專利名稱：人源化的抗-cxcr5抗體、其衍生物及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗CXCR5的抗體及其在改善、治療或預(yù)防哺乳動物包括人類的疾病或障礙中的用途，這些疾病或障礙源自不適宜的CXCR5活性或代謝或者例如病原體對CXCR5 活性或代謝的不恰當(dāng)或不正常的使用。目的抗體可阻斷配體例如CXCL13與其受體例如 CXCR5的結(jié)合。本發(fā)明還披露了含有目的抗體及其衍生物的預(yù)防、免疫治療和診斷組合物， 以及它們在預(yù)防或治療哺乳動物包括人類的疾病的方法中的用途，這些疾病是由CXCR5+細(xì) 胞例如B淋巴細(xì)胞的不適宜的代謝和/或活性引起的。這類疾病包括由炎癥引起或以炎癥 為特征的自身免疫缺陷和疾病，例如其中CXCR5發(fā)生上調(diào)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。
背景技術(shù)：
CXCR5也被稱為伯基特淋巴瘤受體(BLRl)、CD185、MDR15和MGC117347。它是G蛋 白偶聯(lián)受體，也是CXC趨化因子受體家族的成員。其中一個配體是BLC，也稱為CXCL13，它 是B細(xì)胞的化學(xué)引誘物。未加工的CXCR5前體長度為372個氨基酸，分子量為42KD。CXCR5參與了 B細(xì)胞在特定解剖間隔內(nèi)的遷移和定位?；蚯贸男∈笕狈ν庵?淋巴結(jié)，具有較少的派伊爾斑和降低的B細(xì)胞水平。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異結(jié)合CXCR5的新的人源化和人抗體以及它們的片段和衍生物。 一部分所述抗體及其CXCR5結(jié)合片段經(jīng)改造可防止鏈內(nèi)二硫鍵的形成，從而產(chǎn)生在體內(nèi)生 產(chǎn)和使用過程中穩(wěn)定的分子。其它目的抗體經(jīng)改造可使與F。R的結(jié)合最小化。某些令人感 興趣的CXCR5抗體與CXCL13競爭結(jié)合CXCR5。其它抗體降低CXCR5活性。本發(fā)明包括所述抗體的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列及其對應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的另一實施方案包括所述抗體的互補決定區(qū)(OTR)序列，以得到包括一個 或多個CDR區(qū)域或源自CDR的區(qū)域的結(jié)合分子，它們保留了母體分子結(jié)合CXCR5的能力，其 中CDR得自母體分子。目的抗體可以是防止CXCL13或其它配體結(jié)合到CXCR5+細(xì)胞例如B細(xì)胞的抗體。本發(fā)明的另一實施方案包括攜帶有本發(fā)明所述抗體序列的細(xì)胞系和載體。本發(fā)明的另一實施方案是所述抗體在制備用于治療與CXCR5功能和代謝有關(guān)的 疾病和障礙的藥物或組合物中的用途。本發(fā)明的另一實施方案是這些抗體在治療與非典型或異常的CXCR5生物學(xué)和功 能相關(guān)的障礙中的用途。本文還敘述了其它特點和優(yōu)點，將在以下的發(fā)明詳述中顯現(xiàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明不局限于本文所述的具體方法學(xué)、實驗方案、細(xì)胞系、載體或試劑，這是因 為它們可發(fā)生變動，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。而且，本文所使用的術(shù)語僅為了舉例說 明具體實施方案的目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義，否則本文所使用的所 有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語和任何首字母縮略詞的含義與本發(fā)明領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。實施本發(fā)明時可使用任何與本文所述類似或等同的方法和材料，本文僅敘述了示 例性的方法、設(shè)備和材料。出于敘述和披露可能與本發(fā)明一同使用和可能在本發(fā)明中使用的所報道的蛋白 質(zhì)、酶、載體、宿主細(xì)胞和方法學(xué)的目的，本文所提及的所有專利和出版物都整體引入本文 作為參考。但是，本文任何部分都不能理解為承認(rèn)以下觀點由于先前的發(fā)明而使本發(fā)明無 權(quán)聲稱早于這些披露內(nèi)容。在教導(dǎo)制備和使用CXCR5相關(guān)的方法和目的產(chǎn)物之前，提供了一些術(shù)語和短語的 下列非限制性定義來指導(dǎo)技術(shù)人員?！癈XCR5”涉及在淋巴細(xì)胞、尤其是B細(xì)胞、特別是原初B細(xì)胞中天然存在的已知分 子；涉及從這些細(xì)胞分離出的分子；涉及使用已知材料和方法并使用編碼CXCR5的核酸經(jīng) 重組制備的分子；以及涉及CXCR5的某些部分，例如胞外(EC)結(jié)構(gòu)域，其保留了與實施本發(fā) 明有關(guān)的特點和性質(zhì)，例如結(jié)合CXCL13?？扇艿腃XCR5分子可基本上由CXCR5的EC區(qū)域組 成，一般包括該分子的前60個氨基酸，即CXCR5的氨基末端部分。CXCR5是非混雜受體。CXCL13是CXCR5的配體，在基底細(xì)胞例如濾泡樹突狀細(xì)胞 和淋巴組織中為組成型表達。CXCL13特異吸引B細(xì)胞和一個T細(xì)胞的小亞組(其稱為B輔 助性濾泡T細(xì)胞(TFH))?？紤]到免疫系統(tǒng)中的T細(xì)胞和B細(xì)胞群體之間有許多互相作用， 這點可能并不出人意料。而且，活化的T細(xì)胞誘導(dǎo)或上調(diào)CXCR5表達。已發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸 潤到三級異位生發(fā)中心(GC)與預(yù)先具有這類非典型的淋巴結(jié)樣結(jié)構(gòu)的某些疾病的病情加 重和耐受崩潰緊密相關(guān)。使用體內(nèi)鼠模型，例如CXCR5-/-和CXCL13-/-小鼠，受體或配體 的缺失導(dǎo)致GC精細(xì)結(jié)構(gòu)由于T細(xì)胞和B細(xì)胞定位改變和可能的互相作用而發(fā)生變化。這 些小鼠還可受到保護，防止發(fā)生嚴(yán)重的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)。由于CXCR5選擇性地在 與RA發(fā)病相關(guān)的成熟B細(xì)胞上表達，阻斷該受體可調(diào)節(jié)受累個體的致關(guān)節(jié)炎的反應(yīng)。使用 生物制品(即抗TNFa和抗CD20抗體，利妥昔單抗)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已表現(xiàn)為臨床有 效，具體而言，接受B細(xì)胞導(dǎo)向療法的患者的臨床體征和癥狀表現(xiàn)出長期改善。選擇性地靶 向于僅在成熟B細(xì)胞和B輔助性T細(xì)胞上表達的CXCR5，不會影響B(tài)細(xì)胞的發(fā)育或使患者免 疫力受損。與利妥昔單抗不同的是，本發(fā)明抗體是不介導(dǎo)細(xì)胞毒性的中和抗體?！癈XCR5疾病”是一種疾病、障礙、癥狀、異常等，其特征或誘因是CXCL13或其它 CXCR5的配體過表達或水平升高、B細(xì)胞水平升高、B細(xì)胞活性水平升高、CXCR5水平升高或 CXCR5代謝或活性異常。所謂“B細(xì)胞活性”是指高于正常B細(xì)胞水平，其可以是局部的，或是某種生物現(xiàn)象 或B細(xì)胞功能的表現(xiàn)，例如抗體表達、Bruton酪氨酸激酶的存在或活性、CD19的表達或存 在、B細(xì)胞活化因子的表達或存在等。就抗體鏈多肽序列而言，短語“基本相同”可理解為具有與參照多肽序列至少 70%、80%、90%、95%或更多的序列同一性的抗體鏈。就核酸序列而言，該術(shù)語可理解為具 有與參照核酸序列至少85 %、90 %、95 %、97 %或更高的序列同一性的核苷酸序列。術(shù)語“同一性”或“同源性”是指將候選序列中核苷酸堿基或氨基酸殘基與相應(yīng)序 列進行比較，經(jīng)序列比對和引入間隔(若有必要的話)以實現(xiàn)整段序列的最大相同百分?jǐn)?shù) 并且不把任何保守性取代視為序列同一性的一部分后，二者堿基或殘基相同的比例。無論 N端或C端延伸或插入均不應(yīng)理解為降低同一性或同源性。用于比對的方法和計算機程序均可獲得，并為本領(lǐng)域所熟知?？墒褂眯蛄蟹治鲕浖y定序列同一性。短語和術(shù)語抗體或抗原的“功能片段、變異體、衍生物或類似物”等以及它們的形 式是具有與全長的目的抗體或抗原的生物活性性質(zhì)相同的化合物或分子。例如，抗CXCR5 抗體的功能片段或類似物是可結(jié)合CXCR5分子的片段或類似物，或是可防止或大幅降低配 體例如CXCL13或激動性或拮抗性抗體結(jié)合CXCR5的能力的片段或類似物。一個實例是scFv 分子。就CXCR5而言，其變異體或衍生物是與天然存在的CXCR5不同的分子，但卻可用于本 發(fā)明的目的，例如盡管與野生型CXCR5不相同，但可用作誘導(dǎo)產(chǎn)生選擇性結(jié)合野生型CXCR5 的抗體的免疫原?！叭〈汀弊儺愺w是一段天然序列中至少一個氨基酸殘基被除去并被一個不同的 氨基酸插入其相同位置的變異體。所述取代可為單個的，其中該分子中僅有一個氨基酸被 取代；或可為多個的，其中該相同分子有兩個或更多的氨基酸被取代。多個取代可位于連續(xù) 的位點。同樣，一個氨基酸可被多個殘基取代，其中該變異體包括取代和插入?！安迦胄汀弊?異體是一個或多個氨基酸被插入到緊鄰一段天然序列某個特定位置處的氨基酸的變異體。 緊鄰的氨基酸是指與該氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團連接?！皠h除型”變異體是天然 氨基酸序列中一個或多個氨基酸被除去的變異體。通常，刪除型變異體在其分子的特定區(qū) 域內(nèi)有一個或兩個氨基酸被刪除。術(shù)語“抗體”被用于最寬泛的含義，具體涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、 多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、攜帶一個或多個CDR或源自CDR序列的 抗體片段或合成多肽，只要這些多肽表現(xiàn)出所需的生物活性。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig) 是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。一般情況下，抗體被認(rèn)為是具有確定或公認(rèn)的特異性的Ig。 因此，盡管抗體表現(xiàn)出與特異靶點的結(jié)合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏靶點 特異性的抗體樣分子。本發(fā)明所述抗體可為任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)、 或亞類(例如^^、^^、^^^^^、^^、^ 、化^等)的抗體(“類型”和“種類”、以及 “亞型”和“亞類”在本文中可互換使用)。天然或野生型(即得自未經(jīng)人工操作的群體成 員)抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈 (L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條重鏈的一端具有一個可變區(qū)(Vh)，隨后是一系列恒定 區(qū)。每條輕鏈的一端具有一個可變區(qū)(VJ，另一端具有一個恒定區(qū)。所謂“未經(jīng)人工操作” 是指未經(jīng)處理以含有或表達外源抗原結(jié)合分子。野生型可指一個群體中最普遍的等位基因 或種類，或指得自未經(jīng)操作的動物的抗體，后者是與得自某種形式的操作的等位基因或多 態(tài)性或變異體或衍生物相比較而言，所述操作是例如誘變、使用重組方法等來改變該抗原 結(jié)合分子的氨基酸。正如本文所使用，“抗CXCR5抗體”是指可特異結(jié)合本文所定義的人CXCR5的抗體或衍生自這些抗體的多肽(衍生物)，其包括但不限于抑制或?qū)嵸|(zhì)降低CXCR5與其配體的結(jié) 合或抑制CXCR5活性的分子。就抗體的可變區(qū)而言，術(shù)語“可變”是指抗體之間有廣泛序列差異的相關(guān)分子的某 些部分，且被用于特異抗體對其特異靶點的特異性識別和結(jié)合。但是，變異性在抗體的整個 可變區(qū)內(nèi)不是均勻分布的。變異性集中在被稱為互補決定區(qū)(CDR ；即CDR1、CDR2和CDR3) 或高變區(qū)的三個區(qū)段，它們均位于輕鏈和重鏈的可變區(qū)內(nèi)?？勺儏^(qū)內(nèi)保守程度更高的部分 被稱為框架(FR)區(qū)或框架序列。天然重鏈和輕鏈的每個可變區(qū)均包括四個FR區(qū)，它們主要采用β-折疊構(gòu)型，通過三個⑶R連接起來，⑶R形成環(huán)連接β-折疊結(jié)構(gòu)，并在某些情況下 形成部分的折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈的CDR通常被FR區(qū)或來自其它鏈的CDR維系在一起，促 進抗體的靶點結(jié)合位點(表位或決定簇)形成(參看Kabat等人Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, National Institute of Health, Bethesda, MD(1987))。正 如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸的編號是依據(jù)Kabat等的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統(tǒng)而進行的，除非另有說明。一個CDR可具有特異結(jié)合同源表位的能力。術(shù)語“抗體片段”是指完整或全長鏈或抗體的一部分，一般是靶點結(jié)合區(qū)域或可變 區(qū)域。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab,、F(ab, )2和&片段?！肮δ芷巍被颉翱笴XCR5 抗體的類似物”是可防止或?qū)嵸|(zhì)降低所述受體結(jié)合配體或啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的片段或類 似物。正如本文所使用，功能片段一般與“抗體片段”含義相同，且就抗體而論，可指能防止 或?qū)嵸|(zhì)降低所述受體結(jié)合配體或啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab, )2。“F/’片 段由一條重鏈的可變區(qū)和一條輕鏈的可變區(qū)通過非共價結(jié)合方式而形成的二聚體(vH-\ 二聚體)組成。在該構(gòu)型中，每個可變區(qū)的三個⑶R互相作用，以確定二聚體表面上 的靶點結(jié)合位點，與完整抗體的情況一樣。所述六個CDR共同賦予完整抗體的靶點結(jié)合特 異性。但是，即使是單個可變區(qū)(或僅包括3個特異識別某靶點的CDR的Fv的一半)，仍可 具有識別和結(jié)合靶點的能力。“單鏈Fv”、“sFv”或“scAb”抗體片段包括抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域 位于單條多肽鏈上。一般而言，所述Fv多肽還包括一段位于Vh和\區(qū)域之間的多肽連接 體，其通常為柔性分子，可使sFv形成適合于靶點結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。術(shù)語“雙價抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，這些片段可包括與同一 多肽鏈的一個輕鏈可變區(qū)連接的一個重鏈可變區(qū)(Vh)。通過使用一條過短的連接體 使得同一條鏈上的兩個可變區(qū)無法配對，所述雙價抗體區(qū)域被迫與另一條鏈的結(jié)合區(qū)域配 對，生成兩個抗原結(jié)合位點。Fab片段含有輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)以及重鏈的第一個恒定區(qū)(C01)。Faiy片段與 Fab片段的不同之處在于前者在Cm區(qū)域的羧基端加入數(shù)個殘基，以包括一個或多個來自抗 體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。通過裂解位于F(ab, )2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫 鍵，可生成Fab,片段。對抗體另外進行酶處理和化學(xué)處理可生成其它目的功能片段。本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指得自基本同源的抗體群的抗體，即組成該群 體的各個抗體除可能有少量天然突變外，均是相同的。本文的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與源自某 特定物種或?qū)儆谀程囟贵w種類或亞類(類型或亞型)的相應(yīng)序列相同或同源，其中所 述鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體以及所述抗體片段的 相應(yīng)序列相同或同源，只要這些抗體片段表現(xiàn)出結(jié)合CXCR5或影響CXCR5活性或代謝的 所需生物活性即可(美國專利4，816，567 ;Morrison等的Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851(1984))。因此，來自同一類別抗體的CDR可移植到不同種類或亞類抗體的FR中。單克隆抗體是高度特異性的抗體，它們識別單個靶位點、表位或決定簇。而且，與 通常包括針對抗原的不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑不同的 是，每個單克隆抗體針對靶點上的單個決定簇。除其特異性以外，單克隆抗體在宿主細(xì)胞內(nèi) 的合成是有利的，不受其它免疫球蛋白的污染，并提供了克隆編碼其抗體鏈的相關(guān)基因和mRNA。修飾語“單克隆”指得自基本同質(zhì)抗體群的抗體的性質(zhì)，其不應(yīng)理解為需要通過任何 特定方法產(chǎn)生所述抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可從噬菌體抗體庫通過使用眾所 周知的技術(shù)分離或從多克隆制品純化。本發(fā)明使用的親代單克隆抗體可通過Kohler等人 在Nature 256:495(1975)中所述的雜交瘤方法制備，或通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的重組方 法制備。非人類(例如鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它 們的片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab,、F(ab, )2或其它靶點結(jié)合序列)，與人抗體相比，其含有 源自非人類的免疫球蛋白序列。一般而言，所述人源化抗體基本包括一個、通常為兩個的 所有可變區(qū)，其中所有或基本上所有CDR區(qū)域?qū)?yīng)于非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)域，以及 所有或基本上所有FR區(qū)域是人類免疫球蛋白模板序列的FR區(qū)域。所述人源化抗體還可包 括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(F。)，通常是所選擇的人免疫球蛋白模板的恒定區(qū)。一般 而言，目的是擁有在人體內(nèi)免疫原性最低的抗體分子。因此，有可能一個或多個CDR中的 一個或多個氨基酸也可被更換成在人類宿主體內(nèi)免疫原性更低的氨基酸，但基本不降低所 述一個或多個CDR對CXCR5或CXCL13的特異結(jié)合功能?；蛘?，F(xiàn)R可為非人類的，但免疫原 性最強的氨基酸被替換為免疫原性較低的氨基酸。但是，上文所討論的CDR移植并非是獲 得人源化抗體的唯一途徑。例如，僅修飾CDR區(qū)域可能不夠充分，因為框架區(qū)殘基參與決 定CDR環(huán)的三維結(jié)構(gòu)以及抗體與其配體的總親和力的情況并不少見。因此，可實施任何方 法，以使非人類親代抗體分子被修飾為對人免疫原性更低的抗體分子，而且并非總是需要 與人抗體的總序列相同。因此，也可通過例如僅取代數(shù)個殘基實現(xiàn)人源化，尤其是取代暴 露在抗體分子外且沒有被包埋在該分子內(nèi)部從而不易接近宿主免疫系統(tǒng)的殘基。本文在 取代抗體分子上的“活動”或“柔性”殘基方面教導(dǎo)了該方法，其目標(biāo)是降低或減少所形成 分子的免疫原性，卻不破壞所述抗體對其表位或決定簇的特異性。例如參見Studnicka等 的 Prot Eng7 (6) 805-814,1994 ；Mol Imm 44 :1986_1988，2007 ;Sims 等的 J Immunol 151 2296(1993) ；Chothia 等的 J Mol Biol 196:901(1987) ；Carter 等的 ProcNatl Acad Sci USA 89:4285(1992) ；Presta 等的 J Immunol 151 2623(1993), WO 2006/042333 和美國專 利 5，869，619。適應(yīng)性免疫反應(yīng)具有兩個主要方面T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)和分泌抗體的B 淋巴細(xì)胞的體液免疫反應(yīng)。B細(xì)胞的表位可以是線性、連續(xù)氨基酸或可以是構(gòu)象的(Protein Science (2005) 14，246)。相反，T細(xì)胞表位是短小的線性肽，它們是主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)蛋白或人白細(xì)胞抗原(HLA)I類或II類分子所呈遞的抗原蛋白的切割產(chǎn)物。表位呈 遞取決于MHC-肽結(jié)合和T細(xì)胞受體(TCR)互相作用。MHC蛋白為高度多態(tài)性的，每個MHC 蛋白可結(jié)合有限數(shù)量的肽。因此，宿主體內(nèi)的MHC等位基因的特定組合限制了感染過程中 可能被識別的表位。通過⑶8和⑶4蛋白表達可區(qū)分兩種基本類型的T細(xì)胞，CD8和⑶4蛋白決定T 細(xì)胞是否識別分別由I類或II類分子所呈遞的表位。CD4+T表位被抗原呈現(xiàn)細(xì)胞包裹到 膜結(jié)合囊泡內(nèi)后進行加工，其中抗原被蛋白酶降解成結(jié)合MHC II類蛋白的肽片段。相反， CD8+T細(xì)胞一般識別被免疫蛋白酶體在細(xì)胞溶質(zhì)中切割成短肽的病毒抗原或細(xì)胞內(nèi)表達的 自身抗原和蛋白質(zhì)。切割后，肽被與抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)移位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以結(jié)合 到HLA I抗原上。CD4+T(輔助性)細(xì)胞表位是驅(qū)動針對蛋白抗原的T細(xì) 胞依賴免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。目的人源化方法基于所述抗體的分子柔性在免疫識別中的影響。蛋白質(zhì)柔性與蛋白分子的分子運動有關(guān)。蛋白質(zhì)柔性是整個蛋白、部分蛋白或單個氨基酸殘基采取構(gòu)象 集合的能力，其中該構(gòu)象集合中每個構(gòu)象各自顯著不同。有關(guān)蛋白質(zhì)柔性的信息可從蛋白 質(zhì)X射線結(jié)晶學(xué)實驗(參見例如Kundu等的2002，Biophys J 83 :723_732·)、核磁共振實 驗(參見例如 Freedberg 等的 J Am Chem Soc 1998,120(31) :7916_7923)或進行分子動 力學(xué)(MD)模擬而獲得。在計算機上進行蛋白質(zhì)的MD模擬，可通過計算原子之間的物理互 相作用測定所有蛋白質(zhì)原子在一段時間內(nèi)的運動。MD模擬的輸出是所研究蛋白在模擬時 間段內(nèi)的軌跡。該軌跡是蛋白質(zhì)構(gòu)象或稱瞬間運動圖的集合，蛋白質(zhì)構(gòu)象在模擬期間例如 每隔1皮秒(PS)內(nèi)定期采樣。通過分析瞬間運動圖的集合，人們能夠定量分析蛋白質(zhì)氨基 酸殘基的柔性。因此，就含有柔性殘基的多肽而言，柔性殘基是采取不同構(gòu)象集合的殘基。 MD方法為本領(lǐng)域所公知，參見例如Brooks等的“Proteins :A TheoreticalPerspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics，，(Wiley, NewYork, 1988)。數(shù)禾中軟件可進行 MD 模擬，例如 Amber (參見 Case 等的(2005) J Comp Chem 26 1668-1688)，Charmm(參見 Brooks 等的(1983)J CompChem 4 :187_217 ；和 MacKerell 等的(1998)“The Encyclopedia ofComputational Chemistry" vol. 1 -.271-177, Schleyer 等 的 eds. Chichester :John ffiley&Sons)或 Impact (參見 Rizzo 等的 J Am Chem Soc ；2000 ；122(51) 12898-12900)。大多數(shù)蛋白質(zhì)復(fù)合物共享相對較大和較平的被包埋表面，已表明結(jié)合伴侶的柔性 提供了其彈性的來源，使其能夠適應(yīng)彼此的構(gòu)象(Structure (2000) 8，R137-R142)。因此，已 表明“誘導(dǎo)契合”的實例在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的界面起了主要作用。此外，穩(wěn)定增長的數(shù)據(jù)表 明蛋白質(zhì)實際上結(jié)合各種形狀、大小和組成的配體(Protein Science (2002) 11 184-187), 且構(gòu)象多樣性似乎是識別不同伴侶能力的基本組分(Science (2003) 299，1362-1367)。柔性 殘基參與了蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)伴侶的結(jié)合(Structure (2006) 14，683-693)。柔性殘基可采取許多構(gòu)象，它們提供了互相作用區(qū)域的集合，其有可能被記憶B 細(xì)胞識別并觸發(fā)免疫原性反應(yīng)。因此，可通過修飾許多來自框架區(qū)的殘基使抗體人源化，使 得構(gòu)象集合和被修飾抗體所展示的識別區(qū)域集合盡可能類似于人抗體所采取的構(gòu)象集合 和識別區(qū)域集合。這一點可通過以下列方法修飾有限數(shù)目的殘基而實現(xiàn)(1)構(gòu)建母體mAb的同源 模型，進行MD模擬；(2)分析柔性殘基和鑒定非人抗體分子最靈活的殘基，以及鑒定有可能 是異質(zhì)性或降解反應(yīng)來源的殘基或基序；(3)鑒定展示出與親代抗體最相似的識別區(qū)域集 合的人抗體；(4)測定待突變的柔性殘基，可能是異質(zhì)性和降解來源的殘基或基序也進行 突變；(5)檢查是否存在已知的T細(xì)胞或B細(xì)胞表位。采用本文所述的MD計算，使用內(nèi)含 的溶劑模型，可發(fā)現(xiàn)柔性殘基，該溶劑模型描述了水溶劑與蛋白質(zhì)原子在模擬期間內(nèi)的互 相作用。一旦在輕鏈和重鏈的可變區(qū)內(nèi)鑒定出一組柔性殘基，就鑒定出與目的抗體高度類 似的一組人重鏈和輕鏈可變區(qū)域框架。例如可使用BLAST在抗體人生殖細(xì)胞系序列的數(shù)據(jù) 庫中檢索柔性殘基來進行上述鑒定。還可通過比較母體mAb與生殖細(xì)胞系經(jīng)典結(jié)構(gòu)庫的動 力學(xué)，進行上述鑒定。檢索時排除CDR殘基和鄰近殘基，以確保保留對于抗原的高度親和 力。
因此，對目的抗體的分子動力學(xué)軌跡與生殖細(xì)胞系抗體結(jié)構(gòu)庫的軌跡進行比較。將16D7與49個生殖細(xì)胞系結(jié)構(gòu)的庫進行比較。每個抗體所留下的分子動力學(xué)軌跡是分子 動力學(xué)計算機仿真過程中的分子動力學(xué)計算結(jié)果的集合，其中例如使用約10個不同的構(gòu) 象作為不同的起點，并且對于每個起點進行約10次的分子動力學(xué)模擬。通過系統(tǒng)合并7個 最常見的人輕鏈(νκ l、vK2、VK3、VK4、VXl、VlX2fPVX3)和7個最常見的重鏈(vhla、 vhlb、vh2、vh3、vh4、vh5和vh6)，構(gòu)建人抗體生殖細(xì)胞系的493D同源模型(Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33，Database issue D593-D597)。隨后將 16D7 的柔性殘基更換為其 軌跡與目的抗體最為接近的生殖細(xì)胞系結(jié)構(gòu)的相應(yīng)殘基。隨后取代柔性殘基。當(dāng)幾個人類殘基表現(xiàn)出類似同源性時，通過可能影響人源 化抗體的溶液行為的殘基性質(zhì)來操作該選擇。例如，暴露的柔性環(huán)上優(yōu)選極性殘基，而不 是疏水殘基。對可能為不穩(wěn)定性和異質(zhì)性來源的殘基進行突變，如果在CDR上也發(fā)現(xiàn)了 它們的話。這些殘基包括暴露的甲硫氨酸，因為亞砜可由氧自由基、對酸敏感的鍵例如 Asp-Pro 二肽的鍵的蛋白水解而形成(Drug Dev Res (2004) 61 :137_154)；位于暴露的天冬 酰胺殘基和隨后的小氨基酸例如Gly、Ser, Ala、His、Asn或Cys處的脫酰胺作用位點(J Chromatog (2006) 837 :35_43)和N-糖基化位點例如Asn-X-Ser/Thr位點。一般情況下，暴 露的甲硫氨酸會被Leu所取代，暴露的天冬酰胺會被谷氨酰胺或天冬氨酸所取代，或更換 其后續(xù)殘基。對于糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)而言，可更換Asn或Ser/Thr殘基。檢查形成的復(fù)合序列是否存在已知的B細(xì)胞或線性T細(xì)胞表位。例如使用披露的 Immune Epitope Data Base(IEDB)進行檢索(PLos Biol (2005) 3 (3) e91)。如果在該復(fù)合 序列中發(fā)現(xiàn)已知表位，則檢索和取代另一組人序列。與美國專利5，639，641的表面重塑方法不同的是，該方法探討了 B細(xì)胞介導(dǎo)和T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫原性反應(yīng)。該方法還避免了有時使用CDR移植可觀察到的活性丟失問題 (美國專利5，530，101)。此外，在設(shè)計和選擇過程中還考慮了穩(wěn)定性和溶解度的問題，從而 形成具有低免疫原性、高抗原親和力和改善的生物物理性質(zhì)的優(yōu)化抗體。例如美國專利5，639，641披露了用于表面重塑抗體的策略和方法以及降低抗體 在不同宿主體內(nèi)免疫原性的其它方法。簡而言之，在一種優(yōu)選方法中，(1)生成抗體重鏈和 輕鏈的可變區(qū)庫的位置比對，得到重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的位置，其中所有可變 區(qū)域的比對位置至少約98%是相同的；(2)確定一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的氨 基酸殘基，用于非人類例如嚙齒動物抗體(或其抗體片段)；(3)鑒定一組與所述嚙齒動物 抗體表面暴露的氨基酸殘基最為一致的重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的氨基酸殘基；以 及(4)將步驟(2)所確定的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的氨基酸替換為步驟(3) 所鑒定的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的氨基酸殘基，除了距離所述嚙齒動物抗體 CDR的任何殘基的任何原子5人以內(nèi)的氨基酸殘基以外，以生成保留結(jié)合特異性的人源化的 例如嚙齒動物抗體。抗體可利用許多其它技術(shù)例如⑶R移植(ΕΡ0 O 239 400 ;W091/09967和美國專 利 5，530，101 以及 5，585，089)、鑲飾或表面重塑(ΕΡ0 0 592106 ；EPO 0 519 596 ；Padlan, 1991，Molec Imm 28(4/5) :489_498 ;Studnicka 等的 1994，Prot Eng 7(6) :805_814 禾口 Roguska等的1994，PNAS 91 =969-973)和鏈改組(美國專利5，565，332)進行人源化。 人抗體可通過許多本領(lǐng)域已知的方法進行制備，包括但不限于噬菌體展示方法(參見美國專利 4，444，887，4，716，111，5，545，806 和 5，814，318 和 WO 98/46645，WO 98/50433， W098/24893, WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735 和 WO 91/10741)、使用轉(zhuǎn)基因動物 例如嚙齒類，以及使用嵌合細(xì)胞等。“抗體同源物”或“同源物”是指本文所教導(dǎo)的特異結(jié)合CXCR5的任何分子。因此， 抗體同源物包括不論修飾與否的天然或重組抗體、抗體的部分，所述的部分保留了目的生 物性質(zhì)如結(jié)合CXCR5，例如Fab或Fv分子、單鏈抗體以及攜帶一個或多個CDR區(qū)域的多肽等。 所述同源物的氨基酸序列無需與天然存在的抗體氨基酸序列相同，但可通過改變或修飾以 攜帶取代的氨基酸、插入的氨基酸、刪除的氨基酸、除蛋白質(zhì)上正常存在的20種氨基酸以 外的氨基酸等，以獲得具有增強的或其它有利性質(zhì)的多肽。具有同源序列的抗體是其氨基酸序列與本發(fā)明的CXCR5抗體的氨基酸序列具有 序列同源性的抗體。優(yōu)選地，同源性位于本發(fā)明抗體的可變區(qū)域的氨基酸序列。應(yīng)用于本 文氨基酸序列的“序列同源性”定義為通過例如根據(jù)Pearson & Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 85,2444-2448(1988)的FASTA檢索方法測定的與其它氨基酸序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%或更多的序列同源性，更優(yōu)選為至少約95%、96%、97%、98% 或99%的序列同源性的序列。嵌合抗體是具有不同部分的抗體，其源自不同來源例如不同抗體、不同種類的抗 體、不同動物物種，例如具有一個源自鼠單克隆抗體的可變區(qū)以及一個配對的人免疫球蛋 白恒定區(qū)的抗體等。因此，人源化抗體是一種嵌合抗體。用于生產(chǎn)嵌合抗體的方法為本領(lǐng) 域所知曉，參見例如 Morrison, 1985，Science 229 1202 ；Oi 等人，1986，BioTechniques 4 :214 ;Gillies 等的 1989，J Immunol Methods 125 191-202 和美國專利 5，807，715， 4，816，567 和 4，816，397。人工抗體包括單鏈抗體、scFv片段、嵌合抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體和 分子識別單位(mru)(參見 Winter & Milstein 的綜述，1991，Nature 349 293~299 ；和 Hudson，1999，Curr Opin Imm 11 :548_557)，其中每種均具有抗原結(jié)合或表位結(jié)合能力。在 單鏈Fv片段(ScFv)中，抗體的V1^nt區(qū)域通過柔性肽連接起來。一般情況下，所述連接體 是約為15個氨基酸的肽。如果該連接體小得多，例如5個氨基酸，則形成雙價抗體，其為雙 價的scFv 二聚體。如果該連接體被減少到不到3個氨基酸殘基，則形成三聚體和四聚體結(jié) 構(gòu)，它們分別被稱為三價抗體和四價抗體?？贵w的最小結(jié)合單元可以是單個CDR，一般為重 鏈的CDR2或CDR3，其具有足夠的特異識別和結(jié)合能力，但也可以是CDR序列的任意組合，這 可通過本文所教導(dǎo)的實施方法進行確定。這種片段被稱為分子識別單位或mru。幾個該類 mru可通過短的連接肽連接到一起，從而形成具有高于單個mru的親和力的人工結(jié)合蛋白。目的抗體的功能等效物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“功能等效物”包括具有同 源系列的抗體、抗體同源物、嵌合抗體、人工抗體和修飾抗體，例如其中每個功能等效物通 過其結(jié)合CXCR5的能力、抑制CXCR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力或功能、或抑制CXCL13和其它配體結(jié) 合到CXCR5的能力來定義。技術(shù)人員能夠理解，名為“抗體片段”的一組分子與名為“功能等 效物”的一組分子有重疊。制備保留CXCR5結(jié)合能力的功能等效物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知，并在例如 WO 93/21319，EPO Ser. No. 239, 400, WO 89/09622，EPO Ser. No. 338, 745 和 EPO Ser. No. 332，424 中披露。本申請的功能等效物還包括修 飾抗體，例如被任何類型的分子經(jīng)共價連接而修飾的抗體。例如，修飾抗體包括經(jīng)過例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、脫酰胺化、磷酸化、酰胺化、被已知的保護/封閉基團衍生化、蛋白裂解、連接到細(xì)胞配體、連接到毒素或細(xì)胞毒性 部分或其它蛋白等修飾的抗體。共價連接無需生成不產(chǎn)生抗獨特型反應(yīng)的抗體。所述修飾 可通過已知技術(shù)實現(xiàn)，其包括但不限于特異化學(xué)切割、乙酰化、甲?；?、代謝合成等。此外， 被修飾的抗體可含有一個或多個非經(jīng)典的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多技術(shù)來實現(xiàn)結(jié)合親和力的優(yōu)化。一般情況下，這些技 術(shù)包括對目的位置處的各種氨基酸殘基進行替代、隨后篩選分析突變多肽對同源抗原或表 位的結(jié)合親和力。一旦抗體被鑒定和分離，通?？捎脕砩勺儺惪贵w或突變體或突變蛋白質(zhì)，其中 例如所述抗體的一個或多個高變區(qū)的一個或多個氨基酸殘基被改變。或者，或此外，可向抗 體引入框架區(qū)殘基的一個或多個變動(例如取代)，而這些變動導(dǎo)致抗體突變體對CXCR5 的結(jié)合親和力升高?？杀恍揎椀目蚣軈^(qū)殘基的實例包括非共價直接結(jié)合抗原的殘基(Amit 等的Science233 747-753(1986))；影響CDR構(gòu)象或與其互相作用的殘基(Chothia等的J Mol Biol 196:901-917(1987))；和/或參與Vf Vh界面的殘基(EP 239 400)。在某些實施 方案中，一個或多個這類框架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體與同源抗原的結(jié)合親和力增加。例如， 在本發(fā)明的該實施方案中可改變約1個到約5個框架區(qū)殘基。有時，這足以產(chǎn)生適合用于 臨床前試驗的抗體突變體，即使其中沒有改變?nèi)魏我粋€高變區(qū)的殘基。但在正常情況下，抗 體突變體可包括一個或多個高變區(qū)變動。也可改變恒定區(qū)以獲得理想的或更加理想的效應(yīng) 物性質(zhì)。被變動的高變區(qū)殘基可隨機改變，尤其是當(dāng)親代抗體的初始結(jié)合親和力可使隨機 產(chǎn)生的抗體突變體容易在本文所教導(dǎo)的檢測中對結(jié)合改變進行篩選時。一種獲得抗體突變體例如⑶R突變體的方法是”丙氨酸掃描誘變”(Cunningham & Wells，Science 244 1081-1085 (1989)和 Cunningham &ffelis,Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437(1991))。一個或多個高變區(qū)殘基被丙氨酸或聚丙氨酸殘基替代。對所述替 代表現(xiàn)出功能敏感性的這些高變區(qū)殘基隨后通過在替代位點引入進一步的或其它突變而 改進。因此，盡管事先確定了引入氨基酸序列變動的位點，但突變本身的性質(zhì)無需事先確 定。根據(jù)被掃描殘基的所需性質(zhì)，可嘗試使用其它氨基酸進行類似替代。一種鑒定待修飾氨基酸殘基的更為系統(tǒng)的方法包括鑒定參與結(jié)合CXCR5的高變 區(qū)殘基和很少或不參與CXCR5結(jié)合的高變區(qū)殘基。進行非結(jié)合高變區(qū)殘基的丙氨酸掃描， 其中檢測每個ala突變體對CXCR5的結(jié)合是否增強。在另一實施方案中，選擇明顯參與 CXCR5結(jié)合的這些殘基進行修飾。修飾可包括刪除殘基或在目的殘基旁插入一個或多個殘 基。但是，正常情況下，修飾包括以另一個氨基酸取代該殘基。保守性取代可以是第一取代。 如果該取代導(dǎo)致生物活性發(fā)生變化(例如結(jié)合親和力)，那么可進行另一次保守取代以確 定是否得到更多實質(zhì)性變化。通過選擇其性質(zhì)與正常情況下位于某位點處的氨基酸有更多實質(zhì)差異的氨基酸， 可對抗體范圍和生物性質(zhì)的呈現(xiàn)進行更為實質(zhì)性的修飾。因此，可進行該取代并同時維持 (a)取代區(qū)域的多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象；(b)該分子在靶位點處的電荷或疏水 性，或(c)側(cè)鏈的體積。例如，根據(jù)常見側(cè)鏈性質(zhì)，天然存在的氨基酸可分為以下幾組
