)現(xiàn)消退后還遭受“復(fù)發(fā)”。在治療患有AML的患者時要克服的最大困難之一是有些患者的白血病細(xì)胞對化 學(xué)療法藥物不敏感。這能導(dǎo)致用于誘導(dǎo)或維持消退的治療失敗。在白血病細(xì)胞中有三種已知的藥物抗性機(jī)制來保護(hù)其免受化學(xué)療法的作用。第一 種，特定的基因編碼進(jìn)化成保護(hù)原始細(xì)胞免受毒素作用的蛋白質(zhì)(例如P-糖蛋白(多藥抗 性蛋白)、肺抗性蛋白、和乳腺癌抗性蛋白)。這些蛋白質(zhì)等可降低化學(xué)療法在急性白血病 細(xì)胞中的效力。第二種，化學(xué)療法通過誘導(dǎo)加強(qiáng)的和加速的程序性細(xì)胞死亡來利用凋亡基 因途徑。然而，在一些白血病中，這些基因受到下調(diào)或者甚至阻斷，精確阻斷由化學(xué)療法引 起的細(xì)胞死亡。第三種，特定的基因家族在導(dǎo)致患者白血病復(fù)發(fā)的化學(xué)療法抗性細(xì)胞中可 以有活性的。至今，還沒有找到阻斷這些中的一種或另一種途徑的新的成功的臨床辦法。
雖然在過去30年里進(jìn)入消退、保持消退數(shù)年、或者實(shí)際治愈的AML患者的比例升 高了，但是AML仍然是最難治愈的血癌之一。由于此困難，用于治療AML的新療法是必不可 少的。因此，本領(lǐng)域中長時間地、迫切地需要治療此破壞性疾病的新方法。本發(fā)明滿足此需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個實(shí)施方案包括一種治療診斷為患有急性骨髓性白血病的人的方法， 所述方法包括對所述人施用包含血小板生成素受體激動劑(TpoRA)、其衍生物、或變體的組 合物，進(jìn)一步地，其中所述組合物在所述人中抑制白血病細(xì)胞生長和增殖。一方面，在施用 化療劑之前、期間或之后對所述人施用所述組合物。另一方面，以包含TroRA、其衍生物或變 體和藥用載體的藥物組合物對所述人施用所述TroRA、其衍生物或變體。又一方面，對所述 人胃腸外施用所述藥物組合物。再一方面，所述血小板生成素受體激動劑是化合物A。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括一種治療診斷為患有骨髓增生異常綜合征 (myelodysplastic syndrome)的人的方法，所述方法包括對所述人施用包含血小板生成素 受體激動劑(TpoRA)、其衍生物、或變體的組合物，進(jìn)一步地，其中所述組合物在所述人中抑 制白血病細(xì)胞生長和增殖。一方面，在施用化療劑之前、期間或之后對所述人施用所述組合 物。另一方面，以包含TroRA、其衍生物或變體和藥用載體的藥物組合物對所述人施用所述 TroRA、其衍生物或變體。又一方面，對所述人胃腸外施用所述藥物組合物。再一方面，所述 血小板生成素受體激動劑是化合物A。
附圖簡述出于例示本發(fā)明的目的，在附圖中描繪了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。然而，本發(fā)明并 不受限于附圖中所描繪的實(shí)施方案的精確安排和手段。

圖1(包含圖IA至圖1C)是一系列圖，其描繪了巨核細(xì)胞集落形成測定法。圖IA 的圖像描繪了在存在血小板生成素(TPO)的情況中在血纖蛋白凝塊中培養(yǎng)的人CD34+細(xì) 胞。圖IB的圖像描繪了在存在化合物A的情況中在血纖蛋白凝塊中培養(yǎng)的人CD34+細(xì)胞。 圖IC的圖形描繪了用TPO或化合物A刺激后自CD34+細(xì)胞形成的集落數(shù)目。圖2(包含圖2A至圖2C)是一系列圖，其描繪了代表暴露于TPO或化合物A的人 原代白血病細(xì)胞的增殖研究的生長曲線。圖2A是一對圖，其描繪了 1 0、化合物六68)、對 照和DMSO對自兩名急性骨髓樣白血病(AML)患者獲得的原代細(xì)胞的影響。細(xì)胞總數(shù)顯示 在Y軸上，而多個時間點(diǎn)(第0天、第3天、和第4天)顯示在X軸上。圖2B是一對圖，其 描繪了 ΤΡ0、化合物A(SB)、對照和DMSO對自兩名急性淋巴樣白血病(ALL)患者獲得的原代 細(xì)胞的影響。細(xì)胞總數(shù)顯示在Y軸上，而多個時間點(diǎn)(第0天、第1天、第3天、和第5天) 顯示在X軸上。圖2C是一對圖，其描繪了 ΤΡ0、化合物A (SB)、對照和DMSO對自兩名慢性骨 髓樣白血病(CML)患者獲得的原代細(xì)胞的影響。細(xì)胞總數(shù)顯示在Y軸上，而多個時間點(diǎn)(第 0天、第3天、和第6天)顯示在X軸上。圖3(包含圖3A至圖3F)是一系列圖，其描繪了對照、DMS0、2.8yM ΤΡ0、5μΜ化合 物A (SB)、2. 5 μ M化合物A (SB)、和1 μ M化合物(SB)對自AML患者獲得的原代白血病細(xì)胞 生長的影響。圖3A的圖描繪了 1、2. 5、和5μΜ化合物A(SB)和2. 8μΜ TPO對自患者AML857獲得的原代白血病細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖3B的圖描繪了 1、2.5、和5411化合物 A(SB)和2. 8μΜ TPO對自患者AML 794獲得的原代白血病細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖3C 的圖描繪了 1、2. 5、和5μΜ化合物A(SB)和2. 8 μ M TPO對自患者AML 342獲得的原代白 血病細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖3D的圖描繪了 1、2. 5、和5 μ M化合物A(SB)和2. 8 μ MTPO 對自患者AML 332獲得的原代白血病細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖3Ε的圖描繪了 1、2. 5、和 5 μ M化合物A (SB)及2. 8 μ M TPO對自患者AML 774獲得的原代白血病細(xì)胞的細(xì)胞生長的 影響。圖3F的圖描繪了 1、2. 5、和5μΜ化合物A(SB)和2. 8 μ M TPO對自患者AML 759獲 得的原代白血病細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。在所有實(shí)驗中在第3天、第5天和第8天對細(xì)胞 計數(shù)。圖4(包含圖4Α和圖4Β)是一系列圖像，其描繪了對TPO信號傳導(dǎo)中牽涉的激酶 的磷酸化的Western印跡分析。圖4A的圖像描繪了 Western印跡UT&-TP0細(xì)胞。圖4B的 圖像描繪了人祖細(xì)胞⑶34+的Western印跡?；衔顰稱為SB。圖5(包含圖5A至圖5F)是一系列圖，其描繪了增殖測定法的結(jié)果。圖5A的圖描 繪了對自AML患者857獲得的原代白血病細(xì)胞實(shí)施的增殖測定法的結(jié)果。圖5B的圖描繪 了對自AML患者794獲得的原代白血病細(xì)胞實(shí)施的增殖測定法的結(jié)果。