專利名稱：心血管疾病的診斷和治療方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的預(yù)防、治療和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化是造成大的和中等大小動(dòng)脈的最內(nèi)層(內(nèi)膜)增厚的慢性疾病。其 減少血流并造成受累血管供應(yīng)的器官中的缺血和組織破壞。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病包 括心肌梗塞、中風(fēng)和外周動(dòng)脈疾病的主要原因。其是西方世界中死亡的主要原因并預(yù)測成 為二十年內(nèi)整個(gè)世界的死亡的主導(dǎo)原因。該疾病由脂蛋白(主要是低密度脂蛋白(LDL))在血管的細(xì)胞外基質(zhì)中的積累而 起始的。這些LDL顆粒聚集并進(jìn)行氧化修飾。氧化的LDL是促炎癥性的、有毒的并造成血 管損傷。動(dòng)脈粥樣硬化在許多方面代表對(duì)這樣的損傷(包括炎癥和纖維變性)的反應(yīng)。1989年P(guān)alinski W等人鑒定了人類中針對(duì)氧化的LDL的循環(huán)的自身抗體(Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc Natl Acad Sci USA.1989,86 1372-6)。這個(gè)觀察提示動(dòng)脈粥樣硬化可能是由針對(duì)氧化的脂蛋白的免疫反應(yīng)造成的自身 免疫疾病。此時(shí)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室開始尋找針對(duì)氧化的LDL的抗體滴度和心血管疾病之間的聯(lián)系。 但是，從這些研究中浮現(xiàn)的圖畫遠(yuǎn)不清楚。存在針對(duì)氧化的LDL中的大量不同的抗原決定 簇的抗體，但是，這些抗原決定簇的結(jié)構(gòu)是未知的。因此術(shù)語“氧化的LDL抗體”是指不同 特異性的抗體的混合物，而不是單一特異性的抗體。已經(jīng)眾所周知在動(dòng)脈粥樣硬化損傷中存在進(jìn)行性炎癥，特征為免疫活性細(xì)胞的 激活和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。已確定的風(fēng)險(xiǎn)因素像高血壓、血脂、糖尿病和吸煙有可能 促進(jìn)這種炎性反應(yīng)，但是其發(fā)生的機(jī)制未被很好地鑒定并且存在不同的非相互排斥的 可能性。已經(jīng)提出幾個(gè)不同的可以引發(fā)這種免疫反應(yīng)性的自身抗原，包括氧化的低密度 月旨蛋白(oxLDL)和熱激蛋白(HSP) (Binder CJ 等人 Innate and acquiredimmunity in atheroRenesis. Nat Med. 2002,8 1218-26 ；Frostegard J. Autoimmunity, oxidized LDL and cardiovascular disease. Autoimmun Rev. 2002,1 233~7) 胃以白勺 云力J0C 樣硬化中免疫反應(yīng)的作用的數(shù)據(jù)指示了復(fù)雜的關(guān)系。其中一個(gè)例子是影響動(dòng)脈粥樣硬化 行成的動(dòng)物模型中的免疫接種。當(dāng)使用HSP時(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化增加，但當(dāng)抗原是oxLDL時(shí)， 動(dòng)脈粥樣硬化減少(Palinski W 等人 Immunization of lowdensity Iipoprotein(LDL) receptor-deficient rabbits with homologousmalondialdehyde-modified LDL reduces atherogenesis. Proc Natl Acad SciUSA. 1995,92 821~5 :Xu Q^A Induction of art eriosclerosisinnormocholesteroIemic rabbits by immunization with heat shock protein 65. Arterioscler Thromb. 1992,12 :789_99)。人類疾病中針對(duì)oxLDL的抗體(抗-OxLDL)的作用似乎是復(fù)雜的。在人類中，以前已經(jīng)證明抗-OxLDL在健康對(duì)照中比在具有臨界性高血壓的人中要高，臨界性高血壓是早期心血管疾病的例子(Wu R等人Autoantibodies to OxLDL are decreased in individuals with borderlinehypertension. Hypertension 1999，33 :53_59)。在另一方面，幾個(gè)作者已經(jīng)報(bào)道了抗-OxLDL在人類心血管疾病(CVD)中特別是在
(Bergmark C等人Patients with early-onsetperipheral vascular disease have increased levels of autoantibodies againstoxidized LDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995,15 441~5 ；Salonen JT 等人 Autoantibody against oxidised LDL and progression of carotidatherosclerosis. Lancet 1992，339 :883_887)。一個(gè)例子是系統(tǒng) 性紅斑狼瘡(SLE)，一種與非常高風(fēng)險(xiǎn)的CVD關(guān)聯(lián)的自身免疫疾病。具有CVD史的SLE患 者有明顯增高的抗-OxLDL 水平(Svenungsson E 等人 Riskfactors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation 2001,104:1887-93)。這些某 些程度上矛盾的結(jié)果可能是由于不同的方法和LDL氧化的階段，從而產(chǎn)生抗原性的差異。 還有可能的是疾病階段和風(fēng)險(xiǎn)因素圖譜與抗體水平有關(guān)。氧化的低密度脂蛋白(OXLDL)本身具有許多促炎癥反應(yīng)的性質(zhì)，包括T細(xì) 胞1、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活(Berliner JA等人Minimally modified low density lipoprotein stimulates monocyteendotheIial interactions. J Clin Invest. 