(1)疏水甲硫氨酸(M或met)、丙氨酸(A或ala)、纈氨酸(V或val)、亮氨酸(L 或leu)和異亮氨酸(I或ile)；(2)中性、親水半胱氨酸(C或cys)、絲氨酸(S或ser)、蘇氨酸(T或thr)、天冬 酰胺(N或asn)和谷氨酰胺(Q或gin)；(3)酸性天冬氨酸(D或asp)和谷氨酸(E或glu)；(4)堿性組氨酸(H或his)、賴氨酸(K或Iys) 和精氨酸(R或arg)；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸(G或gly)和脯氨酸(P或pro)，以及(6)芳香族色氨酸(W或trp)、酪氨酸(Y或tyr)苯丙氨酸(F或phe)。非保守取代需要以來自另一組的氨基酸來調(diào)換某氨基酸。保守性取代需要以來自 組內(nèi)的另一氨基酸來調(diào)換某氨基酸。優(yōu)選的氨基酸取代包括下列氨基酸取代(1)降低對蛋白水解的敏感性，⑵降低 對氧化的敏感性，(3)改變結(jié)合親和力，以及(4)賦予或修飾這些類似物的其它生理-化 學(xué)或功能性質(zhì)。類似物可包括除天然存在肽序列以外的一段序列的各種突變蛋白質(zhì)。例 如，可對天然存在的序列(優(yōu)選在形成分子間接觸的區(qū)域以外的多肽部分)進行單個或 多個氨基酸的取代(優(yōu)選為保守性氨基酸取代)。除R基團或側(cè)鏈的大小或構(gòu)象的改變 以外，保守性氨基酸取代不應(yīng)當(dāng)實質(zhì)性改變母體序列的結(jié)構(gòu)特征(例如氨基酸取代不應(yīng) 當(dāng)打斷母體序列中的螺旋，或破壞表現(xiàn)母體序列特征的其它類型的二級結(jié)構(gòu))(Proteins， Structures and Molecular Principles，Creighton，編輯，W. H. Freeman and Company, New York(1984)) ；Introduction to ProteinStructure (Branden & Tooze,編輯，Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))；以及 Thornton 等的 Nature 354:105(1991)。通常情況下，生物學(xué)性質(zhì)改善的抗體突變體具有與母體的抗人CXCR5抗體的重鏈 或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列至少75%的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，和至少 80 %、至少85 %、至少90 %以及通常為至少95 %的同一性。就親代抗體序列而言，同一性或 相似性在本文中定義為經(jīng)比對序列和引入間隔(若有必要的話)以實現(xiàn)最大程度的序列同 一性后，候選序列的氨基酸殘基與親代抗體的殘基相同(即，相同殘基)或類似(即，根據(jù) 相同側(cè)鏈性質(zhì)而來自同一組的氨基酸殘基，參見上文)的百分比?；蛘?，通過重鏈和輕鏈的FR或⑶R區(qū)域或抗CXCR5抗體的F。區(qū)域的系統(tǒng)突變， 可生成抗體突變體。生成抗體突變體的另一種方法包括使用噬菌體展示進行親和力成熟 (Hawkins 等的 J Mol Biol 254 :889_896 (1992)和 Lowman 等的 Biochemistry 30(45) 10832-10838(1991))。已知噬菌體外殼蛋白融合(Smith, Science 228:1315(1985) ；Scott & Smith，Science249 386(1990) ；Cwirla 等的 Proc Natl Acad Sci USA 8:309(1990)； Devlin 等的 Science 249:404(1990) ；Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol2 597(1992)和美國專利5，223, 409)可用于將所展示的蛋白或肽的表現(xiàn)型與編碼它們的噬 菌體顆粒的基因型聯(lián)系在一起?？贵w的Fab區(qū)域也被展示在噬菌體上(McCafferty等的 Nature 348:552(1990) ；Barbas等的Proc NatlAcad Sci USA 88:7978(1991)；和Garrard 等的 Biotechnol 9:1373(1991))。單價噬菌體展示由一組作為噬菌體外殼蛋白融合體而被展示于噬菌體顆粒上 的蛋白變異體組成(Bass等的Proteins 8:309(1990)。以前已通過連續(xù)應(yīng)用誘變、單 價噬菌體展示和功能分析(Lowman & Wells, J Mol Biol234 564578 (1993)；美國專利5，534，617)，例如通過集中分析抗體的CDR區(qū)域(Barbas等的Proc Natl Acad Sci USA 91 3809(1994) ；and Yang等的JMol Biol 254 :392 (1995))，實現(xiàn)了親和力成熟或各種蛋白平
衡結(jié)合親和力的提高?？稍谑删w顆粒上構(gòu)建許多(例如IO6或更多)在序列特定位置上有差異的蛋白 變異體的庫，其中每個噬菌體顆粒含有編碼特定蛋白變異體的DNA。使用固定抗原進行多次 親和純化后，分離單個噬菌體克隆，并從DNA推斷出所展示蛋白的氨基酸序列。制備抗體突變體后，可依據(jù)本文教導(dǎo)測定該分子相對于親代抗體的生物活性。正 如上文指出，該過程涉及測定抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物活性或物理性質(zhì)。在本發(fā) 明的一個優(yōu)選實施方案中，制備一組抗體突變體，篩選其對抗原的結(jié)合親和力。任選地可對 選自篩選的一個或多個抗體突變體另外進行一次或多次生物活性測定，以驗證抗體突變體 具有新的或改進的性質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體突變體保留了與親代抗體類似 的或更好/更高的結(jié)合CXCR5的結(jié)合能力。通常，根據(jù)抗體的預(yù)期用途，可對所選擇的抗體突變體進行進一步修飾。這類修飾 可包括進一步改變氨基酸序列、與異源的多肽融合和/或共價修飾。例如，一般可使用絲氨 酸取代未參與維持抗體突變體適宜構(gòu)象的半胱氨酸殘基，以改善該分子的氧化穩(wěn)定性和防 止異常的交聯(lián)。相反，可向抗體中加入半胱氨酸以提高穩(wěn)定性(尤其當(dāng)該抗體是抗體片段 例如Fv片段時)。另一類型的抗體突變體具有改變的糖基化類型?？赏ㄟ^刪除抗體上的一個或多 個碳水化合物部分和/或加入一個或多個抗體上沒有的糖基化位點來實現(xiàn)。抗體的糖基 化一般為N-連接到Asn或0-連接到Ser或Thr。三肽序列天冬酰胺_X_絲氨酸和天冬酰 胺-χ-蘇氨酸是碳水化合物部分經(jīng)酶促連接到天冬酰胺側(cè)鏈的常見識別序列，其中X是除 脯氨酸以外的任何氨基酸。例如，將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、果糖或木糖連接到羥基氨基 酸，大多數(shù)為絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向原始抗體的序列 加入或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基可增加0-連接糖基化的概率。可能需要修飾本發(fā)明所述抗體的效應(yīng)物功能，以增強抗體的效力。例如，可在F。區(qū) 引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚抗體可具有改善 的內(nèi)化能力和/或增加的補體_介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷以及抗體依賴性的細(xì)胞毒性(ADCC)，參見 Caron 等的 J Exp Medl76 :1191_1195 (1992)和 Shopes，Immunol 148:2918-2922(1993)。 或者，可改造具有兩個F。區(qū)的抗體，因而該抗體可具有增強的補體裂解和ADCC能力，參見 Stevenson 等的 Anti-Cancer Drug Design 3:219230(1989)?？贵w的共價修飾涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^化學(xué)合成或通過抗體的酶切割或 化學(xué)切割(如果可行的話)實現(xiàn)這一點。通過抗體的靶向氨基酸與有機衍生試劑發(fā)生反應(yīng)， 可向抗體分子引入抗體的其它類型的共價修飾，其中有機衍生試劑可與所選側(cè)鏈或與N端 或C端殘基反應(yīng)。 半胱氨酰殘基可與α -鹵代乙酸酯(以及相應(yīng)的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺發(fā)生 反應(yīng)，生成羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰殘基還可通過例如與溴三氟丙酮、 α -溴- β - (5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸酯、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化 物、甲基2-吡啶二硫化物、對氯汞苯甲酸鹽、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧 雜-1，3- 二唑反應(yīng)進行衍生化。
組氨酰殘基可通過與焦碳酸二乙酯在pH 5. 5-7.0下反應(yīng)進行衍生化。還可使用 對_溴苯甲?；?，該反應(yīng)優(yōu)選在PH 6. 0的0. IM 二甲胂酸鈉中進行。賴氨酰和α末端殘基可與琥珀酸或其它羧酸酐發(fā)生反應(yīng)，以逆轉(zhuǎn)殘基的電荷。用 于衍生化含有α“氨基的殘基的其它適宜試劑包括亞氨酸酯例如甲基吡啶亞氨酸甲酯、磷 酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、0-甲基異脲和2，4_戊二酮，氨基酸可被轉(zhuǎn) 氨酶以乙醛酸催化?？赏ㄟ^與一種或多種常規(guī)試劑例如苯甲酰甲醛、2，3_ 丁二酮、1，2_環(huán)己二酮和茚 三酮反應(yīng)來修飾精氨酰殘基。精氨酸殘基的衍生化通常需要堿性反應(yīng)條件。而且，這些試 劑可與賴氨酸以及精氨酸的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)?？墒褂梅枷阕逯氐衔锘蛩南趸淄檫M行酪氨酰殘基的特異修飾。例如，使用 N-乙?；溥蚝退南趸淄榉謩e形成0-乙酰酪氨酰類和3-硝基衍生物。使用125I或131I 可碘化酪氨酰殘基以制備用于放射免疫分析的標(biāo)記蛋白。通過與碳二亞胺(R-N = C = C-R')反應(yīng)，羧基側(cè)鏈基團(天冬氨?；蚬劝滨?基 )可被修飾，其中R和R'可為不同的烷基，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳 二亞胺或1-乙基-3_(4-氮鐺-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨酰和谷氨酰殘 基通過與銨離子反應(yīng)可被轉(zhuǎn)化為天冬酰胺?；凸劝滨０孵；鶜埢?。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?；鶜埢Ｔ谥行曰驂A性條件下被脫酰胺，分別生成相 應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基脫去酰胺的形式落在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化、絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化、 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化(Creighton，Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N 端氨基 的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。另一類型的共價修飾涉及通過化學(xué)方式或酶催化方式將配糖體偶聯(lián)到抗體上。這 些方法不需要在具有N-連接或0-連接的糖基化能力的宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗體。根據(jù)所使用 的偶聯(lián)方法，糖可被連接到(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離巰基，例如半胱 氨酸的巰基；(d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(e)芳香殘基例如苯丙 氨酸、酪氨酸或色氨酸殘基；或(f)谷氨酰胺的酰氨基。WO 87/05330和Aplin & Wriston， CRC Crit Rev Biochem，pp. 259-306 (1981)敘述了這類方法。可通過化學(xué)或酶催化方式除去位于抗體上的任何碳水化合物部分。例如化學(xué)去 糖基化需要抗體與化合物三氟甲磺酸或等效的化合物接觸，從而導(dǎo)致除連接糖基(N-乙 ?；咸前坊騈-乙?；肴樘前?以外的多數(shù)或全部糖基的切割，并保持抗體的完整性。 例如 Hakimuddin 等的 Arch BiochemBiophys 259 :52 (1987)和 Edge 等的 Anal Biochem 118 :131(1981)敘述了化學(xué)去糖基化?？赏ㄟ^例如Thotakura等的Meth Enzymol 138 350(1987)所述的許多內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶中的任何一種實現(xiàn)抗體上碳水化合物部分 的酶催化切割。另一類型的抗體共價修飾包括依據(jù)美國專利4，640，835,4, 496，689,4, 301，144、 4，670，417,4, 791，192或4，179，337所述相同的方式，將該抗體連接到許多非蛋白質(zhì)聚合
物例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯類的一種。獲得突變體或突變蛋白質(zhì)的另一種優(yōu)選技術(shù)是通過噬菌體展示進行親和力成熟(Hawkins 等的 J Mol Biol 254 :889_896 (1992)和 Lowman 等的 Biochemistry 30(45) 10832-10838 (1991))。簡而言之，突變幾個高變區(qū)位點(例如6_7個位點)，得到每個位點 所有可能的氨基酸取代。依此得到的抗體突變體作為噬菌體顆粒上的融合蛋白以單價形式 展示于噬菌體顆粒上。表達各種突變體的噬菌體可經(jīng)歷多輪結(jié)合選擇，隨后對展示出高親 和力的突變體進行分離和測序。選擇新結(jié)合多肽的方法可使用結(jié)構(gòu)相關(guān)多肽的庫。通過誘變產(chǎn)生與例如噬菌體外 殼蛋白融合的結(jié)構(gòu)相關(guān)多肽的庫，并將其展示在顆粒表面。隨后這些顆粒與靶分子接觸。將 對靶分子具有最高親和力的顆粒從低親和力的顆粒中分離出來。隨后通過感染適宜的細(xì)菌 宿主來擴增高親和力的結(jié)合顆粒，并重復(fù)競爭性結(jié)合步驟。重復(fù)該過程，直至得到所需親和 力的多肽。或者，還可使用多價噬菌體(McCafferty等(1990) Nature 348 :552_554 和 Clackson等的(1991)Nature 352 :624_628)來表達隨機點突變(例如通過使用易錯DNA 聚合酶生成的)，以生成噬菌體抗體片段的庫，并隨后篩選該庫對CXCR5的親和力(Hawkins 等(1992) J Mol Biol 254:889-896)。優(yōu)選情況下，在親和力成熟過程中，可復(fù)制的表達載體處于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的嚴(yán)密 調(diào)控下，調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件使得展示一個以上融合蛋白拷貝的顆粒的量或數(shù)目小于約1 %。同樣 在優(yōu)選情況下，展示一個以上融合蛋白拷貝的顆粒的量小于展示單拷貝融合蛋白的顆粒的 量的10%。優(yōu)選該量小于20%。通過互換不同抗體鏈的框架區(qū)內(nèi)或源自多個抗體的復(fù)合FR的不同⑶R，可產(chǎn)生功 能等效物。因此對于一組特定的⑶R而言，通過取代不同的重鏈例如IgGy，、IgMUgAn或 IgD，不同種類的抗體有可能生成不同的CXCR5抗體類型和亞型。與之類似，通過將一組特 定CDR植入整個合成的框架區(qū)內(nèi)，可產(chǎn)生位于本發(fā)明范圍內(nèi)的人工抗體。例如，從效應(yīng)物功能下降的IgG4分子可得到攜帶可變區(qū)或一個或多個目的⑶R的 適宜框架區(qū)和F。部分。在其它實施方案中，為了增強結(jié)合CXCR5的目的分子的性質(zhì)，可對攜帶目的分子 抗原結(jié)合部分的分子框架部分和/或F。部分進行某些修飾。例如，可進行氨基酸取代以 增強或降低目的性質(zhì)。因此，在IgG4分子中已知可影響功能的位點例如鉸鏈區(qū)以及影 響效應(yīng)物功能或影響F。結(jié)合的區(qū)域的取代適合于進行修飾。可使用Kabat編號在氨基 酸 225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、 243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255 等處或它們的組合對 IgG4 分 子進行取代，以獲得所需性質(zhì)。例如，使用脯氨酸取代絲氨酸241可穩(wěn)定分子的三級和四 級結(jié)構(gòu)(Mol Imm30 (1) 105-108，1993)，使用谷氨酸取代亮氨酸248可削弱效應(yīng)物功能(J Imml64 (4) 1925-1033，2000 ；以及 Clin Imm 98 (2) 164-174，2001)。另一有利性質(zhì)是獲得結(jié)合CXCR5但例如卻不損耗B細(xì)胞的抗體衍生物。這在患者的抗體生成沒有受損時是有利的。使用該試劑處理還便于使用聯(lián)合療法，其中針對某一特 定適應(yīng)癥的第二藥物作用于B細(xì)胞以外的水平。例如可以是在T細(xì)胞水平。因此，例如處理16D7-HC1-LC3以包含兩個取代S241P和L248E。脯氨酸和谷氨酸 殘基賦予結(jié)合CXCR5且攜帶IgG4框架區(qū)的目的分子的所需性質(zhì)，例如穩(wěn)定性和降低的效應(yīng) 物功能。
本發(fā)明的抗體片段和功能等效物包括其特異結(jié)合CXCR5的程度可檢測的分子。可 檢測程度的結(jié)合包括目的抗體的結(jié)合能力為至少10-100%范圍內(nèi)的所有值，優(yōu)選為至少 50%、60%或70%，更優(yōu)選為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。具有大于目的抗體 100 %親和力的等效物也包括在內(nèi)。一般而言⑶R對于表位識別和抗體結(jié)合是重要的。但是，可對組成⑶R的殘基 進行變動，而不干擾抗體識別和結(jié)合同源表位的能力。例如，可進行不影響表位識別但卻 增加抗體對表位的結(jié)合親和力的變動?；趯χ饕贵w序列的了解，幾項研究調(diào)查了向抗 體序列多個位點引入一個或多個氨基酸變動后對抗體性質(zhì)的作用，例如結(jié)合和表達水平 (Yang等的 1995，J Mol Biol 254 :392_403 ;Rader等的 1998，Proc Natl Acad Sci USA95 8910-8915 ；和 Vaughan 等的 1998，Nature Biotechnology 16，535-539)。因此，使用方法例如寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變、盒式誘變、易錯PCR、DNA改組或大 腸桿菌的突變株來改變重鏈和輕鏈基因的CDR1、CDR2或CDR3或框架區(qū)的序列，可生成目的 抗體的等效物(Vaughan 等的 1998，NatBiotech 16 :535_539 ；和 Adey 等的 1996，Chap. 16， pp.277-291,in PhageDisplay of Peptides and Proteins, eds. Kay等,Academic Press)。 改變主要抗體核酸序列的方法可導(dǎo)致抗體的親和力提高(Gram等的1992，Proc NatlAcad Sci USA 89 :3576-3580 ;Boder 等的 2000，Proc Natl Acad Sci USA97 10701-10705 ； Davies & Riechmann，1996，Immunotech 2 :169_179 ;Thompson等的 1996，J Mol Biol 256 77-88 ；Short 等的 2002，J Biol Chem277 16365-16370 ；和 Furukawa 等的 2001，J Biol Chem 276 27622-27628)。通過例如選擇歷經(jīng)多輪選擇的多個氨基酸變化，可使用重復(fù)循環(huán)的“多肽選擇”以 選擇越來越高的親和力結(jié)合。第一輪選擇后可對配體的其它區(qū)域或氨基酸進行其它輪次的 選擇，其中第一輪選擇涉及對配體或抗體多肽的首個氨基酸區(qū)域進行選擇。重復(fù)多輪選擇， 直到實現(xiàn)所需的親和力性質(zhì)。改良抗體還包括具有改良特征的抗體，它們通過動物免疫、雜交瘤形成和選擇具 有特異特征的抗體等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備?！稗卓箘笔侵敢种瓢悬c分子一種或多種生物活性(例如通過CXCR5的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)) 的分子。拮抗劑通過滅活或殺滅被配體活化的細(xì)胞和/或干擾受體或配體活化(例如酪氨 酸激酶活化)或干擾配體結(jié)合到受體后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可干擾受體結(jié)合到配體，并且反之亦 然。所述拮抗劑可完全阻斷受體-配體的互相作用，或?qū)嵸|(zhì)降低這種互相作用。出于本發(fā)明 的目的，拮抗劑的所有干擾位點均被視為等價的。因此，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的拮抗劑是 結(jié)合CXCR5、CXCL13、或CXCR5的其它配體、或CXCR5與其配體例如CXCL13的復(fù)合物的拮抗 劑(例如中和抗體)；拮抗CXCR5和配體例如CXCL13的互相作用的CXCR5或CXCL13的氨 基酸序列的變異體或衍生物；任選地與異源分子例如免疫球蛋白區(qū)域(例如免疫粘附素) 融合的可溶性CXCR5 ；包含CXCR5與另一受體或生物分子的復(fù)合物；結(jié)合CXCR5的合成或天 然序列肽等?！凹觿笔侵赴芗せ頒XCR5 —種或多種生物活性的蛋白質(zhì)、多肽、 肽、抗體、 抗體片段、綴合物、大分子、小分子等的化合物。激動劑可作為被配體活化的細(xì)胞的分裂原 和/或在配體結(jié)合到受體后干擾細(xì)胞失活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制，從而與受體對配體的結(jié)合發(fā)生 互相作用，反之亦然。出于本發(fā)明的目的，激動劑的所有干擾位點均被視為等價的。因此，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的激動劑是結(jié)合CXCR5、CXCL13、或CXCR5的其它配體、或CXCR5與其配體例如CXCL13的復(fù)合物的激動劑；促進CXCR5和配體例如CXCL13互相作用的CXCR5或 CXCL13氨基酸序列的變異體或衍生物；任選地與異源分子例如免疫球蛋白區(qū)域(例如免疫 粘附素)融合的可溶性CXCR5 ；包含CXCR5與另一受體或生物分子的復(fù)合物；結(jié)合CXCR5的 合成或天然序列肽等。激動劑一般是直接激活CXCR5進行例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的實體。術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)”包括它們的后代。還應(yīng)理解，由于有意或無 意的突變，所有的后代不一定精確相同，例如DNA含量。包括具有相同目的功能或生物性質(zhì) 的各種后代，其中目的功能或生物性質(zhì)用于篩選原始細(xì)胞。本發(fā)明所使用的“宿主細(xì)胞”一 般是選擇用于設(shè)計的原核或真核宿主。使用核酸“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞生物體、細(xì)胞或細(xì)胞系是指向靶細(xì)胞引入一段核酸，使得該 核酸作為染色體外的元件或經(jīng)染色體整合后可進行復(fù)制，以及任選地進行表達。使用核酸 “轉(zhuǎn)染”細(xì)胞或生物體是指細(xì)胞或生物體吸收該核酸，例如表達載體，而不論是否有任何編 碼序列實際上被表達。術(shù)語“轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞”和“轉(zhuǎn)化的”是指引入了一段核酸的細(xì)胞。 典型的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌的各種菌株。典型的真核宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例 如中國倉鼠卵巢細(xì)胞或來源于人的細(xì)胞。被引入的核酸序列可來自與宿主細(xì)胞相同或不同 的物種，或者可為雜交核酸序列，其含有一些外源核酸和一些同源核酸。還可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或用 源自病毒的組件感染進行轉(zhuǎn)化。術(shù)語“載體”是指核酸構(gòu)建體、載體，其含有核酸、轉(zhuǎn)基因、外源基因或目的基因，它 們被可操作地連接到適宜的調(diào)控序列以便在適宜的宿主內(nèi)進行轉(zhuǎn)基因的表達。這類調(diào)控序 列包括例如影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼適宜HiRNA核糖體結(jié)合 位點的序列以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可為質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H僅是潛在的 基因組插入物。一旦被轉(zhuǎn)化到適宜的宿主體內(nèi)，載體可獨立于宿主的基因組進行復(fù)制和發(fā) 揮功能，或在某些場合下可整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體” 可互換使用，因為質(zhì)粒是載體常見的使用形式。但是，本發(fā)明意圖包括發(fā)揮等效載體功能的 其它形式的載體，它們已經(jīng)或正在為本領(lǐng)域所知曉，例如病毒、攜帶核酸的合成分子、脂質(zhì) 體等。就治療而言，“哺乳動物”是指可被歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、家畜和 農(nóng)場動物、人類以外的靈長類和動物園動物、競技動物或?qū)櫸飫游?，例如狗、馬、貓、牛等?？稍诒疚乃龌虮绢I(lǐng)域已知的試驗中篩選或使用目的抗體。這類試驗通常需要可 檢測的試劑，例如被標(biāo)記的試劑。本文所使用的詞語“標(biāo)記”是指可直接或間接結(jié)合到分子 或蛋白例如抗體上的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記本身可以是可檢測的(例如放射性同位 素標(biāo)記、顆粒或熒光標(biāo)記)，或就酶標(biāo)記而言，可催化底物化合物或組合物發(fā)生能被檢測的 化學(xué)變化。正如本文所使用，“固相”是指實體或分子例如本發(fā)明所述抗體可粘附于其上的非 水基質(zhì)。本文所包括的固相實例包括部分或全部由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如 瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的固相。在一些實施方案中，根據(jù)語 境，所述固相可包括分析板的孔；在其它情況下可用于純化柱(例如親和層析柱)。因此， 所述固相可以是紙、珠、塑料、芯片等，可由許多材料例如硝化纖維素、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚 丙烯、硅等制備，還可采取多種構(gòu)型。