圖5C的圖描繪了 對自AML患者342獲得的原代白血病細(xì)胞實(shí)施的增殖測定法的結(jié)果。圖5D的圖描繪了對 自AML患者332獲得的原代白血病細(xì)胞實(shí)施的增殖測定法的結(jié)果。圖5E的圖描繪了對自 AML患者774獲得的原代白血病細(xì)胞實(shí)施的增殖測定法的結(jié)果。圖5F的圖描繪了對自AML 患者759獲得的原代白血病細(xì)胞實(shí)施的增殖測定法的結(jié)果?；衔顰稱為SB。圖6的圖像描繪了對暴露于化合物A和rhTPO兩者的N2C-TP0細(xì)胞中的ERK1/2、 p70S6、S6和STAT5激酶磷酸化的Western印跡分析?；衔顰稱為SB。圖7的圖像描繪了一幅熱圖(heat map)，其顯示了在不同時間點(diǎn)時用TPO對化合 物A刺激的N2C-TP0細(xì)胞中的所有所測試基因的表達(dá)差異。用化合物A刺激的細(xì)胞中的基 因表達(dá)變化用較淺的顏色標(biāo)示。圖8(包含圖8A和圖8B)是一系列圖像，其描繪的熱圖描繪了響應(yīng)TPO對化合物 A刺激的基因調(diào)節(jié)。圖8A的圖像描繪了一幅熱圖，其顯示了 N2C-TP0細(xì)胞中的凋亡途徑中 所牽涉的受用TPO對化合物A刺激上調(diào)的基因。圖8B的圖像描繪了一幅熱圖，其顯示了 N2C-TP0細(xì)胞中的凋亡途徑中所牽涉的受用TPO對化合物A刺激下調(diào)的基因。用化合物A 刺激的細(xì)胞中的基因表達(dá)變化用較淺的顏色標(biāo)示。圖9(包含圖9A和圖9B)是一系列圖像，其描繪的熱圖顯示了用TPO對化合物A 刺激的N2C-TP0細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。圖9A的圖像描繪了一幅熱圖，其顯示了在用TPO 對化合物A刺激的N2C-TP0細(xì)胞中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子。圖9B的圖像描繪了一幅熱圖，其顯示 了在用TPO對化合物A刺激的N2C-TP0細(xì)胞中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子。用化合物A刺激的細(xì)胞中 的基因表達(dá)變化用較淺的顏色標(biāo)示。 圖10是一系列圖像，其描繪了對自診斷為患有AML或ALL的人患者分離的原代細(xì) 胞實(shí)施的凋亡測定法的結(jié)果。上組的三幅小圖描繪了自AML患者774獲得的數(shù)據(jù)，其中將 分離的原代細(xì)胞暴露于對照(左側(cè)小圖)、rhTpo+DMSO (中間小圖)或SB559457(右側(cè)小 圖)，然后測定凋亡。下組的三幅小圖描繪了自ALL患者710獲得的數(shù)據(jù)，其中將原代細(xì)胞 暴露于對照(左側(cè)小圖)、rhTpo+DMSO(中間小圖)或SB559457 (右側(cè)小圖)，然后測定凋亡。軸指示碘化丙啶(PI ；y軸)或膜聯(lián)蛋白v(x軸)染色的細(xì)胞數(shù)目。圖11是一系列圖形，其描繪了在用rhTpo (2.86 μ M)或SB559457 (5 μ Μ)刺激6小 時的原代AML細(xì)胞中對GAPDH(頂部小圖)和Reddl (底部小圖)mRNA水平的定量RT-PCR 分析的比較。圖12是一系列圖像，其描繪了在暴露于rhTpo或SB559457達(dá)1、3、或5小時后在 原代AML細(xì)胞的三種不同樣品(AML 774、AML 794、和AML 971)中對p70S和S6激酶磷酸 化的Western印跡分析的結(jié)果。對照=未刺激的細(xì)胞；TPO =用2. 866 μ M rhTpo+0. 05% DMSO刺激的細(xì)胞；SB =用μ M SB559457刺激的細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過對患有AML的個體施用血小板生成素受體激動劑(TpoRA)、其 衍生物、或變體來抑制人骨髓樣白血病細(xì)胞生長和增殖的方法。在一個實(shí)施方案中，對患有 AML的個體施用TpoRA、其衍生物、或變體。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，對患有AML的個 體施用TpoRA、其衍生物、或變體作為化學(xué)治療方案的一部分。定義除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù) 人員的一般理解具有相同的含義。雖然可以在測試本發(fā)明的實(shí)踐中使用與本文中所描述的 方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述 和要求保護(hù)本發(fā)明時，會使用下列術(shù)語。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文中所使用的術(shù)語僅僅出于描述特定實(shí)施方案的目的，而并 不意圖是限制性的。冠詞“一個/種”在本文中用于指一個/種或超過一個/種(即至少一個/種)的 冠詞語法對象。舉例而言，“一個/種元件”指一個/種或超過一個/種元件。如本文中所使用的，“氨基酸”想要包括天然的和合成的氨基酸兩者，及D和L氨基 酸兩者。“標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸”指天然存在的肽中通常找到的20種L-氨基酸之任一種。“非標(biāo) 準(zhǔn)的氨基酸殘基”指標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以外的任何氨基酸，無論它是以合成方式制備還是衍生自 天然來源。如本文中所使用的，“合成的氨基酸”還涵蓋經(jīng)過化學(xué)修飾的氨基酸，包括但不限 于鹽、氨基酸衍生物(諸如酰胺)、和取代。可以通過甲基化、酰胺化、乙?；蛴媚芨淖冸?的循環(huán)半衰期而沒有不利地影響肽活性的其它化學(xué)基團(tuán)的取代來修飾肽內(nèi)含有的，和特別 是在羧基端或氨基端的氨基酸。另外，肽中可以存在或沒有二硫化物連接。如本文中所使用的，“約”在提及可測量值諸如量、持續(xù)時間等時想要涵蓋自規(guī)定 值起士20%或士 10%，更優(yōu)選士5%，甚至更優(yōu)選士 1%，且還更優(yōu)選士0. 的差異，因為 此類差異對于實(shí)施所公開的方法是合適。術(shù)語“激動劑”和“激動性”在本文中使用時指或描述能夠直接或間接地實(shí)質(zhì)性誘 導(dǎo)、促進(jìn)或增強(qiáng)生物學(xué)活性或受體活化的分子。如本文中所使用的，術(shù)語“化學(xué)療法”指如下的治療過程，其中對診斷為患有癌癥 的個體施用化療劑?；焺┌苡欣貙加邪┌Y的個體施用以治療所述癌癥的藥劑諸 如藥物?；焺┏３０T導(dǎo)細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)凋亡的凋亡誘導(dǎo)劑。