1990,85 1260-6 ；Frostegard J 等 人 Oxidized low density lipoprotein induces differentiation and adhesion ofhuman monocytes and the monocytic cell line U937. Proc Natl Acad SciUSA. 1990,87 904~8 :Frostegard J 等人 Biologically modified LDLincreases the adhesive properties of endothelial cells. Atherosclerosis. 1991,90 :119-26)。但是應(yīng)該注意的是，oxLDL還可以改善急性炎性反應(yīng)，反而促進(jìn)更低級(jí)別的慢性炎 癥(如動(dòng)脈粥樣硬化中所見到的)。有趣的是注意到oxLDL的許多生物作用是由oxLDL中 血小板激活因子(PAF)樣脂質(zhì)引起的(Frostegard J等人Platelet-activating factor and oxidized LDLinduce immune activation by a common mechanism. Arterioscler ThrombVasc Biol. 1997,17 :963_8 ；Heery JM 等人 Oxidatively modified LDLcontains phospholipids with platelet-activating factor-like activity andstimulates the growth of smooth muscle cells. J Clin Invest. 1995,96 2322~30 ；Subbanagounder G ^ A Evidence that phospholipid oxidationproducts and/or platelet-activating factor play an important role in earlyatherogenesis :in vitro and in vivo inhibition by WEB 2086. Circ Res.1999,85 311~8)。血小板激活因子(PAF)是各種細(xì)胞包括單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成的磷脂炎性調(diào) 節(jié)子。在LDL氧化的過程中，產(chǎn)生PAF-樣脂質(zhì)。因此PAF可能在病理過程中、在血管壁樣動(dòng) 脈粥樣硬化和高血壓有重要意義。在先前的報(bào)道中，描述了具有磷脂抗體綜合癥的個(gè)體中 PAF 抗體的存在(Barquinero J 等人 Antibodies against platelet-activating factor inpatients with antiphospholipid antibodies. Lupus 1994，3 :55_58)。Tektonidou MG 等入(Clinical importance of antibodies againstplatelet activating factor in antiphospholipid syndrome manifestations.EurJ Clin Invest. 2000，30 :646_52)報(bào)道抗PAF抗體在APS和SLE中是常見的并且包含血栓發(fā)生發(fā) 展的獨(dú)立因子。
WO 00/02046描述了升高的PAF抗體濃度與臨界性高血壓和代謝綜合癥即早期心 血管疾病相關(guān)。已經(jīng)顯示升高的PAF抗體濃度與發(fā)生早期動(dòng)脈粥樣硬化的增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān) 聯(lián)。Wu 等 人(Antibodies to platelet-activating factor are associated withborderline hypertension, early atherosclerosis and the metabolic syndrome. T Intern Med. 1999 246 389-397)進(jìn)一步提出抗PAF抗體可能反映早期血管變化，因此作 為疾病的新型標(biāo)記，并且其可能還是致病性的(通過在血管壁中引發(fā)炎性反應(yīng))。WO 2005/100405描述了確定針對(duì)磷酰膽堿(PC)(其與發(fā)生缺血性心血管疾病的 升高的或降低的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān))的抗體(例如IgM或IgG抗體)存在或不存在的方法，并進(jìn)一 步提出PC-偶聯(lián)物或針對(duì)PC-偶聯(lián)物的抗體在治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供了至少一個(gè)PAF衍生物、一個(gè)PAF偶聯(lián)物或?qū)AF偶聯(lián)物 具有反應(yīng)性的抗體制備物(例如單克隆抗體)在制備用于免疫接種和預(yù)防、防止或治療哺 乳動(dòng)物(包括人類)抵抗心血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病)的藥物 中的用途。該藥物旨在提供具有抵抗心血管疾病的免疫原性或治療性性質(zhì)的免疫接種。本發(fā)明的第二方面提供了免疫接種和治療哺乳動(dòng)物(包括人類)抵抗心血管疾病 (如動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病)的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用包含 至少一個(gè)PAF衍生物、一個(gè)PAF偶聯(lián)物或?qū)AF偶聯(lián)物具有反應(yīng)性的抗體制備物(例如單 克隆抗體)的藥物組合物的步驟。所述藥物組合物旨在提供具有抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的免疫 原性或治療性性質(zhì)的免疫接種。本發(fā)明的第三方面提供如了本發(fā)明的以上方面所定義的一個(gè)或多個(gè)PAF衍生物 和PAF偶聯(lián)物在制備用于心血管疾病的防止、預(yù)防和/或治療的免疫治療或治療的藥物組 合物(可選地與佐劑組合)中的用途。