可溶性CXCR5或其片段例如胞外區(qū)域(EC)可用作免疫原，產(chǎn)生目的抗體?？蓮奶烊粊碓传@得或分離免疫原，或可通過重組方式制備免疫原。全細(xì)胞例如CXCR5+細(xì)胞，天然 來源的細(xì)胞(例如B細(xì)胞、B細(xì)胞系或癌細(xì)胞系)或經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)以表達以 及可能過表達CXCR5的細(xì)胞，都可用作生產(chǎn)目的抗體的免疫原。同樣，可使用本領(lǐng)域已知的 攜帶CXCR5或?qū)?yīng)于CXCR5的EC區(qū)域的合成肽或截短多肽的膜制備物。CXCR5長約60個氨基酸的EC或EC的部分可用作免疫原。可用于制備抗體的其它 形式免疫原例如綴合物，是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。因此，CXCR5或其部分可被連接到 載體分子例如白蛋白或KLH上以用作免疫原。當(dāng)然，對于表達CXCR5的細(xì)胞，EC區(qū)域是優(yōu) 選的免疫原或該免疫原的部分。依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法或例如參見下文的方法，本領(lǐng)域已知的編碼 CXCR5的基因或cDNA可被克隆到質(zhì)?；蚱渌磉_載體中，并在眾多表達體系的任意一種中 進行表達。由于遺傳密碼的簡并性，進行重組CXCR5或其功能產(chǎn)物的表達時，可使用多個編 碼CXCR5蛋白或多肽的核苷酸序列?；诳赡艿拿艽a子選擇，例如宿主細(xì)胞所優(yōu)選的密碼 子，通過選擇組合可以變動所述核苷酸序列。依據(jù)適用于編碼天然CXCR5的核苷酸序列的 標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體遺傳密碼，可進行這些組合，而且可考慮所有這些變動。因此，編碼CXCR5的序 列可被重新編碼，以含有表達目的氨基酸的密碼子，但三聯(lián)體密碼子是宿主細(xì)胞例如人細(xì) 胞的基因表達裝置所偏愛的密碼子。這些多肽中的任意一條可用于免疫動物例如駱駝或其 它體系，以產(chǎn)生結(jié)合CXCR5的抗體。正如上文所提及，在有利時，CXCR5免疫原可表達為融合蛋白，其中CXCR5被連接 到融合片段，該融合片段一般是具有一個或多個有利功能的多肽。融合片段通常有助蛋白 純化，例如通過親和層析分離和純化融合蛋白，但也可用于增加免疫原性。使用編碼連接到 CXCR5多肽的羧基端和/或氨基端的蛋白質(zhì)的融合核酸序列轉(zhuǎn)化重組細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)該重組 細(xì)胞可產(chǎn)生融合蛋白。融合片段可包括但不限于免疫球蛋白F。區(qū)域、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、 β-半乳糖苷酶、可結(jié)合雙價金屬離子的多聚組氨酸片段和麥芽糖結(jié)合蛋白。編碼氨基酸序列突變體的核酸分子可通過許多本領(lǐng)域已知的方法進行制備。這些方法包括但不限于對先前制備的目的分子突變體或非突變體進行的寡核苷酸_介導(dǎo)的 (或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變(參見例如Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82: 488(1985))。本發(fā)明抗體或其片段、衍生物或類似物(例如本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈、本發(fā)明 的單鏈抗體或本發(fā)明的抗體突變蛋白質(zhì))的重組表達包括構(gòu)建含有編碼本文所述的抗體 或抗體片段的多核苷酸的表達載體。一旦獲得編碼抗體分子的多核苷酸，可通過本領(lǐng)域公 知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生用于生產(chǎn)所述抗體的載體。構(gòu)建含有抗體編碼序列和適宜的轉(zhuǎn)錄和 翻譯調(diào)控信號的表達載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重 組。通過常規(guī)技術(shù)將表達載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞體內(nèi)，隨后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或片段。在本發(fā)明的一個方面，編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主 細(xì)胞內(nèi)共表達，以表達本文詳述的完整的免疫球蛋白分子?？墒褂迷S多宿主/表達載體體系來表達本發(fā)明的抗體分子。這些表達體系不僅代 表可產(chǎn)生和隨后純化目的編碼序列的載體，還代表了以適宜核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后可原位表達本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌和真核細(xì)胞常用于重組抗體分 子的表達，尤其是用于全長重組抗體分子的表達。例如，哺乳動物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞與例如 攜帶來自人巨細(xì)胞病毒的主要中間體早期基因啟動子元件的載體是抗體的有效表達體系 (Foecking 等的 Gene 45:101(1986)；和 Cockett 等的 Bio/Technology 8:2(1990))。正如 本領(lǐng)域所知，還可使用植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)、昆蟲細(xì)胞等來生產(chǎn)目的蛋白。此外，選擇可調(diào)節(jié)插入序列表達或以所需的特異方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主 細(xì)胞。蛋白產(chǎn)物的這些修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對于蛋白功能可能是重要 的。不同的宿主細(xì)胞具有蛋白質(zhì)及基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾的特有和特異機制?？蛇x擇 適宜的細(xì)胞系或宿主體系，以確保所表達的目的抗體的正確修飾和加工。因此，可使用擁有 用于主要轉(zhuǎn)錄物適宜加工、基因產(chǎn)物糖基化和磷酸化的細(xì)胞裝置的真核宿主細(xì)胞。這些哺 乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CH0、C0S、293、3T3或骨髓瘤細(xì)胞。穩(wěn)定表達對于長期高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白而言是優(yōu)選的。例如可改造穩(wěn)定表達抗 體分子的細(xì)胞系。除了使用含有病毒復(fù)制起點的表達載體，可使用受到適宜表達調(diào)控組件 (例如啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點等)調(diào)控并具有選擇性標(biāo)記的 DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外源DNA后，可讓被改造的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基上生長1至2天，隨 后將其轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基上。重組質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記 賦予對選擇的抗性，使得細(xì)胞將質(zhì) 粒穩(wěn)定整合到其染色體上，并在細(xì)胞系中擴增質(zhì)粒。這些改造的細(xì)胞系不僅可用于抗體制 備，還可用于篩選和評估直接或間接與抗體分子互相作用的化合物。可使用許多選擇體系，其包括但不限于單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等 的Cell 11 :223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska等的Proc Natl Acad Sci USA 48 :202 (1992))、谷氨酸合成酶在蛋氨酸磺酰亞胺的存在下選擇(Adv Drug Del Rev 58，671，2006 并參見 Lonza Group Ltd.的網(wǎng)站或文獻)以及 tk、hgprt 或 aprt 細(xì)胞中的腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy等的Cell 22:817(1980))。同樣，可使用抗代 謝物的抗性作為選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，其賦予甲氨蝶呤抗性(Wigler等的Proc Natl Acad Sci USA 77:357(1980) ；0' Hare 等的 Proc Natl Acad SciUSA 78:1527(1981))； gpt，其賦予霉酚酸抗性(Mulligan 等的 Proc NatlAcad Sci USA 78 :2072 (1981)) ;neo， 其賦予氨基糖苷G-418抗性(Wu等的Biotherapy 3:87(1991))；以及hygro，其賦予潮霉 素抗性(Santerre等的Gene 30:147(1984))?？沙Ｒ?guī)應(yīng)用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域已知的方 法來選擇所需的重組克隆，這些方法的描述見于例如Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press(1990) ；Dracopoli等白勺eds.，Current Protocols in Human Genetics, John Wiley &Sons(1994)；禾口 Colberre-Garapin 等的 J Mol Biol 150 1(1981)。通過載體擴增可增加抗體分子的表達水平(例如參見Bebbington等的DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987))。當(dāng)表達抗體的載體體系中的標(biāo)記物可擴增時，培 養(yǎng)物中抑制劑水平的升高會增加標(biāo)記物基因的拷貝數(shù)目。由于被擴增區(qū)域與抗體基因有關(guān) 聯(lián)，抗體的產(chǎn)生也會上升(Crouse等人，Mol Cell Biol 3:257(1983))。可使用本發(fā)明的兩種或多種表達載體對宿主細(xì)胞進行共轉(zhuǎn)染，例如第一載體編 碼源自重鏈的多肽，而第二載體編碼源自輕鏈的多肽。這兩個載體可含有相同的選擇標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可使重鏈和輕鏈多肽的表達相同?；蛘?，可使用編碼并可同時表達重鏈 和輕鏈多肽的單個載體。在這種情況下，輕鏈應(yīng)置于重鏈之前，以避免產(chǎn)生過多的無毒性 的重鏈(Proudfoot，Nature 322 :52 (1986)；和 Kohler，Proc Natl Acad Sci USA 77: 2197 (1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包括cDNA或基因組DNA。一旦通過動物、化學(xué)合成或重組表達產(chǎn)生本發(fā)明的抗體分子，可通過本領(lǐng)域已知的任何純化免疫球蛋白分子的方法，例如層析(例如離子交換、親和層析等，尤其是經(jīng)蛋白 質(zhì)A和分子排阻層析后對CXCR5進行親和層析)、離心、溶解度差異或通過蛋白純化的任何 其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化抗體分子。此外，本發(fā)明所述抗體或抗體片段可與本文所述的異源多肽 序列或本領(lǐng)域已知的其它多肽序列融合，以便于純化。使用下文實施例所例示的重組CXCR5蛋白來免疫小鼠，生成可產(chǎn)生本發(fā)明單克隆 抗體的雜交瘤。選擇具有良好治療潛力的所得單克隆，例如防止CXCR5配體結(jié)合于CXCR5 的單克隆。隨后修飾所選擇的抗體，以得到有利的性質(zhì)，例如具有增強的體內(nèi)穩(wěn)定性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適宜方法生成本發(fā)明所述抗體。本發(fā)明所述抗體可包括 多克隆抗體，盡管由于進行抗體修飾以優(yōu)化其在人體內(nèi)的使用以及優(yōu)化抗體本身的使用， 但單克隆抗體仍是優(yōu)選的，這是因其生產(chǎn)和操作特定蛋白方便。制備多克隆抗體的方法為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉(Harlow 等的 Antibodies :a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,^! 2 Hjx (1988))。例如，可將本文所例示的免疫原施用給各種宿主動物，其包括但不限于兔、小鼠、 駱駝、大鼠等，以誘導(dǎo)產(chǎn)生含特異識別CXCR5的多克隆抗體的血清。施用免疫原需要一次或 多次注射免疫劑和佐劑(若需要的話)。根據(jù)宿主物種，可使用各種佐劑來增加免疫反應(yīng)， 其包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物油、凝膠、明礬(氫氧化鋁)、表面活性物 質(zhì)例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇類(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油狀乳液、鑰孔 帽貝血藍蛋白(KLH)、二硝基苯酚和可有效使用的人佐劑，例如BCG(卡介苗)和短小棒狀 桿菌(Corynebacterium parvum)?？墒褂玫淖魟┑钠渌鼘嵗∕PL-TDM佐劑(單磷酰 脂A，合成的海藻糖雙棒霉酚酸酯(trehalose dicorynomycolate) 0免疫實驗方案為本領(lǐng) 域所熟知，它們可通過在所選擇的宿主體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的任何方法進行。因此，在不同的 時間段內(nèi)可設(shè)計使用不同的給藥途徑。一般情況下，通過多次皮下或腹腔注射或肌肉注射或靜脈注射將免疫原(帶有或 不帶佐劑)注射到哺乳動物體內(nèi)。免疫原可包括CXCR5多肽、融合蛋白或它們的變異體，它 們可由產(chǎn)生或過產(chǎn)生CXCR5的細(xì)胞產(chǎn)生。這些細(xì)胞可為天然存在的細(xì)胞、天然存在的突變 體細(xì)胞或遺傳改造細(xì)胞。在某些情況下，可使用表達CXCR5的全細(xì)胞。根據(jù)多肽的性質(zhì)(即 疏水比例、親水比例、穩(wěn)定性、凈電荷、等電點等)，CXCR5或其部分可被修飾或結(jié)合，以在被 免疫動物例如哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性或更強的免疫原性。例如，CXCR5或其部分可與 載體結(jié)合。所述結(jié)合包括將活性化學(xué)官能團連接到免疫原和待結(jié)合的免疫原性蛋白從而形 成共價鍵的化學(xué)綴合，或基于融合蛋白的方法學(xué)或本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的其它方法。這類 載體或免疫原蛋白的實例包括但不限于KLH、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、大豆 胰蛋白酶抑制劑和混雜的T輔助細(xì)胞肽?？墒褂酶鞣N佐劑增加上文所述的免疫反應(yīng)。一旦得到適宜的制劑，有可能通過已知分離技術(shù)例如親和層析、淘選、吸附等從多 個抗體中分離出特定的抗體。以這種方式，可獲得用于進一步研究(例如測序以獲得一個或多個CDR的氨基酸序列)的單個抗體種類。本發(fā)明所述抗體優(yōu)選地包括單克隆抗體?？墒褂美缬蒏ohler等的Nature 256 495(1975)；美國專利 4，376，110 ；Harlow 等的 Antibodies =ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)禾口 Hammerling 等的 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier (1981)描述的雜交瘤技術(shù)、重組 DNA 方法 例如制備和使用轉(zhuǎn)染瘤或為技術(shù)人員知曉的其它方法制備單克隆抗體?？捎糜诋a(chǎn)生單克隆 抗體的方法的其它實例包括但不限于人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等的Immunology Today 4:72(1983)；和 Cole 等的 Proc Natl Acad Sci USA80 :2026 (1983))和 EBV-雜交瘤技術(shù) (Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,pp. 77-96,Alan R. Liss(1985))。 這些抗體可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD的任何免疫球蛋白類和其任何亞類的抗體。 可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤。在雜交瘤模型中，對宿主例如小鼠、人源化小鼠、攜帶人免疫系統(tǒng)基因的轉(zhuǎn)基因小 鼠、倉鼠、兔、大鼠、駱駝或其它任何適宜的宿主動物進行免疫，以引發(fā)產(chǎn)生或可產(chǎn)生特異結(jié) 合CXCR5的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，可體外免疫淋巴細(xì)胞。隨后使用適宜的融合劑例如聚 乙二醇使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal Antibodies Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103(1986))。
一般而言，制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤時，如果希望細(xì)胞為人類來源的，可使用外周血 淋巴細(xì)胞(“PBL”)，或如果希望細(xì)胞為非人類來源的，則可使用脾臟細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。永 生細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，尤其是嚙齒類、牛或人來源的骨髓瘤細(xì)胞。一般使用 大鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系?？稍谶m宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有可 抑制未融合的永生細(xì)胞生長或生存的一種或多種物質(zhì)。例如，如果母體細(xì)胞缺乏次黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般會含有次黃嘌呤、氨 基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培養(yǎng)基”)和防止HGPRT缺陷的細(xì)胞生長的物質(zhì)。優(yōu)選的永生細(xì)胞系是有效融合并支持所選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞能穩(wěn)定高水平表 達抗體的細(xì)胞系，并且對培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感。這些骨髓瘤細(xì)胞系中有鼠骨髓瘤 系，例如源自可從 Salk Institute Cell DistributionCenter, San Diego, Calif 獲得的 MOPC-21和MPC-Il小鼠腫瘤和可從美國典型培養(yǎng)物收藏中心，Manassas，VA獲得的SP2/0、 FO 或 X63-Ag8-653 細(xì)胞。還描述了用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細(xì)胞系 (Kozbor, J Immunol 133:3001(1984)；禾口 Brodeui 的 MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987))。還可使用小鼠骨 髓瘤細(xì)胞系 NSO(European Collection ofCell Cultures, Salisbury, Wilshire，UK)。另外一種選擇是使用電融合而非化學(xué)融合來形成雜交瘤?？墒褂美鏓pstein Barr病毒或其它轉(zhuǎn)化基因而非融合，使B細(xì)胞永生化，例如參見Zurawaki等的Monoclonal Antibodies, ed.，Kennett 等人，Plenum Press, pp. 19-33. (1980)。還可使用表達免疫球蛋 白的轉(zhuǎn)基因小鼠和移植有人B淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。分析生長有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基是否產(chǎn)生識別CXCR5的單克隆抗體?？赏ㄟ^免疫 沉淀或通過體外結(jié)合測定例如放射免疫分析(RIA)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)或酶聯(lián)免 疫吸附分析(ELISA)測定雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這些技術(shù)為本領(lǐng)域已知，并在技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)?？赏ㄟ^例如Scatchard分析(Munson等的Anal Biocheml07 =220(1980))測定單克隆抗體對CXCR5的結(jié)合親和力。鑒定雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生抗體的所需特異性、親和力和/或活性后，這些克隆可通 過有限稀釋方法進行亞克隆，并按標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies Principles and Practice, Academic Press，pp. 59-103 (1986)。適宜培養(yǎng)基包括例如達爾 伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(D-MEM)或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水腫瘤 在動物體內(nèi)生長。亞克隆分泌的單克隆抗體通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、 蛋白質(zhì)G-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基中被 適宜地分離。本領(lǐng)域存在許多用于產(chǎn)生單克隆抗體的方法，因此本發(fā)明不局限于它們僅在雜交 瘤中的制備。例如，可通過重組DNA方法例如美國專利4，816，567所述的方法制備單克隆 抗體。在這種情況下，術(shù)語“單克隆抗體”是指源自單個真核生物、噬菌體或原核生物克隆 的抗體。使用常規(guī)方法(例如使用可特異結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈基因的寡核苷酸探 針或使用可特異結(jié)合編碼來自人、人源化或其它來源抗體的重鏈和輕鏈基因的寡核苷酸探 針)，可容易地分離和測序編碼本發(fā)明所述單克隆抗體的DNA(Irmis等的PCR Protocols. A Guide to Methods andApp 1 ications, Academic (1990)禾口 Sanger 等的 Proc Natl Acad Sci 74:5463(1977))。雜交瘤細(xì)胞作為這類DNA的來源。分離后，所述DNA可被置于表達 載體中，隨后表達載體被轉(zhuǎn)染到本身不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌細(xì)胞、 NSO細(xì)胞、COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組的宿主細(xì)胞體內(nèi)獲得 單克隆抗體的合成。還可通過例如用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列替換同源的鼠序列(美 國專利 4，816，567 ；和 Morrison 等的 Proc Natl Acad Sci USA 81 :6851 (1984))或通過 將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接到免疫球蛋白編碼序列，從而對所述 DNA進行修飾。這些非免疫球蛋白多肽可被替換為本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或可被替換為本發(fā) 明抗體的一個CXCR5結(jié)合位點的可變區(qū)，以形成嵌合的二價抗體。這些抗體可為單價抗體。用于制備單價抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，一種方 法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達。重鏈一般在F。區(qū)的任意位點被截短，以防 止重鏈交聯(lián)?；蛘?，相關(guān)的半胱氨酸殘基可被另一氨基酸殘基取代或被刪除，以防止交聯(lián)。可通過已知技術(shù)生成識別特異表位的抗體片段。傳統(tǒng)上通過完整抗體的蛋白裂解 消化得到這些片段(例如參見 Morimoto 等 J Biochem BiophysMethods 24:107(1992)；禾口 Brerman等Science 229:81(1985))。例如，使用酶例如木瓜酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白 酶(產(chǎn)生F(ab, )2片段)對免疫球蛋白分子進行蛋白切割，可產(chǎn)生本發(fā)明的Fab和F(ab, )2片 段。F(ab, )2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的恒定區(qū)Chi域。但是可直接通過重組的宿 主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，這些抗體片段可從抗體噬菌體庫分離得到。或者，F(xiàn)(ab，)2-SH 片段可直接從大腸桿菌中回收并通過化學(xué)方式偶聯(lián)形成F(ab’)2片段(Carter等的Bio/ Technology 10:163(1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab, )2片段可直接從重組的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物 中分離得到。產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見 的。在其它實施方 案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(Fv) (W0 93/16185)。
對于某些用途、包括人體內(nèi)使用抗體和體外檢測試驗而言，可優(yōu)選使用嵌合的人源化或人抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域所知曉，例如參見Morrison，Science 229 1202(1985) ；Oi 等的BioTechniques 4:214(1986) ；Gillies 等的 J Immunol Methods 125 191 (1989)；和美國專利 5，807，715 ；4，816，567 以及 4，816397。人源化抗體源自在非人類物種體內(nèi)生成的可結(jié)合CXCR5的抗體分子，其中來自 結(jié)合CXCR5的抗體的一個或多個CDR被插入到來自人免疫球蛋白分子的FR區(qū)。使用許 多本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如CDR移植(EP0239, 400 ；WO 91/09967 ；和美國專利5，225，539 ； 5，530，101 ；以及 5，585，089)、鑲飾或表面重塑(ΕΡ0 592，106 ；EPO 519，596 ；Padlan, MolecularImmunology 28:489(1991) ；Studnicka 等 的 Protein Engineering 7: 805(1994)；和 Roguska 等的 Proc Natl Acad Sci USA 91 969(1994))以及鏈改組(美國 專利5，565，332)，可將抗體人源化。人源化抗體具有一個或多個來自非人類來源的氨基酸殘基。這些非人類的氨基 酸殘基通常被稱作“導(dǎo)入”殘基，它們一般取自“導(dǎo)入”的可變區(qū)。依據(jù)Winter及其同事等 人的方法(Jones 等的 Nature 321 522(1986) ；Riechmann 等的 Nature 332 323(1988)和 Verhoeyen等的Science239 :1534(1988))，通過以非人類的CDR或CDR序列的部分替換人 抗體的相應(yīng)序列，可基本上完成人源化。因此，這些”人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利 4，816，567)，其中實質(zhì)上小于完整的人可變區(qū)的序列已被來自非人類物種的相應(yīng)序列所取 代。實踐中，人源化抗體一般是人抗體，其中一些CDR殘基和可能部分FR殘基被嚙齒動物 抗體的類似位點所取代?？砂ㄒ粋€或多個重鏈結(jié)構(gòu)域的重鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)可來自任何 種類或亞類，以獲得所需效應(yīng)，例如特定的效應(yīng)物功能。通常，人框架區(qū)的框架殘基可被來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基替換，從而改變并 有可能提高抗原結(jié)合?？蚣苋〈赏ㄟ^本領(lǐng)域已知方法進行鑒定，例如建立CDR與框架 殘基互相作用的模型來鑒定參與抗原結(jié)合的重要框架殘基，以及經(jīng)序列比較以鑒定特定 位置處的非正?？蚣軞埢鐓㈤喢绹鴮＠?，585，089和Riechmarm等的Nature 332 323(1988)。更為優(yōu)選的是，人源化抗體保留對CXCR5的高親和力，并且保留或獲得其它有利 的生物學(xué)性質(zhì)。因此，利用母體序列和人源化序列的三維模型，通過分析母體序列和各種概 念性的人源化產(chǎn)物，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可為本領(lǐng)域技術(shù)人員利用 和熟知。可利用圖示和展示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程 序。參考此展示，可分析某些殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影 響候選免疫球蛋白結(jié)合CXCR5能力的殘基。通過此種方式，可從接收和導(dǎo)入序列選擇和合 并FR殘基，使得所需抗體特性得到最大化，例如增加對靶點抗原的親和力，但是CDR殘基是 直接并最實質(zhì)性地影響CXCR5結(jié)合的。還可修飾CDR區(qū)域，使其含有一個或多個與得自親 代抗體(CDR得自親代抗體)氨基酸不同的氨基酸，以提供增強的或不同的目的性質(zhì)，例如 更高的親和力或親合力。可操作和改變抗體恒定區(qū)的某些區(qū)域，以提供具有不同與或優(yōu)于親代抗體性質(zhì)的 抗體同源物、衍生物、片段等。因此，例如許多IgG4抗體在鉸鏈區(qū)附近形成鏈內(nèi)二硫鍵。鏈 內(nèi)二硫鍵可使母體雙價分子變得不穩(wěn)定，形成含有一條重鏈及與之相連輕鏈的單價分子。 這類分子可重新結(jié)合，但為隨機結(jié)合。
經(jīng)觀察，修飾IgG4分子鉸鏈區(qū)的氨基酸可降低鏈內(nèi)二硫鍵形成的幾率，從而穩(wěn)定 IgG4分子，這將最大程度降低雙特異性分子形成的幾率。若治療用抗體是IgG4分子，則這 種修飾是有利的，這是因為穩(wěn)定性增強可最大程度降低分子在生產(chǎn)和制備過程中以及在體 內(nèi)的解離幾率。單價抗體可能不具有與雙價母體分子相同的有效性。例如，當(dāng)將雙價IgG4 施用給患者時，雙價IgG4的比例在兩周內(nèi)衰變?yōu)榧s30%。位點228的氨基酸取代增強了 IgG4穩(wěn)定性。位于位點228的絲氨酸可為另一氨基酸替換，例如其余19種氨基酸中的一 種。尤其可對重組抗體作出這種變動，其中核酸編碼序列經(jīng)突變可得到228位點處的氨基 酸取代。例如S可被替換為脯氨酸。另一組適合修飾的氨基酸包括鉸鏈區(qū)域的氨基酸，這些氨基酸影響含有重鏈的分子與F。受體之間的結(jié)合和被結(jié)合抗體的內(nèi)化。這類氨基酸包括IgGl分子中從約233 至約 237 的殘基(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly) ； (SEQ IDNO 49)中從約 252 至約 256 的殘基 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr)和(SEQ ID NO 50)中從約 318(Glu)至約 331 (Pro)的殘基，例如 包括 Lys320、Lys322 禾口 Pro329 0完全的人抗體特別適合于人類患者的治療性處置?？赏ㄟ^許多本領(lǐng)域已知的方 法制備人抗體，其中包括利用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫而進行的上述噬菌體展示 方法，參閱美國專利 4，444，887 和 4，716，111 ；W098/46645, WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，W096/33735 和 WO 91/10741。還可利用 Cole 等人和 Boerder 等人 的入(Cole ^^ Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985)；和 Boerner 等的 J Immunol 147:86(1991))。還可使用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人抗體，這些小鼠不能表達有功能的內(nèi)源免疫球蛋白， 但也表達某些人免疫球蛋白基因。例如，可通過隨機方式或同源重組將人重鏈和輕鏈免疫 球蛋白基因復(fù)合物引入到小鼠的胚胎干細(xì)胞?；蛘?，除了人重鏈和輕鏈基因以外，可將人的 可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)引入到小鼠胚胎干細(xì)胞中。通過同源重組引入人免疫球蛋白位點， 可使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因分別或同時失去功能。具體而言，JH區(qū)的純合缺失可 防止內(nèi)源抗體生成。被修飾的胚胎干細(xì)胞經(jīng)擴增，被顯微注射到胚泡中，形成嵌合小鼠。隨 后繁育嵌合小鼠，產(chǎn)生表達人抗體的純合后代，例如參閱Jakobovitis等的Proc Natl Acad Sci USA 90 2551 (1993) Jakobovitis 等的 Nature 362 255(1993) ；Bruggermann 等的 Year inlmmunol 7:33(1993)；和 Duchosal 等的 Nature 355:258(1992))。使用CXCR5 (例如所有或部分CXCR5，如CXCR5的EC區(qū)域)通過正常方式免疫轉(zhuǎn)基 因小鼠。利用常規(guī)雜交瘤技術(shù)可從被免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠得到抗CXCR5的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基 因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過程中發(fā)生重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和 體細(xì)胞突變。因此，利用這種技術(shù)有可能產(chǎn)生治療用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。如果想了 解概況，可參閱Lonberg等的Int Rev Immunol 13:65-93(1995)。對于生產(chǎn)人抗體和人單 克隆抗體以及生產(chǎn)這類抗體的試驗方案的討論，可參閱例如WO 98/24893 ；WO 92/01047 ； WO 96/34096 ；WO 96/33735 ；EPO No. O 598 877 ；和美國專利 5，413，923 ；5，625，126 ； 5，633，425 ；5，569，825 ；5，661，016 ；5，545，806 ；5，814，318 ；5，885，793 ；5，916，771 以及 5,939,598。此夕卜，例如 Amgen(Fremont, CA) > Genpharm(San Jose, CA)禾口 Medarex, Inc. (Princeton, NJ)等公司利用與上述類似的技術(shù)可提供抗CXCR5的人抗體。同樣，可免疫移植有人外周血白細(xì)胞、脾細(xì)胞或骨髓(以色列XTLBiopharmaceuticals公司的三體雜交瘤技術(shù))的小鼠，制備人mAb?？衫帽环Q為“導(dǎo) 向選擇”的技術(shù)生成識別所選擇表位的完全人抗體。在該方法中，使用經(jīng)選擇的非人類單克 隆抗體如小鼠抗體來引導(dǎo)選擇識別相同表位的完全人抗體(Jespers等的Bio/technology 12 :899(1988))。使用重組技術(shù)時，抗體變異體可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞周質(zhì)空間內(nèi)產(chǎn)生，或直接被分泌到 培養(yǎng)基中。如果抗體變異體是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，則可首先通過例如離心或超濾除去微小碎 片，其是宿主細(xì)胞或是被裂解的片段。Carter等的Bio/Technology 10 163 (1992)描述 了一種分離被分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的方法。簡而言之，細(xì)胞糊漿與乙酸鈉(PH 3.5)和EDTA接觸?？赏ㄟ^離心除去細(xì)胞碎片。當(dāng)抗體變異體被分泌到培養(yǎng)基中時，一般首 先利用市售的蛋白質(zhì)濃縮過濾器如Ami con或Mi 11 ipore Pe 11 i con超濾組件濃縮來自這些 表達體系的上清液?？杉尤氲鞍酌敢种苿├鏟MSF，以抑制蛋白酶解，還可加入抗生素以防 止外來污染物的生長。可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析，純化從細(xì)胞制備的抗體組 合物。蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G是否適合作為親和配體取決于抗體變異體上任意免疫球蛋白F。 域的物種和同型。可使用蛋白質(zhì)A純化基于人IgGl、IgG2或IgG4重鏈的抗體(Lindmark 等的J Immunol Meth 62:1(1983))?？墒褂玫鞍踪|(zhì)G用于小鼠同型和人IgG3 (Guss等的 EMBO J5:1567 (1986))。親和配體所結(jié)合的基質(zhì)通常多數(shù)是瓊脂糖，但也可使用其它基質(zhì)。 機械穩(wěn)定的基質(zhì)例如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可實現(xiàn)比瓊脂糖更快的流速 和更短的處理時間。當(dāng)抗體變異體包括Ch3域時，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(JT Baker ； Phillipsburg, NJ)進行純化。還可利用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如離子交換 柱分級、乙醇 沉淀、反相HPLC、硅膠色譜、肝素瓊脂糖層析、陰離子或陽離子交換樹脂層析(例如多聚天 冬氨酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀，這取決于待回收的抗體或變異體。進行任何初步純化步驟后，含有目的抗體或目的變異體和污染物的混合物可進 行低PH疏水作用層析，其中使用PH約2. 5-4. 5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約 0-0. 25M鹽)下進行。而且，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知技術(shù)，本發(fā)明抗體還可用于產(chǎn)生“模擬”CXCR5的 抗獨特型抗體(例如參閱 Greenspan 等的 FASEB J 7:437(1989)和 Nissinoff，J Immunol 147 :2429(1991))。例如，可使用與配體結(jié)合并競爭性抑制CXCR5多聚化和/或CXCR5與配 體結(jié)合的抗體來產(chǎn)生“模擬”CXCR5和結(jié)合域并從而結(jié)合和中和CXCR5和/或其配體的抗獨 特型。這種中和性抗獨特型或這些抗獨特型的Fab片段可用于治療方案，例如中和CXCL13。本發(fā)明的抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體可為單克隆抗體，優(yōu)選為具有 對至少兩種不同抗原結(jié)合特異性的人或人源化抗體。在本發(fā)明中，結(jié)合特異性之一針對 CXCR5，另一種可針對任何其它抗原，例如細(xì)胞表面蛋白、受體、受體亞基、配體、組織特異性 抗原、病毒來源的蛋白、病毒編碼的包膜蛋白、細(xì)菌來源的蛋白、細(xì)菌表面蛋白等。因此另一 特異性可以是結(jié)合CXCL13。制備雙特異性抗體的方法是眾所周知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基 于兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein等 的Nature 305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，雜交瘤(四體雜交 瘤)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行正確分子的純化。