一種用于心臟疾病和心血管疾病檢測的試劑盒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白適配子在制備檢測上尿路 上皮癌試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuregulin, NRG ;heregulin, HRG),又叫神經(jīng)膠質(zhì)生長因子 (glial growth factor, GGF), neu 分化因子(new differentiationf actor, NDF),為 分子量在44KD左右的糖蛋白，它們?cè)诩?xì)胞間傳遞信號(hào)，是酪氨酸激酶受體ErbB家族的配體。 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuregulin)是一種表皮生長因子(EGF)類的生長因子。它能激活EGF受體族 中erbB受體，并涉及到其他的一些生物反應(yīng):如刺激乳房癌細(xì)胞分化和乳蛋白的分泌;誘導(dǎo) 神經(jīng)脊細(xì)胞分化為Schwann細(xì)胞;刺激骨胳肌細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成；以及促進(jìn)心肌細(xì) 胞成活和DNA合成。用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因嚴(yán)重缺陷的小鼠胚胎做的活體研究證明神經(jīng)調(diào)節(jié) 蛋白對(duì)于心臟和神經(jīng)發(fā)育是必需的。然而，關(guān)于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白如何控制細(xì)胞分化和其下游 信號(hào)途徑的信息是有限的。已知神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白家族含4個(gè)成員:NRG1，NRG2，NRG3，NRG4。 對(duì)后三者的生物學(xué)功能相對(duì)來講知之甚少。NRG1在神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和乳腺中起著重要作用， 還有證據(jù)顯示NRG1信號(hào)傳遞在其他一些器官系統(tǒng)的發(fā)育、功能以及人類疾病(包括精神分 裂癥和乳腺癌）的發(fā)病機(jī)理中起作用。NRG1有很多異構(gòu)體。對(duì)基因突變小鼠（基因敲除小鼠） 的研究說明在N末端區(qū)或表皮生長因子(EGF)類似區(qū)不同的異構(gòu)體，其在體功能也不一樣。
[0003] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β為一跨膜蛋白。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白類似區(qū)（Ig-likedomain)和EGF類似區(qū)（EGF-likedomain)，膜內(nèi)部分是C末端。在細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白 酶作用下，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的膜外部分可被酶切下來而呈游離狀態(tài)，從而有利于和周圍細(xì)胞 表面的ErbB受體結(jié)合，激活相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳遞。
[0004] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對(duì)心臟的發(fā)育尤其重要。在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)主 要局限于心內(nèi)膜，隨后通過旁分泌途徑釋放到周圍心肌細(xì)胞并與細(xì)胞膜上的蛋白酪氨酸激 酶受體ErbB4膜外部分結(jié)合，ErbB4進(jìn)而與ErbB2形成異源二聚體。ErbB4/ErbB2復(fù)合物的形 成及激活對(duì)早期海綿樣心臟形成小梁是必須的。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、ErbB4和ErbB2三個(gè)蛋白基 因中的任何一個(gè)缺失都會(huì)使胚胎在發(fā)育早期死于子宮。在早期發(fā)育的心臟中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白和ErbB受體各自在心內(nèi)膜襯里和心臟肌肉內(nèi)表達(dá)，因?yàn)檫@二層分開很寬，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 必須穿過二層細(xì)胞中的空間，再激活ErbB受體。激活這些心肌細(xì)胞中的受體對(duì)于促進(jìn)肌肉 細(xì)胞生長或迀移到心內(nèi)膜，從而在二層細(xì)胞中形成手指型結(jié)構(gòu)是必須的。已知神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白可用于檢測、診斷和治療各種心血管疾病。
[0005] 因此針對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的研究顯得尤為重要。特別是特異性識(shí)別或者檢測神經(jīng)調(diào) 節(jié)蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)蛋白檢測通常是采用抗體進(jìn)行識(shí)別，但是抗體由于制備復(fù)雜，成 本高，檢測復(fù)雜使得其并不適合大面積推廣。核酸適配子(aptamer)是一種生物大分子的人 工單鏈寡核苷酸配體，通過SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。SELEX技術(shù)（即系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集 技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制/發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，其運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡 核苷酸文庫，結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪 篩選，獲得親和力高、特異性強(qiáng)的核苷酸適配子(aptamers)。該技術(shù)己成功運(yùn)用于許多靶分 子的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、藥物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。這種方法 具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，與其他組合化學(xué)庫如隨機(jī)膚/肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示 文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢:a.本身是寡核苷酸，分子量較 小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本。b.具有比抗體更高的親和性和特異性。c.便于標(biāo)記，可以在不 同部位有選擇性的標(biāo)記。d.重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，易于保存，對(duì)高溫和劇烈條件不敏感。因 此，寡核苷酸適配子/SELEX技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，特別是在抗體工程領(lǐng)域。消減SELEX 技術(shù)是識(shí)別癌與非癌細(xì)胞間微小差異、篩選癌細(xì)胞特異性親和適配子的有力工具。
[0006] 核酸適配子篩選的基本步驟如下：設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫；將文庫與 靶標(biāo)共孵育，使文庫中能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的寡核酸與靶標(biāo)形成復(fù)合物，分離復(fù)合物并洗 脫寡核酸，以洗脫的寡核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備成新的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，開始 下一輪篩選;重復(fù)數(shù)輪孵育-洗脫-擴(kuò)增，與靶標(biāo)高特異性和高親和力結(jié)合的核酸序列將從 文庫中篩選出來并被指數(shù)富集;對(duì)最后一輪篩選后制備的文庫進(jìn)行克隆、測序，其中長度及 兩端序列與文庫相符者即為核酸適配子;測定各核酸適配子與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和 力，選出能高特異性和高親和力結(jié)合靶標(biāo)者，即可應(yīng)用于靶標(biāo)的檢測分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種DNA適配子，能夠特異性結(jié)合神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白蛋白，可以來 實(shí)現(xiàn)心臟病和心血管疾病的檢測。