本發(fā)明的第四方面提供了預(yù)防或治療性處理哺乳動(dòng)物(可以是人)的方法，所述 哺乳動(dòng)物患有動(dòng)脈粥樣硬化或面臨發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，其中施用治療上有效量的至少 一個(gè)PAF衍生物、一個(gè)PAF偶聯(lián)物或?qū)AF偶聯(lián)物具有反應(yīng)性的抗體制備物(例如單克隆 抗體)。本發(fā)明的第五方面提供了使用PAF偶聯(lián)物診斷與發(fā)生心血管疾病的增加的或減 少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的抗體(例如IgM、IgG或IgA抗體)存在或不存在的方法。本發(fā)明的第六方面提供了 PAF偶聯(lián)物在評(píng)估患者發(fā)生或發(fā)展心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn) 的方法中的用途，其中評(píng)估了病人的對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體(例如IgM、IgG或IgA 抗體)的水平。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)低水平的與PAF偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體與發(fā)生心血管疾病的增加 的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這與現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的相反，現(xiàn)有技術(shù)中提示高水平的PAF抗體與發(fā)生心血管 疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本發(fā)明涉及包含PAF衍生物、PAF偶聯(lián)物或?qū)AF偶聯(lián)物具有反應(yīng)性的抗體制備物(例如單克隆抗體)的藥物組合物，以及這些組合物在治療、預(yù)防或防止心血管疾病(如 動(dòng)脈粥樣硬化)中的用途，例如在治療、防止或減少動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)一步發(fā)展中的用途。 此外，本發(fā)明還涉及PAF衍生物、PAF偶聯(lián)物或所述抗體制備物(例如單克隆抗體)在制備 藥物組合物(可選具有佐劑)中的用途。此外本發(fā)明涉及診斷與發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的抗體(例 如IgM、IgG或IgA抗體)不存在或存在和/或水平。PAF的意思是根據(jù)以下通式的1-0-烷基-2-乙?；?sn-甘油_3_磷酸膽堿。 優(yōu)選地，烷基基團(tuán)是十六烷(十六烷基)基團(tuán)或油烯基(十八烷基)基團(tuán)。PAF偶聯(lián)物的意思是與載體連接的PAF部分(moiety)，優(yōu)選通過間隔子(spacer) 連接?？梢詫AF部分共價(jià)或非共價(jià)地連接至載體。PAF部分可以是PAF的衍生物。優(yōu)選 地通過烷基基團(tuán)將PAF部分連接至載體。PAF衍生物的例子是根據(jù)以下通式的化合物 其中Rl是C2至C25的亞烷基、亞烯基或亞炔基連接基團(tuán)，R2至R5獨(dú)立地選自C1 至 C6 烷基，如 WO 87/05904 和 US 5，061，626 中所述；根據(jù)下面通式的化合物 其中Rl是C2至C18烷基，優(yōu)選為十五烷基，R2是H、甲基、乙基、丙基或異丙基；R3 是甲基、乙基、丙基或異丙基，如Karasawa K等人J Biochem(Tokyo) 1991，110 :683_687所 述；根據(jù)下面通式的化合物 其中Rl是C6至C18烷基，優(yōu)選為己基或十二烷基，如Smal MA等人Lipids 1991， 26 1130-5 所述；根據(jù)下面通式的化合物 其中Rl是C6至C18烷基，優(yōu)選為己基或十二烷基(1-酰基-PAF)，如Muzya GI等 人 Immunologiya(Moscow) 1997,6,9-11 所述。載體可以是例如蛋白、碳水化合物、聚合物、乳膠珠子或膠體金屬。PAF偶聯(lián)物可以是例如蛋白-PAF偶聯(lián)物，如人血清白蛋白(HSA) -PAF偶聯(lián)物、鐵 轉(zhuǎn)移蛋白-PAF偶聯(lián)物、鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)-PAF偶聯(lián)物或牛血清白蛋白(BSA)-PAF偶聯(lián) 物。PAF偶聯(lián)物和抗-PAF抗體的產(chǎn)生的例子在WO 87/05904中有描述并由 Karasawa K 等 人(Antibodies to synthetic platelet-activating factor(1-0-alkyl-2-0-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) analogues withsubstituents at the sn-2 position. J Biochem(Tokyo). 1991,110 :683_7), Macpherson JL 等 人 (Production and characterization of antibodies toplatelet-activating factor. T Lipid Mediat. 1992,5 49~59), Smal MA ^A (Synthesis of a PAF immunogen and production of PAF-specific antibodies. Lipids. 1991, 26 :1130_5),Tomii A 禾口 Masugi F. (Production ofanti-platelet-activating factor antibodies by the use of colloidal gold ascarrier. .Ton T Med Sci Biol. 1991,44 75~80),和 Wang C 和 Tai HH. (Asensitive and. specific radioimmunoassay for platelet-activating factor. Lipids. 1992,27:206-8)和US 5，061，626描述，其內(nèi)容通過引用并入本文。