類似方法披露于WO 93/08829和Traunecker等的 EMBOJ 10:3655(1991)。例如 Kufer 等的 Trends Biotech 22 :238_244，2004 提供了生 產(chǎn)雙特異性抗體的其它方法?？蓪⒕哂兴杞Y(jié)合特異性的抗體可變區(qū)融合到免疫球蛋白的恒定區(qū)序列上。優(yōu) 選用包括至少部分鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)進行融合。它可具有首個 重鏈恒定區(qū)(CH1)，其含有至少在一次融合中出現(xiàn)的輕鏈接合所需的位點。將編碼免疫球 蛋白重鏈融合區(qū)和免疫球蛋白輕鏈(若需要的話)的DNA插入到不同的表達載體，并共轉(zhuǎn) 化到適宜的宿主生物體內(nèi)。對于產(chǎn)生雙特異性抗體的更多細(xì)節(jié)，可參閱例如Suresh等的 MethEnzym 121 210(1986)。本發(fā)明也考慮了異源偶聯(lián)抗體。異源偶聯(lián)抗體由兩個通過共價鍵連接的抗體組 成。有人建議用這類抗體對準(zhǔn)免疫系統(tǒng)細(xì)胞至不希望的細(xì)胞(美國專利4，676，980)。考慮 該抗體可用合成蛋白化學(xué)的已知方法在體外制備，包括涉及交聯(lián)劑的那些方法。例如，免疫 毒素可用二硫化物交換反應(yīng)或形成硫酯鍵的方式來構(gòu)建。適合于該目的的試劑例子包括亞 氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞氨酸酯，以及如美國專利4，676，980中所披露的那些。此外，還可產(chǎn)生CXCR5的單域抗體。這種技術(shù)的某些例子已在W09425591有關(guān)源 自駱駝重鏈Ig的抗體時有所敘述，在US20030130496有關(guān)從噬菌體文庫分離單域完全人抗 體時也有所敘述。此外，某些生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4，946，778 ；Bird, Science242 423(1988) ；Huston 等，Proc Natl Acad Sci USA 85:5879(1988)；以及 Ward，等，Nature 334:544(1989))也可適應(yīng)于生產(chǎn)單鏈抗體。單鏈抗體是通過將Fv區(qū)域的重鏈和輕鏈片段 以一個氨基酸橋連接生成一個單鏈多肽而形成的。大腸桿菌中的功能Fv片段的組合技術(shù) 也可以利用(Skerra 等，Science 242:1038(1988))。本發(fā)明包括了與一個多肽重組融合或化學(xué)偶聯(lián)(包括共價和非共價偶聯(lián))的 抗體。本發(fā)明的融合或輟合的抗體可用于簡化純化，參閱例如W093/21232 ；EP 439，095 ； Naramura 等，Immunol Lett 39:91(1994)；美國專利 5，474，981 ;Gillies 等，Proc Natl Acad Sci USA 89 1428 (1992)；以及 Fell 等，J Immunol 146:2446(1991)。標(biāo)記氨基 酸序列可以是六個組氨酸的肽(SEQ ID NO :51)，如pQE載體提供的標(biāo)簽(QIAGEN，Inc., Chatsworth，CA)，此外，其中許多還可經(jīng)商業(yè)渠道獲得，Gentz等，Proc Natl Acad SciUSA 86 :821(1989)。其它可用于純化的多肽標(biāo)簽包括但不限于“HA”標(biāo)簽，它對應(yīng)于一個源自流 感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell 37:767(1984))以及“flag”標(biāo)記。還可產(chǎn)生一種單肽鏈接合分子，其中重鏈和輕鏈Fv域相連。單鏈抗體(“scFv”) 和它們的構(gòu)建方法在例如美國專利4，946，778中有所敘述。或者，F(xiàn)ab可以類似方式構(gòu)建和 表達。與完全的鼠mAbs相比，所有完全和部分的人抗體均可具有較小的免疫原性，片段和 單鏈抗體也可具有較小的免疫原性?？贵w或抗體片段，可從用McCafferty等，Nature 348 =552(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的 抗體噬菌體文庫分離。Clarkson 等，Nature 352 624(1991)和 Marks 等，J Mol Biol 222 581(1991)分別敘述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體的技術(shù)。隨后的出版物敘述了以鏈 改組方式生產(chǎn)高親和力(在nM的范圍)的人抗體的方法(Marks等，Bio/Technology 10 779(1992))，以及以組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建大型噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nucl Acids Res 21:2265(1993))。因此，這些技術(shù)是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗 體雜交瘤技術(shù)的可行的替代技術(shù)?？笴XCR5抗體是用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、FACS、Western免疫印跡技術(shù)或本 領(lǐng)域內(nèi)已知的其它免疫化學(xué)技術(shù)檢測的。因此，B細(xì)胞或表達CXCR5的細(xì)胞可以已知的技 術(shù)用于檢測與其結(jié)合的抗體，或者，作為一種設(shè)計選擇，以重組方式表達的CXCR5或其一部 分如EC區(qū)域可附著在固相上，用作試驗中的捕獲元件。為了確定某種特定的抗體同源物是否與人類CXCR5結(jié)合，任何傳統(tǒng)的結(jié)合測定均 可應(yīng)用。有用的CXCR5結(jié)合測定包括FACS分析、ELISA分析、放射免疫分析等方法，以檢測抗 體與人類CXCR5的結(jié)合以及由此而產(chǎn)生的功能。本文所教導(dǎo)的全長和可溶性人類CXCR5在 這類分析中是有效的?？贵w或同源物與CXCR5或其可溶性片段的結(jié)合，可以很方便地使用 對該物種的免疫球蛋白具有特異性的二抗來檢測，所檢測的抗體或同源物源自上述物種。為了確定某種特定的抗體或同源物是否顯著地阻斷CXCL13或其它配體與人類 CXCR5的結(jié)合，任何適宜的競爭性分析試驗均可使用。有用的分析方法包括例如ELISA分 析、FACS分析、放射免疫分析等，它們可定量分析抗體或同源物與CXCL13或其它配體競爭 結(jié)合人CXCR5的能力。優(yōu)選的是，測量配體阻斷帶標(biāo)記的人類CXCR5與固定化的抗體或同 源物結(jié)合的能力。通過測定與人類CXCR5+細(xì)胞結(jié)合的能力，可以評估抗體或同源物與人類CXCR5結(jié) 合的能力。在確定某種特定的抗體或同源物是否與人類CXCR5結(jié)合的過程中，適合使用的 CXCR5+細(xì)胞是用編碼全長人CXCR5的DNA轉(zhuǎn)化并在細(xì)胞表面表達CXCR5的哺乳動物的組織 培養(yǎng)細(xì)胞，或B細(xì)胞系?？贵w或同源物與CXCR5+細(xì)胞的結(jié)合可通過使用對同一物種的免疫球蛋白具有 特異性的熒光標(biāo)記的二抗對細(xì)胞染色來檢測，所檢測的抗體同源物源自上述物種。熒光 激活細(xì)胞分選儀(“FACS”)可用于檢測和量化任何類型的結(jié)合，一般性地參閱Shapiro， Practical Flow Cytometry, Alan R. Liss, Inc. , New York, N. Y. (1985)。同樣，抗體同源物阻斷配體如CXCL13與人類CXCR5結(jié)合的能力，可將過量配體與 CXCR5+細(xì)胞一起預(yù)溫育，并對結(jié)合的配體阻斷抗體或同源物與該細(xì)胞結(jié)合的程度進行定量 來確定?？贵w同源物與CXCR5+細(xì)胞的結(jié)合可使用對同一物種的免疫球蛋白具有特異性的 帶熒光標(biāo)記的二抗，通過FACS分析來量化，所檢測的抗體同源物源自上述物種。或者，如本 領(lǐng)域內(nèi)公知，可使用帶標(biāo)記的配體或抗體進行競爭分析。用于上述分析的配體如CXCL13可以從用該配體基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提供，或來自實 施本文教導(dǎo)的方法所獲得的或經(jīng)商業(yè)購買的分離的CXCL13。為了確定某種特定的抗體或同源物是否未引起體內(nèi)循環(huán)的CXCR5+細(xì)胞數(shù)目的顯 著減少，在對具有正常免疫功能的哺乳動物施用抗體或同源物后24小時內(nèi)，測定從該哺乳 動物分離出的循環(huán)CXCR5+細(xì)胞的數(shù)目，并與施用前的數(shù)目比較，或與施用了具有不相關(guān)特 異性的同型抗體或同源物而非本發(fā)明的抗體或同源物的對照哺乳動物體內(nèi)的數(shù)目比較。施 用了 CXCR5抗體或其功能部分或衍生物的動物體內(nèi)CXCR5+細(xì)胞的定量，可通過下列步驟完成例如，通過使用與抗CXCR5抗體結(jié)合的帶熒光標(biāo)記的抗體以及對T細(xì)胞和B細(xì)胞具有特 異性的帶標(biāo)記抗體給獲得的細(xì)胞染色，然后再進行FACS分析。本發(fā)明的抗體可以描述或規(guī)定為識別或特異性結(jié)合CXCR5的表位或部分的抗體。該表位或多肽部分可按本文所述而規(guī)定，例如根據(jù)N端和C端的位置、根據(jù)毗鄰氨基酸殘基 的大小、構(gòu)象表位等。本發(fā)明的抗體也可以通過交叉反應(yīng)性來描述或規(guī)定。跟與CXCR5有至少95%、至 少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %、至少有65 %、至少有60 %、至少55 %， 以及至少50%同一性(使用本領(lǐng)域內(nèi)已知和本文所述的方法計算)的CXCR5多肽結(jié)合的抗 體，也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的抗體也可以通過與目的CXCR5的結(jié)合親和力來描述或規(guī)定?？笴XCR5抗 體可 以以低于約10_7M、低于約10_6M，或低于約10_5M的KD結(jié)合。目的抗體的較高結(jié)合親和 力可以是有益的，例如具有約10_8至10_15、約10_8至10_12、約10_9至10—11，或約10_8至IO-1qM 的平衡解離常數(shù)或kd的那些抗體。本發(fā)明還提供了一些抗體，按照本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的測 定競爭性結(jié)合的方法如本文所述的免疫分析所確定的，這些抗體競爭性地抑制抗體與本發(fā) 明的表位的結(jié)合。在一些優(yōu)選的實施方案中，該抗體競爭性地抑制與表位的結(jié)合達到至少 95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少為60%，或至少50%。本發(fā)明還包括含有目的抗體的輟合物。該輟合物包含兩個主要組分，一是目的抗 體，二是第二組分，其可以是細(xì)胞結(jié)合劑、細(xì)胞毒性劑等。本文所用的術(shù)語“細(xì)胞結(jié)合劑”是指一種能特異性識別和結(jié)合細(xì)胞表面分子的試 劑。因此，細(xì)胞結(jié)合劑可以是CD抗原，病原體抗原如病毒抗原，分化抗原，腫瘤抗原，細(xì)胞 特異性抗原，組織特異性抗原，Ig或Ig樣分子等。在一個實施方案中，該細(xì)胞結(jié)合劑能特異性識別CXCL13或CXCR5的復(fù)合物及其配 體，如CXCL13。該輟合物可與靶點細(xì)胞接觸足夠的時間，使該輟合物的效應(yīng)子功能對細(xì)胞起 作用，和/或使該輟合物有足夠的時間被細(xì)胞內(nèi)化。細(xì)胞結(jié)合劑可以是目前已知或剛為人所知的任何類型，包括肽、非肽、糖、核酸、配 體、受體等，或其組合。該細(xì)胞結(jié)合劑可以是能與細(xì)胞結(jié)合的任何化合物，無論是以特異性 或非特異性方式結(jié)合。一般而言，細(xì)胞結(jié)合劑可以是抗體(尤其是單克隆抗體)、淋巴因子、 激素、生長因子、維生素、營養(yǎng)輸送分子(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)，或其它任何細(xì)胞結(jié)合分子或物質(zhì)。可利用的細(xì)胞結(jié)合劑的其它例子包括多克隆抗體；單克隆抗體；抗體片 段，如 Fab、Fab 丨、F(ab , )2 以及 Fv (Parham, J. Immunol. 131 :2895_2902 (1983) ；Spring 等，J. Immunol. 113 :470_478 (1974)；以及 Nisonoff 等，Arch. Biochem. Biophys. 89 230-244(1960))o第二組分也可以是一種細(xì)胞毒性劑。本文所用的術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”是指一種能 降低或阻斷細(xì)胞的功能或生長，和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。因此，細(xì)胞毒性劑可以是紫杉 醇、美登素(maytansinoids)，如DM1或DM4、CC_1065或CC-1065類似物、蓖麻蛋白、絲裂霉 素C等。在某些實施方案中，如同本發(fā)明的輟合物的任何結(jié)合劑，細(xì)胞毒性劑是以共價鍵與 目的抗體直接連接或通過可切割的或不可切割的連接分子連接的。適宜的美登素的例子包括美登醇(maytansinol)和美登醇類似物。美登素能抑制 微管的形成并對哺乳動物細(xì)胞具有很強的毒性。適宜的美登醇類似物的例子包括含有被修飾的芳環(huán)的美登醇類似物和在其它 位置有修飾的美登醇類似物。在下列美國專利中披露了這類適宜的美登素4，424，219 ； 4，256，746 ；4，294，757 ；4，307，016 ；4，313，946 ；4，315，929 ；4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ；4，371，533 ；6，333，410 ；5，475，092 ； 5，585，499 ；以及 5，846，545。適宜的含有被修飾的芳環(huán)的美登醇類似物的例子包括(1)C-19_脫氯(美國專利 4，256，746)(例如通過美坦西醇P2(ansamytocin P2)的LAH還原而制備)；(2)C_20_羥基 (或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國專利4，361，650和4，307，016)(例如用鏈霉菌或 放線菌脫甲基或用氫化鋰鋁(LAH)脫氯而制備)；以及(3)C-20-脫甲氧基、C-20-乙酰氧基 (-0C0R)，+/"脫氯(美國專利4，294，757)(用酰氯進行?；苽?。適宜的在其它位置有修飾的美登醇類似物的例子包括(1)C-9_SH(美國專利 4，424，219)(通過美登醇與H2S或P2S5的反應(yīng)而制備)；(2)C_14烷氧基甲基(脫甲氧基/ CH20R)(美國專利4，331，598) ； (3)C_14_羥甲基或酰氧基甲基(CH20H或CH20Ac)(美國專利 4，450，254)(從諾卡爾菌屬制備)；(4) C-15-羥基/酰氧基(美國專利4，364，866)(通過 鏈霉菌使美登醇轉(zhuǎn)化而制備)；(5)C-15-甲氧基(美國專利4，313，946和4，315，929)(從 Trewia nudiflora 分離)；(6) C-18-N-脫甲基(美國專利 4，362，663 和 4，322，348)(通過 鏈霉菌使美登醇脫甲基化而制備)；以及(7) 4，5-脫氧(美國專利4，371，533)(通過美登 醇的三氯化鈦/LAH還原而制備)。細(xì)胞毒性輟合物可以體外方法制備。為了將細(xì)胞毒性劑、藥物或前藥與抗體連接， 通常使用連接基。適宜的連接基是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，包括二硫基、硫醚基、酸不穩(wěn)定基、光不 穩(wěn)定基，肽酶不穩(wěn)定基以及酯酶不穩(wěn)定基。例如，利用二硫鍵交換反應(yīng)或在目的抗體和藥物 或前藥之間形成硫醚鍵可構(gòu)建輟合物。如上所討論，本發(fā)明提供了編碼本文所披露抗體或其功能變體的分離的核酸序 列，含有編碼本發(fā)明CXCR5結(jié)合多肽的核苷酸序列的載體構(gòu)建物，含有這種載體的宿主細(xì) 胞，以及生產(chǎn)多肽的重組技術(shù)。該載體通常包含本領(lǐng)域內(nèi)已知的組分，一般包括但不限于一個或多個下列組件 信號序列、復(fù)制起點、一個或多個標(biāo)記或選擇基因、促進和/或加強翻譯的序列、增強子元 件等。因此，該表達載體包括與適宜的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控核苷酸序列(例如那些源自哺乳動 物、微生物、病毒或昆蟲基因的核苷酸序列)可操作地連接的核苷酸序列。其它調(diào)控序列的 例子包括操作子、mRNA的核糖體結(jié)合位點，和/或其它控制轉(zhuǎn)錄和翻譯(例如其起始和終 止)的適宜序列。當(dāng)調(diào)控序列在功能上與相應(yīng)多肽的核苷酸序列相關(guān)時，核苷酸序列就是 “可操作地連接的”。因此，如果一個啟動子核苷酸序列控制該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟 動子核苷酸序列就是與例如抗體重鏈序列可操作地連接的。此外，編碼與抗體重鏈和/或輕鏈序列非天然相連的適宜信號肽序列，可引入表 達載體中。例如，信號肽(分泌前導(dǎo))的核苷酸序列可與多肽序列融合，使得該抗體被分泌 到周質(zhì)空間或培養(yǎng)基中。在預(yù)期宿主細(xì)胞中起作用的信號肽，加強了相應(yīng)抗體或其部分的 細(xì)胞外分泌。該信號肽可在細(xì)胞分泌抗體時從多肽上裂解。這類分泌信號的例子是眾所周 知的并包括例如在美國專利5，698，435,5, 698，417以及6，204，023中所述的那些分泌信 號。載體可以是質(zhì)粒、單鏈或雙鏈病毒載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA的噬菌體載體、噬 菌粒、粘?；蛉魏纹渌康霓D(zhuǎn)基因的載體。采用眾所周知的將DNA和RNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)， 可將這類載體作為聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。在噬菌體和病毒載體的情況下，也可采用眾所周知的感染及轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將載體作為包裝或包裹的病毒導(dǎo)入細(xì)胞。病毒載體可以是復(fù)制型或復(fù) 制缺陷型。在后一種情況下，病毒的繁殖一般只會在輔助型宿主細(xì)胞中發(fā)生，并需使用攜帶 產(chǎn)生顆粒所必須的各種病毒組分的多種載體。使用源自現(xiàn)有DNA構(gòu)建物的RNA，也可用無細(xì) 胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白(參閱例如W086/05807和W0 89/01036，以及美國專利5，122，464)。本發(fā)明的抗體可從任何適宜的宿主細(xì)胞表達?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細(xì)胞的例子包 括原核細(xì)胞、酵母或高級的真核細(xì)胞，包括但不限于微生物，例如用含有本發(fā)明抗體編碼序 列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿 菌、腸桿菌、歐文氏菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、沙門氏菌、沙雷氏菌、志賀氏菌，以及桿 菌、假單胞菌和鏈霉菌)；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如釀酒 酵母、畢赤酵母、放線菌、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬、木霉屬、鏈孢霉屬，以及 絲狀真菌，如鏈孢霉菌、青霉屬、彎頸霉屬和曲霉屬)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表 達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒， CaMV;或煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如Ti 質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含重組表達構(gòu)建物的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如C0S、CH0、 BHK、293或3T3細(xì)胞)，該構(gòu)建物含有源自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白 啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒后期啟動子；或疫苗病毒7. 5K啟動 子)。用于原核宿主細(xì)胞的表達載體，一般含有一個或多個表型選擇標(biāo)記基因。表型 選擇標(biāo)記基因可以是，例如一種編碼賦予耐藥性或提供自養(yǎng)要求的蛋白的基因。有用 的原核宿主細(xì)胞的表達載體的例子包括從商業(yè)渠道獲得的質(zhì)粒如pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI)、pET (Novagen, Madison，WI)以及 pRSET (Invitrogen，Carlsbad，CA)系列載體(Studier，J Mol Biol 219 37(1991)；以及Scho印fer，Gene 124 83(1993))所衍生的那些載體。通常用于重組原核宿 主細(xì)胞表達載體的啟動子序列包括T7，(Rosenberg等，Gene56 125 (1987))、0 -內(nèi)酰胺酶 (青霉素酶)、乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，Nature275 =615(1978)；以及Goeddel等，Nature 281 :544(1979))、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel 等，Nucl Acids Res 8:4057(1980))， 以及 tac fn ^J] (Sambrook 等,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.， ColdSpring Harbor Laboratory(1990))。酵母載體往往含有一個復(fù)制起點序列，如2 y酵母質(zhì)粒、自主復(fù)制序列(ARS)、啟 動子區(qū)、多聚腺苷化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列以及可選擇標(biāo)記基因。酵母載體的適宜的啟動子序 列包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J Biol Chem 255 2073(1980))或其它糖酵解酶(Holland等，Biochem 17 =4900(1978))如烯醇化酶、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸 甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶。其它用于酵 母表達的適宜載體和啟動子，在Fleer等，Gene 107 =285(1991)中進一步說明。其它酵母 和酵母轉(zhuǎn)化方案的適宜啟動子和載體是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。酵母轉(zhuǎn)化方案也是眾所周知 的。Hinnen等，Proc Natl Acad Sci 75 1929 (1978)敘述了這樣的一個方案，它在一種選擇 性培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化。任何真核細(xì)胞培養(yǎng)物都是可行的，無論是源自脊椎動物還是無脊椎動物的培養(yǎng)物。無脊椎動物細(xì)胞的例子，包括植物和昆蟲細(xì)胞(Luckow等，Bio/Technology 6 47(1988) ；Miller 等，Genetic Engineering, Setlow 等，eds. , vol. 8, pp. 277-9, Plenum Publishing (1986)；以及 Maeda 等，Nature315 :592 (1985))。例如，桿狀病毒系統(tǒng)可用于 生產(chǎn)異源蛋白。在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus，AcNPV)可作為載體用來表達外源基因。該病毒在草地貪夜 蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長?？贵w編碼序列可在AcNPV啟動子(例如多角 體蛋白啟動子)的控制下被克隆。其它已經(jīng)鑒定的宿主包括白紋伊蚊(Aedes)、黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster)和家蠶(Bombyxmori)。各種各樣的轉(zhuǎn)染病毒株可從市面上獲 得，例如AcNPV的L-1變種和家蠶NPV的Bm-5株。此外，如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，棉花、玉米、 馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿、煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)液也可作為宿主。脊椎動物細(xì)胞、脊椎動物細(xì)胞在培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)基)中的繁殖，可以是一種常規(guī) 步驟，但苛求細(xì)胞系確實存在，它需要例如一種具有獨特因子的專門培養(yǎng)基、飼養(yǎng)細(xì)胞等， 參閱 Tissue Culture, Kruse 等，eds.，AcademicPress (1973)。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞 系的例子為猴腎細(xì)胞；人胚腎細(xì)胞；幼倉鼠腎細(xì)胞；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc Natl Acad Sci USA 77:4216(1980))；小鼠塞爾托利氏細(xì)胞；人宮頸癌細(xì)胞(例如 HeLa)；犬腎細(xì)胞；人肺癌細(xì)胞；人肝細(xì)胞；小鼠乳腺腫瘤；以及NS0細(xì)胞。宿主細(xì)胞是用載體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生抗體，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有 生長因子、維生素、礦物質(zhì)等，以及適合于所用細(xì)胞和載體的誘導(dǎo)劑。常用的啟動子序列和 增強子序列是源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40 (SV40)以及人的巨細(xì)胞病毒(CMV)。源自 SV40病毒基因組的DNA序列可用于提供其它遺傳組件，用于在哺乳動物宿主細(xì)胞(如SV40 起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪接和多聚腺苷化位點)中表達一個結(jié)構(gòu)基因序列。病 毒的早期和晚期啟動子是特別有用的，因為兩者都很容易從病毒基因組作為片段獲得。該 片段也可能含有一個病毒復(fù)制起點。用于哺乳動物宿主細(xì)胞的典型表達載體可從商業(yè)渠道 獲得。可從商業(yè)渠道獲得的培養(yǎng)基如Ham' s F10、極限必需培養(yǎng)基(MEM)、RPMI_1640和 達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)都適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham等，Meth Enzymol 58 44 (1979)和 Barnes 等，Anal Biocheml02 255 (1980)，以及美國專利 4，767，704 ； 4，657，866 ；4，560，655 ；5，122，469 ；5，712，163 ；或 6，048，728 中所述的任何培養(yǎng)基也可作 為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基使用。這些培養(yǎng)基中任何一種，必要都可補充激素和/或其它生長因 子(如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)，鹽(如氯化物，如氯化鈉、氯化鈣或氯化鎂；以 及磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素，痕量元素(定義為無機 化合物，通常其最終濃度在微摩爾的范圍內(nèi))，以及葡萄糖或等效的能量來源。任何其它必 要的補充，都可以按適當(dāng)?shù)臐舛劝ㄔ趦?nèi)，作為一項設(shè)計選擇。培養(yǎng)基條件，如溫度、PH值 等，都是本領(lǐng)域內(nèi)已知適合于細(xì)胞的，并使轉(zhuǎn)基因能夠理想表達。使用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法，就可獲得目的聚核苷酸，并確定該聚核苷酸的核 苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，就可從化學(xué)合成的寡核苷酸組裝編碼抗 體的聚核苷酸(例如Kutmeier等，Bio/Techniques 17 =242(1994)所敘述的)，然后擴增連 接的寡核苷酸，例如通過PCR?；蛘撸幋a抗體的聚核苷酸可從表達相同抗體的核酸的細(xì)胞產(chǎn)生。如果不具備含有編碼某特定抗體的核酸的克隆，但抗體分子的序列是已知的，則可從適當(dāng)來源如文庫中獲得編碼免疫球蛋白的核酸，這也許是一種對產(chǎn)生抗體的細(xì)胞具有特異性的核酸，所述細(xì) 胞如選定表達本發(fā)明的抗體的雜交瘤細(xì)胞?？蔀镻CR擴增配置適宜的引物。然后，使用本 領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的任何方法，可將PCR所產(chǎn)生的擴增核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體中去。一旦核苷酸序列和對應(yīng)于抗體的氨基酸序列被確定，就可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知 的操作核苷酸序列的方法，如重組DNA技術(shù)、定點誘變，PCR等(參閱，例如Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1990)；以及 Ausubel 等，eds. , CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)，操作該抗體的核苷酸序列以獲得本文所述的等效物，產(chǎn)生含有 不同氨基酸序列的抗體，例如，造成氨基酸取代、刪除和/或插入。可以眾所周知的方法檢查重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，以鑒定CDR序列， 例如，通過與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列的比較可確定序列高變異性的區(qū) 域。使用常規(guī)DNA重組技術(shù)，可將一個或多個⑶R插入構(gòu)架區(qū)，例如插入人的構(gòu)架區(qū)使非人 源抗體人源化，如上所述。通過該構(gòu)架區(qū)與一個或多個CDR的結(jié)合而產(chǎn)生的聚核苷酸，可編 碼與CXCR5特異性結(jié)合的抗體或至少編碼其ED域。例如，這種方法可用于一個或多個參與 鏈內(nèi)二硫鍵可變區(qū)半胱氨酸殘基的氨基酸取代或刪除，以產(chǎn)生缺乏一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵 的抗體分子。本發(fā)明的抗體或抗體片段可用于在體外或體內(nèi)檢測生物樣本的CXCR5，從而檢測 表達CXCR5的細(xì)胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗CXCR5抗體被用于測定CXCR5在一種組 織或源自該組織的細(xì)胞中的存在和水平。例如，在用本發(fā)明的抗體或抗體片段進行的免疫 分析中，可測定CXCR5在該組織或活檢樣本中的水平。組織或活檢樣本可冷凍或固定。同 一方法或其它方法也可用于測定CXCR5的其它性能，如它的水平、細(xì)胞定位、mRNA水平、基 因突變等等。上述方法可用于例如為已知或疑患癌癥的個體診斷癌癥，將該個體測定的CXCR5 水平與一個正常對照或標(biāo)準(zhǔn)相比。本發(fā)明的分析也可用于診斷關(guān)節(jié)炎或其它以B細(xì)胞的浸 潤和富集以及分化淋巴組織發(fā)展為特征的自身免疫性疾病。本發(fā)明還提供了為了研究或診斷應(yīng)用而進一步標(biāo)記的單克隆抗體、人源化抗體及 其抗原表位結(jié)合片段。在某些實施方案中，該標(biāo)記是一種放射性標(biāo)記、熒光團、生色團、顯像 劑，或金屬離子。此外還提供了一種診斷方法，其中將所述標(biāo)記抗體或其抗原表位結(jié)合片段施用于 懷疑患有癌癥、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病或其它CXCR5疾病的個體，對該標(biāo)記在個體體內(nèi)的 分布予以測量或監(jiān)視。本發(fā)明的抗體及其片段可作為親和純化劑使用。在此過程中，使用本技術(shù)領(lǐng)域已 知的方法，將抗體固定在一種固相載體如葡聚糖或瓊脂糖樹脂或濾紙上。被固定的抗體與 含有CXCR5的樣本或載有CXCR5的待純化細(xì)胞接觸，然后用一種適宜的溶劑洗滌載體，該溶 劑將洗去樣本中除CXCR5或待純化細(xì)胞以外幾乎所有的物質(zhì)，CXCR5或待純化細(xì)胞則結(jié)合 在被固定的本發(fā)明的抗體上。最后，用另一種適宜的溶劑(如甘氨酸緩沖液，PH值5.0)洗 滌載體，這將從抗體上釋放CXCR5或細(xì)胞。為了診斷應(yīng)用，目的抗體通常會用一種可檢測的成分加以標(biāo)記。有許多標(biāo)記可供利用，大致可分為以下幾類(a)放射性同位素，如36S、14C、125I、3H和mI(抗體可 用方文身寸性同位素標(biāo)記，使用 Current Protocols inlmmunology, vol. 12, Coligen 等’ ed.，ffiley-Interscience, New York(1991)所述的技術(shù)，例如，放射性可用閃爍計數(shù)技 術(shù)來衡量)；(b)熒光標(biāo)簽，如稀土螯合物(銪螯合物)、熒光素及其衍生物、羅丹明及其 衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白以及得克薩斯紅；熒光標(biāo)簽可用Current Protocols inlmmunology (同上)披露的技術(shù)結(jié)合到抗體上，例如，熒光可用熒光儀量化；以及(c)有 各種酶底物標(biāo)簽可供利用(美國專利4，275，149提供了綜述)，酶通?？纱呋a(chǎn)色底物的 化學(xué)改變，這可采用各種技術(shù)來測量，例如酶可催化底物顏色的變化，這可用分光光度來衡 量；或者，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。定量測定熒光變化的技術(shù)是眾所周知的，例 如使用發(fā)光計，或者該標(biāo)記可向一種熒光受體提供能量。酶標(biāo)記的例子包括熒光素酶(例 如，螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利4，737，456)、熒光素、2，3- 二氫酞嗪二酮、 蘋果酸脫氫酶、脲酶，過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRP0)、堿性磷酸酶，3 -半乳糖苷酶、 葡糖糖基化酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶)、 雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。使酶與抗體結(jié) 合的技術(shù)在 0' Sullivan 等，Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, AcademicPress, New York, 73 (1981)中有所敘述。當(dāng)使用這些標(biāo)記時，有適宜的底物可供利用，例如⑴對于辣根過氧化物酶可用 過氧化氫酶作為底物，過氧化氫酶可氧化一種染料前體(例如鄰苯二胺(0PD)或3，3'， 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB)) ； (ii)對于堿性磷酸酶(AP)可用磷酸對-硝基苯基 酯作為產(chǎn)色底物；以及(iii) 3-D-半乳糖苷酶(日-D-Gal)可用產(chǎn)色底物(例如對硝基苯 基-0 -D-半乳糖苷酶)，或熒光底物如4-甲基傘形酮酰-0 -D-半乳糖苷酶。其它酶-底物組合也可供本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員利用。對于一般性評述，參閱美國專利 4，275，149 和 4，318，980。有時，標(biāo)記與抗體是間接地結(jié)合。例如，抗體可與生物素結(jié)合，上述任何報告蛋白 都可與抗生物素蛋白結(jié)合，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白選擇性地結(jié)合，因此，標(biāo)記可 與抗體以間接方式結(jié)合?；蛘?，為了實現(xiàn)標(biāo)記的間接結(jié)合，抗體與一種小的半抗原(如地高 辛)結(jié)合，將不同類型的標(biāo)記或上述的報告蛋白與一種抗地高辛抗體結(jié)合。因此，使用第二 種抗體可以實現(xiàn)標(biāo)記與抗體或突變蛋白的間接結(jié)合。在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗體不必加以標(biāo)記，它的存在可使用一種與該抗 體結(jié)合的標(biāo)記抗體來檢測，其是另一種形式的第二抗體。本發(fā)明的抗體可用于任何已知的分析方法，如競爭性結(jié)合分析、直接和間接夾心