細(xì)胞(包括癌細(xì) 胞)能被誘導(dǎo)來經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(也稱為凋亡)。凋亡的特征在于將細(xì)胞選擇性程序 性破壞成相對較小的碎片，其中DNA變得高度片段化(即所得的片段通常具有不超過約200個堿基)。凋亡期間發(fā)生細(xì)胞皺縮和核小體間DNA切割，這導(dǎo)致DNA的片段化。術(shù)語“衍生物”用于定義自另一種化合物衍生的化合物，具體的是，包含本發(fā)明的 化合物A的任何修飾且保留如本發(fā)明中所描述的化合物A的生物活性的化合物。如本文中所使用的，術(shù)語“DNA”定義為脫氧核糖核酸。“有效量”或“治療有效量”在本文中可互換使用，指有效實(shí)現(xiàn)特定生物學(xué)結(jié)果的化 合物、配制劑、材料或組合物的量，如本文中所描述的。此類結(jié)果可以包括但不限于對病毒 感染的抑制，如通過本領(lǐng)域中合適的任何手段所測定的?！胺蛛x的”指自天然狀態(tài)改變的或取出的。例如，活的動物中天然存在的核酸或 肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存材料部分或完全分開的相同核酸或肽是“分離 的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或者可以存在于非天然的環(huán)境諸 如例如宿主細(xì)胞中。如本文中所使用的，短語“白血球減少癥”指哺乳動物中的血液白細(xì)胞(白血球) 濃度低于正常水平的減少。如本文中所使用的，短語“突變”指基因中的變化，其源自于對代表基因的一段DNA 的一部分的改變?！吧臣?xì)胞突變”存在于卵或精子中，而且能從親本傳遞至后代?！绑w細(xì)胞突變”在特定的組織細(xì)胞中發(fā)生，而且能導(dǎo)致特定的組織細(xì)胞生長成腫 瘤。大多數(shù)癌癥在體細(xì)胞突變后開始。在白血病、淋巴瘤或骨髓瘤中，原始骨髓或淋巴結(jié)細(xì) 胞經(jīng)歷體細(xì)胞突變，導(dǎo)致腫瘤形成。在這些病例中，腫瘤在進(jìn)行檢測時通常是廣泛分布的； 它們通常牽涉多塊骨的骨髓或者牽涉數(shù)個部位中的淋巴結(jié)。如本文中所使用的，短語“癌基因”指作為癌癥原因的突變基因。急性骨髓性白血 病的數(shù)種亞型、急性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、和幾乎所有慢性骨髓性白血病病例具有一 致的突變基因(癌基因)。如本文中所使用的，術(shù)語“肽”、“多肽”、和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指由通過肽鍵共 價連接的氨基酸殘基構(gòu)成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個氨基酸，并且沒有對能 構(gòu)成蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸的最大數(shù)目設(shè)置限制。多肽包括包含通過肽鍵彼此連接的 兩個或更多個氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。如本文中所使用的，該術(shù)語指短鏈(其在本領(lǐng)域 中通常也稱為例如肽、寡肽和寡聚物)和較長鏈(其在本領(lǐng)域中一般稱為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)有 許多類型)兩者?！岸嚯摹卑ɡ缬猩飳W(xué)活性的片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚 體、異二聚體、多肽變體、經(jīng)修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重 組肽、合成肽、或其組合?！八帉W(xué)可接受的”指對于患者而言從藥理學(xué)/毒理學(xué)觀點(diǎn)看而對于制備藥物化學(xué)家 而言從物理/化學(xué)觀點(diǎn)看在組成、配方、穩(wěn)定性、患者接受和生物利用度方面可接受的那些 特性和/或物質(zhì)。“藥學(xué)可接受載體”指不妨礙活性成分的生物學(xué)活性效力而且對其被施用 的宿主沒有毒性的介質(zhì)。如本文中所使用的，短語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) ”指用于擴(kuò)增痕量的DNA或RNA 從而能研究或測定特定類型的DNA或RNA的技術(shù)。此技術(shù)在檢測濃度很低的殘留白血病或 淋巴瘤細(xì)胞(少得使用顯微鏡看不到)中變得有用。該技術(shù)可以在50萬至100萬非白血 病細(xì)胞中檢測出一個白血病細(xì)胞的存在。為了鑒定殘留異常細(xì)胞的用途，PCR要求白血病或淋巴瘤細(xì)胞中有特定的DNA(或RNA)異?；驑?biāo)志物(如癌基因)。如本文中所使用的，術(shù)語“多核苷酸”定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚 合物。如此，如本文中所使用的，核酸和多核苷酸可互換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸是 多核苷酸(其能被水解成單體“核苷酸”)的一般知識。單體核苷酸能被水解成核苷。如本 文中所使用的，多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域中可用的任何手段(包括但不限于重組 手段)獲得的所有核酸序列。如本文中所使用的，短語“頑固性/不應(yīng)性(疾病)”指在用針對疾病的標(biāo)準(zhǔn)療法 進(jìn)行初始治療后沒有進(jìn)入消退中或者沒有實(shí)質(zhì)性改善的疾病。如本文中所使用的，短語“復(fù)發(fā)(再現(xiàn))”指疾病在進(jìn)行治療后已經(jīng)消退后的恢復(fù)。如本文中所使用的，短語“消退”指通常由于治療引起的疾病跡象的消失。使用術(shù) 語“完全”或“部分”來修飾術(shù)語“消退”。完全消退意味著疾病的所有跡象都消失了。部分 消退意味著治療顯著改善疾病，但是存在疾病的殘留跡象。長期益處通常要求完全消退，尤 其是在急性白血病或進(jìn)行性淋巴瘤中。如本文中所使用的，短語“對治療有抗性”指細(xì)胞盡管其暴露于通常殺死細(xì)胞或抑 制其生長的化學(xué)物，但是仍活著并分裂的能力。頑固性白血病是如下的情況，其中部分惡性 細(xì)胞對一種或多種藥物的損害效果有抗性。細(xì)胞具有數(shù)種形成藥物抗性的方式。如本文中所使用的，術(shù)語“治療性”指治療和/或預(yù)防。通過抑制、消退、或根除與 肝病有關(guān)的疾病狀態(tài)來獲得治療效果。