舉例說明了可以根據(jù)本發(fā)明治療和/或防止的心血管疾病，所述心血管疾病不限 于動(dòng)脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞痛，中風(fēng)，動(dòng)脈移植、動(dòng)脈支架術(shù)和球囊 血管成形術(shù)之后的再狹窄，特別是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)和冠狀動(dòng)脈血管 成形術(shù)之后的再狹窄。在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的用途中，或根據(jù)本發(fā)明的第二方面的方法中，心血管 疾病可以選自動(dòng)脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞痛，中風(fēng)，動(dòng)脈移植、動(dòng)脈支 架術(shù)和球囊血管成形術(shù)之后的再狹窄，特別是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)和冠 狀動(dòng)脈血管成形術(shù)之后的再狹窄。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的用途中，或根據(jù)本發(fā)明的第二方面的方法中，通過注射施用藥物。本發(fā)明的第五方面可以提供確定與發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān) 的PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體(例如IgM、IgG或IgA抗體)存在或不存在的方法。通常，本發(fā)明的第五方面的方法包括向來自個(gè)體的樣品暴露于PAF偶聯(lián)物并檢測 與PAF偶聯(lián)物結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第五方面的方法中，個(gè)體是人類。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第五方面的方法中，樣品是血清。根據(jù)本發(fā)明的第六方面的PAF偶聯(lián)物的用途可以對(duì)應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的第五方面 的使用PAF偶聯(lián)物的方法。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第五或第六方面中，PAF通過間隔子連接至載體。在這個(gè)具體 實(shí)施方式中，載體通常是蛋白，優(yōu)選為KLH (鑰孔戚血藍(lán)蛋白)、鐵轉(zhuǎn)移蛋白、人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。或者載體可以是乳膠珠子。通常，根據(jù)本發(fā)明的第五方面，通過一種檢驗(yàn)(優(yōu)選免疫檢驗(yàn))來測定結(jié)合至PAF 偶聯(lián)物的抗體?；颊叩膶?duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體(例如IgM、IgG或IgA抗體)的水平可以使 用免疫檢驗(yàn)來測定。下面描述了合適的免疫檢驗(yàn)的例子，其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員在任何情 況下是明顯的。通常，在本發(fā)明的第五和第六個(gè)具體實(shí)施方式
中，低水平的對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng) 性的抗體是發(fā)生心血管疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn)的指征。相反，高水平的對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性 的抗體是減少的發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的指征。通常，在患者血漿或血清的樣品中測定抗 體。在任何給定的人群中，對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體的水平有可能變化。對(duì)于任 何給定的個(gè)體測定的對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體的水平可以通過參考廣闊人群中觀察 到的范圍而被分類為高或低。例如，在通過參考廣闊人群而測定的特定百分比值以下的這 樣的抗體的水平可以被分類為低水平。適當(dāng)?shù)兀退娇梢詫?duì)應(yīng)于25%以下或20%、10% 或5%以下的值。高水平可以對(duì)應(yīng)于例如5%、10%、20%或25%以上的值。當(dāng)個(gè)體被鑒定為具有低水平的對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體時(shí)，這個(gè)信息可以輔 助發(fā)生或發(fā)展缺血性心血管疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn)的診斷或預(yù)后。臨床醫(yī)生可以考慮其它因素 以達(dá)到診斷或預(yù)后。當(dāng)認(rèn)為個(gè)體有發(fā)生缺血性心血管疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，可以推薦預(yù)防 性治療和/或生活方式的改變。當(dāng)個(gè)體被診斷為具有進(jìn)行性缺血性心血管疾病時(shí)，他或她 的臨床醫(yī)生可以推薦個(gè)體化的治療和/或生活方式的改變。在本發(fā)明的第五和第六方面中，抗體的水平可以通過測定所有對(duì)PAF偶聯(lián)物有反 應(yīng)性的抗體，或只測定特定同種型的抗體如IgM、IgG或IgA，或測定兩個(gè)或兩個(gè)以上抗體同 種型的組合而鑒定。優(yōu)選地，確定IgG的水平。免疫檢驗(yàn)可以是競爭性的或非競爭性的。在典型的競爭性免疫檢驗(yàn)中，樣品中的 抗體與標(biāo)記的抗體競爭性結(jié)合至PAF偶聯(lián)物。然后測定結(jié)合至PAF偶聯(lián)物的標(biāo)記的抗體的 量。樣品中的抗體濃度與檢測的標(biāo)記的抗體的量之間有反向的關(guān)系。在非競爭性免疫檢驗(yàn) 中，樣品中的抗體結(jié)合至PAF偶聯(lián)物，然后標(biāo)記的檢測試劑(通常是抗免疫球蛋白抗體)結(jié) 合至該抗體。然后測定結(jié)合至該抗體的標(biāo)記的檢測試劑的量。與競爭性方法不同，非競爭性方法的結(jié)果將直接與抗體的濃度成比例。