Zo 1 a， Monoclonal Antibodies :AManual of Techniques (CRC
Press,Inc.1987)。競爭性結(jié)合分析取決于一種帶標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與試驗樣本在與有限量的抗體結(jié)合 過程中的競爭能力。試驗樣本中抗原的量與跟抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為便于測定 跟抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，抗體在競爭之前或之后通常是不溶解的。因此，與抗體結(jié)合的標(biāo) 準(zhǔn)物和試驗樣本可與未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和試驗樣本方便地分離。夾心分析涉及使用兩種抗體，每一種都有能力與待檢測目標(biāo)的不同免疫原部分 (決定簇或抗原表位)結(jié)合。在夾心分析中，待分析試驗樣本與直接或間接固定在固體載體上的第一種抗體結(jié)合，然后直接或間接地加有標(biāo)記的第二種抗體與已經(jīng)結(jié)合的試驗樣本結(jié) 合，從而形成不溶性的三部分復(fù)合物，參閱例如美國專利4，376，110。第二種抗體本身可用 一種可檢測的成分加以標(biāo)記(直接夾心分析)，或采用抗免疫球蛋白的抗體或用可檢測成 分加以標(biāo)記的結(jié)合對(例如抗體/抗原、受體/配體、酶/底物)的其它適宜成員進行測量 (間接夾心法)。例如，一種夾心分析是ELISA分析，在這種情況下，該可檢測成分是酶。對于免疫組織化學(xué)，細(xì)胞或組織樣本可以是新鮮的或冷凍的，或可封在石蠟里并 用一種防腐劑如甲醛固定?？贵w也可用于體內(nèi)診斷分析。一般而言，抗體的突變體是用放射性核苷酸(如 mIn、99Tc、14C、mI、3H、32P或35S)標(biāo)記的，使得表達CXCR5的位點可使用免疫閃爍法定位。本發(fā)明還包括試劑盒，例如包括抗體、其片段、同源物、其衍生物等的試劑盒，例如 一種帶標(biāo)記或具有細(xì)胞毒性的輟合物，以及抗體使用說明書、殺死特定類型細(xì)胞的輟合物 等等。該說明書可包括在體外、體內(nèi)或體內(nèi)外使用抗體、輟合物等的指示。抗體可以是液態(tài) 或固態(tài)，通常是凍干形式。該試劑盒可包含其它適宜的試劑，如緩沖液、重組溶液以及為了 預(yù)定用途的其它必要成分。成套的預(yù)定劑量組合試劑與使用說明書，例如用于治療用途或 診斷分析，都是經(jīng)過精心考慮的。如果抗體是帶標(biāo)記的，例如用酶標(biāo)記的，那么該盒可包括 底物和酶所需的輔因子(例如提供可檢測生色團或熒光團的底物前體)。此外，其它添加 劑，如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或裂解緩沖液)等也可包括在內(nèi)。各種試劑的相對 量可以改變而提供試劑溶液的濃縮物，這就提供了用戶靈活性、節(jié)省空間、節(jié)省試劑等優(yōu)越 性。這些試劑也可以干粉形式提供，通常是凍干形式，包括賦形劑，它在溶解時可提供具有 適當(dāng)濃度的試劑溶液。本發(fā)明的抗體可用于治療哺乳動物。在一個實施方案中，例如出于獲得臨床前數(shù) 據(jù)的目的，將目的抗體或等效物施用于非人類哺乳動物。代表性的待治療非人類哺乳動物， 包括非人靈長類動物、狗、貓、鼠、嚙齒類以及其它哺乳動物，其中進行了臨床前研究。這些 哺乳動物可為一種需用抗體治療的疾病建立動物模型，或可用于研究目的抗體的毒性。在 每個這樣的實施方案中，可在哺乳動物中進行劑量遞增研究。一種抗體，無論有無第二個組分(如作為一種治療成分與抗體結(jié)合)，無論是單獨 或與細(xì)胞毒性因子一起施用，均可作為治療劑使用。本發(fā)明是關(guān)于以抗體為基礎(chǔ)的治療，其 中涉及給動物、哺乳動物或人施用本發(fā)明的抗體，以治療CXCR5介導(dǎo)的疾病、病癥或狀況。 該動物或患者可以是需要特別治療的哺乳動物，例如經(jīng)診斷患有特殊(例如與CXCR5有關(guān) 的)疾病的哺乳動物。針對CXCR5的抗體是有用的，例如可用于預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎、炎癥， 一般而言，移植排斥反應(yīng)、癌癥和自身免疫性疾病。例如，通過施用在治療上可接受劑量的 本發(fā)明的抗CXCR5抗體，或多種本發(fā)明的抗體或其等效物的混合物，或與其它不同來源的 抗體聯(lián)合施用，所治療哺乳動物尤其是人的疾病癥狀可得到減輕或預(yù)防。本發(fā)明的治療化合物包括但不限于本發(fā)明的抗體(包括如本文所述的其片段、類 似物，等效物和衍生物)、如本文所述的編碼本發(fā)明的抗體的核酸(包括其片段、類似物和 衍生物)以及如本文所述的抗獨特型抗體。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制或預(yù)防與CXCR5 異常表達和/或活性相關(guān)的疾病、病癥或狀況，包括但不限于任何一種或多種本文所述的 疾病、病癥或狀況。治療和/或預(yù)防與CXCR5異常表達和/或活性相關(guān)的疾病、病癥或狀況 包括但不限于減輕與這些疾病、病癥或狀況相關(guān)的至少一種癥狀。如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知或本文所述，本發(fā)明的抗體可以藥學(xué)上可接受的組合物形式提供。“生理上可接受的”、“藥理 學(xué)上可接受的”等術(shù)語是指已經(jīng)被聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)，或已列入美國藥典或其 它普遍公認(rèn)的用于動物、尤其是人類的藥典?？笴XCR5抗體可以任何可接受方式給哺乳動物施用。施用方法包括但不限于胃腸 外、皮下、腹腔內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜外、吸入和口服途徑；若欲進行免疫抑制治療，則施用于 病灶內(nèi)。胃腸外輸液包括肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或腹腔內(nèi)施用?？贵w或組合物可以任何 方便途徑施用，例如通過輸液或快速注射、通過上皮或粘膜(例如口腔粘膜、直腸和腸道粘 膜等)吸收，并可與其它生物活性劑一起施用。給藥可以是全身性或局部性。此外，也許需 要以任何適當(dāng)途徑將本發(fā)明的治療抗體或組合物施用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi) 注射；腦室內(nèi)注射借助于腦室內(nèi)導(dǎo)管，例如與一個貯器如奧莫耶貯器(Ommaya reservoir) 連接的導(dǎo)管。此外，該抗體適合于以脈沖輸液方式給藥，尤其是以抗體劑量遞減的方式。優(yōu) 選的是以注射方式給藥，優(yōu)選靜脈注射或皮下注射，部分地取決于給藥時間的長短。各種其它給藥系統(tǒng)是眾所周知的，可用于本發(fā)明的抗體的給藥，包括例如封裝于 脂質(zhì)體、微粒、微膠囊(參閱 Langer，Science 249 1527 (1990) ；Treat 等，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer ；Lopez-Berestein 等，eds.， p. 353-365(1989)；以及 Lopez-Berestein, ibid.，p. 317-327)以及能表達該化合物的重組 細(xì)胞；受體介導(dǎo)的胞吞(參閱Wu等，J Biol Chem 262:4429(1987))；構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒 或其它載體等的組成部分的核酸?；钚猿煞忠部煞庋b在以凝聚技術(shù)或界面聚合法制備的微膠囊中，例如分別用于膠 體藥物給藥系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或微乳液的羥 甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。在Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學(xué))，16版，A. Osal，Ed. (1980)中公開了這些技術(shù)。也可應(yīng)用經(jīng)肺給藥，例如使用吸入器或噴霧器，以及含有霧化劑的制劑。抗體也可 以干粉組合物的形式施用患者肺部，參閱例如美國專利6，514，496。在一個具體實施方案中，也許希望在需要治療的局部區(qū)域施用本發(fā)明的治療抗體 或組合物；這可通過以下方式實現(xiàn)例如但不限于，局部輸液、局部敷用、注射、經(jīng)由導(dǎo)管、 以栓劑或植入的方式；所述植入物是一種多孔、非多孔或凝膠狀物質(zhì)，包括膜如硅橡膠膜或 纖維。優(yōu)選的是，當(dāng)施用本發(fā)明的抗體時，應(yīng)注意采用蛋白不吸收或不吸附的材料。在另一實施方案中，該抗體可經(jīng)由一種控制釋放系統(tǒng)給藥。在一個實施方案中， 可使用泵(參閱 Langer，Science 249 1527 (1990) ；Sefton, CRCCrit Ref Biomed Eng 14 201(1987) ；Buchwald 等，Surgery 88 507(1980)；以及 Saudek 等，N Engl J Med 321:574(1989))。在另一實施方案中，可使用聚合材料(參閱Medical Applications of Control led Release, Langer 等，eds. , CRC Press (1974) ；Controlled Drug Bioavailability, Drug ProductDesign and Performance, Smolen eds. , Wiley (1984)； Ranger^, JMacromol Sci Rev Macromol Chem 23 61 (1983) ；iii#BLevyScience228 190(1985) ；During 等，Ann Neurol 25 351(1989)；以及 Howard 等，J Neurosurg 71 105(1989))。在另一實施方案中，控制釋放系統(tǒng)可放置在治療靶點的附近。通過混合具有所需純度的多肽與任選的“藥學(xué)上可接受的”載體、稀釋劑、賦形 劑或常用于本領(lǐng)域的穩(wěn)定劑(即緩沖液、穩(wěn)定劑)、防腐劑、等滲劑、非離子型洗滌劑、抗氧化劑以及其它多種添加劑，參閱Remington' sPharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科 學(xué))，16版，0sOl，ed. (1980)，多肽或抗體治療制劑可制備成凍干制劑或水溶液儲存。這些 添加劑在所用劑量和濃度下，對接受治療者一般都沒有毒性，因此，賦形劑、稀釋劑、載體等 是藥學(xué)上可接受的。“分離，，或“純化”的抗體基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或來自細(xì)胞或組織來源或源自蛋白 的培養(yǎng)基的其它污染蛋白，或在化學(xué)合成的情況下基本上不含化學(xué)前體或其它化合物。“基 本上不含細(xì)胞物質(zhì)”這一措詞包括抗體制劑，其中多肽/蛋白從細(xì)胞中分離或以重組方式產(chǎn) 生，但是與該細(xì)胞的組分是分開的。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的抗體包括污染蛋白含量低 于約30%、20%、10%、5%、2. 5%或(干重)的抗體制劑。當(dāng)抗體是以重組方式產(chǎn)生時， 優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即以蛋白制劑體積計，培養(yǎng)基含量低于約20 %、10%、5%、2.5%或 1%。當(dāng)抗體是以化學(xué)合成方式產(chǎn)生時，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化合物和試劑，即 目的抗體是與化學(xué)前體或涉及蛋白合成的其它化合物分開的。相應(yīng)地，這些抗體制劑含有 低于約30%、20%、10%、5%或(干重)的化學(xué)前體或目的抗體以外的其它化合物。在 本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是分離或純化的。本文所用的術(shù)語“低至不可檢測的聚集水平”，是指樣本中含有不超過5%、不超過 4 %、不超過3 %、不超過2 %、不超過1 %且往往不超過0. 5 %的聚集量(按蛋白重量計，例 如以高效尺寸排阻層析法(HPSEC)測量)。本文所用的術(shù)語“低至不可檢測的碎片水平”，是指例如在HPSEC所確定的一個單 峰處，或還原性毛細(xì)管凝膠電泳(rCGE)所確定的兩個(2)峰(重鏈和輕鏈)處，樣本中含 有等于或高于80%、85%、90%、95%、98%或99%的總蛋白，且不含高于5%、高于4%、高 于3 %、高于2 %、高于1 %或高于0. 5 %的總蛋白的其它單峰。本文所用的rCGE是指還原 條件下的毛細(xì)管凝膠電泳，該還原條件足以使抗體或抗體類型或衍生物分子中的二硫鍵還 原。就含有CXCR5抗體或其結(jié)合片段的液體制劑而論，本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定”和“穩(wěn) 定的”是指制劑中的抗體或其抗原結(jié)合片段，在給定的制造、制備、運輸和儲存條件下，對于 熱和化學(xué)解折疊、聚集、降解或斷裂的抵抗力。本發(fā)明的“穩(wěn)定的”制劑在給定的制造、制備、 運輸和儲存條件下，可保持等于或高于80 %、85%、90 %、95%、98 %、99%或99. 5 %的生物 活性。所述抗體制劑的穩(wěn)定性，可根據(jù)聚集、降解或斷裂的程度來評估，并與參照物比較；采 用的方法是本領(lǐng)域內(nèi)專業(yè)人員已知的，包括但不限于rCGE、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)以及 HPSEC。術(shù)語“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這類生理載 體可以是無菌液體，例如水和油，包括來源于石油、動物、植物或合成的油，例如花生油、豆 油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)藥物組合物為靜脈內(nèi)注射時，水是適宜的載體。鹽水溶液以及 葡萄糖和甘油的水溶液也可作為液體載體使用，尤其是用于注射溶液。適宜的藥用賦形劑 包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油 酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，該組合物也可含有 少量的潤濕劑或乳化劑，或PH緩沖劑。該組合物可采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠 囊、粉劑、緩釋制劑、貯庫等形式。該組合物可用傳統(tǒng)的粘合劑和載體如甘油三酯配制成栓 劑的形式?？诜苿┛珊袠?biāo)準(zhǔn)載體，如醫(yī)藥級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適宜載體的例子在“雷明頓藥物科學(xué)”(Remington' s Pharmaceutical Sciences, Martin)中有所描述。這類組合物將包含有效量的抗體，優(yōu)選的是純抗體，以及 適量的載體以形成適合給患者施用的形式。如本領(lǐng)域內(nèi)周知，該制劑將配制成適合于施用 的方式。緩沖劑有助于將pH值維持在近似于生理條件的范圍內(nèi)。緩沖劑優(yōu)選的是約2mM 至約50mM的濃度范圍。適宜用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機酸和無機酸及其鹽，例如檸檬酸 鹽緩沖劑(例如檸檬酸單鈉_檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸_檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸_檸 檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(例如琥珀酸_琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸_氫氧化 鈉混合物、琥珀酸_琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(例如酒石酸_酒石酸鈉混合 物、酒石酸_酒石酸鉀混合物、酒石酸_氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(例如富馬 酸_富馬酸單鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸單鈉_富馬酸二鈉混合物等)、 葡糖酸鹽緩沖劑(例如葡糖酸_葡糖酸鈉混合物、葡糖酸_氫氧化鈉混合物、葡糖酸_葡 糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(例如草酸_草酸鈉混合物、草酸_氫氧化鈉混合物、草 酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、 乳酸_乳酸鉀混合物等)以及乙酸鹽緩沖劑(例如乙酸_乙酸鈉混合物、乙酸_氫氧化鈉 混合物等)。磷酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑、三甲胺鹽例如Tris、HEPES以及 其它已知的此類緩沖劑均可以使用。可加入防腐劑以阻滯微生物生長，加入量的范圍可為0. 2% -1% (w/v)。適用于本 發(fā)明的防腐劑包括苯酚、芐醇、間甲酚、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基 芐基銨、烷基二甲基芐基銨鹵化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化己烷雙胺、羥基苯 甲酸烷基酯如羥苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇以及3-戊醇。等滲劑的存在可確保本發(fā)明的液體組合物的生理等滲性，其包括多元糖醇、優(yōu)選 的是三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇以及甘露醇。考慮 到其它成分的相對含量，多元醇可以約0.1%至約25% (重量)的含量存在，優(yōu)選的是 至約5%。穩(wěn)定劑是指種類廣泛的賦形劑，其功能范圍可從填充劑至將治療劑溶解或有助于 預(yù)防治療劑變性或粘在容器壁上的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多元糖醇；氨基酸，如精 氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙 氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機糖或糖醇、如乳糖、海藻糖、水蘇糖、阿糖醇、赤蘚醇、甘露醇、 山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚 合物；含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫基乙醇酸鈉、硫代甘油、a-單硫代甘油和 硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即< 10殘基)；蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、明 膠或免疫球蛋白；親水聚合物、如聚乙烯吡咯烷酮，糖類；單糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄 糖；二糖，如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖；多糖，如右旋糖苷等等。穩(wěn)定劑含量的范 圍為活性蛋白的0. 1至10，000倍(w/w重量)。其它各種賦形劑包括填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血 酸、蛋氨酸或維生素E)以及共溶劑。根據(jù)所治療具體病癥的需要，本文的制劑也可包含一種以上的活性化合物，優(yōu)選 的是那些具有互補活性的化合物；這類互補活性不會在相互之間造成不良影響。例如，也許希望進一步提供一種免疫抑制劑。這類化合物分子以適宜的量組合，以有效地實現(xiàn)預(yù)期目 的。本文所用的術(shù)語“表面活性劑”是指具有兩親結(jié)構(gòu)的有機物，即具有由相反溶解傾 向的基團，通常是油溶性烴鏈和水溶性離子基團組成的結(jié)構(gòu)。表面活性劑可根據(jù)表面活性 基團所帶的電荷而劃分為陰離子型、陽離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑經(jīng)常作 為潤濕劑、乳化劑、增溶劑和分散劑，用于各種的藥物組合物以及生物材料制劑?？杉尤敕请x子型表面活性劑或洗滌劑(又稱為潤濕劑)以幫助治療劑的溶解，并 保護治療蛋白以避免振蕩引起的聚集，也使得制劑暴露于表面剪切力而不會發(fā)生蛋白的 變性。適宜的非離子型表面活性劑包括聚山梨酯(20、80等)、聚環(huán)氧烷(184、188等)、
Pluronic 多元醇以及聚氧乙烯山梨坦單醚(TWEEN-20 、TWEEN-80 等)。非
離子型表面活性劑的含量范圍可為約0. 05mg/ml至約1. Omg/ml，優(yōu)選的是約0. 07mg/ml至 約 0. 2mg/ml。本文所用的術(shù)語“無機鹽”是指任何由于酸分子中的一部分或所有氫原子被金屬 或起金屬作用的基團置換而生成的不含碳化合物，并在藥物組合物和生物材料制劑中經(jīng)常 作為滲透壓調(diào)節(jié)化合物。最常見的無機鹽是NaCl、KC1、NaH2P04等。本發(fā)明提供了抗CXCR5結(jié)合的化合物或其片段的液體制劑，其pH值范圍為約5. 0 至約7. 0，或約5. 5至約6. 5，或約5. 8至約6. 2，或約6. 0。本發(fā)明包括在醫(yī)生診所或?qū)嶒炇业尼t(yī)用冰箱和冷凍室溫度(如約-20°C至約5°C) 下儲存時(例如約60天、約120天、約180天、約1年、約2年或以上)具有穩(wěn)定性的液體 制劑，上述穩(wěn)定性是用例如高效尺寸排阻層析法(HPSEC)來評估的。本發(fā)明的液體制劑在 室溫下也顯示了至少幾小時的穩(wěn)定性，例如根據(jù)HSPEC的評估，在使用之前穩(wěn)定1小時、2小 時或約3小時。術(shù)語“小分子”和類似術(shù)語包括但不限于肽、擬肽類物質(zhì)、氨基酸、氨基酸類似物、 聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、分子量為每摩爾小于約10，000克的有 機或無機化合物(包括雜有機和/或有機金屬化合物)、分子量為每摩爾小于約5，000克的 有機或無機化合物、分子量為每摩爾小于約1，000克的有機或無機化合物、分子量為每摩 爾小于約500克的有機或無機化合物，以及這類化合物的鹽、酯及其它藥學(xué)上可接受的形 式。因此，例如在癌癥的情況下，本發(fā)明的抗體可以單獨使用，也可與其它類型的癌癥 治療劑結(jié)合使用，包括傳統(tǒng)的化療劑(紫杉醇(paclitaxel)、卡鉬(carboplatin)、順鉬 (cisplatin)和多柔比星(doxorubicin))，抗EGFR劑(吉非替尼(gef itinib)、厄洛替尼 (erlotinib)和西妥昔單抗(cetuximab))，抗血管生成劑(貝伐珠單抗(bevacizumab)和 舒尼替尼(sunitinib))，以及免疫調(diào)節(jié)劑如干擾素a和沙利度胺。在另一項實施方案中，在風(fēng)濕性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的情況下，可使用含有 本發(fā)明的CXCR結(jié)合分子的組合治療劑。例如，一種人源化CXCR5抗體可與一種小分子結(jié) 合使用，例如緩解病情的抗風(fēng)濕藥，包括但不限于甲氨蝶呤和吡啶合成抑制劑如來氟米特 (Mader & Keystone，JRheum 34Supp (16-24) 2007，Gaffo 等，Am J Health Syst Pharm63 2451-2465，2006)。由于各種形式的目的CXCR5結(jié)合分子可以是不清除B細(xì)胞的，本發(fā)明的分子可與具有重疊作用機制的其它藥物組合，以產(chǎn)生疊加或協(xié)同的終點。因此，例如，第二種藥物可 以是在T細(xì)胞軸上在細(xì)胞因子水平上起作用的藥物等。本文所用的術(shù)語“治療劑”是指可用于與異常CXCR5和/或CXCL13代謝和活性相 關(guān)的疾病、障礙等的治療、管理或改善的任何藥物。其可能在異常B細(xì)胞水平或B細(xì)胞活性 中表現(xiàn)作用。也包括在與異常CXCR5和/或CXCL13代謝和活性相關(guān)的疾病、障礙等的治療 中具有藥理學(xué)作用的已知化合物。此外，本發(fā)明的抗體可以與各種效應(yīng)分子綴合，例如異源的多肽、藥物、放射性核 苷酸或毒素，參閱例如 W0 92/08495 ；W0 91/14438 ；W089/12624 ；美國專利 5，314，995 ；以 及EP0 396，387。一種抗體及其片段可與一種治療組分綴合，例如一種細(xì)胞毒素(例如一 種細(xì)胞靜止劑或殺細(xì)胞劑)、一種治療劑或放射性金屬離子(例如a發(fā)射體如213Bi)。細(xì) 胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括任何損害細(xì)胞的試劑。其例子包括紫杉醇(paclitaxol)、松胞 菌素 B (cytochalasin B)、短桿菌肽 D (gramicidin D)、溴乙唆(ethidiumbromide)、依米 T (emetine)、絲裂霄素(mitomycin)、依托泊昔(etoposide)、替尼泊昔(tenoposide)、 長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicine)、多柔比星 (doxorubicin)、柔紅霄素(daunorubicin)、二 尹圣基惠酉昆(dihydroxy anthracindione) > 米托惠酉昆(mitoxantrone)、普卡霄素(mithramycin)、方文線菌素(actinomycin D)、l_ 去 氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾 (propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其類似物或同源物。治療劑包括但不限于抗 代謝物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6_巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6_硫代鳥嘌 呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5_ 氟脲嘧啶(5_f luorouracil)和氮烯咪胺 (decarbazine)),燒化齊(例如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美 法侖(melphalan)、亞硝基脲氮芥(carmustine (BSNU))和洛莫司汀(lomustine (CCNU))、 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈 脲佐菌素(str印tozotocin)、絲裂霉素C(mitomycin C)和順二氯二胺鉬(II) (DDP)順 白(cisplatin)),惠環(huán)霄素(anthracyclines)(例如柔紅霄素(daunorubicin)、道諾霄 素(daunomycin)和多柔比星(doxorubicin))，抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)、 放線菌素(actinomycin)、博萊霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和安曲霉 素(anthramyCin(AMC)))，以及抗有絲分裂劑(例如長春新堿(vincristine)和長春堿 (vinblastine))。使治療組分與抗體綴合之類的技術(shù)是眾所周知的，參閱例如Arnon等，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Reisfeld 等 (eds.), p. 243-56Alan R. Liss (1985) ；Hellstrom 等，inControlled Drug Delivery (控 M 會合 M ), 2nd ed. ， Robinson 等，eds. ， p. 623-53, Marcel Dekker(1987) ； Thorpe, in Monoclonal Antibodies' 84 :BiologicalAnd Clinical Applications (生物禾口臨床 應(yīng) 用)，Pinchera 等，eds. , p.475-506 (1985) ；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy (用于癌癥檢測和治療的單克隆抗體)，Baldwin等，eds.， p. 303-16，Academic Press (1985)；以及 Thorpe,等，Immunol Rev (免疫學(xué)評論)62 119(1982)。或者，一種抗體也可以與第二種抗體綴合，以形成一種異源耦聯(lián)抗體，如雙功能 抗體，參閱例如美國第4，676，980號專利。
本發(fā)明的綴合物可用于改變一定的生物反應(yīng)，治療劑或藥物組分不應(yīng)被理解為只 限于傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑。例如，該藥物組分可以是具有某種所需生物活性的蛋白或多肽。這 類蛋白可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌屬外毒素，或白喉毒素； 蛋白，如腫瘤壞死因子、a-干擾素、干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組 織纖維蛋白溶酶原活化劑；凋亡劑，例如TNF-a、TNF-0、AIM I (WO 97/33899)、AIM 11 (WO 97/34911)、Fas 配體(Takahashi 等，Int Immunol, 6 :1567 (1994))，VEGF(WO 99/23105)； 血栓形成劑；抗血管生成劑，例如血管生長抑素或內(nèi)皮抑素；或生物反應(yīng)修飾劑，例如淋巴 因子、白細(xì)胞介素-1 (IL-1)、白細(xì)胞介素_2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞 集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)或其它生長因子。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這可通過例如無菌過濾膜過濾而實現(xiàn)。例如， 本發(fā)明的液體制劑可通過用0. 2 y m或0. 22 y m過濾器過濾而滅菌?？梢灾苽渚忈屝椭苿?。緩釋型制劑的適宜例子包括含有抗體的用固體疏水型聚 合物制成的半滲透基質(zhì)，該基質(zhì)以成形物體的形式出現(xiàn)，例如薄膜或基質(zhì)。緩釋型基質(zhì)的 例子包括聚酯、水凝膠(例如聚甲基丙烯酸2-羥基乙基酯、聚乙烯醇、聚乳酸酯(美國第 3，773，919號專利)、L-谷氨酸和乙基_L_谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯 酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如由乳酸_乙醇酸共聚物構(gòu)成的可注射微球粒)以及 聚-D-(-)-3-羥基丁酸。乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸_乙醇酸之類的聚合物能夠釋放分子長 達100天以上，但某些水凝膠釋放蛋白的時間則較短。根據(jù)所涉及的機制，可以制訂出達到 穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是通過硫代-二硫化物交換而形成分子間的S-S 鍵，那么通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中冷凍干燥、控制水分含量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?基酸置換和開發(fā)特異的聚合物基質(zhì)組合物就可以達到穩(wěn)定?？贵w或其變體和組合物將以符合藥品質(zhì)量管理規(guī)范的方式配制、給藥以及施用。 這方面考慮的因素包括包括所治的具體疾病、所治的具體哺乳動物、個體的臨床情況、致病 原因、給藥部位、給藥方法、給藥方案以及醫(yī)療工作者所知的其它因素。即將施用的抗體或 其變體的“治療有效量”取決于這些考慮，并可以是為了預(yù)防、減輕或治療CXCR5疾病、癥狀 或障礙所必須的最低量。任選地，抗體或其變體也可與目前用于預(yù)防或治療該疾病的一種或多種藥物配制 在一起。上述其它藥物的有效量取決于藥物中抗體的含量、疾病或治療的種類，以及上面討 論的其它因素。這些量通常與此前所用的劑量一樣且通過同樣的給藥途徑，或為此前所用 劑量的約1至99%。本文所用的術(shù)語“有效量”是指一種治療劑(例如一種預(yù)防藥物或治療藥物)的 量，其足以降低某種CXCR5疾病的嚴(yán)重性和/或持續(xù)時間，減輕其一種或多種癥狀，預(yù)防 CXCR5疾病的發(fā)展或?qū)е翪XCR5疾病的消退，或足以產(chǎn)生防止CXCR5疾病或其一種或多種 癥狀的發(fā)展、復(fù)發(fā)、發(fā)作或惡化的效果，或足以加強或改善另一種用于治療CXCR5疾病的治 療方式(例如另一種治療劑)的預(yù)防和/或治療效果。例如，以基線或正常水平計，本發(fā)明 的治療劑可將升高的B細(xì)胞水平降低至少5%，優(yōu)選的是至少10%、至少15%、至少20%、 至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至 少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%。 在另一項實施方案中，一種治療藥物或預(yù)防藥物的有效量足以將某種CXCR5疾病如關(guān)節(jié)炎或移植排斥的癥狀降低至少5%，優(yōu)選的是至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %，或至少100 %。作為等價的術(shù)