如本文中所使用的，短語“血小板減少”指哺乳動物中的血液血小板濃度低于正常 的減少。如本發(fā)明的語境內(nèi)所使用的，術(shù)語“治療/處理”想要包括針對疾病或病癥的治療 性處理及預(yù)防性、或抑制性措施。如此，例如，術(shù)語治療包括在疾病或病癥發(fā)作之前或之后 施用藥劑，由此預(yù)防或消除疾病或病癥的所有體征。又例如，在疾病的臨床表現(xiàn)后為了抗擊 疾病癥狀而進(jìn)行的藥劑施用構(gòu)成“治療”疾病?！白凅w”在該術(shù)語在本文中使用時指在序列上分別與參照核酸序列或肽序列不同， 但是保留參照分子的本質(zhì)特性的核酸序列或肽序列。核酸變體的序列變化可以不改變由參 照核酸編碼的肽的氨基酸序列，或者可以導(dǎo)致氨基酸替代、添加、刪除、融合和截短。肽變體 的序列變化通常是有限的或保守的，從而參照肽和變體的序列總體上極其相似，而且在許 多區(qū)域中是相同的。變體和參照肽可以在氨基酸序列上相差任意組合的一處或多處替代、 添加、刪除。核酸或肽的變體可以是天然存在的，諸如等位變體，或者可以是不知道天然存 在的變體。可以通過誘變技術(shù)或者通過直接合成來生成核酸和肽的非天然存在變體。術(shù)語 變體還可以指對分子進(jìn)行的不改變其功能的修飾。描述本發(fā)明提供了使用血小板生成素受體激動劑來抑制人骨髓樣白血病細(xì)胞生長和 增殖的方法。本發(fā)明的方法可用于治療細(xì)胞增殖性和/或分化性病癥，特別是那些涉及急 性骨髓樣白血病的。 本發(fā)明包括血小板生成素受體激動劑(TpoRA)用于抑制AML細(xì)胞生長和增殖的用 途。術(shù)語“血小板生成素受體激動劑”或“ΤΡ0受體激動劑”(TpoRA)在本文中可互換使用，
8包括擁有結(jié)合血小板生成素受體即mpl的特性，而且具有mpl激動劑的生物學(xué)特性的任何 藥用化合物、小分子、肽或核酸。在本發(fā)明中，TPO受體激動劑的生物學(xué)特性是對AML細(xì)胞 生長和增殖的抑制。在本發(fā)明方法中有用的一種優(yōu)選TpoRA是3’ - {N’ -[1_(3，4_ 二甲基苯基)_3_甲 基-5-氧-1，5-二氫吡唑-4-亞基]胼}-5，_氟-2，-羥基聯(lián)苯-3-羧酸(3，-{Ν，-[1-(3， 4-dimethyIpheny1)_3_methyl_5_oxo_l，5-dihydropyrazol-4-yIidene]hydrazine}-5' -f luoro-2’-hydroxybiphenyl-3-carboxylic acid)，下文稱為化合物A?；衔顰是在國際申 請 No. PCT/US01/16863(國際公開 No. WO 01/89457 ；美國公開 No. US2004/0019190A1)(在 此通過提及而收錄其公開內(nèi)容)中公開(如實(shí)施例13)和要求保護(hù)的，作為TPO受體激動 劑有用的(特別在增強(qiáng)血小板生成方面和特別在治療血小板減少方面)化合物，連同其藥 學(xué)可接受鹽、水合物、溶劑化物和酯，且其結(jié)構(gòu)如下 治療方法在本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，對診斷為患有AML的個體施用TpoRA、其衍生物 或變體。在本發(fā)明的一方面，對患有AML的個體施用TpoRA、其衍生物、或變體作為化學(xué)治療 方案的一部分以提升化療劑的功效。在本發(fā)明方法的另一個實(shí)施方案中，對診斷為患有骨髓增生異常綜合征的個體施 用TpoRA、其衍生物或變體。在本發(fā)明的一方面，對患有骨髓增生異常綜合征的個體施用 TpoRA、其衍生物、或變體作為化學(xué)治療方案的一部分以提升化療劑的功效?！疤嵘焺┑墓πА敝甘┯肨poRA、其衍生物、或變體會引起有益的臨床結(jié)果，包 括但不限于延長個體的存活、減少/減輕個體中AML或骨髓增生異常綜合征的臨床體征、或 者通過容許化療劑劑量和/或施用化療劑頻率的降低，由此降低與化療劑毒性有關(guān)的不想 要的副作用，并使化學(xué)治療方案更可耐受?？梢栽谑┯没焺┲?、施用化療劑期間或者施 用化療劑之后、或者其一些組合(認(rèn)為這樣對于治療個體是有效的)，對個體施用TpoRA、其 衍生物或變體。建立作為化學(xué)治療方案的一部分施用TpoRA、其衍生物或變體的最佳日程表 完全在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一方面，在施用化學(xué)療法前對個體施用TpoRA、其衍生物、或變體。 不希望限于任何理論，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，在開始化學(xué)療法前對個體施用TpoRA 會靶向?qū)瘜W(xué)療法有抗性的白血病細(xì)胞，而且會提升化療劑的功效。另外，表達(dá)TPO受體 的所有白血病細(xì)胞都是TpoRA、其衍生物或變體的靶物。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會顯而易見的是，在開始化學(xué)療法前對個體提供TpoRA、其衍生物或變體會使白血病細(xì)胞對化療劑更易 感，由此使治療更有效。在本發(fā)明的又一方面，在個體已經(jīng)完成化學(xué)療法療程后對個體施用TpoRA、其衍生 物、或變體。不希望限于任何理論，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，殘留的、未檢測出的循環(huán) 白血病細(xì)胞增加AML患者在完成化學(xué)療法后的復(fù)發(fā)風(fēng)險。對已經(jīng)完成化學(xué)療法療程的個體 施用TpoRA、其衍生物、或變體靶向殘留的白血病細(xì)胞(此時它們?nèi)允菦]有活性的)，并降低 疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險。在本發(fā)明的又一方面，對個體施用TpoRA、其衍生物、或變體代替化學(xué)療法作為治 療AML的唯一方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，在眾多診斷為患有AML的個體中，白血 病細(xì)胞對化學(xué)療法是不應(yīng)的。用TpoRA、其衍生物、或變體治療這些個體是繞過容許白血病 細(xì)胞躲避化療劑的機(jī)制的備選療法。在本發(fā)明的又一方面，對個體施用TpoRA、其衍生物、或變體代替化學(xué)療法作為治 療AML的唯一方法。本發(fā)明的組合物和方法可以與其它治療方案聯(lián)合使用，包括抑制病毒生長劑和病 毒毒劑(virostatic and virotoxic agent)、抗生劑、抗真菌劑、抗炎劑、疼痛減輕療法、以 及聯(lián)合療法等。本發(fā)明還可以與其它治療形態(tài)(諸如化學(xué)療法、冷凍療法、高熱療法 (hyperthermia)、放射療法等)聯(lián)合使用。