在非競爭性免疫檢驗(yàn)或western印跡中，標(biāo)記的檢測試劑(通常是抗免疫球蛋白 抗體)被用于檢測與PAF偶聯(lián)物結(jié)合的抗體。合適的抗免疫球蛋白抗體必須特異性結(jié)合一 種物種(樣品從該物種獲得)的免疫球蛋白。其可以結(jié)合至該物種的所有免疫球蛋白同種 型或只結(jié)合同種型的一個(gè)亞型。例如，其可以只結(jié)合IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，或結(jié)合兩個(gè) 或兩個(gè)以上的這些同種型的組合?？姑庖咔虻鞍卓贵w可以只特異性結(jié)合任何給定的同種型 的某些亞型。人類IgA的亞型為IgAl和IgA2?？姑庖咔虻鞍卓贵w可以結(jié)合至一個(gè)或兩個(gè) 這些亞型。人類IgG的亞型為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4?？姑庖咔虻鞍卓梢越Y(jié)合至一個(gè)或 多個(gè)這些人類IgG亞型。應(yīng)該理解的是不同的脊椎動(dòng)物物種中有不同的同種型和亞型。在放射免疫檢驗(yàn)中，以放射性同位素如131I或125I標(biāo)記抗體或檢測試劑。在酶免 疫檢驗(yàn)中，以酶標(biāo)記抗體或檢測試劑。合適的酶能夠使用生色底物被檢測到。生色底物是 作為與酶反應(yīng)的結(jié)果而產(chǎn)生有色產(chǎn)物的底物，從而有色產(chǎn)物可以分光光度計(jì)測量而被檢測 至|J。酶如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和來自大腸桿菌(E.coli)的焦磷 酸酶已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用。還可以使用基于酶如熒光素酶的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。其它的標(biāo)記包括 熒光標(biāo)記如Alexa系列的熒光基團(tuán)。經(jīng)常使用維生素生物素偶聯(lián)抗體或檢測試劑，因?yàn)檫@可以通過酶連接的或熒光基 團(tuán)連接的親和素或鏈霉親和素的反應(yīng)而容易地被檢測到(生物素以強(qiáng)烈的特異性和親和 力與親和素或鏈酶親和素結(jié)合)。在典型的非競爭性酶免疫檢驗(yàn)中，將需要分析的樣品與吸附在固體基質(zhì)上的PAF 偶聯(lián)物接觸并孵育。因此可能存在于樣品中的任何抗PAF偶聯(lián)物的抗體被吸附在固體基質(zhì) 上的PAF偶聯(lián)物特異性地結(jié)合，從而產(chǎn)生PAF偶聯(lián)物/抗PAF偶聯(lián)物抗體復(fù)合物。然后通過 例如洗滌將樣品從固體基質(zhì)上分離以便除去非結(jié)合的物質(zhì)。在該方法的下一步，向固體基 質(zhì)加入能夠結(jié)合任何以PAF偶聯(lián)物/抗PAF偶聯(lián)物抗體復(fù)合物形式存在于基質(zhì)中的抗-PAF 偶聯(lián)物抗體的指示劑抗體，因此產(chǎn)生PAF偶聯(lián)物/抗PAF偶聯(lián)物抗體/指示劑抗體復(fù)合物。 指示劑抗體可以是例如在非人的動(dòng)物物種中產(chǎn)生的抗人IgG免疫球蛋白。最后，檢測在固 體基質(zhì)上的PAF偶聯(lián)物/抗PAF偶聯(lián)物抗體/指示劑抗體復(fù)合物的存在，固體基質(zhì)上的所 述復(fù)合物的存在是來自個(gè)體的樣品中抗PAF偶聯(lián)物抗體存在的指征。通常，固體基質(zhì)是微量滴定板，例如是用于進(jìn)行ELISA免疫檢驗(yàn)的常見類型的微 量滴定板。所述微量滴定板優(yōu)選為聚苯乙烯板。其它適當(dāng)?shù)墓腆w基質(zhì)是乳膠顆粒、珠子和 包被的紅血細(xì)胞。方便地，通過在含有固體基質(zhì)的緩沖液中孵育PAF偶聯(lián)物而將PAF偶聯(lián) 物吸附至固體基質(zhì)上。合適的緩沖液包括碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖的鹽水。或者，可以 將PAF偶聯(lián)物共價(jià)連接至固體基質(zhì)。通常，將PAF偶聯(lián)物吸附或共價(jià)連接至固體基質(zhì)上之 后，以封閉試劑孵育固體基質(zhì)以減少來自樣品的物質(zhì)與固體基質(zhì)的非特異性結(jié)合。合適的 封閉試劑包括牛血清白蛋白。優(yōu)選對(duì)可以結(jié)合至PAF偶聯(lián)物的抗體的定量測定是通過一種或更多上述技術(shù)獲得的。在典型的非競爭性檢驗(yàn)中，假定了測量的變量(不論其是光密度或一些其它的讀數(shù)) 和抗體濃度之間的線性關(guān)系。例如，如果樣品A在檢驗(yàn)中有樣品B的雙倍的光密度(已經(jīng) 從兩者中減去本底)，則認(rèn)為A中的抗體濃度是B的兩倍。但是，優(yōu)選的是構(gòu)建陽性血清樣 品的庫的系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)選地，在檢驗(yàn)樣品的同時(shí)檢驗(yàn)這樣的稀釋物。通過這樣做，在測定樣品中抗體量的時(shí)候可以將任何來自線性關(guān)系的差異都考慮進(jìn)去。希望的是測定與oxLDL或丙二醛修飾的LDL(MD-LDL)反應(yīng)的抗體以及測定對(duì)PAF 偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體例如IgM、IgG或IgA抗體。另外希望的是或還希望的是測定脂蛋 白相關(guān)的磷脂_A2(LpPLA2)、同型半胱氨酸、C-反應(yīng)性蛋白(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白 (HDL)、TNF(特別是TNF a )和/或HSP60以及測定對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體(例如 IgM、IgG或IgA抗體)的水平。對(duì)這樣因子的檢驗(yàn)可以幫助發(fā)生或發(fā)展心血管疾病的增加 的風(fēng)險(xiǎn)的診斷或預(yù)后?？紤]到本文描述的任何方法或組合物可以根據(jù)本文描述的任何其它方法或組合 物實(shí)現(xiàn)。相似地，任何關(guān)于本發(fā)明的一個(gè)方面所討論的具體實(shí)施方式