語，本文也使用”治療有效量”這一術(shù)語。在某種具體疾病或狀況的治療中，治療用多肽、抗體或其片段的有效量將取決于 該疾病或狀況的性質(zhì)，并可通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)測定。當(dāng)可能時，可先在體外試驗的條件下 得出劑量-反應(yīng)曲線以及本發(fā)明的藥物組合物。如果可獲得適宜的動物模型系統(tǒng)，同樣可 獲得劑量-反應(yīng)曲線，并運用本領(lǐng)域已知的方法外推出適宜的人類劑量。但是，基于本技術(shù) 領(lǐng)域的常識，能有效地降低炎癥影響的藥物組合物可形成的局部治療劑濃度為例如約5至 20ng/ml之間，優(yōu)選的是約10至20ng/ml之間。在本發(fā)明另一項具體實施方案中，針對造成 依賴于B細(xì)胞的自體免疫現(xiàn)象或移植排斥現(xiàn)象的細(xì)胞能有效地減緩其增生和存活的藥物 組合物，可形成的局部治療劑濃度為約10至lOOng/ml之間。在一項優(yōu)選的實施方案中，一種治療用多肽、抗體或其片段的水溶液可以皮下注 射的方式施用。每次劑量的范圍按每公斤體重計可為約0. 5mg至約50mg，或優(yōu)選按每公斤 體重計為約3mg至約30mg。針對具體的疾病、患者群體、施用方式等，可采用本領(lǐng)域內(nèi)已知 的藥學(xué)方法憑經(jīng)驗確定該劑量。根據(jù)許多臨床因素包括疾病類型、疾病嚴(yán)重程度以及患者對治療劑的敏感度，皮 下注射的劑量方案可在每周一次至每天一次的范圍內(nèi)變化。本發(fā)明提供了制備抗體或其CXCR5-結(jié)合片段的液體制劑的方法，其包括將純化 抗體的一部分濃縮至約 15mg/ml、約 20mg/ml、約 30mg/ml、約 40mg/ml、約 50mg/ml、約 60mg/ ml、約 70mg/ml、約 80mg/ml、約 90mg/ml、約 100mg/ml、約 200mg/ml、約 250mg/ml、約 300mg/ ml或更高的最終濃度，例如使用具有適當(dāng)分子量(mw)限度的半透膜(例如對于F(ab, )2片 段的限度為30Kd ；對于Fab片段的限度為10Kd)來進行濃縮，以及任選地采用同樣的半透膜 將濃縮的抗體部分滲濾至制劑緩沖液中。此外，本發(fā)明也包括了穩(wěn)定(例如KD穩(wěn)定)的、改善體內(nèi)半衰期的產(chǎn)品的液體制 劑。因此，本發(fā)明的抗體在個體(優(yōu)選的是人)體內(nèi)的半衰期為3天以上、7天以上、10天以 上、15天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2月以上、3月以上、4 月以上、5月以上或更長。為了延長抗體在體內(nèi)的血清循環(huán)，可采用各種各樣的技術(shù)。例如，惰性聚合物分子 如高分子量聚乙二醇(PEG)，可以通過PEG的位點特異性綴合或通過賴氨酸殘基上的￡氨 基連接到抗體的N-端或C-端上，其中可經(jīng)過多功能連接子連接、也可以不經(jīng)過?？梢圆捎?導(dǎo)致生物活性損失最小的直鏈或支鏈聚合物衍生。綴合程度可通過SDS-PAGE和質(zhì)譜密切 監(jiān)測，以確保PEG分子與抗體的正確綴合。未反應(yīng)的PEG可通過尺寸排阻法或離子交換色 譜法與抗體-PEG綴合物分離。采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法，例如本文所述的免疫測定 法，可以測定PEG衍生的抗體的結(jié)合活性以及體內(nèi)功效。在體內(nèi)具有較長半衰期的抗體也可通過將一個或多個氨基酸修飾(即取代、插入 或缺失)引入IgG恒定區(qū)或其F。R結(jié)合片段(如或鉸鏈區(qū)域片段)來產(chǎn)生，參閱例如 W0 98/23289 ；W0 97/34631 ；以及美國第 6，277，375 號專利。而且，抗體可與白蛋白綴合使得抗體在體內(nèi)更穩(wěn)定，或在體內(nèi)具有較長的半衰期。這些技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，參閱例如W0 93/15199,W0 93/15200和WO 01/77137;以 及EP0 413，622?？贵w也可通過其它方法來修飾，例如糖基化、乙?；?、磷?；?、酰胺化、用已 知保護劑/封閉劑實現(xiàn)衍生化、蛋白水解裂解、與細(xì)胞配體或其它蛋白實現(xiàn)鍵合等。在一項實施方案中，按照常規(guī)步驟將該組合物配制成適合于人類靜脈給藥的藥物 組合物。通常，靜脈給藥的藥物組合物是以無菌等滲緩沖水溶液配制的溶液。在必要的場 合，該組合物也可包含穩(wěn)定劑和局部麻醉劑如利多卡因或其它“卡因”類麻醉劑，以減輕注 射部位的疼痛。通常，各種成分是以單位劑量的形式單獨供應(yīng)或混合后供應(yīng)，例如作為凍干 粉末或無水濃縮物裝在密封容器中，如安瓿瓶或小袋，并標(biāo)明有效成分的量。當(dāng)藥物組合物 以輸注方式給藥時，可通過裝有無菌醫(yī)藥級水或鹽水的輸注瓶給藥。當(dāng)藥物組合物以注射 方式給藥時，例如可在藥盒中提供裝有無菌注射用水或鹽水的安瓿，使得各成分可在注射 前先混合。本發(fā)明也提供了液體制劑，本發(fā)明的液體制劑是裝在密封容器中，如安瓿瓶或小 袋，并標(biāo)明產(chǎn)品的量。本發(fā)明的液體制劑可裝在密封容器中，并標(biāo)明抗體或抗體片段的量和 濃度。例如，本發(fā)明的液體制劑可裝在密封容器中，CXCR5抗體濃度至少為15mg/ml、20mg/ ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、lOOmg/ml、150mg/ml、 200mg/ml、250mg/ml，或 300mg/ml，其量為 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、 15ml 或 20ml。提供了一種含有對上述疾病治療有用物質(zhì)的制造產(chǎn)品。該制造產(chǎn)品包括容器和標(biāo) 簽。適宜的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和試管。容器可用各種材料制造，例如玻璃或 塑料。該容器容納能有效地診斷、預(yù)防或治療CXCR5癥狀或疾病的組合物，并可設(shè)有一個無 菌入口(例如該容器可以是靜脈注射液小袋或小瓶，設(shè)有一個能被皮下注射針頭刺破的塞 子)。容器上貼的標(biāo)簽或附帶的標(biāo)簽標(biāo)明該組合物是用于治療所選的病癥。該產(chǎn)品還可包 括第二個容器，裝有藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸緩沖鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。它 還可包括從商業(yè)和用戶的立場看來所需的其它材料，包括緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭、注 射器以及使用說明等包裝插頁。在本發(fā)明的另一方面，以基因治療的方式，施用含有編碼抗體或其功能衍生物的 序列的核酸，以治療、抑制或預(yù)防與CXCR5的異常表達和/或活性相關(guān)的疾病或障礙。基因 治療是指通過給個體施用一種表達或可表達的目的核酸而進行的治療。在本發(fā)明的該實施 方案中，核酸在介導(dǎo)某種治療作用的目標(biāo)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生編碼的蛋白。任何可供利用的基 因治療方法均可按照本發(fā)明而使用。關(guān)于基因治療方法的一般評論，參閱Goldspiel等，Clinical Pharmacy 12 488(1993) ；ffu Biotherapy 3:87(1991) ；Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 32:573(1993) ；Mulligan, Science 260:926(1993) ；Morgan Ann Rev Biochem 62 191(1993)；以及 May，TIBTECH 11:155(1993)。在一個方面，該化合物含有編碼抗體或其功能結(jié)合片段的核酸序列，上述核酸序 列是在適宜的宿主細(xì)胞中表達抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表達載體的一部 分。具體而言，此類核酸序列具有以可操作方式與抗體編碼區(qū)以及其它調(diào)控序列連接的啟 動子，該啟動子是誘導(dǎo)型或組成型的，也任選地具有組織特異性。在另一項具體實施方案中，使用了某些核酸分子，其中抗體編碼序列和任何其它所需序列的側(cè)面連接在該基因組所需位點促進同源重組的區(qū)域，從而為該編碼抗體的核 酸在染色體內(nèi)的表達創(chuàng)造了條件(Koller等，Proc Natl Acad Sci USA 86:8932(1989)； Zijlstra等，Nature 342 :435(1989))。在一項特殊的實施方案中，被表達的抗體分子是一 種單鏈抗體，或者，該核酸序列包括同時編碼該抗體的重鏈和輕鏈或其片段的序列。其它整 合方法包括使用特定的能識別特定核酸序列、鋅指等的轉(zhuǎn)錄因子。將核酸施用到患者體內(nèi)的方式可以是直接的，也可以是間接的。在直接情況下，患 者是直接與核酸或載有核酸的載體接觸；在間接情況下，首先在體外用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后 移植至患者體內(nèi)。在一項實施方案中，核酸序列被直接施用到體內(nèi)，并被表達以產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可 用本領(lǐng)域內(nèi)公知的許多方法中的任何一種來實現(xiàn)，例如構(gòu)建和施用作為適宜核酸表達載體 一部分的抗體編碼序列，使得該載體進入細(xì)胞內(nèi)，例如通過使用缺陷型或減毒型逆轉(zhuǎn)錄病 毒或其它病毒載體感染(參閱美國專利4，980，286)；通過直接注射裸DNA;通過使用微粒 轟擊(例如基因槍；生物導(dǎo)彈，Dupont)；通過使用非病毒載體，如含有兩親化合物的合成組 合物，該兩親化合物與親水的核酸結(jié)合并能夠與細(xì)胞融合，通常含有一個與膜結(jié)合的疏水 部分；通過用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑涂覆，封裝于脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z囊中；通過施 用與一種肽連接的載體(已知該肽將進入細(xì)胞核)；通過施用與一種配體連接的載體(該 配體將受到受體介導(dǎo)的胞吞作用，該胞吞作用可用于瞄準(zhǔn)特異表達該受體的細(xì)胞)(參閱 例如Wu等，J Biol Chem 262:4429(1987))；等等。在另一實施方案中，可形成核酸-配體 復(fù)合物，其中該配體含有一種融合病毒肽以擾亂核內(nèi)體，從而使核酸避免溶酶體降解。在另 一個實施方案中，通過瞄準(zhǔn)特定的受體，核酸可在體內(nèi)靶向以達到細(xì)胞特異性的吸收和表 達(參閱 W 92/06180 ；W0 92/22635 ；W092/20316 ；W093/14188 以及 W0 93/20221)。關(guān)于載體，如本領(lǐng)域公知，例如可以使用慢病毒載體。慢病毒載體包含用于包裝 病毒基因組和整合到宿主細(xì)胞DNA中的組分。將用于基因治療的編碼抗體的核酸序列克 隆進一個或多個載體，這些載體協(xié)助把基因遞送給患者。例如，慢病毒載體可用于將一種 轉(zhuǎn)基因傳給造血干細(xì)胞。顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中應(yīng)用的參考文獻如下ciowes 等，J Clinlnvest 93:644(1994) ；Kiem 等，Blood 83:1467(1994) ；Salmons 等，HumanGene Therapy 4:129(1993)；以及 Grossman 等，Curr Op in Gen and Dev3 :110 (1993)。腺病毒也可用于本發(fā)明。基于腺病毒的給藥系統(tǒng)的靶點器官為例如肝、中樞神 經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒感染非分裂細(xì)胞，這是比先前的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)越之 處。Kozarsky等在Curr Op in Gen Dev 3:499(1993)中回顧了基于腺病毒的基因治療。 Bout等在Human Gene Therapy 5:3(1994)中展示了利用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至恒河 猴的呼吸上皮細(xì)胞。在基因治療中利用腺病毒的其它例子可參閱Rosenfeld等，Science 252:431(1991) ；Rosenfeld 等，Cell 68 143 (1992) ；Mastrangeli 等，J Clin Invest91 225(1993) ；W094/12649 ；以及 Wang 等，Gene Therapy 2:775(1995)。腺病毒相關(guān)病毒(AAV)也可用于基因治療(Walsh等，Proc Soc ExpBiol Med 204 289 (1993)；以及美國專利 5，436，146,6, 632，670 和 6，642，051)。基因治療的另一種手段涉及以電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等 方法將基因轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)液的細(xì)胞內(nèi)。通常，該轉(zhuǎn)移方法包括給細(xì)胞引入一種可選擇的 標(biāo)記。然后將細(xì)胞置于一個選擇過程中，分離出那些接受并表達了引入基因的細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞移入患者體內(nèi)。因此，可在生成的重組細(xì)胞移入體內(nèi)之前先將核酸引入細(xì)胞。這樣的引入過程可 以本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法實現(xiàn)，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列 的病毒或噬菌體載體感染，細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原 生質(zhì)球融合等。將外部基因引入細(xì)胞的許多技術(shù)都是本領(lǐng)域內(nèi)公知的(參閱例如Loeffler 等，MethEnzymol 217:599(1993) ；Cohen 等，Meth Enzymol 217 :618 (1993)；以及 Cline Pharm Ther 29 :69 (1985))，并可按照本發(fā)明加以利用，但前提是該受者細(xì)胞必要的發(fā)育和 生理功能未受到干擾。該技術(shù)應(yīng)該將核酸穩(wěn)定地引入細(xì)胞，使核酸能被細(xì)胞表達、遺傳并被 細(xì)胞后代表達。生成的重組細(xì)胞可以本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法引入患者體內(nèi)。重組血細(xì)胞(例如 造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)優(yōu)選通過靜脈注射。預(yù)期使用細(xì)胞的數(shù)量取決于所期待的效果、患 者狀況等，可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員決定。出于基因治療目的而可將核酸引入的細(xì)胞包括任何所需的、可利用的細(xì)胞類型， 包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、血細(xì)胞如T 淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞以及粒 細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，尤其是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如從骨髓、臍帶血液、外周血 液、胎肝等獲得的細(xì)胞。在一項實施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是患者自身的。編碼本發(fā)明抗體的核 酸的引入使得該轉(zhuǎn)基因可由細(xì)胞或它們的后代表達，然后該重組細(xì)胞被施用體內(nèi)以產(chǎn)生 治療作用。在一項專門的實施方案中，使用了干細(xì)胞或祖細(xì)胞。任何能被分離并在體 外維持的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞都有可能按照本發(fā)明的實施方案加以利用(參閱例如W0 94/08598 ;Stemple等，Cell71 973(1992) ；Rheinwald Meth Cell Bio 21A :229 (1980)；以 及 Pittelkow 等，Mayo Clinic Proc 61:771(1986))。因為 CXCR5 在例如 B 細(xì)胞上表達，所 以血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞是適宜的宿主細(xì)胞。但是，本發(fā)明關(guān)于使用干細(xì)胞宿主的范圍并不包 括制備和利用轉(zhuǎn)基因以將目的轉(zhuǎn)基因引入胚胎和胚胎干細(xì)胞而制備轉(zhuǎn)基因生物體。本發(fā)明通過給個體施用有效量的例如本發(fā)明的液體制劑而提供了治療、預(yù)防和改 善CXCR5疾病或其一種或多種癥狀的方法。個體優(yōu)選是哺乳動物，如非靈長類(例如牛、豬、 馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類(例如猴，如獼猴，以及人類)。在一項優(yōu)選的實施方案中，個 體是人。CXCR5也可表達在某些癌細(xì)胞中，如胰腺、結(jié)腸、膀胱，以及白血病T細(xì)胞(Qinping 等，Oncogene 24 :573_584，2005)，和白血病 B 細(xì)胞(Burke 1 等，Blood, Jul 2007 ；doi 10. 1182/blood-2007-05-089409)，并且CXCR5的刺激與癌細(xì)胞的增殖相關(guān)(Meijer等， Cane Res 66 :9576_9582，2006)。因此，目的抗體或其衍生物可用于控制表達CXCR5的癌細(xì)胞的增殖，上述癌癥是 通過以本文教導(dǎo)的診斷分析來測定CXCR5表達的存在而確定的。目的抗體可降低惡性細(xì)胞 的浸潤、減少對凋亡的抵抗以及最大程度地減少增殖。然后給這類患者施用抑制癌細(xì)胞增 殖的量的本文所提供的目的抗體或其衍生物。自身免疫性疾病與CXCL13的異常表達和/或高度表達相關(guān)，如狼瘡(Ishikawa 等，J Exp Med 193 1393-1402，2001)和含格倫綜合征(Salomonsson 等，Scan J Imm 55 336-342，2002 ；以及 Barone 等，ArthRheum 52 (6) 1773-1784，2005)，或與 CXCR5 的高度表 達相關(guān)，如重癥肌無力(Sims 等，J Imm 167 1935-1944, 2001 ；Saito 等，J Neuroimm 55 336-342，2005 ；以及 Tackenberg 等，Eur J Imm 37 :849_863，2007)。因此，用目的抗體將 CXCL13或CXCR5配體的高水平或高活性降低至最低限度。在以B細(xì)胞的高水平、CXCR5或 CXCL13或其它CXCR5配體的高水平為特征的自身免疫性疾病中，如本文所教導(dǎo)，施用了抑 制B細(xì)胞活性的量的目的抗體。在多發(fā)性硬化癥中，觀察到CXCR5的異常表達(Brain 129 (Pt 1) 200-211，2006)。在結(jié)腸炎中，CXCR5在GALT的形成和功能中起一定作用(Carlsen等，Gut，2002， 51 (3) 364-367)。CXCR5介導(dǎo)的B細(xì)胞向腸粘膜固有層的遷移和浸潤，以及一般的粘膜浸潤 (Mazzucchelli 等，J Clin Invest，1999，104(10)R49-R54)，及其在潰瘍性結(jié)腸炎病變部位 (其包含異位生發(fā)中心)的表達，被目的抗體所抑制。在某些情況下和某些癥狀如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，B細(xì)胞的減少可在減輕癥狀方面產(chǎn) 生治療效益(Oligino & Dalrymple, Arth Res Ther 5 (Suppl4) S7—S11，2003)。與未患風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎的人相比，CXCR5在關(guān)節(jié)炎患者的滑液組織中表達水平很高(Schmutz等，Arth Res Ther 7 :R217_R229，2005)。因此，某些形式的本發(fā)明的抗體及其衍生物能夠減少B細(xì) 胞數(shù)量，并能預(yù)防B細(xì)胞在關(guān)節(jié)中的浸潤和相互作用。相應(yīng)地，治療方法可包括給診斷為關(guān) 節(jié)炎的患者施用其劑量足以降低B細(xì)胞水平的目的抗體。該抗體可局部地注射至受影響的 關(guān)節(jié)。在某些病癥，包括銀屑病關(guān)節(jié)炎(Canete等，Ann Rheum Dis，Jan 12，2007，doi 10 :1136/ard. 2006. 062042)、一般慢性炎癥(Aloisi & Pujol-Borrell，Nat Rev Imm 6 205-217,2006)以及慢性移植排斥(Baddoura 等，Am JTrans 5 :510_516，2005)和急性 (DiCarlo等，Am J Trans 7 :201_210，2007)移植排斥中，觀察到了異位的淋巴樣再生。 CXCL13和CXCR5存在于心臟移植的情況中(DiCarlo等，同上)；CXCL13存在于銀屑病關(guān)節(jié) 炎的情況中(Canete等，同上)。如在正常淋巴結(jié)處所發(fā)現(xiàn)的那樣，CXCL13和/或CXCR5的 存在與具有B細(xì)胞和T細(xì)胞區(qū)域的異位淋巴結(jié)發(fā)展有關(guān)。異體抗原的B細(xì)胞抗原呈遞也與 急性心臟同種異體移植模型有關(guān)(Noorchashm等，J Imm 177 :7715_7722，2006)。因此，目的抗體可用于減輕發(fā)炎和移植排斥。因此在移植手術(shù)之前或之后，給患者 施用足以抑制B細(xì)胞活性的量的本發(fā)明的抗體，以減輕發(fā)炎、盡量減緩異位生發(fā)中心的發(fā) 展、盡量減少移植后B細(xì)胞的恢復(fù)，以及盡量降低B細(xì)胞異體抗原呈遞。本發(fā)明將以下列非限制性實施例進一步為技術(shù)人員加以說明。這些實施例描述了 某些本發(fā)明可以借此實施的實施方案。
實施例實施例1 免疫原的產(chǎn)生抗CXCR5單克隆抗體可以針對用編碼全長人CXCR5并表達于細(xì)胞表面上的DNA轉(zhuǎn) 化的CH0細(xì)胞(“r-CXCR5-CH0細(xì)胞”)產(chǎn)生。用來轉(zhuǎn)化該細(xì)胞的CXCR5序列如NM 001716. 2、 NC000011. 8或NM001716可以從數(shù)據(jù)庫獲得，并且可以從合適的細(xì)胞來源中合成或分離。將CXCR5可讀框置于表達載體如pCDNA3. lneo_DEST內(nèi)，并且隨后轉(zhuǎn)染至300-19 細(xì)胞(免疫原)。
另外，將具有氨基酸序列，MNYPTLEMDLENLEDLFffELDRLDNYNTSLVENHLC (SEQ ID NO 1)的 CXCR5EC 結(jié)構(gòu)域通過 羧基末端的半胱氨酸綴合至KLH，并且用作免疫原。腹膜內(nèi)(IP)施用表達CXCR5或CXCR5EC 結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞(0. 2ml中的5 X IO6個細(xì)胞或100 μ 1緩沖液中的50 μ g肽，任選地與100 μ 1 佐劑如弗氏完全佐劑混合)。抗原注射每兩周加以重復(fù)直至使用任何多種已知方法，例如通 過使用例如可以由例如FACS分離的CXCR5+細(xì)胞以及例如市售ΜΑΒ190 (R&D Systems)作為 陽性對照的ELISA或FACS，在血清中檢測到高滴度CXCR5抗體。表達CXCR5的細(xì)胞在37 °C于5% 0)2下在補加10%透析的胎牛血清(FBS) (Invitrogen)的 RPMI (Invitrogen，Carlsbad，CA)中維持。通過用補加 5mM EDTA 的磷酸緩 沖(無Ca/Mg)鹽溶液(CMF-PBS)置換上述培養(yǎng)基并在該緩沖液內(nèi)收獲細(xì)胞而制備用于注 射的細(xì)胞。收獲的細(xì)胞通過在500 Xg離心約5分鐘而沉淀、通過將該沉淀重懸于CMF-PBS 中并如前離心而洗滌一次、計數(shù)并且通過將細(xì)胞沉淀重懸于CMF-PBS中而調(diào)整至用于注射 的適宜體積(如0. 2ml中的5 X IO6個細(xì)胞)。如所提及，CXCR5表達例如通過FACS分析法，使用市售CXCR5抗體，如 MABl90 (R&D)、克隆RF8B2和2G8 (2G8是大鼠抗小鼠CXCR5抗體，而其它的購買抗體是抗人 CXCR5抗體)(BD)及2C1 (Abnova)以及針對hCXCR5的多種多克隆抗體，實施本領(lǐng)域已知方 法而監(jiān)測。為方便質(zhì)粒構(gòu)建和為了增強CXCR5的表達，產(chǎn)生對應(yīng)于包含CXCR5核酸編碼序列 的前135個堿基對的前導(dǎo)肽序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸在擺動編碼位置內(nèi)含有一些改 變以降低GC含量。全部核苷酸序列改變是沉默性的，即不產(chǎn)生氨基酸序列改變。在寡核 苷酸退火到一起后，將改造的前導(dǎo)肽編碼序列通過PCR-SOE (Ho等，Gene 77:51(1989)和 Horton等，BioTechniques 8:528(1990))與編碼序列的剩余部分連接。CXCR5的表達在作為免疫原使用之前進行驗證。細(xì)胞在含有10% FBS,0. 2mM谷氨 酰胺和ι χ非必需氨基酸溶液的RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA)中培養(yǎng)，隨后在T75搖瓶 中接種每孔約3-5X IO5個細(xì)胞并且培育大約24-48小時。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)約二周直至不攜帶CXCR5表達質(zhì)粒的細(xì)胞通過抗生素選 擇被消除?？梢詫⒎€(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞裂解、獲得蛋白質(zhì)并進行Western印跡分析。使用用于檢測CXCR5的細(xì)胞表面表達的方法，如通過FACS分析而對穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞測定CXCR5的表達。另外，可以將細(xì)胞裂解并研究蛋白質(zhì)，例如通過Western印跡 分析進行。從培養(yǎng)皿中收獲的轉(zhuǎn)染細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌一次并重懸于去離 子水中，與等體積2X蛋白質(zhì)樣品加樣緩沖液(BioRad，Hercules, CA)混合并且隨后在約 100°C加熱10分鐘。膜蛋白使用與等體積2X蛋白質(zhì)樣品加樣緩沖液混合并在100°C加熱 10分鐘的條件培養(yǎng)基進行分析。樣品使用4-12%梯度SDS-PAGE而分開。將蛋白質(zhì)從凝膠 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Bi0Rad，HercUles，CA)，其中所述的硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)之前 用PBST(含0. 05%TWEEN-2O 的PBS)中的5%脫脂乳封閉至少一小時。CXCR5通過將膜與封閉緩沖液中的CXCR5特異性一級抗體在室溫下溫育振搖至少一小時而檢測。將膜洗滌至少三次并且將封閉緩沖液中的報導(dǎo)分子綴合的第二抗體添加至 該膜上并在室溫下溫育振搖至少一小時。將膜在PBST中洗滌三次并且用例如化學(xué)發(fā)光底 物進行顯色。
實施例2 抗CXCR5mAB的產(chǎn)生約4-6 周齡的 A/J 或BALB/cJ 小鼠(Jackson Labs, Bar Harbor,ME)用 CXCR5 轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞或EC肽免疫。一組小鼠在第0日用與佐劑(CFA)混合的KLH綴合肽的1 1乳劑進 行腹膜內(nèi)致敏(prime)，在第20日用含IFC(弗氏不完全佐劑)的所述肽和/或在無佐劑的 PBS中的細(xì)胞進行靜脈內(nèi)加強，并且最終在第44日用混在IFC中的KLH-肽和/或在無佐劑 的PBS中的細(xì)胞進行靜脈內(nèi)加強。另一組小鼠在第0日進行腹膜內(nèi)致敏，在第15、39、53和 67日進行腹膜內(nèi)加強，并且最終在第81日進行靜脈內(nèi)加強(全部小鼠用PBS中的細(xì)胞在無 佐劑下注射)。對于這兩組小鼠，每一注射含有在大約200 μ 1體積中的大約3Χ 106-2X IO7 個細(xì)胞。備選地，肽和/或細(xì)胞免疫每兩周進行一次，實施3-6次直至獲得想要的抗CXCR5 滴度，如通過例如FACS分析或ELISA確認(rèn)。在最后注射后3日，對小鼠任選地測試血清中的抗CXCR5抗體滴度，將小鼠處死并 且取出脾臟并將其置于培養(yǎng)皿中的大約IOml無血清DMEM (Gibco)內(nèi)。脾細(xì)胞使用鉗狀骨針 從被膜中挑出并在37°C的IOml無血清IMDM(Cellgro，Herndon, VA)中洗滌兩次。將脾細(xì) 胞混懸液轉(zhuǎn)移至15ml錐底管中并且使碎片下沉約2-5分鐘。將含有脾細(xì)胞的上清液轉(zhuǎn)移 至新鮮的15ml錐底管中且用IMDM另外洗滌三次直至融合?？梢詤R集來自小鼠的脾細(xì)胞。任選地，5ml對照性脾飼養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液從非免疫小鼠中基本如上文對免 疫脾細(xì)胞所述加以制備并且置于培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2)中直至需要。用于免疫脾細(xì)胞的融合伴侶可以是次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)敏感性非分 泌性骨髓瘤細(xì)胞系，如P3X63-AG8. 653或SP2/0 (ATCC，Manassas, VA)或F0_B淋巴母細(xì)胞 (ATCC，CRL-1646))。融合前，將淋巴樣細(xì)胞在IMDM/10% FBS (37 °C, 7% CO2)中維持，確保 該細(xì)胞在融合當(dāng)日處于對數(shù)生長期。替代性選擇機制依賴于使用重氮絲氨酸，其一般在融 合后1日添加。所用融合方法是在Lerner (Yale J Biol Med，1981，54 (5) 387-402)和 Gefter 等 (Somatic Cell Genet, 1977, 3 (2) 231-236)中所述方法的綜合。融合前，將匯集的脾細(xì)胞 用無血清IMDM洗滌三次并計數(shù)。另外，緊鄰融合前，將對數(shù)期骨髓瘤細(xì)胞用無血清IMDM洗 滌三次并計數(shù)。淋巴樣細(xì)胞在無血清IMDM中重懸至IX IO7個細(xì)胞/ml。對于每次融合，將 1-1. 5 X IO8個脾細(xì)胞與1-3 X IO7個骨髓瘤細(xì)胞在50ml錐底聚丙烯管中混合，并且將細(xì)胞 用無血清IMDM洗滌一次。脾細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的比例是5 1。將該管在500Xg離心10 分鐘以沉淀細(xì)胞。在吸出上清液后，通過敲擊管底部而柔和地重懸沉淀。隨后將該管置于 具有37°C水的燒杯中。全部后繼融合步驟在此燒杯內(nèi)實施。接著，將預(yù)熱至37 "C 的 Iml 聚乙二 醇 1500 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)經(jīng)約1分鐘時間緩慢地添加至每個細(xì)胞沉淀中，同時柔和地振動試管。 細(xì)胞在PEG中溫育約一分鐘，隨后經(jīng)約30秒時間逐滴添加Iml無血清IMDM至每個沉淀 中，并且隨后將9ml無血清IMDM經(jīng)又一分鐘添加至每個沉淀。將兩支管在室溫于500 X g 離心10分鐘并且吸出上清液。細(xì)胞沉淀重懸在100ml濾過的完全雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基(與 10% FBS(SeraCare, Millford, ΜΑ) ,0. 2mM L-谷氨酰胺、IX 非必需氨基酸溶液、ImM 丙 酮酸鈉、0.01 % pen-strep (Invitrogen)和 IXHT 補充物(Invitrogen)混合的 500ml IMDM(Cellgro))ο將每份100ml細(xì)胞混懸液以體積約100 μ 1/孔鋪種在10個96孔平底微量滴定平板中。將平板保持在37°C含7% CO2的培養(yǎng)箱中。在融合后第2日，通過添加每孔100μ 1 在IMDM中的5. 7 μ M重氮絲氨酸至融合細(xì)胞而選擇細(xì)胞。從含有克隆的孔內(nèi)抽取上清液用 于初次篩選，一般在融合后10-14日。融合效率是75-99% (960個可能的孔中720-950個 孔形成受到篩選的克隆)。初次篩選可以是設(shè)計旨在檢測與人CXCR5結(jié)合的抗體的放射免疫測定法 (RIA)。為開展RIA，添加在PBS中親和純化的山羊抗小鼠IgG(F。片段特異性)(Cappell， Cochranville, PA)至96孔PVC微量滴定平板(50 μ 1/孔)并在4°C溫育過夜。從平板 中移去山羊抗小鼠IgG并且將孔用100 μ 1/孔的5% FCS/PBS在室溫封閉1小時。在移 去封閉溶液后，添加凈的雜交瘤培養(yǎng)上清液至孔(50 μ 1/孔)中并在室溫溫育1小時。平 板用 PBS/0. 05% Tween-20 洗滌三次。接著，將 50 μ 1 在 PBS/5% FCS 中的 125I_CXCR5( 20，OOOcpm)添加至各孔，并且在室溫溫育1小時。最后，孔用PBS/0. 05% Tween-20洗滌三 次。在彈去全部洗滌緩沖液后，切開平板而將孔分開并在Y計數(shù)器中分析。向其添加5% FCS/PBS替代培養(yǎng)上清液的孔充當(dāng)背景孔。純化的CXCR5根據(jù)Bolton-Hunter法，基本上如Bolton-Hunter試劑供貨商(New England Nuclear, Boston,ΜΑ)所述用125I標(biāo)記。125I_CXCR5的質(zhì)量通過證實標(biāo)記過程未破 壞由市售CXCR5抗體(R&D或BectonDickinson，Mountain View, CA)識別的表位而監(jiān)測。若上清液樣品在RIA中高于背景大約10倍地受到標(biāo)記，則認(rèn)為克隆在初次篩選時 呈陽性。將陽性克隆匯集、擴充并冷凍貯存。設(shè)計雜交瘤初級篩選法以確定抗體是否識別天然CXCR5表位。如此實現(xiàn)這一點， 即通過FACS分析展示在用單克隆抗體染色的CXCR5+細(xì)胞上的細(xì)胞表面CXCR5，使結(jié)合作 用以熒光標(biāo)記山羊抗小鼠第二抗體可見。若上清液樣品在FACS分析中高于背景大約10倍 地受到標(biāo)記，則認(rèn)為克隆在初次篩選時呈陽性。另外，為定位由抗體結(jié)合的CXCR5表位，用 CXCR5抗體實施競爭測定。將陽性克隆選出、擴充并冷凍貯存。實施例3 用于抗CXCR5mAB的基于細(xì)胞的結(jié)合測定基于細(xì)胞的結(jié)合測定用來表征抗CXCR5mAb。例如，可以使用上文所述的表達 CXCR5的轉(zhuǎn)染細(xì)胞如hCXCR5/HEK293。將全長人CXCR5可讀框克隆至載體例如pCDNA3. Ineo DEST(Invitrogen, Carlsbad, CA)。CXCR5 編碼區(qū)通過使用人腦及肝臟 RNA(Ambion，Inc.， Austin, TX)作為模板的RT-PCR而合成。最終質(zhì)粒構(gòu)建體CXCR5/CDNA3. Ineo表達了全長 CXCR5蛋白。表達CXCR5的穩(wěn)定細(xì)胞系通過使用標(biāo)準(zhǔn)和市售的Lipofectamine 2000試劑盒 轉(zhuǎn)染CXCR5/pCDNA3. Ineo質(zhì)粒構(gòu)建體至CHO或HEK293細(xì)胞(ATCC編號CRL-1573)而產(chǎn)生。 轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)過夜，隨后在含有200 μ g/ml新霉素的培養(yǎng)基中再接種并且培 養(yǎng)12-14日。挑出分離的單個集落并且在單獨的孔內(nèi)培育直至擴增足夠的克隆細(xì)胞?？剐?霉素的和表達高水平CXCR5蛋白的穩(wěn)定克隆通過使用抗CXCR5多克隆抗體(R&D Systems, Minneapolis, MN)或定制產(chǎn)生的多克隆抗體的FACS分析而鑒定。天然表達CXCR5的人HS Sultan細(xì)胞(ATCC編號CRL-1484)也通過FACS分析驗證 了 CXCR5表達。HS Sultan細(xì)胞在含有10%胎牛血清、0. 2mM谷氨酰胺和0. 1% pen/strep 溶液(100 μ g/ml青霉素與10 μ g/ml鏈霉素)的RPMI 1640中培育?；诩?xì)胞的抗體結(jié)合作用 可以使用FMAT (熒光宏觀共聚焦高通量篩選法 (fluorescence macro-confocal high-throughput screening)) 8100HTS 或 8200 細(xì)胞檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA)，按照由制造商提供的方案進行評估。天 然表達CXCR5的或用CXCR5表達構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系在96孔平板中接種。備選地，在 96孔平板中接種瞬時轉(zhuǎn)染的293T或CHO細(xì)胞。細(xì)胞以密度5，000-30, 000個細(xì)胞/每孔接 種。20-24小時后，將抗CXCR5mAb和FMAT-綴合的山羊抗小鼠IgG抗體一并添加至孔內(nèi)并 且在室溫下溫育1小時、2小時、4小時或過夜?；诩?xì)胞的抗體結(jié)合作用還通過使用表達CXCR5的HEK29 3/CXCR5穩(wěn)定細(xì)胞系的 FACS進行評估。細(xì)胞與PBS中的抗CXCR5mAb溫育。在洗滌三次后，將細(xì)胞與熒光分子綴合 的第二抗體(BDSciences，Palo Alto, CA)溫育。結(jié)果顯示幾種mAb結(jié)合從每個重組質(zhì)粒構(gòu)建體中表達的CXCR5。例如，測試了克 隆 11D6、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6、79B7 和 16D7 以及后一抗體 16D7 的人源化變體 16D7-HC1-LC3、16D7-HC1-LC2、16D7-HCI-LCl 和 16D7-HC2-LC1、陰性對照 IL13 抗體 CA13、 陽性對照MAB190、2C1和RF8B2、三種針對IgGl、IgG2a和IgG2b的小鼠同種型對照以及大 鼠IgG2b同種型對照(與RF8B2匹配)與被轉(zhuǎn)染以表達CXCR5的HEK293細(xì)胞的結(jié)合作用。 2C1和MAB190陽性對照抗體與CXCR5細(xì)胞結(jié)合。RF8B2顯示中等結(jié)合水平。陰性對照抗體 僅顯示背景結(jié)合作用。除CA13之外的全部抗體以如親代抗體16D7和79B7那樣的相似結(jié) 合模式和滴定動力學(xué)與hCXCR5/HEK293細(xì)胞結(jié)合。含有CXCR5/ne0質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞也用如上所述的免疫熒光法染色并 且通過熒光顯微鏡檢觀察。