療法和藥物制劑可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的路徑(包括例如靜脈內(nèi)治療方案)來對個體 施用TpoRA、其衍生物、或變體。施用可以是通過快速、直接注射或者在一段時間里如通過緩 慢輸注。也可以使用緩慢釋放配制劑。此外，可以將TpoRA、其衍生物、或變體穩(wěn)定地連接至 聚合物諸如聚乙二醇以賦予TpoRA以想要的特性諸如溶解度、穩(wěn)定性、延長的半衰期和其 它藥學(xué)有利特性(參見例如 Burnham, 1994，AM. J. Hosp. Pharm. 51 :210_8)。也可以將磷酸酶抑制劑和活化劑，及激酶抑制劑和活化劑與TpoRA連接或偶聯(lián)以 賦予TpoRA以想要的特性諸如溶解度、穩(wěn)定性、延長的半衰期和其它藥學(xué)有利特性。本發(fā)明涵蓋藥物組合物用于實(shí)施本發(fā)明方法的用途，所述組合物包含合適的治療 性化合物和藥學(xué)可接受載體。如本文中所使用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受載體”指如下的化學(xué)成分，其可以與治療性 化合物組合，而且其在組合后可以用于對哺乳動物施用合適的治療性化合物?？梢允┯脤τ趯?shí)施本發(fā)明有用的藥物組合物來投遞lng/kg/天和100mg/kg/天之 間的劑量。所施用的精確劑量會隨任何數(shù)目的因素而變化，包括但不限于動物類型和所治 療疾病狀態(tài)類型、動物年齡和施用路徑。建立最大限度臨床益處所需要的TpoRA、其衍生物 或變體的最佳劑量完全在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。可以在靜脈內(nèi)配制劑中系統(tǒng)地施用在本發(fā)明方法中有用的藥物組合物。在合適的 治療性化合物外，此類藥物組合物可以含有藥學(xué)可接受載體和其它已知增強(qiáng)和促進(jìn)藥物施 用的成分。本發(fā)明涵蓋包含本文中所公開的對于治療AML有用的化合物(作為活性成分)的 藥物組合物的制備和用途。此類藥物組合物可以由單獨(dú)的活性成分(處于適合于對受試者施用的形式)組成，或者藥物組合物可以包含活性成分和一種或多種藥學(xué)可接受載體、一 種或多種別的成分、或者這些的一些組合。活性成分可以以生理學(xué)可接受酯或鹽的形式存 在于藥物組合物中，諸如與生理學(xué)可接受陽離子或陰離子組合，正如本領(lǐng)域中公知的。如本文中所使用的，術(shù)語“生理學(xué)可接受的”酯或鹽指活性成分的如下酯或鹽形 式，其與藥物組合物的任何其它成分相容且對要接受組合物施用的受試者無害?？梢酝ㄟ^藥理學(xué)領(lǐng)域中已知的或今后開發(fā)的任何方法來制備本文中所描述的藥 物組合物的配制劑。一般而言，此類制備方法包括以下步驟，即使活性成分與載體或者一種 或多種其它輔助性成分聯(lián)合，然后若必要或想要的話，將產(chǎn)品定形或包裝成想要的單劑或 多劑單元。可以在適合于胃腸外、靜脈內(nèi)或另一種施用路徑的配制劑中制備、包裝、或出售在 本發(fā)明方法中有用的藥物組合物?？梢陨⒀b地、作為單一單位劑量、或者作為多個單一單位劑量制備、包裝、或出售 本發(fā)明的藥物組合物。如本文中所使用的，“單位劑量”是包含預(yù)定量的活性成分的藥物組 合物的離散量。活性成分的量一般等于會對受試者施用的活性成分的劑量或者此類劑量的 便利分?jǐn)?shù)，諸如例如此類劑量的1/2或1/3。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分、藥學(xué)可接受載體、和任何別的成分的相對量 會隨所治療受試者的身份、體型、和狀況而且進(jìn)一步隨組合物要施用的路徑而變化。舉例而 言，組合物可以包含0. 和100% (w/w)之間的活性成分。在活性成分外，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一種或多種別的藥學(xué)活性劑。可以使用常規(guī)技術(shù)來生成本發(fā)明藥物組合物的受控或持續(xù)釋放配制劑。如本文中所使用的，藥物組合物的“胃腸外施用”包括以物理突破受試者的組織和 經(jīng)由組織中的突破來施用藥物組合物為特征的任何施用路徑。如此，胃腸外施用包括但不 限于通過注射組合物、通過經(jīng)由手術(shù)切口應(yīng)用組合物、通過經(jīng)由組織穿透非手術(shù)傷口應(yīng)用 組合物等來施用藥物組合物。具體地，所涵蓋的胃腸外施用包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、腹 膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射、和腎透析輸注技術(shù)。適合于胃腸外施用的藥物組合物的配制劑包含與藥學(xué)可接受載體諸如無菌水或 無菌等張鹽水組合的活性成分。可以以適合于推注施用或連續(xù)施用的形式制備、包裝、或出 售此類配制劑。可以以單位劑量形式諸如在安瓿中或在含有防腐劑的多劑量容器中制備、 包裝、或出售可注射配制劑。供胃腸外施用的配制劑包括但不限于懸液、溶液、油性或水性 媒介物中的乳劑、糊劑、和可植入的持續(xù)釋放或生物可降解的配制劑。此類配制劑還可以包 含一種或多種別的成分，包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑、或分散劑。在供胃腸外施用的配制 劑的一個實(shí)施方案中，以干燥(即粉末或顆粒)形式提供活性成分，用于用適合的媒介物 (例如無菌無熱原水)重建，之后胃腸外施用重建的組合物?？梢砸詿o菌的、可注射的、水性或油性懸液或溶液形式制備、包裝、或出售藥物組 合物?？梢砸勒找阎夹g(shù)配制此懸液或溶液，并且在活性成分外可以包含本文中所描述的 別的成分諸如分散劑、潤濕劑、或懸浮劑?？梢允褂脽o毒胃腸外可接受稀釋劑或溶劑諸如例 如水或1，3-丁二醇制備此類無菌可注射配制劑。其它可接受稀釋劑和溶劑包括但不限于 Ringer氏溶液、等張氯化鈉溶液、和不揮發(fā)性油諸如合成的甘油單酯或甘油二酯。其它有用 的胃腸外可施用的配制劑包括那些包含處于微晶形式、在脂質(zhì)體制備物中、或者作為生物可降解聚合物系統(tǒng)成分的活性成分的。供持續(xù)釋放或植入用的組合物可以包含藥學(xué)可接受 聚合或疏水材料諸如乳劑、離子交換樹脂、略溶性聚合物、或略溶性鹽。可以以每天數(shù)次的頻率對個體施用化合物，或者它可以以更低的頻率施用，諸如 一天一次、一周一次、每兩周一次、每月一次，或者甚至更低的頻率，諸如每數(shù)月一次或者甚 至一年一次或更少。劑量頻率對于熟練技術(shù)人員會是容易顯而易見的，而且會取決于任何 數(shù)目的因素，諸如但不限于所治療疾病的類型和嚴(yán)重性、個體的類型和年齡等。實(shí)驗實(shí)施例通過參閱以下實(shí)驗實(shí)施例來詳細(xì)地進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅出于例示目 的而提供，并不意圖是限制性的，除非另有規(guī)定。