可以用于本發(fā)明的任 何其它方面的內(nèi)容中。貫穿本申請(qǐng)，術(shù)語“約”用于表明數(shù)值包括用于測定該數(shù)值的儀器或方法的誤差的 標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)與權(quán)利要求和/或說明書中的術(shù)語“包含”結(jié)合使用時(shí)，使用單詞“一個(gè)(a) ”或 “一個(gè)(an)”可以意味著“一個(gè)(one)”，但還與“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或一個(gè) 以上”的意思一致。在權(quán)利要求中使用術(shù)語“或”是用于表示“和/或”，除非明確地指出只表示兩者之 一或兩者之一是相互排斥的，雖然本公開支持提及只有兩者之一和“和/或”的定義。本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將在下列詳細(xì)的說明中變得顯而易見。但是應(yīng)該 理解的是詳細(xì)的描述和特定的例子，雖然指示了本發(fā)明的特定具體實(shí)施方式
，但是其只以 舉例說明的方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)詳細(xì)的本說明書，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修 改將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。下面公開的實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明的目的，不應(yīng)被認(rèn)為是作為任何對(duì)隨 附的權(quán)利要求書所劃定的范圍的任何限制。本文參考的文獻(xiàn)通過引用并入本文。描述了測定與發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的PAF偶聯(lián)物有反應(yīng) 性的IgG抗體的不存在或存在和/或水平的方法的例子。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法?？梢允褂孟嗨频姆椒y定對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的IgM或IgA抗體的不存在或存 在和/或水平。A. PAF 偶聯(lián)物在根據(jù)本發(fā)明的方法中合成并使用了下列PAF-BSA偶聯(lián)物 n = 16B.泖誠PAF {臓勿能謹(jǐn)輸赫&禾口 /赫種誠在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中以5 ii g/ml PAF-BSA偶聯(lián)物(以上所述的)包被微量滴定板。以PBS洗滌后，以BSA溶液封閉該板。血清樣品在樣品稀釋液中稀釋(1 101) 并加入板中。將板在室溫孵育30分鐘并洗滌。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗人 IgGd 1000稀釋)并在室溫孵育30分鐘。洗滌后，通過加入3，3’，5，5，四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)底物并室溫黑暗中孵育板10分鐘發(fā)生顯色。使用分光光度計(jì)在450nm讀出吸收值。 與PAF-BSA偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體的水平被計(jì)算為從測試樣品獲得的吸收值與從每個(gè)檢驗(yàn)中 包括的陽性對(duì)照獲得的吸收值之間的比率。C.針對(duì)PAF偶聯(lián)物的抗體可以如上述制備針對(duì)PAF偶聯(lián)物的抗體。參見例如WO 87/05904，Macpherson JL ^ A (Production and characterization of antibodies toplatelet-activating factor. T Lipid Mediat. 1992,5 :49-59)，禾口 Smal MA等人(Synthesis of a PAF immunogen and production of PAF-specificantibodies. Lipids. 1991,26:1130-5)。D.針對(duì)PAF偶聯(lián)物的單克降抗體可以使用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法制備針對(duì)PAF的單克隆抗體。參見例如 Tomii A禾口Masugi F. (Production of anti-platelet-activatingfactor antibodies by the use of colloidal gold as carrier. Jpn J Med Sci Biol. 1991,44 :75_80)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備其它與PAF偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體。例如， 可以制備與PAF偶聯(lián)物反應(yīng)的人免疫球蛋白制備物的亞組分，例如如下面所述，例如通過 使用PAF偶聯(lián)物進(jìn)行親和純化。靜脈內(nèi)免疫球蛋白制備物(例如IGIV ；Baxter和其它)是商業(yè)上可獲得的高度 純化的IgG制備物并用于治療無抗體產(chǎn)生的或有非常低水平的抗體產(chǎn)生的患者。免疫球 蛋白制備物包括那些可以從下列生產(chǎn)商獲得的制備物=Baxter (US)，例如Gammagard , Isiven(Antimo Naples, Italy), Omrix(Tel-Hashomer, Israel), MiIes(Biological Products Division, West Heaven, CT), Sclavo (Lucca, Italy), Sandoz (Novartis, Basel, Switzerland),例如 Sandoglobulin , Biotest Diagnostic Corporation(Deville,
NJ)。免疫球蛋白制備物的例子有 GammagardS/D , GammarlV , Gaimnar-PIV , Gammimune N , Iveegam , Panglobulin , Polygam S/D , Sandoglobulin , Venoglobulin 。免疫球蛋白制備物通常包含一些IgM以及igG。在Gammagard 中存在 痕量的IgM。Pentaglobin(Biotest)是濃縮的已經(jīng)用于SARS治療的IgM制備物。對(duì)PAF 偶聯(lián)物有反應(yīng)性的亞組分可以同時(shí)包含IgG和IgM，或可以被選擇而主要包含IgG(例如通 過以富含IgG的制備物如Gammagard 起始和/或通過選擇IgG)；或主要包含IgM(例如 通過以富含IgM的制備物如Pentaglobin起始和/或選擇IgM)。E.主動(dòng)免疫因此本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