基于細(xì)胞的FMAT和FACS分析證實mAb確實與從重組質(zhì)粒構(gòu)建 體中或作為培養(yǎng)細(xì)胞中天然蛋白質(zhì)表達的CXCR5結(jié)合。陽性結(jié)合信號基于顯著高于背景結(jié) 合作用和其它陰性雜交瘤克隆(P > 0. 01)的FMAT信號讀數(shù)而確定。產(chǎn)生的CXCR5mAb (如 16D7、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6 及 79B7)與 EC 結(jié)構(gòu)域 結(jié)合并阻斷CXCL13與細(xì)胞上的CXCR5結(jié)合。實施例4 :BIAC0RE親和力分析來自人和小鼠的CXCR5的氨基末端EC區(qū)(氨基酸1_59)隨末端生物素標(biāo)簽一起 合成，并且在正向模式(forward format) Biacore測定中使用，其中將肽固定于Biacore芯 片上并且隨后測定抗體與芯片上的肽相互作用的動力學(xué)。合成性肽以大約20個應(yīng)答單位 (RU)固定在Biacore芯片上。隨后使mAb按照制造商推薦(GE Healthcare, Piscataway, NJ)暴露于該芯片以便測量動力學(xué)。小鼠抗hCXCR5mAb克隆16D7具有計算的Kd 2. 16"12M ；小鼠/人IgG4嵌合16D7 (移 植至人IgG4Fc上的16D7VH和VL區(qū)，其序列是本領(lǐng)域已知的，任選地是密碼子優(yōu)化的，使用 標(biāo)準(zhǔn)方法如克隆法、末端擴增法確認(rèn)所述區(qū)域的質(zhì)量并克隆所述部分)具有Kd 1. 4Γ12Μ ；并 且就移植至IgG4主鏈上的16D7的多種人源化變體而言，其中變體的結(jié)構(gòu)及其重鏈和輕鏈 的衍生化由用于特定重鏈的，，HC_”和用于特定輕鏈的，，LC_”術(shù)語說明，其中鏈的組成在下 文提供，16D7-HCI-LCl 具有 KD3. 1Γ12Μ ;16D7-HC1_LC2 具有 KD1. 4廠 12M ； 16D7-HC2-LC1 具有 Kd2. 4(Γ12Μ ； 16D7-HC1-LC3 具有 KdL 2Γ12Μ ； 16D7-HC3-LC4 具有 KD4. 92_12M ； 16D7-HC3-LC5 具 有 KD1. 84,M 并且 16D7-HC1-LC6 具有 KD9. 17-11M。人源化SAR113244，一種16D7的人源化變體形式，帶有S241P和L248E替代的 16D7-HC1-LC3 (替代通過采用已知方法和試劑用Kabat編號引入)，在Biacore芯片上由 預(yù)固定的小鼠抗人IgG Fc抗體捕獲，并隨后用于反向測定模式Biacore測定，其中測定了未加標(biāo)簽的人CXCR5氨基末端肽(氨基酸1-59)與該芯片上的mAb相互作用的動力學(xué)。 SARl 13244的Kd被確定是1. 13士0. 08_"M。使用固定在芯片表面上的生物素化的人肽和 SAR113244作為分析物，以正向測定測定的Kd值與使用反向測定獲得的那些Kd值是一致的。實施例5 抗CXCR5mAb結(jié)合活性的Western印跡分析 開展Western印跡以評估變性條件下抗CXCR5mAb對CXCR5的結(jié)合活性以及人細(xì) 胞系中CXCR5和其它CXCR5相關(guān)性蛋白質(zhì)的表達水平。蛋白質(zhì)樣品也從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中， 使用M-PER哺乳動物蛋白質(zhì)提取試劑盒(Pierce，Rockland，IL，目錄編號78501)按照制造 商說明書制備，并且在添加等體積的2X蛋白質(zhì)樣品加樣緩沖液后在70°C加熱10分鐘。全 部樣品通過電泳在4-12%梯度SDS-PAGE凝膠中分開。蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜并且施 加抗CXCR5mAb作為一級檢測抗體至Western印跡膜上。Alexa 680-綴合的第二抗體用于 檢測并且使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(Li_cor，Lincoln, Nebraska)或使用電化學(xué)發(fā)光法 (ECL)掃描該膜。抗人CXCR5的陽性對照抗體如本文中所教授那樣產(chǎn)生。實施例6 用于監(jiān)測CXCR5內(nèi)化FACS測定暗黃覆蓋層細(xì)胞從健康志愿者(Gulf Coast Blood Center, Houston, TX)獲得。 人外周單核細(xì)胞(PBMCs)以標(biāo)準(zhǔn)FicolI-Hypaque梯度方法予以分離。PBMC在96孔平板中 于4°C培養(yǎng)(0. 5 X IO6個細(xì)胞/孔)。各孔含有補加10% FBS的存在/不存在單克隆抗體 (10μ g/ml)的0. 2ml RPMI 1640。30分鐘后，培養(yǎng)基用補加10% FBS和無抗體的新鮮的冷 RPMI 1640替換。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含5% CO2的37°C調(diào)濕組織培養(yǎng)箱。單克隆抗體處理的細(xì)胞 在細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37°C后立即收獲、2小時或24小時后收獲。細(xì)胞用PBS洗滌一次并在含 BSA的冷PBS (PBSB)中溫育30分鐘。細(xì)胞隨后用PE-綴合的抗人CXCR5 (BD Biosciences) 染色。30分鐘后，細(xì)胞用PBSB洗滌三次并在多聚甲醛溶液中固定過夜。次日，CXCR5的 存在用 BDFACSCalibur 系統(tǒng)流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, San Jose，CA)分析。實施例7 =FLIPR測定胞內(nèi)鈣的變化通過鋪種9000個細(xì)胞/孔并溫育過夜而測量。細(xì)胞是用人CXCR5穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染的RBL-2H3系。隨后洗滌細(xì)胞并且隨后載入在含有2. 5mM丙磺舒(probenicid)的緩 沖液中的2mM氟-4/AM(M0leCularPr0bes)。細(xì)胞暴露于CXCR5mAb，隨后用分析緩沖液洗滌。 細(xì)胞暴露于 IOnM CXCL13 (R&D)。胞內(nèi) Ca+2 的變化使用 384-B FLIPR 儀(MolecularDevices) 記錄。市售抗人CXCR5mAb和小鼠IgGl及IgG2b用作對照。如本文以下所討論，構(gòu)建了 mAbl6D7的幾種人源化形式，如嵌合16D7 QiIgG4R 合體)、16D7-HQ-LCl、16D7-Ha-LC2、16D7-HC2-LCl、16D7-Ha-LC3、16D7-HC3-LC4、 16D7-HC3-LC5和16D7-HC1-LC6，并且對它們測試如由鈣流所示的生物活性。除陰性對照CA13以外，人源化抗體顯示了與穩(wěn)定表達CXCR5的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上親代 16D7抗體等同的信號中和活性。實施例8 趨化性測定將CXCR5+HS Sultan 細(xì)胞(ATCC CRL1484)以 0. 5 X IO6 個細(xì)胞 / 孔在 IOOnM CXCL13 (R&D)或CTX緩沖液(無酚紅的RPMI，含有1 % FBS,0. 5% BSA和InM丙酮酸鈉)存 在下添加至transwell平板(Millipore)的上室中并評估到達下室的遷移性細(xì)胞。將這兩 個室裝配并溫育2小時。下室中的細(xì)胞在添加比色試劑(Promega)及在OD49tl上讀數(shù)后進 行計數(shù)。
將CXCR5特異性遷移確定為遷移的細(xì)胞總數(shù)與自發(fā)遷移性細(xì)胞數(shù)目之間的差異。 若測試抗CXCR5，則細(xì)胞在添加至上室之前與該抗體溫育30分鐘?？贵w抑制的程度是抗體 存在下的特異性遷移與抗體不存在下的遷移量的比率。該比率可以乘以100%以產(chǎn)生公制 的抑制百分?jǐn)?shù)。實施例7的抗體與親代16D7抗體就中和趨化性的能力加以比較。除陰性對照mAb CAl3之外的全部人源化抗體以與16D7及79B7、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6的模式可比 的模式中和趨化性。R&D MAB190具有中等活性而H28和Abnova抗體2C1沒有徹底中和配 體誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。實施例9 原代人B細(xì)胞反應(yīng)性測定使用Accuspin柱(Sigma)從全血中分離人PBMC。PBMC隨后以二千萬個細(xì)胞/ ml重懸于BD Stain緩沖液(Becton Dickinson)中。將1 μ g小鼠抗人CXCR5單克隆抗體 添加至50 μ 1 PBMC中并且允許其在4°C結(jié)合20分鐘。細(xì)胞用BD Stain緩沖液洗滌2次。 將1/100稀釋的50 μ 1第二抗體即山羊抗小鼠IgG-PE F(ab, ) (Beckman Coulter)添加至 PBMC-抗體混合物內(nèi)并且允許其在4°C結(jié)合20分鐘。細(xì)胞用BD Stain緩沖液洗滌三次。 含有1/50稀釋的小鼠抗人⑶20-FITC (BD)與⑶4-APC (BD)的混合物分別添加至細(xì)胞上，所 述細(xì)胞隨后在4°C溫育20分鐘以評估B/T細(xì)胞特異性。細(xì)胞用BD Stain緩沖液洗滌三次 并且重懸于250 μ 1 BD Stain緩沖液中并且在FACStar Plus上進行FACS分析。小鼠抗人 CXCR5抗體(R&D;mAbl90)用作陽性對照。產(chǎn)生人源化抗體的滴定曲線并且將平均熒光強 度(MFI)對濃度作圖。對實施例7的人源化抗體測試與人PMBC的結(jié)合作用。除陰性對照CA13之外，抗體均在人B細(xì)胞上結(jié)合并且具有相同的滴定模式。陰性 對照CA13僅顯示背景結(jié)合作用。BD克隆RF8B2與人PBMC結(jié)合不佳。實施例10 短尾猴B細(xì)胞反應(yīng)性測定短尾猴(cyno)全血從 Bioreclamation，Inc. (Hicksville, NY)獲得。血液在離A、 后裝入BD細(xì)胞制備管(CPT)。將血漿層中所含的短尾猴PBMC從CPT管中移至一支50ml管 而不擾動梯度凝膠層。該管用5ml PBS洗滌以徹底提取全部細(xì)胞并且將洗液添加至50ml的 新管。將短尾猴PBMC在4°C于1200轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。將沉淀重懸于ImlBD FACSStain 緩沖液(BD)中。每次測定使用一百萬個細(xì)胞。將Iyg(純化的)小鼠抗人CXCR5單克隆 抗體添加至50 μ 1 PBMC并且允許其在4°C結(jié)合20分鐘。細(xì)胞用BD Stain緩沖液洗滌2 次。將1/100稀釋的50 μ 1第二抗體即山羊抗小鼠IgG-PE F(ab, ) (Beckman Coulter)添加 至細(xì)胞并且允許其在4°C結(jié)合20分鐘。細(xì)胞用BD Stain緩沖液洗滌三次。將含有1/20分 別稀釋的小鼠抗人⑶20-FITC(BD)和⑶4-APC(BD)的混合物添加至細(xì)胞上，以便在4°C溫 育20分鐘以評估B/T細(xì)胞特異性。細(xì)胞用BD Stain緩沖液洗滌三次，并且重懸于250 μ 1 BD Stain緩沖液中并在FACStar Plus上進行FACS分析。商業(yè)性小鼠抗人CXCR5mAb (R&D ； MAB190)用作陽性對照。對人CXCR5反應(yīng)的本發(fā)明的小鼠單克隆11D6與IgG同種型對照比較。測試16D7 的人源化形式及市售MAB190對短尾猴CXCR5的反應(yīng)性。也測試了 79B7。對⑶20和CXCR5呈陽性的 細(xì)胞用MAB190及11D6找到。另一方面，16D7及其人 源化變體以及G7和BD RF8B2及Abnova 2C1均不與短尾猴B細(xì)胞結(jié)合。14C9、19H5、H28、54G6、56H6和79B7也結(jié)合短尾猴B細(xì)胞。本發(fā)明的CXCR5抗體用來研究外周血細(xì)胞。B細(xì)胞表達CXCR5并且在至少一個實 驗中，發(fā)現(xiàn)約10%外周T細(xì)胞表達CXCR5。實施例11 抗CXCR5mAB的測序小鼠單克隆抗體使用市售同種型試劑盒進行同種分型。對16D7及其它抗 CXCR5mAb的可變序列測序?？俁NA使用Qiagen Qianeasy微量制備試劑盒，按照試劑盒的 方案，從約5百萬個雜交瘤細(xì)胞中分離。使用Invitrogen Superscript試劑盒(目錄編號 11904-018)合成第一鏈cDNA，試劑盒方案如下。重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)首先基于Wang等J Immunol Methods. 233 167-77， 2000中所述方法，使用下列簡并性PCR引物及Taq聚合酶(Roche)擴增。重鏈左引物 1:CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO 2)2 :CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ IDNO 3)重鏈右引物GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO 4)輕鏈左引物GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO 5)輕鏈右引物TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO 6)其中R是A或G;N是A、G、T或C;M是A或C;W是A或T;S是G或C ；并且Y是C 或T。將PCR產(chǎn)物使用Invitrogen TOPO TA克隆 試劑盒(目錄編號45_0641)克隆 至PCR4-TOPG .并且使用T3和T7引物測序。序列隨后對基因文庫數(shù)據(jù)庫blast以推導(dǎo) 用于克隆全長可變區(qū)的前導(dǎo)序列?；赽last結(jié)果，以下引物(Chardes等，F(xiàn)EBS Letters 452 =386-394,1999)選擇用于使用Pfx聚合酶(Invitrogen)的第二輪PCR擴增。重鏈左引物CCAAGCTGTGTCCTRTCC(SEQ ID NO 7)右引物CGACAAGTCGACTAGCCCTTGACCAGGCATCC(SEQ ID NO 8)輕鏈左引物WTCTCTRGAGTCAGTGGG(SEQ ID NO 9)右引物CGACTAGTCGACTGGTGGGAAGATGGATACAG(SEQ ID NO 10)將PCR產(chǎn)物使用Invitrogen Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒(目錄編號 45-0245)克隆至pCR-Blunt ΙΙ -ΤΟΡ〇 并且使用T7引物測序。一旦測出輕鏈及重鏈的序列，核酸可以被再編碼以優(yōu)化例如人宿主細(xì)胞中的表達。實施例12 轉(zhuǎn)染瘤將NSO-eu細(xì)胞培育至密度1 X IO6細(xì)胞/ml。細(xì)胞維持在指數(shù)生長期并且在轉(zhuǎn)染 前日更換培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染當(dāng)日，洗滌40X IO6個細(xì)胞。隨后，將IOyg線性化核酸例如輕鏈 DNA和10 μ g例如線性化重鏈DNA添加至細(xì)胞混懸液(總DNA體積應(yīng)當(dāng)少于50 μ 1)并且 在冰上孵育培養(yǎng)物15分鐘。把DNA與細(xì)胞的混合物轉(zhuǎn)移至冷凍的透明小容器(cuvette) (0. 4cm)并且施加電脈沖(750V和25yF)。透明小容器在電脈沖處理后立即置于冰上并且 在冰上保持10-15分鐘。收集細(xì)胞并且鋪板。將細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱中溫育12-16日或直 至集落出現(xiàn)。以混懸培養(yǎng)方式培育的細(xì)胞集落或細(xì)胞的上清液通過ELISA進行測試并且將 陽性轉(zhuǎn)染瘤在新鮮培養(yǎng)基中克隆。為進一步篩選陽性轉(zhuǎn)染瘤，實施了滴定ELISA或Biacore 測定。將擴充的轉(zhuǎn)染瘤在搖瓶中維持并且從上清液中收集抗體或其衍生物。實施例13 體內(nèi)測定膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是充分建立的人RA模型，已經(jīng)用來證實抗體對TNF α的 效力(Williams 等，PNAS 1992,89:9784-9788)以及對 CTLA-4 與 TNF α 融合蛋白(Webb 等， Eur J Immunol. 1996,26 :2320_2328 ；和 Wooley 等，J Immunol. 1993，151 :6602_6607)的 效力。一種大鼠抗小鼠CXCR5單克隆抗體即克隆1038在CIA的小鼠模型中得到描述，其中 DBA/1 J小鼠用雞II型膠原免疫并加強免疫。疾病嚴(yán)重性(其以眼觀察方式通過測量爪腫 脹/發(fā)炎而記分)每周監(jiān)測兩次，同時在研究結(jié)束時對收集的關(guān)節(jié)評估炎癥變化、關(guān)節(jié)翳、 軟骨破壞和骨侵蝕。與同種型處理的CIA小鼠相比，克隆1038在以預(yù)防劑量方案施用時顯 著地減少疾病嚴(yán)重性和關(guān)節(jié)病理學(xué)(重復(fù)測量AN0VA，ρ < 0. 05)。使用急性小鼠模型以評估16D7-HC1-LC3在體內(nèi)趨化性方面的效力。簡而言之，在 免疫細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上選擇性表達huCXCR5的C57/B16小鼠(8_16周 齡)通過使用CDlla啟動子的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法而產(chǎn)生。體內(nèi)趨化性模型是嗜中性粒細(xì)胞驅(qū) 動的模型。當(dāng)腹膜內(nèi)施用20yg huCXCL13配體(R&D)時，表達huCXCR5受體的小鼠嗜中性 粒細(xì)胞應(yīng)答huCXCL13梯度而遷移至腹膜腔。腹膜腔洗液用來在腹膜內(nèi)施用huCXCL1380分 鐘后恢復(fù)細(xì)胞并且使用熒光細(xì)胞計數(shù)分析來定量2ml腹腔灌洗樣品中應(yīng)答于huCXCL13滴 注而特異性遷移至腹膜腔的表達huCXCR5的嗜中性粒細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞通過表型標(biāo)記如 Ly6G、⑶19和⑶lib而鑒定。與同種型處理的對照相比時，在滴注huCXCL13之前24小時 以兩個不同劑量(7. 5 μ g或15 μ g)皮下施用抗hCXCR5人源化16D7-HC1LC3顯示在減少表 達huCXCR5的嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答于huCXCL13時遷移至腹膜腔中的效力，CXCR5抗體處理的 兩種樣品在與嗜中性粒細(xì)胞的同種型陰性對照水平相比時顯示基本上無統(tǒng)計學(xué)差異的嗜 中性粒細(xì)胞水平。與所測試CXCR5抗體的較高劑量相比，在1. 5 μ g上的人源化CXCR5抗體 顯示低水平的嗜中性粒細(xì)胞遷移抑制。實施例 14 再表面化(resurfacing)鼠16D7克隆的再表面化按照Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :969和美國專利5，639，641中所述的步驟進行。16D7 的 Vl 和 Vh 序列對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank) (NucleicAcids Research, 28 :235_242 (2000)blast或可以登錄因特網(wǎng)上含有生物大分子的3D坐標(biāo)的蛋白 質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)，并且檢索與16D7的輕鏈及重鏈氨基酸序列最相似的10個輕鏈及重鏈氨基酸序列。PDB身份編碼用于確定所述序列?？勺冚p鏈的10個最接近的同源物是IMJUCJ Mol Biol 332 =423-435, 2003), 1AE6 (Proteins 29 :161_171，1997)、lQYG(Pozharski 等， “Carvinga Binding Site Structural Study of an Anti-Cocaine Antibody" in" Complex with Three Cocaine Analogs “ )、1UZG(J Virol 79 :1223，2005)、1UB5(Beuscher 等， “Structure and Dynamics of Blue FluorescentAntibody 19G2at Blue and Violet Fluorescent Temperatures" )、lRUR(Proc Natl Acad Sci USA 110 :2247_2252，2004、IFPT(Nat Struct Biol2 :232-243，1995)、IQFU(Nat Struct Biol 6 :530_534，1999)、INAK(Virology315 : 159-173，2003)和 ICGS (J MoI Biol 236 :247_274，1994)(多余序列被除去)并且可變重 鏈的 10 個最接近的同源物是 IFNS (Nat Struct Biol7 :881_884，2000)、10AK (Nat Struct Biol 5 :189-194，1998)、IVFB(ProcNatl Acad Sci 91 :1089-1093，1994)、ICIC(Nature 348 :254-257,1990)UGIG (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50:768-777， 1994)UT4K(J MolBiol 343 :1269-1280，2004)、1A7P (Marks 等)、1FE8(J Biol Chem276 9985-9991,2001)UDL7(J Exp Med 191 :2101_2112，2000)和 1YY8(Cancer Cell 7 301-311,2005) 。所述輕鏈及重鏈最接近的同源物分別是IMJU和1FNS。這兩個序列用來 構(gòu)筑可變結(jié)構(gòu)域的同源性模型，該模型隨后通過原子坐標(biāo)位置的共軛梯度最小化作用，用 如在 MOE 軟件包(Chemical Computing Group, Quebec, CA)中執(zhí)行的 CHARMM22 力場(J Comput Chem(1983)4，187 ;J Comput Chem(1986) 7，591)而實現(xiàn)能量最小化。此模型用來 定位CDR區(qū)和框架殘基。計算對每個抗體可變區(qū)的10個最接近同源物的每個可變區(qū)殘基 的溶劑可及性并且在如 Scitegic 方法(Hill & Lewicki (2006) Statistics =Methods and Applications, Statsoft, Tulsa, OK)內(nèi)執(zhí)行的Excel表格程序中予以平均。具有大于30% 平均可及性的位置視為表面殘基。具有25% -30%之間平均可及性的位置也視為依賴與 ⑶R環(huán)的接近度。將鼠16D7可變區(qū)的表面位置與人抗體序列中的相應(yīng)位置比較。這種搜索僅留下 了顯示大于30%可及表面積的那些殘基以及顯示大于25%可及表面積并且分布在溶劑暴 露性殘基側(cè)翼的少量殘基。包括在完整免疫球蛋白序列中的一些保守殘基以改善搜索的趨 同性。僅保留種系序列用于命中分析。選擇具有最多相同表面殘基的人抗體可變區(qū)表面， 特別考慮在⑶R的5.0 Λ范圍內(nèi)的位置，以替換鼠16D7抗體可變區(qū)的表面殘基。序列均不含有免疫表位數(shù)據(jù)庫(Immune Epitope database) (IEDB，免疫表位數(shù)據(jù) 庫和分析資源網(wǎng)站；PLoS Biol. 2005 ；3 (3) :e91)中所列的任何已知B細(xì)胞或T細(xì)胞表位。鼠16D7可變結(jié)構(gòu)域的原初序列是輕鏈(對⑶R加下劃線)DIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSG SGSGTAFTLRISRV EAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQID NO: 11)；禾口重鏈(對⑶R加下劃線)QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNSALKSRLSI RKDNSQSQYFLKMNSLQTDDTAMYYCARIYYffGQGTLYTYSA(SEQ ID NO: 12)。對于輕鏈搜索留下的表面殘基組包括01、￥3、々7、？9、？15、1 16』17、518、？45、646、 Q47、D65、R79、R82、E86、K108、E110 和 K112。
對輕鏈的提交項含有如上所定義的表面殘基組和為BLAST方法趨同性而包括的 保守氨基酸C23、W40、Q43、Y91、C93、F103、G104、G106及T107。全部其它氨基酸可以是20 種天然氨基酸中的任何一種。對IMGT編纂的人種系抗體序列數(shù)據(jù)庫(國際免疫原信息系統(tǒng) 網(wǎng)站，MolecImmunol，2004，40 :647-659)進行BLAST搜索。發(fā)現(xiàn)最佳記分匹配是從其中衍 生輕鏈LC4的X72482(蛋白質(zhì)」d = CAA51150. 1)。LC5和LC6是VL4 (VL是指可變輕鏈) 的兩個變體，據(jù)稱所述的兩個變體解決了輕鏈中可能有問題的殘基欲突變成Leu的1個暴 露性甲硫氨酸(M51) (LC5和LC6)和1個潛在脫酰胺位點(LC6)，其中天冬酰胺N53改變成 絲氨酸殘基。總之，對可變輕鏈提出了與親代鼠16D7克隆相比時含有4-6個突變的3種形 式。在下表1中給出相應(yīng)的突變。給出了序列編號和Kabat編號。留下的表面殘基組對于可變重鏈包括Ql、Q3、K5、S7、P9、Ll 1、S15、Q16、S20、P41、 G42、K43、S61、A62、K64、S65、R70、S74、Q75、Q86、T87、D88、Q103、L106、A111、A112 和 K113(序 列編號)。在BLAST提交項中包含用于搜索趨同的非變異氨基酸是C22、W36、I37、Q39、D89、 Y93、C95、WlOU G102、G104和T105。對IMGT編纂的人種系抗體序列數(shù)據(jù)庫進行BLAST搜 索。留下了重鏈(HC3)的一種形式。對所述表面殘基組顯示最佳匹配記分的AF062266(蛋 白質(zhì)_id = AAC18304. 1)和AY393082 (蛋白質(zhì)_id = AAS86018. 1)的兩個Vh結(jié)構(gòu)域顯示等 效的相似性記分并顯示相同的表面殘基。因此，僅留下含10個突變的該重鏈的單個序列。 未留下具有不同表面殘基的記分較低 的序列，因為它們具有暗示潛在降低的溶解性的較少 極性殘基。
表 1 對輕鏈提出三種形式(LC4、LC5和LC6)。通過可變鏈的再表面化而導(dǎo)入的各個突 變以小寫體標(biāo)注并且加下劃線，并且對CDR加下劃線。下文列出可變區(qū)的再表面化序列，不 包括恒定結(jié)構(gòu)域(IgG4)。LC4 DIVMTQsAlSVAVTPgESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSG SGSGTAFTLklSRYEAEDYGYYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 13)LC5 DIVMTQsAlSVAVTPgESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRlSNLASGVPDRFSG SGSGTAFTLklSRYEAEDYGYYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 14)LC6 DIVMTQsAISVAVTPeESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRlSsnLASGVPDRFS GSGSGTAFTLkISRVFAEDVGVYYCMOHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 15)
對重鏈提出一種形式(VH3) (VH是指可變重鏈)。通過可變鏈的再表面化而導(dǎo)入的突變以小寫體標(biāo)注并且加下劃線，并且對CDR加下劃線。不包括恒定結(jié)構(gòu)域序列。HC3 QVQLaESGPGLVAPSeSLSlTCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNpsLKSRLSI sKDNSkSQVFLKMNSLtaaDTAMYYCARIVYffGQGTLVTVSs(SEQ ID NO: 16)核苷酸序列由OE-PCR產(chǎn)生并克隆至附加型表達載體pXL4214 (Durocher等，NAR, 2002,30(2), E9)的Nhel/Hindlll位點內(nèi)。序列進行密碼子優(yōu)化以便在人細(xì)胞中表達。\ 與 IGKC 融合(AAH93097)。Vh 與缺少羧基末端 Lys 的 IGHG4 (IGHG4 Δ K)融合(ΑΑΗ25985)。 序列通過雙鏈測序法驗證。LC4 MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQ LLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 17)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGAGCGCCCTCAGCGTGGCCGTGACCCCCGGCGAGAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGA TCTACCGCATGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG AAGATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCC ACCAGGGCCT GTCCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 18)LC5 MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQ LLIYRLSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 19)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGAGCGCCCTCAGCGTGGCCGTGACCCCCGGCGAGAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGA TCTACCGCCTGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG AAGATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGT CCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTG TCCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 20)
LC6 MGWSCHLFLVATATGVHSDIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQL LIYRLSSLASGYPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 21)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGAGCGCCCTCAGCGTGGCCGTGACCCCCGGCGAGAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGA TCTACCGCCTGAGCAGCCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG AAGATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 22)HC3 MGWSCHLFLVATATGVHSQVQLQESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDYGYNWIRQPPGKGLEWLGV IW⑶GTTYYNPSLKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLTAADTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLG(SEQ ID NO 23)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAG GTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGGCCCCCAGCGAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTT CAGCCTGATCGACTACGGCGTGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGG GCGACGGCACCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCCTGAGCATCTCCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTG TTCCTGAAGATGAACAGCCTGACCGCCGCCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCATCGTGTACTGGGGCCAGGG CACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCT CCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGAC CGTGCCTTCCTCCTGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACA AGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTTCCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTC CTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTC CCAGGAGGACCCTGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGG AGGAGCAGTTCAATTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAA TACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAG GGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGA AGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAA CGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGGCT GAAGCTT(SEQ ID NO 24)實施例15 人源化對16D7的\和Vh序列進行blast并且可變輕鏈最接近的同源物是1MH5、1MJJ和IMJUCJ Mol Biol 332 :423-435，2003)，具有等效的相似性記分。IMJU因已經(jīng)測定下 至1.22人分辨率的高精度晶體結(jié)構(gòu)而留作模板。發(fā)現(xiàn)重鏈最接近的同源物是lFNS(Nat Struct Biol 7:881-884,2000)。IMJU和IFNS的結(jié)構(gòu)用來構(gòu)筑可變結(jié)構(gòu)域的同源性模型， 模型隨后用標(biāo)準(zhǔn)方法實現(xiàn)能量最小化。16D7的3D同源性模型的分子動力(MD)計算隨后在 廣義波恩內(nèi)隱溶劑(implicit solvent)中進行1. 7納秒(見GalIicchio和Levy，J Comput Chem 2004,25 :479_499)。MD始于在298. 15° K上對來自高斯分布的速率的初始化，隨后是300皮秒的平衡 時間。在 MD 期間，使用 SHAKE 算法(見 Barth.等，J CompChem, 1995，16 1192-1209)約束 全部鍵，時間步長是1飛秒(fs)并且基于Verlet積分算法的模擬在規(guī)范NVT(粒子數(shù)、體 積和溫度)系綜中在溫度298. 15° K上運行。隨后在產(chǎn)生時間期間儲存1，700次快照，每 隔1皮秒1次。鼠抗體的1，700個構(gòu)象構(gòu)成對其開展下列分析以鑒定最靈活殘基的系綜。 ^iffli MOE ^iiMllifil (Molecular Operating Environment (MOE), Chemical Computing Group, Quebec, Canada)中可獲得的科學(xué)向量語言(Scientific Vector Language, SVL)來 編碼下列分析。首先，將每個快照N最佳地迭加到其前期快照N-I上，以控制在MD建模及 計算期間出現(xiàn)的整體旋轉(zhuǎn)和平移運動。迭加通過使來自兩次快照中的全部相應(yīng)原子對之間 的均方根距離(RMSD)最小化而獲得。在迭加運用中僅考慮抗體主鏈的重原子。隨后使用 相同的迭加方法，將每次快照迭加到中心點(medoi'd)快照上。中心點快照是具有離全部 構(gòu)象的平均坐標(biāo)最近的Cartesian坐標(biāo)的抗體構(gòu)象。對于每一個抗體殘基i，計算了在構(gòu)象j與中心點參考構(gòu)象k的重原子之間的
RMSD0 RMSD具有下列式.