如此，本發(fā)明決不應(yīng)當(dāng)解釋為受限于以下 實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)解釋為涵蓋由于本文中所提供的教導(dǎo)而變得明顯的任何和所有變型?，F(xiàn)在描述本文中所公開的實(shí)驗中所采用的材料和方法。 化合物化合物A 獲自 Glaxo SmithKline Pharmaceuticals (Collegeville，PA)。將化 合物溶解于100% DMSO中以制備IOmM儲液，然后在IMDM(Iscoves改良的Dulbecco氏培 養(yǎng)基，Invitrogen ；Carlsbad, CA)中稀釋以獲得ImM工作溶液。全長重組人血小板生成素 (rhTPO)獲自 R&D Systems (Minneapolis, MN)，并溶解于 IMDM 培養(yǎng)基中至終濃度 5ng/ml。細(xì)胞培養(yǎng)N2C-TP0細(xì)胞是通過在rhTpo中培養(yǎng)原巨核細(xì)胞系10周衍生的，并由Glaxo SmithKline Pharmaceuticals (Collegeville,PA)提供。將 N2C-TP0 細(xì)胞在補(bǔ)充有 10%動 物血清復(fù)合物-Fetalplex(Gemini Bio-Products，WestSacramento，CA)、0· 5%青霉素 / 鏈 霄素(Invitrogen ；Carlsbad, CA)禾口 20ng/mlrhTP0 的 RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA)培
養(yǎng)基中培養(yǎng)。將Mo7e細(xì)胞在補(bǔ)充有10 % Fetalplex、0. 5 %青霉素/鏈霉素、和GM-CSFlOng/ ml (R&D Systems,Minneapolis,MN) ^DMEM(Dulbecco K^giWEagle；Invitrogen, Carlsbad, CA)中培養(yǎng)。在每項實(shí)驗前使來自這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞饑餓24小時。人原代白血病細(xì)胞獲自賓夕法尼亞大學(xué)干細(xì)胞和白血病中心。將細(xì)胞在 EGM-2(內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基-2，Cambrex ；East Rutherford,NJ)中培養(yǎng)。將所有細(xì)胞在增濕的 培養(yǎng)箱中于37°C和5% CO2培養(yǎng)。巨核細(xì)胞集落形成測定法以每ml 5000個⑶34+細(xì)胞的密度將正常的人祖細(xì)胞在血纖蛋白原凝塊中鋪 板。如下制備血纖蛋白原凝塊將細(xì)胞在補(bǔ)充有碳酸氫鈉(3mg/ml) ；3-巰基-1-2丙二醇 (0. 002% )；運(yùn)鐵蛋白(300 μ g/ml) ；CaCl2 (37 μ g/ml)；無脂肪酸的、去離子 BSA(10 % )； 胰島素(20 μ g/ml)；膽固醇(5. 6 μ g/ml)、細(xì)胞因子:IL_3 (10ng/ml)、SCF(10ng/ml)和 rhTPO (lOOng/ml，等于2. 8 μ Μ)或化合物A (5 μ Μ)的IMDM培養(yǎng)基中重懸。然后凝結(jié)混合物 含有血纖蛋白原(0. 2% )和凝血酶(0. 2u/ml)。將細(xì)胞在35mm培養(yǎng)皿上鋪板，并在增濕的 培養(yǎng)箱中于37°C和5% CO2培養(yǎng)。10天后，固定集落，并用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體對巨核細(xì)胞標(biāo) 志物CD41a染色。使用倒置熒光顯微鏡對巨核細(xì)胞集落計數(shù)。對激酶磷酸化的Western印跡分析在PBS中清洗對照和用rhTPO或化合物A刺激的細(xì)胞兩次，然后沉淀。將沉淀物溶解于由50mM TRIS、150mM NaCl、0. 02 %疊氮化鈉、0. 十二烷基硫酸鈉(SDS)禾Π 1% Igepal (Sigma, St. Louis, MO)構(gòu)成的三重溶胞緩沖液中，然后在冰上溫育30分鐘，期間每 10分鐘進(jìn)行渦旋振蕩。然后以最大速度在微量離心機(jī)中于4°C將溶胞物旋轉(zhuǎn)10分鐘。使 用所提取的細(xì)胞上清液進(jìn)行Western印跡分析。通過Bradford蛋白質(zhì)測定法(BiO-Rad，Hercules, CA)測定蛋白質(zhì)濃度。將總共 150 μ g蛋白質(zhì)提取物在10 %聚丙烯酰胺凝膠上解析(150V，60分鐘)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙 烯(PVDF)膜(25V，60分鐘)。使用煉乳(5% )作為封閉溶液。將膜于4°C與1 1000稀 釋的一抗一起溫育過夜。溫育后，在TBS-T緩沖液中清洗膜三次，并用1 1000稀釋的偶 聯(lián)有HRP的二抗(Amersham Biosciences ；Piscataway, NJ)于室溫探查2小時。所有抗體 均購自 Cell Signaling Technology(Danvers, ΜΑ) 微陣列分析用2. 8uM TPO或5uM化合物A刺激N2C-TP0細(xì)胞(每Iml補(bǔ)充有10% FBS的RPMI 培養(yǎng)基IxlO6個細(xì)胞)30分鐘、1小時和3小時。然后在PBS中清洗細(xì)胞兩次，并用于使用 Qiagen的RNaesy試劑盒(Valencia，CA)分離RNA。一式三份完成每種條件。將RNA提交 給Penn微陣列室(賓夕法尼亞大學(xué)；Philadelphia，PA)。使用Affymetrix基因芯片U133A 第2版來實(shí)施分析。在Penn生物信息學(xué)中心(賓夕法尼亞大學(xué)；Philadelphia，PA)使用 GCRMA算法和Array Assistlite3. 4程序來實(shí)施統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析。使用Spotfire軟件來完 成基因序型的顯現(xiàn)。實(shí)駘實(shí)施仿ι丨ι -.^mrn λ TPO WMmy^m Α分子的細(xì)胞,培ih平估為了確定化合物A是否具有發(fā)揮血小板生成素受體(TpoR)激動劑的功能及刺激 人巨核細(xì)胞增殖和分化的能力，使用Tpo依賴性細(xì)胞系(N2C-TP0)及正常的人CD34+細(xì)胞 來實(shí)施許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗。發(fā)現(xiàn)化合物A刺激TPO依賴性細(xì)胞系N2C-TP0增殖的能力展現(xiàn) 出在1和IOuM之間的劑量依賴性細(xì)胞增殖提升，其中最大效果在5-10 μ M。因此，在直接比 較rhTPO對化合物A的特性的進(jìn)一步實(shí)驗中使用5 μ M劑量。使用正常的人祖細(xì)胞(CD34+)來評估化合物A刺激巨核細(xì)胞增殖和分化的能力。 將CD34+細(xì)胞在血纖蛋白凝塊中鋪板，并培養(yǎng)10天，此時間后固定集落，并用對巨核細(xì)胞標(biāo) 志物CD41特異性的抗體染色。自用化合物A刺激的細(xì)胞獲得的巨核細(xì)胞集落的數(shù)目在與 來自用rhTPO刺激的細(xì)胞的巨核細(xì)胞集落的數(shù)目相比時略微較低，然而集落的大小或形狀 沒有差異(圖1)。這些結(jié)果還得到人祖細(xì)胞液體培養(yǎng)確認(rèn)。將⑶34+細(xì)胞在細(xì)胞因子及 rhTPO或化合物A中溫育7-10天的一段時間，此時間后對培養(yǎng)中的細(xì)胞檢查多倍體化程度 和巨核細(xì)胞譜系標(biāo)志物⑶41和⑶61的表達(dá)。與rhTPO中的8%相比，在化合物A中培養(yǎng)的 細(xì)胞中14%顯示大于4N的DNA含量。這些相同細(xì)胞在35%的細(xì)胞上表達(dá)巨核細(xì)胞標(biāo)志物 ⑶41和⑶61，這與rhTPO的結(jié)果相當(dāng)。實(shí)驗實(shí)施例2 化合物A對原代白血病細(xì)胞的差別影響樣品獲自18名患有急性骨髓性白血病(AML)的患者、7名患有急性淋巴細(xì)胞性 白血病(ALL)的患者和3名患有慢性骨髓性白血病(CML)的患者。在18份所測試AML樣 品的17份中，化合物A在與未處理對照或與rhTPO —起培養(yǎng)的細(xì)胞相比時抑制細(xì)胞增殖 70-90% (圖2A)。在來自ALL和CML患者樣品的原代細(xì)胞中沒有觀察到化合物A的顯著影 響(圖2B和圖2C)。
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進(jìn)一步檢查化合物A的多種劑量(1 μ Μ、2. 5 μ M和5 μ Μ)對AML樣品的影響。對 6份不同樣品實(shí)施此實(shí)驗。在3份樣品中，1和2. 5 μ M劑量的化合物A對細(xì)胞增殖具有影 響。在樣品857和332中，1和2. 5 μ M劑量的化合物A對細(xì)胞增殖的抑制與用5 μ M劑量實(shí) 現(xiàn)的抑制類似(圖3)。在剩余的3份樣品中，1 μ M和2. 5 μ M劑量的化合物A對細(xì)胞增殖 和存活沒有影響。在這些情況中，僅5 μ M化合物A抑制白血病細(xì)胞生長和增殖。在ALL或 CML患者樣品中沒有觀察到對細(xì)胞生長或存活的顯著影響。實(shí)駘實(shí)施例3 由rhTPO和化合物A刺激的信號傳導(dǎo)涂徑的WM為了了解化合物A觸發(fā)AML細(xì)胞的細(xì)胞死亡的機(jī)制，比較由rhTPO和化合物A刺 激的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。對造血祖細(xì)胞(⑶34+)及工程化改造成表達(dá)TpoR且其中細(xì)胞 增殖受Tpo刺激控制的原巨核細(xì)胞細(xì)胞系，即N2C-TP0實(shí)施這些研究。檢查化合物A對已知在Tpo信號傳導(dǎo)途徑中重要的激酶的磷酸化的影響。所評估 的激酶包括STAT5、ERK、p70S6、和核糖體激酶S6。用rhTPO刺激10或30分鐘的N2C-TP0 細(xì)胞顯示上文所列所有激酶的高磷酸化水平。然而，在將細(xì)胞暴露于化合物A達(dá)10或30 分鐘時，那些激酶均沒有受到活化(圖4A)。對人祖細(xì)胞CD34+ (其受化合物A刺激而分化 成巨核細(xì)胞)實(shí)施相同的實(shí)驗。與N2C-TP0細(xì)胞不同，⑶34+細(xì)胞在暴露于rhTPO(2.8 μ M) 或化合物A (5 μ Μ)后顯示對ERK、p70S6和S6核糖體蛋白質(zhì)磷酸化的活化。然而，只有暴露 于rhTPO的細(xì)胞刺激STAT5 (即一種在AML細(xì)胞中過磷酸化的激酶)的磷酸化(圖4B)。4 :rhTP0齜散能否陽斷化合物A對AML細(xì)朐的影口向?qū)ψ?名AML患者獲得的細(xì)胞實(shí)施增殖測定法。在一些實(shí)驗中，首先將細(xì)胞暴露 于化合物A，然后在5分鐘后用rhTPO刺激。為了避免所有受體均被化合物A占據(jù)，且因此 阻止rhTPO結(jié)合的可能性，還如下實(shí)施其它實(shí)驗，即首先用rhTPO刺激細(xì)胞，接著在5分鐘 后暴露于化合物A。在6份樣品的4份(857，774，759，342)中，通過在用化合物A刺激后 添加rhTPO或者通過首先用rhTPO刺激細(xì)胞，之后暴露于化合物A沒有挽救AML細(xì)胞存活。 然而，在樣品794和332中，添加rhTPO確實(shí)削弱化合物A的效果(圖5)。這些結(jié)果提示多 種可能性第一，化合物A可以比rhTPO具有強(qiáng)得多的對TpoR的親和力；第二，Kd rhTPO低 得多，因此化合物A能自受體置換rhTPO ；或者，第三，化合物A刺激觸發(fā)AML細(xì)胞的細(xì)胞死 亡的其它途徑。為了解決這些可能性，在評估TPO途徑中牽涉的激酶的磷酸化時對N2C-TP0細(xì)胞 實(shí)施類似的挽救實(shí)驗。在兩組實(shí)驗(首先添加rhTPO，然后是化合物A，或者首先添加化合 物A，然后是rhTPO)中，觀察到對STAT5、ERKp70S6激酶和S6核糖體蛋白質(zhì)(它們在用單 獨(dú)的化合物A刺激后沒有被磷酸化)的磷酸化的挽救(圖6)。這些數(shù)據(jù)提示，化合物A活 化導(dǎo)致AML細(xì)胞死亡的另一條途徑。實(shí)驗實(shí)施例5 對用TPO對化合物A刺激的細(xì)胞中基因表達(dá)差異的微陣列分析為了進(jìn)一步了解化合物A信號傳導(dǎo)中牽涉的機(jī)制，使用Affymetrix基因芯片對用 Tpo或化合物A刺激的細(xì)胞實(shí)施微陣列分析。在第一組實(shí)驗中，探查N2C-TP0細(xì)胞系來為使 用原代AML細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)一步分析建立最佳時間點(diǎn)。用TPO (2. 8 μ M)或化合物A (5 μ Μ)刺激細(xì)胞30分鐘、1小時或3小時。然后自細(xì) 胞分離RNA，并用于陣列實(shí)驗。用Tpo對化合物A刺激后基因表達(dá)有顯著性差異。如與由 TPO刺激的樣品相比化合物A樣品中在刺激30分鐘后，200種基因得到差別地表達(dá)，刺激1