是使用PAF衍生物或PAF偶聯(lián)物用于制備藥物組 合物，所述藥物組合物用于治療、預(yù)防或防止心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗塞、 穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞 痛、中風(fēng)，動(dòng)脈移植后再狹窄、動(dòng)脈支架術(shù)和球囊血管成形術(shù)，特別是冠 狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后的再狹窄、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)。所述偶聯(lián)物可以 是與藥學(xué)上可以接受的蛋白、碳水化合物或聚合物連接的PAF或PAF衍生物。優(yōu)選通過注射施用藥物組合物。提出的主動(dòng)免疫的方法將調(diào)節(jié)抗體的滴度，其轉(zhuǎn)而將對(duì)心血管疾病的發(fā)生有積極 的作用。F.被動(dòng)免疫本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
是使用抗體制備物例如單克隆抗體，其識(shí)別用于制 備治療、預(yù)防或防止心血管疾病的藥物組合物的PAF偶聯(lián)物，所述心血管疾病如動(dòng)脈粥樣 硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞痛，中風(fēng)，動(dòng)脈移植、動(dòng)脈支架術(shù)和球囊血管成形術(shù) 之后的再狹窄，特別是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)之后 的再狹窄。單克隆可以使用本領(lǐng)域已知的方法制備。G.診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估本發(fā)明的進(jìn)一步具體實(shí)施方式
提供了使用PAF偶聯(lián)物診斷對(duì)PAF偶聯(lián)物有反應(yīng)性 的抗體(例如IgA、IgM或IgG抗體)的不存在、存在和/或水平的方法，所述PAF偶聯(lián)物與 發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。優(yōu)選的方法是免疫檢驗(yàn)。該方法可以用于評(píng) 估患者的發(fā)生或發(fā)展心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例1包括了下列實(shí)施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方式
。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理 解的是遵循本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明時(shí)可以很好地 發(fā)揮作用，因此可以被認(rèn)為構(gòu)成了其實(shí)施的優(yōu)選模式。但是，考慮到本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是在公開的特定具體實(shí)施方式
中可以做出許多改變，并且不背離本發(fā)明的精 神和范圍而仍然獲得同樣的或相似的結(jié)果。A.受試者在Malm6(theMalmdDiet and Cancer Study)的觀測性研究中，募集來自群體 的約30000個(gè)受試者中的約6000個(gè)以進(jìn)行深入的心血管疾病研究，包括通過頸動(dòng)脈的超聲 測定非侵入性地評(píng)估亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化?？偣灿?37個(gè)CVD病例(主要是心肌梗塞(Ml) 和缺血性中風(fēng))和384個(gè)年齡和性別匹配的對(duì)照?？筆AF-BSA的截止水平為307 (10%的抗 PAF水平)。抗PAF-BSA IgG的截止水平為60. 8 (25%的水平)?？偣灿?8個(gè)CVD病例具 有25%以下的抗PAF-BSA IgG水平(42% )，和79個(gè)對(duì)照(21 % )，這對(duì)應(yīng)于3. 19的相對(duì)風(fēng) 險(xiǎn)(95% CI 2. 04-4. 99)(表 1)。結(jié)果顯示低的抗PAF-BSA水平是健康受試者中出現(xiàn)心血管疾病的預(yù)測物，可以作 為心血管疾病的標(biāo)記。B.試劑Maxisorp 鎖定孔板、C96、微量滴定板購自 Nunc (RoskildeDenmark)，PAF-BSA 由 IsoSep, Uppsala (Sweden)合成禾口提供。與兔抗人IgG ( Y _特異的)偶聯(lián)的辣根過氧化物酶購自DakoCytomation， Stockholm (Sweden) 。 TMB ^^ 自 Phadia, Freiburg (Germany)。C.針對(duì)PAF偶聯(lián)物的抗體的測定通過酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)(ELISA)測定PAF-BSA的IgG抗體。產(chǎn)生0. 5-0. 70D吸收 值的一個(gè)血清被用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)并在每個(gè)板上測試。抗原濃度為g/ml時(shí)達(dá)到抗體結(jié)合 的穩(wěn)定水平。因此以PBS中的PAF-BSA(5 u g/ml)包被C96微量滴定maxsorp板(100 u g/孔)并在4°C孵育過夜。吸取包被溶液后，以BSA-PBS在室溫封閉板2小時(shí)。吸取封閉 溶液，加入0. 2% BSA-PBS中1 101稀釋的血清樣品(100 μ 1/孔)。于室溫孵育板30分 鐘，如上所述，并以洗滌緩沖液(Phadia，F(xiàn)reiburg, Germany)洗滌三次。每孔加入100 μ 1 辣根偶聯(lián)的兔抗人IgG(稀釋1 1000)并在室溫孵育30分鐘。洗滌三次后，如上所述， 通過加入TMB底物(100 μ 1/孔)而顯色。黑暗中在室溫孵育10分鐘以后，通過加入0.5Μ H2SO4 (50 μ 1/孔)終止反應(yīng)。