定義為在殘基j的重原子1與中心點參考構(gòu) 象k的其對應(yīng)物之間以埃(人)為單位表示的歐幾里德(Euclidean)距離。為了重原子1的 配對關(guān)聯(lián)，還考慮了側(cè)鏈重原子相對于氨基酸Asp，Leu, Val, Glu，Arg，Phe和Tyr的對稱。 每一個殘基彼此的參考構(gòu)象k均不同，并且對應(yīng)于中心點構(gòu)象k，其具有離所研究殘基i的 全部構(gòu)象的平均坐標(biāo)最接近的歐幾里德距離。隨后，對于每個殘基i，獲得1，700個RMSD值 的分布，該分布反映殘基i的坐標(biāo)在MD期間的變異。通過合計所研究抗體的全部殘基的全 部RMSD值，獲得全部RMSD的整體分布。全部RMSD的整體分布隨后用作參考分布。若殘基 i是高度靈活的，則開展統(tǒng)計檢驗以決定觀察到殘基i的平均RMSD(Hii)是否顯著地高于全 部殘基的整體平均RMSD(mg)。由于樣本眾多，例如1700個樣本用于克隆16D7的分析，故使 用具有無效假設(shè)Htl即“觀察到的Hii低于整體mg”的一尾Z-檢驗(見Dorofeev和Grant， “Statistics for real-life samplesurveys. Non-simple-random samples and weightedy._(m-mglobal)
data" 2006. CambridgeUniversity Press)以根據(jù)式
計算統(tǒng)計量 Zi,其中 Hii
是從殘基i的RMSD分布中計算的平均RMSD，mg是從整體RMSD分布中計算的平均RMSD，Sdi 是從殘基i的RMSD分布中計算的標(biāo)準(zhǔn)差并且η是樣本量，即對于16D7克隆的分析，η = 1，700。計算的Zi隨后與標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的累積概率比較，以估計備擇假設(shè)即“觀察到的Hii 高于整體mg”的99. 9%顯著性水平。這對應(yīng)于Zi ^ 3. 08?？梢砸曌黛`活性記分的Zi統(tǒng) 計量與抗體殘基的重原子的分子量或數(shù)目不相關(guān)(當(dāng)分析16D7抗CXCR5模型MD時，r2分 別是 0.014 和 0. 0009)。對于輕鏈靈活殘基組包括以下殘基(序列編號)D1、T14、P15、R16、E17、Q47、D65、 S72、R79、R82、E86、K108、E110 和 K112 ；并且對于重鏈包括以下殘基Q1、V2、Q3、Lll、S15、 Q16、S61、A62、K64、S65、R70、D72、Q75、K81、M82、N83、Q86、Q103、S110、A111、A112 和 K113。 比較16D7的靈活部分與ImMunoGeneTics Database網(wǎng)站2005年9月版中的人抗體序列的
相應(yīng)位置。表現(xiàn)出明顯高的靈活性記分的那些殘基以及維持靈活殘基的3D結(jié)構(gòu)的少量側(cè)翼 殘基因搜索而保留。選擇含相同靈活殘基最多的人抗體可變區(qū)，特別考慮位于⑶R的5.0人范圍內(nèi)的 位置，以便替換鼠16D7抗體可變區(qū)的靈活殘基。將產(chǎn)生的人源化序列就序列相似性而在 UniProtKB/SwissProt數(shù)據(jù)庫中blast，得出了已經(jīng)作出合理假設(shè)的置信度。全部序列都顯 示出與眾多人抗體的高度相似性。此外，序列均不含有IEDB中所列的任何已知B細(xì)胞或T 細(xì)胞表位。IEDB中的最佳序列匹配對于輕鏈(LCI、LC2和LC3)是 KPGQPPRLLIYDASNRATGIPA (SEQ ID NO 25)，其覆蓋CDR2，但是具有顯著的殘基差異，如通過 從IEDB數(shù)據(jù)庫內(nèi)的BLAST搜索中獲得的56%序列同一性所代表。IEDB中的最佳匹配對于重鏈(HCl和HC2)是位于⑶R3的起點之前的 TDDTAMYYCARI (SEQ ID NO :26)，該序列顯示與肽 SEDSALYYCARD (SEQ ID NO 27)的 61%序 列同一性，這使它不可能是潛在的人T細(xì)胞表位(J Exp Med(1995) 181，1540)。鼠16D7可變結(jié)構(gòu)域的原初序列是輕鏈(對⑶R加下劃線)DIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSG SGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 28)；禾口重鏈(對⑶R加下劃線)QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNSALKSRLSI RKDNSQSQYFLKMNSLQTDDTAMYYCARIYYffGQGTLYTYSA(SEQ ID NO 29)對重鏈提出兩種形式(HCl和HC2)并且對輕鏈提出三種形式(LCI、LC2和LC3)。 重鏈的兩種形式分別從AF262096/AAF79987和AB063657/BAC01285. 1中衍生。這兩個序 列顯示等效的相似性記分，但因為待突變的殘基組似乎是相對不同的并且表現(xiàn)不同的物 理_化學(xué)性質(zhì)而得以保留。LCl序列從BAC01682/AB064054. 1中衍生并且僅存在兩個待突 變的殘基。LC2和LC3是LCl的變體，據(jù)稱所述變體解決了輕鏈中可能有問題的殘基突變 成Leu(形式3和4)的暴露甲硫氨酸(M51)和1個潛在脫酰胺位點(形式4)，其中天冬酰胺N53改變成絲氨酸殘基。并沒有留下全部組合，但是四個組合覆蓋了最多的待解決關(guān)鍵 點。使用Kabat編號。表2 通過可變鏈的人源化而導(dǎo)入的突變是小寫體并且加下劃線并且對⑶R加下劃線。 不包括恒定結(jié)構(gòu)域。LCl DIVMTQAAPSVAVTPRaSVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSG SGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 30)LC2 DIVMTQAAPSVAVTPRaSVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRlSNLASGVPDRFSG SGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 31)LC3 DIVMTQAAPSVAVTPRaSVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRlSsLASGVPDRFSG SGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 32)HCl QVQLKESGPGLVAPSeSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNpsLKSRLSI sKDNSkSQVFLKvtSLtTDDTAMYYCARIVYffGQGTLVTVSA(SEQ ID NO 33)HC2 eVQLKESGPGLVAPRRSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNapLKRRLSI sKDNSkSQVFLqMNSLkTDDTAMYYCARIVYffGQGTLVTVSs(SEQ ID NO 34)嵌合構(gòu)建體的序列如下嵌合LC序列MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQ LLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 35)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGGCCGCCCCCAGCGTGGCCGTGACCCCCCGCGAGAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGA TCTACCGCATGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG CGCATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 36)嵌合HC序列 MGffSCIILFLVATATGVHSQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEffLG VIWGDGTTYYNSALKSRLSIRKDNSQSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFPEVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLG(SEQ ID NO 37)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAG GTGCAGCTGAAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTT CAGCCTGATCGACTACGGCGTGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGG GCGACGGCACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGCCTGAGCATCCGCAAGGACAACAGCCAGAGCCAGGTG TTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCATCGTGTACTGGGGCCAGGG CACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCT CCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGAC CGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACA AGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTTCCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTC CTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTC CCAGGAGGACCCTGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGG AGGAGCAGTTCAATTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAA TACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAG GGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGA AGCGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCT CCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAA CGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGGCT GAAGCTT(SEQ ID NO 38)人源化VL序列LCl MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQ LLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 39)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGGCCGCCCCCAGCGTGGCCGTGACCCCCGGCGCCAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCGCATGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG CGCATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 40) LC2 MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQ LLIYRLSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 41)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGGCCGCCCCCAGCGTGGCCGTGACCCCCCGCGCCAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGA TCTACCGCCTGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG CGCATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 42)LC3 MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQ LLIYRLSSLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 43)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAC ATCGTGATGACCCAGGCCGCCCCCAGCGTGGCCGTGACCCCCGGCGCCAGCGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCAA GAGCCTGCTGCACAGCAGCGGCAAGACCTACCTGTACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGA TCTACCGCCTGAGCAGCCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTG CGCATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGG CGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGC TGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAGCTT(SEQ ID NO 44)人源化VH序列HCl
MGffSCIILFLVATATGVHSQVQLKESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEffLG VIWGDGTTYYNPSLKSRLSISKDNSKSQVFLKVTSLTTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO 45)GCTAGCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAG GTGCAGCTGAAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGGCCCCCAGCGAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTT CAGCCTGATCGACTACGGCGTGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGG GCGACGGCACCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCCTGAGCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTG TTCCTGAAGGTGACCAGCCTGACCACCGACGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCATCGTGTACTGGGGCCAGGG CACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCT CCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGAC CGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACA AGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTTCCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTC CTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTC CCAGGAGGACCCTGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGG AGGAGCAGTTCAATTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAA TACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAG GGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGA AGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCT CCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAA CGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTCTCTCTGGGCT GAAGCTT(SEQ ID NO 46)HC2 MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGV IffGDGTTYYNAPLKGRLSISKDNSKSQVFLQMNSLKTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSR STSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLG(SEQ IDNO :47)GCTAGCACCATGGGCTTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGA GGTGCAGCTGAAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGGCCCCCGGCGGCAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCT TCAGCCTGATCGACTACGGCGTGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGG GGCGACGGCACCACCTACTACAACGCCCCCCTGAAGGGCCGCCTGAGCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGT GTTCCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGACGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCATCGTGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACC TCCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGG CGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGA CCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGAC AAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTTCCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTT CCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGT CCCAGGAGGACCCTGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGG GAGGAGCAGTTCAATTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGA ATACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTA GGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTG AAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCC TCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGG AGGGC AACGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGG CTGAAGCTT(SEQ ID NO 48)實施例16 基于分子動力軌跡的人源化16D7 的 Vl 和 Vh 序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB) (Berman 等，Nucleic AcidsResearch, 2000,28 =235-242)中進行blast并且可變輕鏈最接近的同源物是1MH5、IMJJ和IMJU (J Mol Biol 332 =423-435, 2003)，具有等效的相似性記分。IMJU因已經(jīng)測定上至1.22人分辨率 的高精度晶體結(jié)構(gòu)而留作模板。經(jīng)發(fā)現(xiàn)重鏈最接近的同源物是IFNS(Nat Struct Biol 7 881-884，2000)。IMJU和IFNS的結(jié)構(gòu)用來構(gòu)筑可變結(jié)構(gòu)域的同源性模型，該模型隨后使用 標(biāo)準(zhǔn)方法實現(xiàn)能量最小化。16D7的3D同源性模型的分子動力(MD)模擬隨后在廣義波恩內(nèi)隱溶劑中進行1. 1 納秒(ns)(見 Gallicchio 和 Levy，J Comput Chem 2004，25 :479_499)。MD 模擬始于在 500K上對來自高斯分布的速率的初始化，隨后是200皮秒(ps)的平衡時間。在MD模擬期 間，使用 SHAKE 算法(見 Barth.等，J Comp Chem，1995，16 =1192-1209)約束全部鍵，時間 步長是1飛秒(fs)，并且基于Verlet積分算法，模擬在規(guī)范NVT (粒子數(shù)、體積和溫度)系 綜中在溫度500K上運行。該模擬以施加至主鏈原子的諧波約束(harmonic constraint) 進行。在這個首次模擬的最后1納秒期間提取了 10個不同構(gòu)象，每100皮秒1個。這10個不同構(gòu)象隨后用作10個不同起點以便在300K溫度上在廣義波恩內(nèi)隱 溶劑中運行10個分子動力模擬持續(xù)2. 3納秒，同時不對主鏈約束。每個MD模擬始于在 298. 15K對來自高斯分布的速率的初始化，隨后是300皮秒的平衡時間。使用SHAKE算法 (見Barth.等，J Comp Chem，1995，16 :1192_1209)約束全部鍵，時間步長是1飛秒，并且 基于Verlet積分算法，模擬在規(guī)范NVT(粒子數(shù)、體積和溫度)系綜中在溫度298. 15K上 運行。隨后在產(chǎn)生時間期間儲存2，000次快照，每1皮秒1次。使用在MOE分子建模環(huán)境 (Molecular Operating Environment (MOE)，ChemicalComputing Group, Quebec，Canada) 中可獲得的科學(xué)向量語言(SVL)來編碼下列的后處理方法。首先，將每個快照N最佳地迭加到其前期快照N-I上以拋棄在MD建模及計算期間 出現(xiàn)的整體旋轉(zhuǎn)和平移運動。迭加通過使來自兩次快照中全部成對相應(yīng)的原子間的均方 根距離(RMSD)最小化而獲得。在迭加操作中僅考慮抗體主鏈的重原子。隨后使用相同的迭加方法，將每次快照迭加到中心點快照上。中心點快照是具有離全部構(gòu)象的平均坐標(biāo)最 近的Cartesian坐標(biāo)的抗體構(gòu)象。對于10個MD模擬中的每一個，最后2，000個構(gòu)象用來 定量鼠抗體的每個氨基酸在該氨基酸的中心點構(gòu)象方面的原子位置的偏離。對于每一個抗 體殘基i，計算了在構(gòu)象j與中心點參考構(gòu)象k的重原子之間的RMSD。RMSD具有下列式
,dlk定義為在殘基j的重原子1與中心點參考構(gòu)象k的其對應(yīng)物之間以 rmsdH1^T，
埃(人)為單位表示的歐幾里德距離。對于重原子1的配對關(guān)聯(lián)，還考慮側(cè)鏈重原子相對于氨 基酸ASp、Leu、Val、Glu、Arg、Phe和Tyr的對稱。每一個殘基彼此的參考構(gòu)象k均不同，并 且對應(yīng)于中心點構(gòu)象k，其具有離所研究殘基i的全部構(gòu)象的平均坐標(biāo)最接近的歐幾里德距離。人源化突變通過確定哪個人抗體種系就其最靈活氨基酸來說與鼠抗體最相似而 找到。為做到這一點，將鼠抗體的60個最靈活氨基酸的運動在分子動力模擬的20納秒 (10X2納秒)期間與49個人抗體種系同源性模型的相應(yīng)氨基酸的運動比較，其中已經(jīng)使 用相同方法對每一個所述人抗體種系同源性模型進行10個分子動力模擬。通過系統(tǒng)地組 合7種最常見的人輕鏈(νκ 1、ν κ 2、ν κ 3、ν κ 4、ν λ 1、ν λ 2、ν λ 3)和7種最常見的重鏈 (vhla、vhlb、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)，產(chǎn)生 49 個 3D 人抗體種系同源性模型(NucleicAcids Research, 2005，第 33 卷，數(shù)據(jù)庫輯 D593-D597)。所述60個最靈活氨基酸不包括⑶R中的任何氨基酸及其直接近鄰區(qū)，即具有α 碳的氨基酸，其中所述的α碳與如在3D同源性模型中所見的CDR氨基酸的任何α碳距離 小于5 Α。通過比較給定氨基酸(i)在10個分子動力模擬上平均的就其如前文所定義的 中心點構(gòu)象的RMSD(Fi)與在10個相同分子動力模擬上平均的鼠抗體的全部氨基酸的 RMSD(Fm)而對靈活性定量。若靈活性記分Zi (定義為Zi = (Fi-Fm)/Fm)在0. 15以上，則 認(rèn)為某氨基酸是足夠靈活的，以至于潛在地與T-細(xì)胞受體相互作用并觸發(fā)免疫應(yīng)答。使用這種分子動力平均靈活性估計方法，已認(rèn)為23個氨基酸在鼠16D7抗體的可 變區(qū)(不包括CDR區(qū)及其直接近鄰區(qū))中是靈活的。靈活殘基組對于輕鏈包括以下殘基(序列編號)R16、E17、R44、G46、Q47、S48、 R79、R82、E84、E86 和 EllO ；并且對于重鏈則包括以下殘基K5、P41、G42、K43、K64、R70、D72、 N73、S74、Q75、Q86 和 Q103。定量鼠抗體對49個人種系同源性模型的四維相似性通過對這60個靈活氨基酸的 具體原子的位置采樣，使用10個分子動力模擬的全部皮秒快照，借助獨特的三維立體網(wǎng)格 進行定量。該網(wǎng)格具有1人分辨率。該三維網(wǎng)格由445740點組成并且已經(jīng)使用基于抗體 的人抗體結(jié)晶學(xué)模型8FAB (Biochem 30 =3739-3748,1991)的三維結(jié)構(gòu)而進行初始化。8FAB 模型也用來定位在所述三維網(wǎng)格中采樣的抗體的全部皮秒快照構(gòu)象。為此目的，將抗體的 分子動力的中心點構(gòu)象迭加到8FAB模型上。這種迭加由比對2個模型的慣性瞬間(moment of inertia)、接著是最小化在2個模型的α碳之間的標(biāo)量距離而構(gòu)成。該分子動力模擬 的全部其余構(gòu)象使用相同方法迭加到中心點構(gòu)象上。進行了兩種類型的采樣，其對于正進行比較的一對抗體產(chǎn)生兩種相似性(靜電相似性和親脂相似性)。這兩種相似性隨后相加以獲得總相似性。靜電采樣考慮到氨基酸側(cè) 鏈的全部原子。在網(wǎng)格的一個點上的值X通過應(yīng)用如在Amber99力場(Ci印Iak等；J. Comp. Chem. 2001,22 1048-1057)中所述的以原子部分電荷加權(quán)的三維高斯函數(shù)f (χ)而獲得。使
用下式在3個Cartesian坐標(biāo)軸上應(yīng)用該f(x)函數(shù)
X和U分別是網(wǎng)格點和被采樣的氨基酸原子的Cartesian坐標(biāo)，并且s = r/1. 6 (r =所述原 子的共價半徑)。對氨基酸的全部構(gòu)象重復(fù)采樣并且將獲得的結(jié)果在三維網(wǎng)格的全部點上 平均。親脂性采樣僅考慮氨基酸側(cè)鏈的親脂原子。在該網(wǎng)格的一個點中的值以非加權(quán)的相 同高斯函數(shù)f (χ)進行計算。因此，由相同的三維網(wǎng)格對來自正進行比較的兩種抗體的分子 動力模擬的兩個皮秒快照構(gòu)象系綜采樣?？贵wa與抗體b之間的靜電相似性(sim-elec)
可以用下式計算
親脂相似性以應(yīng)用于由前述親脂采
樣產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的相同式進行計算。人種系模型ν λ 2-vh4表現(xiàn)了相對于鼠抗體16D7的60個最靈活氨基酸的60個最 靈活氨基酸的最高四維相似性(總相似性=50% )。因此已經(jīng)使用人種系模型νλ 2-vh4來 替換鼠抗體16D7靈活殘基。兩種序列的氨基酸預(yù)先根據(jù)相應(yīng)3D同源性模型的α碳的最 佳迭加進行比對。使用BLAST搜索法對產(chǎn)生的人源化序列搜索不想要的基序，如上文第41 段中前述。此外，如上文第44段中所述，使用IEDB數(shù)據(jù)庫對產(chǎn)生的人源化序列搜索已知的 B細(xì)胞或T細(xì)胞表位。IEDB 中的最佳序列匹配對于輕鏈(LC7)是 PGKAPQLLIYRMSNL(SEQ ID NO 52), 其覆蓋CDR2。該序列顯示與肽PGKAPKLLIYAASSL (SEQ ID NO 53)的73 %序列同一 性，其中所述的肽顯示對HLA-DRBl 0404 *的結(jié)合作用，但是未證實在人中有免疫原性 (JImmunol(1995) 155，5655)。IEDB 中的最佳匹配對于重鏈(HC4 和 HC5)是 SLIDYGVNWIRQPPG (SEQ ID NO 54)， 其中該序列覆蓋CDR1，但是具有顯著的殘基差異，如從IEDB數(shù)據(jù)庫內(nèi)的BLAST搜索中獲得 的40%序列同一性所代表。對重鏈獲得了兩種形式(HC4和HC5)并且對輕鏈獲得了一種形式(LC7)。重鏈的 兩種形式從人種系模型ν λ 2-vh4中衍生。HC5是HC4的變體，具有旨在解決潛在有問題的 殘基的額外突變1個潛在脫酰胺位點，其中天冬酰胺N60改變成脯氨酸殘基。通過可變鏈的人源化而導(dǎo)入的突變是小寫體并且加下劃線，并且對⑶R加下劃 線。不包括恒定結(jié)構(gòu)域。LC7 DIVMTQAAPSVAVTPRqSVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQhPGkaPQLLIYRMSNLASGVPDRFSG SGSGTAFT111SRVqAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 55)HC4 QVQLflESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNSALKSRLSI sKDtSkSQVFLKMNSLtTDDTAMYYCARIVYffGQGTLVTVSAAK(SEQ ID NO 56)
HC5 QVQLqESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYpSALKSRLSI sKDtSkSQVFLKMNSLtTDDTAMYYCARIVYffGQGTLVTVSAAK(SEQ ID NO 57) 實施例17 藥物動力學(xué)本研究用合適數(shù)目的動物實施(例如，在一項研究中用4只；2只用于單次劑 量并且2只用于重復(fù)劑量，每周5個劑量)，動物是健康、定向育種的雄性短尾猴，體重 2. 0-5. 4kg并且年齡2-7歲?？梢詫游锓峙渲羶蓚€處理組，一個處理組接受對照IgG4抗體并且一個處理組接受人源化16D7。對每組中的猴施用單個靜脈內(nèi)大丸劑劑量，例如在劑 量體積2-3mL/kg中的2. 5-10mg/kg或靜脈內(nèi)5個周劑量。血液樣品在每一劑量施用后的 多個時間點上收集并且加工成血漿。使用ELISA對血漿樣品分析總IgG4及CXCR5mAb的濃度。實施例18 比較性研究某些本發(fā)明抗體與市售抗體在并列實驗中進行比較。可從R&DSystems獲得的 MAB190是小鼠mAb。RF82B是可從BD獲得的大鼠抗人CXCR5。克隆2C1是可從Abnova獲 得的帶GST標(biāo)簽的小鼠mAb。本文中所述的多種人源化抗體使用本領(lǐng)域已知的試劑和方法 進行同種分型。例如，本文中教授的那些具有κ輕鏈，眾多是IgGl，而46C9、68D3和H28是 IgG2a。大部分的抗體與CXCR5的氨基末端結(jié)合并且?guī)追N抗體相互競爭與相同表位或區(qū)域 的結(jié)合。BD抗體與人PBMC結(jié)合不良。盡管抗體通常不與短尾猴細(xì)胞結(jié)合，然而本發(fā)明的14C9、19H5、H28、54G6、56H6和 79B7與短尾猴細(xì)胞結(jié)合。發(fā)現(xiàn)16D7具有更高的親和力，至少10倍高于商業(yè)抗體，并且具有優(yōu)于其它抗體 100倍的解離速率(off rate)。實施例19:放大每種單克隆抗體變體在懸浮培養(yǎng)的HEK293FS 細(xì)胞中通過瞬時轉(zhuǎn)染編碼與 293fectin (Invitrogen)復(fù)合的重鏈或輕鏈的兩個表達質(zhì)粒而產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)染后八日收 獲并離心分泌的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通過在蛋白A(Prc)S印vA，Millipore)上的親和層析在用 25mM檸檬酸鹽pH 3，0. 15MNaCl緩沖液從柱中洗脫后得到純化。單克隆抗體配制在PBS 中并且經(jīng)0.22μπι過濾。蛋白質(zhì)濃度通過測量在280nm的吸光度而測定。每一批次由 SDS-PAGE(Nupage Bistris/MES-SDS 10% )，在還原和非還原條件下分析以確定每種亞基 以及單體的純度和分子量。每個蛋白質(zhì)批量也由凝膠過濾法(Tricorn 10/300GL Superdex 200)分析以確定單體的均一性和高分子量種類的存在。從240mL培養(yǎng)物中，可獲得總計30_40mg的8種16D7變異單克隆抗體并且具有適 合用于后繼體外和體內(nèi)實驗的品質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不超過常規(guī)的實驗將認(rèn)出或能夠確認(rèn)本文中所述的本發(fā)明 具體實施方案的眾多等效物。此類等效物意圖包括在下列權(quán)利要求內(nèi)。
權(quán)利要求
分離的與人CXCR5胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的人多肽或人源化多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其含有抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其還含有恒定區(qū)。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其含有CHpCH2、CH3或它們的組合。
5.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中恒定區(qū)是源自IgG抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中IgG抗體是IgG4抗體。
7.編碼如權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
8.含有如權(quán)利要求7所述的核酸的載體。
9.含有如權(quán)利要求8所述的載體的細(xì)胞。
10.含有如權(quán)利要求1所述的多肽的抗體或抗體片段。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體或抗體片段，其還含有可變的輕鏈。
12.如權(quán)利要求10所述的抗體或抗體片段，其還含有重鏈的可變區(qū)。
13.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中該多肽含有單鏈Fv。
14.為具有包含CXCR5陽性細(xì)胞的障礙的患者進行治療的方法，其包括給所述患者施 用與CXCR5結(jié)合的CXCR5拮抗劑。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述拮抗劑含有如權(quán)利要求1所述的多肽。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述CXCR5陽性細(xì)胞是B細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述障礙是關(guān)節(jié)炎。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述CXCR5陽性細(xì)胞被CXCL13激活。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述CXCR5陽性細(xì)胞是T細(xì)胞。
20.制備如權(quán)利要求1所述的多肽的方法，其包括(a)鑒定與非人CXCR5抗體的可變區(qū)同源的人的可變區(qū)；(b)從所述非人CXCR5抗體可變區(qū)的分子構(gòu)象鑒定柔性的氨基酸以及位于所述柔性殘 基側(cè)翼并保持所述可變區(qū)分子構(gòu)象的氨基酸；(c)在所述人的可變區(qū)鑒定出與所述步驟(b)鑒定出的氨基酸同源的氨基酸；(d)用所述步驟(c)鑒定出的氨基酸替換所述步驟(b)鑒定出的氨基酸，以產(chǎn)生人源化 可變區(qū)；以及(e)將步驟(d)所述的人源化可變區(qū)與人序列連接，以產(chǎn)生與CXCR5特異結(jié)合的人源化多肽。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述步驟(b)包括分子動態(tài)建模。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述步驟(d)包括不替換離互補決定區(qū)5人以上的氨基酸。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其通過將所述人源化可變區(qū)序列與一組人抗體序列的 序列相比較，進一步證實步驟(d)所述的人源化可變區(qū)與人抗體相似。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其通過將所述人源化可變區(qū)軌跡與一組人抗體軌跡的 序列相比較，進一步證實步驟(d)所述的人源化可變區(qū)與人抗體相似。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中步驟(d)所述的人源化可變區(qū)不包含B細(xì)胞表位 或T細(xì)胞表位。
全文摘要
本發(fā)明涉及與CXCR5特異性結(jié)合并能例如抑制CXCR5功能的人源化抗體。本發(fā)明還包括該抗體治療或預(yù)防與CXCR5相關(guān)的疾病或障礙的用途。
文檔編號A61K39/395GK101842115SQ200880113572
公開日2010年9月22日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日
發(fā)明者B·卡莫隆, E·阿蘭, N·魯特施, N·鮑里恩, R·李, T·奧利吉諾, V·米克爾 申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司