14小時后，約400種基因得到差別地表達(dá)，而3小時后超過2000種基因得到上調(diào)或下調(diào)(圖 7)。這些基因中，觀察到凋亡途徑中牽涉的多種基因(圖8)及轉(zhuǎn)錄因子(圖9)的表 達(dá)差異。下調(diào)最大的基因(50-200倍倍數(shù)改變)包括早期生長因子應(yīng)答基因1_4(其編碼 充當(dāng)細(xì)胞外信號的細(xì)胞核效應(yīng)物的蛋白質(zhì))家族、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)阻抑物3、和大多數(shù)細(xì) 胞的信號傳導(dǎo)途徑中牽涉的細(xì)胞因子誘導(dǎo)型含有SH2的蛋白質(zhì)?！雠锪? 舶λ赫縣·趣___^雕法膜聯(lián)蛋白-V是對磷脂酰絲氨酸(PS)具有高親和力的磷脂結(jié)合蛋白。膜聯(lián)蛋白V 不會結(jié)合正常的完整細(xì)胞，但是壞死細(xì)胞泄漏得足以容許膜聯(lián)蛋白V接近內(nèi)膜PS。碘化丙 啶使DNA染色。因此該測定法鑒定正在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞。自AML (患者774;頂排)或ALL (患者710 ；底排)患者分離原代細(xì)胞。然后將細(xì) 胞暴露于對照溶液(左側(cè)的一對小圖)、rhTpo+DMS0 (中間的一對小圖)、或SB559457 (右側(cè) 的一對小圖)72小時。圖10描繪了與對照細(xì)胞(頂部，左側(cè)小圖)和用Tpo+DMSO刺激的 細(xì)胞(頂部，中間小圖)相比暴露于SB55945達(dá)72小時的AML樣品(頂部，右側(cè)小圖)中 的膜聯(lián)蛋白V和PI陽性細(xì)胞增加。在自ALL患者分離的原代細(xì)胞中觀察不到細(xì)胞凋亡的 顯著增加。這提示SB559457在AML細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。糖種· 7 :AML麵Φ白··詢果對5份不同原代AML細(xì)胞樣品(AML患者332、342、774、和794)實(shí)施Affymetrix 基因芯片分析。用Tpo或SB559457刺激原代細(xì)胞6小時。在芯片(指明假發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate)小于36% )上所代表的22，000種基因中的僅2種中找到表達(dá)的統(tǒng)計學(xué) 顯著性差異甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和DNA損害誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄物4 (也稱為Reddl)。 使用定量實(shí)時PCR(QRT-PCR)來確認(rèn)這些結(jié)果。在原代AML樣品中，用SB559457處理的細(xì) 胞中的GAPDH表達(dá)比在用rhTpo處理相同時間(6小時)的細(xì)胞中的GAPDH表達(dá)高至少兩 倍。類似地，Reddl基因的表達(dá)在與SB559457 —起溫育的細(xì)胞中比在與rhTpo —起溫育的 對照細(xì)胞中高約3至4倍(圖11)。為了建立細(xì)胞信號傳導(dǎo)與陣列數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，檢查原代白血病細(xì)胞中的Tpo 信號傳導(dǎo)途徑中牽涉的激酶的磷酸化。在3份原代AML樣品中在用SB559457(5yM)和 Tpo (2，86 μ Μ)刺激1、3和5小時的細(xì)胞中比較核糖體S6和p70S6激酶的磷酸化。在這兩 種AML樣品中，用SB559457刺激3小時的細(xì)胞顯示p70S6激酶在Thr421/Ser424處和核糖 體激酶S6的高度磷酸化，而在未刺激的對照細(xì)胞和用Tpo刺激的細(xì)胞中，沒有檢測出那些 激酶的磷酸化或者檢測出那些激酶的很少的磷酸化(圖12)。在此通過提及而將本文中所引用的每篇專利、專利申請、和出版物的公開內(nèi)容完 整收入本文。雖然已經(jīng)關(guān)于具體的實(shí)施方案公開了本發(fā)明，但是顯而易見的是，本領(lǐng)域其它 技術(shù)人員能在不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍的前提下設(shè)計本發(fā)明的其它實(shí)施方案和變 型。所附權(quán)利要求書意圖解釋為包括所有此類實(shí)施方案和等同變型。
權(quán)利要求
一種治療診斷為患有急性骨髓性白血病的人的方法，所述方法包括對所述人施用包含血小板生成素受體激動劑(TpoRA)、其衍生物、或變體的組合物，進(jìn)一步地，其中所述組合物抑制所述人中的白血病細(xì)胞生長和增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在施用化療劑之前、期間或之后對所述人施用所述組合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中以包含TroRA、其衍生物或變體和藥用載體的藥物組合物對 所述人施用所述TroRA、其衍生物或變體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中對所述人胃腸外施用所述藥物組合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述血小板生成素受體激動劑是化合物A。
6.一種治療診斷為患有骨髓增生異常綜合征的人的方法，所述方法包括對所述人施用 包含血小板生成素受體激動劑(TpoRA)、其衍生物、或變體的組合物，進(jìn)一步地，其中所述組 合物抑制所述人中的白血病細(xì)胞生長和增殖。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在施用化療劑之前、期間或之后對所述人施用所述組合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中以包含TroRA、其衍生物或變體和藥用載體的藥物組合物對 所述人施用所述TroRA、其衍生物或變體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中對所述人胃腸外施用所述藥物組合物。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述血小板生成素受體激動劑是化合物A。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過對患有AML的個體施用血小板生成素受體激動劑(TpoRA)、其衍生物、或變體來抑制人骨髓樣白血病細(xì)胞生長和增殖的方法。
文檔編號A61K31/426GK101888841SQ200880119312
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者安妮·科拉塔, 康妮·L·埃里克森-米勒, 艾倫·M·格維爾茨 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)理事會