[0008] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 體外合成一個(gè)含有39個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA文庫，通過體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建出單鏈DNA適配子 隨機(jī)文庫;采用NRG蛋白為靶蛋白，采用SELEX技術(shù)篩選具有高親和力的表面抗原特異性DNA 適配子;通過結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RNA Structure Program分析預(yù)測適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu);通過膜結(jié) 合測定實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定篩選適配子對(duì)靶蛋白的特異性和親和力，得到了多個(gè)與表 面抗原親和力高、特異性強(qiáng)的適配子。所述的適配子都能形成各自的特異莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述適 配子能特異性、高親和力地結(jié)合NRG蛋白。所述適配子序列如下：



這些序列分別序列表的SEQ ID NO: 1-55所示。
[0009] 本發(fā)明的有益效果：（1)獲得了一種能夠特異高效結(jié)合NRG蛋白的適配子。該適配 子可以大量人工制備，方法簡單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎(chǔ)可以制備成為特異性 結(jié)合NRG蛋白的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1 NRG蛋白特異性結(jié)合DNA適配子的SELEX篩選 根據(jù)人NPG蛋白的序列，Genbank: NP_039250，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，以人基因組DNA作為模 板，通過常規(guī)的PCR，擴(kuò)增得到相應(yīng)的目的基因，經(jīng)鑒定，產(chǎn)物大小為1900bp左右。選用 PET22b作為表達(dá)質(zhì)粒，用氯化鈣沉淀法將人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因克隆至PET22b表達(dá)質(zhì)粒中， 構(gòu)建成重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)質(zhì)粒(PET22b-人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白），此蛋白在T7啟動(dòng)子的驅(qū) 動(dòng)下，尚效表達(dá)。表達(dá)基因 N端從Ndel位點(diǎn)插入，C端有終止子緊接在最后個(gè)氣基酸處，所 得蛋白不與任何氨基酸形成融合蛋白。經(jīng)酶切切出約1900bp的正確片段。轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切鑒 定后，提取雙鏈DNA進(jìn)行核甘酸序列測定。結(jié)果證實(shí)，表達(dá)載體上的人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白序列完 全正確。取經(jīng)PCR和酶切鑒定的工程菌克隆(BL21-PET22b_A神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白），隨機(jī)挑選一系 列單菌落接種于2mlLB-Amp液體培養(yǎng)基，置37°C、250rpm培養(yǎng)過夜，然后按一定比例接種于 20ml LB-Amp培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至0D達(dá)1. 0時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)4h，收集菌體。破菌后收集包 涵體，15% SDS-PAGE電泳、薄層掃描分析、Western-blotting鑒定，經(jīng)反復(fù)篩選獲得一株穩(wěn)定 高表達(dá)目的蛋白神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的工程菌(BL21-PET22b-人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白）。該菌株表達(dá)的目 的蛋白占菌體總蛋白的10%左右。經(jīng)尚壓勾楽破菌后，獲得了相應(yīng)的目的蛋白。
[0011] 化學(xué)合成初始寡核苷酸隨機(jī)文庫及引物，序列如下：（5 7 -CATGACCTTGGACAAGTCAGC--N39--TTGACAGTGATATGGTCAC-3')，其中N39為40個(gè)隨機(jī)寡核 苷酸； 引物P1: CATGACCTTGGACAAGTCAGC; 引物 P2: GTGACCATAGCACTGTCAA。
[0012] 將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回 收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。80 μ g RNA文庫 經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與3ug NPG蛋白37°C孵育40min，反應(yīng) 液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素，0. 7mol/L醋酸銨，1.6mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文 庫用于下一輪篩選;每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn) 錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行15輪。
[0013] 實(shí)施例2特異性高親和力的NPG結(jié)合適配子的獲得 將DNA適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP) 37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的DNA ;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放 射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的NPG蛋白37°C孵育30min，各組反應(yīng)液 經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣 品平行做兩次測定。計(jì)算各個(gè)適配子與NPG蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
實(shí)施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析 從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的55個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中也沒 有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合NPG蛋白。
[00M]分別采用人血白蛋白，人IgG抗體，ErbB4蛋白，H-FABP蛋白分別與55條適配子進(jìn)行 特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與NPG蛋白結(jié)合 保持較高的特異性。
[0015]實(shí)施例4降解活性分析 將所述的適配子，取〇.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過RT-PCR檢 測，發(fā)現(xiàn)四周的放置所有55個(gè)適配子其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。比現(xiàn)有技術(shù)的適配子都具有 更長的穩(wěn)定性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測心臟疾病和心血管疾病的試劑盒，其特征在于:包括特異性識(shí)別特異性NPG 蛋白的適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述適體序列為包括SEQ ID No. 1-55任一 條序列所示。3. 序列為SEQ ID No. 1-55任一條所示的適體在制備檢測NPG蛋白的試劑盒中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于心臟疾病和心血管疾病檢測的試劑盒及其用途，其包含的適體具有較強(qiáng)的結(jié)合特性和穩(wěn)定性；該適體的獲得是應(yīng)用新的組合化學(xué)技術(shù)SELEX，以NPG蛋白為靶蛋白，從單鏈DNA隨機(jī)文庫中篩選出了能與NPG蛋白特異性結(jié)合的DNA適配子。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號(hào)】CN105572385
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610043558
【發(fā)明人】查文娟
【申請(qǐng)人】查文娟
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月24日