在450nm在ELISADigiScan分光光度計(jì)中讀板。以兩次重復(fù) 測定所有的樣品，所有樣品的差異系數(shù)在15%以下。P.結(jié)果表1 ******************根據(jù)本公開，無需花費(fèi)過量實(shí)驗(yàn)即可得到并實(shí)施本文公開的和要求保護(hù)的所有組 合物和/或方法。雖然已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍而對(duì)本文描述的 組合物和/或方法以及方法的步驟或步驟順序適用某些變化。更特別地，顯而易見的是同 時(shí)在化學(xué)上和生理上相關(guān)的某些試劑可以替代本文描述的試劑而獲得相同或相似的結(jié)果。 所有這樣的對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的相似替換和修改被認(rèn)為是落在如隨附的權(quán)利 要求書所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
權(quán)利要求
至少一個(gè)PAF衍生物、一個(gè)PAF偶聯(lián)物或?qū)AF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體制備物例如單克隆抗體在制備用于免疫接種和預(yù)防、防止或治療哺乳動(dòng)物包括人類以抵抗心血管疾病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中心血管疾病選自動(dòng)脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn) 定和不穩(wěn)定心絞痛，中風(fēng)，動(dòng)脈移植、動(dòng)脈支架術(shù)和球囊血管成形術(shù)之后的再狹窄，特別是 冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)之后的再狹窄。
3.一種用于免疫接種和預(yù)防、防止和治療哺乳動(dòng)物包括人類以抵抗心血管疾病的方 法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含至少一個(gè)PAF 衍生物、一個(gè)PAF偶聯(lián)物或?qū)AF偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體制備物例如單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中心血管疾病選自動(dòng)脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn) 定和不穩(wěn)定心絞痛，中風(fēng)，動(dòng)脈移植、動(dòng)脈支架術(shù)和球囊血管成形術(shù)之后的再狹窄，特別是 冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)之后的再狹窄。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，或根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中通過注射 施用藥物或通過注射施用組合物。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)定義的一個(gè)或更多的PAF衍生物或PAF偶聯(lián)物在制備用于 預(yù)防、防止或治療心血管疾病的藥物組合物中的用途，所述藥物組合物可選地與佐劑組合。
7.一種預(yù)防或治療性處理患有動(dòng)脈粥樣硬化或面臨發(fā)生心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物 例如人類的方法，其中施用治療上有效量的至少一個(gè)PAF衍生物、一個(gè)PAF偶聯(lián)物或?qū)AF 偶聯(lián)物有反應(yīng)性的抗體制備物例如單克隆抗體。
8.一種使用PAF偶聯(lián)物診斷與發(fā)生缺血性心血管疾病的增加的或減少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的 IgM、IgG或IgA抗體存在或不存在的方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，包括暴露來自個(gè)體的樣品的PAF偶聯(lián)物并檢測結(jié)合至 PAF偶聯(lián)物的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中個(gè)體是人類。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中樣品是血清。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)所述的方法，其中通過間隔子將PAF連接至載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)所述的方法，其中載體是蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中蛋白是KLH(鑰孔戚血藍(lán)蛋白、鐵轉(zhuǎn)移蛋白、人血 清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中載體是膠體珠子。
16.根據(jù)權(quán)利要求8-15任一項(xiàng)所述的方法，其中通過一種檢驗(yàn)優(yōu)選免疫檢驗(yàn)測定結(jié)合 至PAF偶聯(lián)物的抗體。
17.PAF偶聯(lián)物在評(píng)估患者發(fā)生或發(fā)展缺血性心血管疾病的方法中的用途，其中評(píng)估患 者的與PAF偶聯(lián)物反應(yīng)的IgM、IgG或IgA抗體的水平。
全文摘要
低水平的與PAF偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體與發(fā)生心血管疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。因此，提供了診斷和治療心血管疾病的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101842119SQ200880113553
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者H·格倫隆德, I·達(dá)爾布姆, J·弗羅斯特蓋德 申請(qǐng)人:阿瑟拉生物技術(shù)公司