專利名稱：用于治療心血管疾病的非遺傳修飾性重編程細胞的組合物和方法
用于治療心血管疾病的非遺傳修飾性重編程細胞的組合物
和方法優(yōu)先權聲明本申請要求對以下美國臨時專利申請的優(yōu)先權2010年6月23日提交的美國臨時專利申請61/398，279、2010年7月I日提交的美國臨時專利申請61/360，852，上述申請參考整體并入本文。
背景技術：
胚胎干細胞能夠分化為多種類型的人體細胞。大部分體細胞是終末分化細胞，并被認為缺乏轉變成其它類型體細胞的能力。誘導型多能干細胞(iPSC)和轉分化領域近來的進展已經改變了這一范式。體細胞可以被重編程為誘導型多能干細胞(iPSC)，即，通過病毒轉導使四種轉錄因子異位表達，即0ct4 (例如SEQ ID NO: I), Sox2 (例如·SEQ IDN0:2)、Klf4 (SEQ ID N0:3)以及 cMyc (例如 SEQ ID N0:4) (Okita 等，Nature448, 313-317(2007) ; Takahashi 和 Yamanaka，Cell 126,663-676(2006))。進一步發(fā)展了一些改良的遺傳方法來產生潛在風險更低的iPSC，包括采用非整合型腺病毒來傳遞重編程基因(Stadtfeld 等,Science 322, 945-949 (2008)),瞬時轉染重編程質粒(Okita 等,Science322、949-953(2008))，使用piggyBac轉座子系統(tǒng)以及使用Cre-可切除的病毒等(Soldner等，Cell 136，964-977(2009) ;Woltjen 等，Nature 458,766-770(2009))。此外，在某些細胞類型中利用內源性基因表達的策略也使得重編程更容易和/或需要的外源基因更少(Aasen 等，Nat Biotechnol 26,1276-1284(2008) ;Kim 等，Nature 454,646-650(2008)；Shi等，Cell StemCell 2，525-528 (2008b))。而且，還發(fā)現(xiàn)了能夠增強重編程效率和替代某些重編程因子的小分子(Huangfu 等,Nat Biotechnol 26，795-797 (2008a) ;Huangfu 等，Nat Biotechnol 26，1269-1275 (2008b) ;Li 等，Cell Stem Cell 4, 16-19(2009) ;Shi 等，Cell Stem Cell 3，568-574 (2008a) ;Shi 等，Cell Stem Cell 2，525-528 (2008b))。然而，現(xiàn)有的所有這些方法仍然涉及使用遺傳物質，其缺陷在于需要向目標細胞中通過外源序列引入未知的、不需要的，或者甚至有害的基因組修飾，而且對轉基因的表達水平也沒有足夠的控制。為了解決這些缺點，本領域要重編程細胞的方法，其不依賴于或不引入外源遺傳物質，如外源基因或DNA片段或包含外源DNA或基因的載體等。盡管已開發(fā)了許多種治療方法，但是心血管疾病，尤其是缺血性疾病仍然是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。這一問題由人類老齡化以及工業(yè)化引起。缺血性心肌缺血通常導致的一個主要形式為梗塞后心力衰竭，尤其是那些具有大量心肌梗塞的患者，而且這與高死亡率相關。心肌梗死的開始通常會有一系列事件，這包括心肌細胞死亡、疤痕組織形成、動脈瘤變薄和左心室重構，從而降低了泵送能力、心臟功能障礙，甚至導致死亡。因此，急需非遺傳修飾性重編程細胞，以為心血管疾病提供有效的治療。發(fā)明概述本披露的一方面涉及包含效應結構域的轉導物質。效應結構域一旦轉導進入生物樣品就能夠使生物樣品發(fā)生重編程改變。在某些實施方式中，效應結構域天然地能夠轉導進入生物樣品中。在某些實施方式中，轉導物質還包含共價或非共價結合或連接于效應結構域的轉導結構域。在某些實施方式中，轉導結構域通過接頭共價連接于效應結構域。在某些實施方式中，轉導物質能夠選擇性轉導進入一種或多種特定生物樣品中，或者在生物樣品周圍特定環(huán)境中變得可轉導。本披露的另一方面涉及包含生物樣品和轉導物質的組合物，其中轉導物質已經轉導進入生物材料。本披露的另一方面涉及通過將生物樣品暴露于包含轉導物質的組合物中而重編程生物樣品的方法。本披露的另一方面涉及治療生物體中疾病或狀態(tài)的方法，包括將包含轉導物質的藥物組合物向生物體給藥。本披露的另一方面涉及開發(fā)基于細胞的療法的方法，所述療法針對各種疾病或狀態(tài)，所述方法包括用轉導物質將iPSC、胚胎干細胞或祖細胞重編程為可移植體細胞或可移植祖細胞的步驟。本披露的另一方面涉及開發(fā)疾病模型的方法，包括用轉導物質將iPSC、胚胎干細胞或祖細胞重編程為可移植體細胞或可移植祖細胞的步驟。本披露的另一方面涉及識別效應結構域的方法，包括將測試效應結構域共價或非共價結合于轉導結構域以形成測試轉導分子，將測試分子暴露于生物樣品以及測定生物樣品的重編程水平。附圖簡要說明圖I :轉導物質的鑒定(I)。(A)轉導物質 0ct4-llR (SEQ ID NO: 12)、Sox2_llR(SEQ ID N0:13)、Klf4-llR (SEQ ID NO: 14)以及 cMyc-llR (SEQ ID NO: 15)、接頭SEQ IDN0:55 ;效應結構域0ct4 (SEQ ID N0:l)、Sox2 (SEQ ID N0:2)、Klf4 (SEQID N0:3)或cMyc (SEQ ID N0:4)的蛋白表達載體的示意圖。(B) Western印跡分析測定的四種轉導物質(0ct4-l IR、Sox2-l IR、Klf4_l IR和cMyc_l IR)在細胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定性。圖2 :轉導物質的鑒定(II)。通過免疫細胞化學檢測IlR標記的轉導物質進入0G2-MEF細胞的蛋白轉導。0ct4 :0ct4_llR轉導的MEF細胞(綠色)，Sox2 :Sox2_llR轉導的MEF細胞(紅色)，Klf4 :Klf4-llR轉導的MEF細胞(紅色)以及cMyc :cMyc_llR轉導的MEF細胞(綠色)。DAPI :用DAPI對細胞染色以顯示細胞核(藍色)，再將圖像合并。圖3 :轉導物質的鑒定(III)。蛋白誘導的多能干細胞(PiPS)在化學確定的培養(yǎng)基和無滋養(yǎng)條件下克隆增殖和自我更新。圖4 :通過轉導物質 0ct4_llR、Sox2_llR、Klf4_llR 和 cMyc-llR 產生 piPS 細胞。(A) piPS細胞產生的時間線。(B)第30-35天左右初始觀察的0ct4_GFP+piPS細胞集落。相代表性的相差圖；GFP :熒光圖。(C)0ct4-GFP+piPS細胞在常規(guī)mESC生長條件下維持長期自我更新。(D)長期擴增的piPS細胞以緊密且凸起的集落生長，強烈表達典型的多能標記ALP。(E)免疫熒光檢測到piPS細胞表達其它典型的多能標記SEA-I (紅色)、Sox2 (紅色)、0ct4 (紅色)以及Nanog (紅色)。DAPI :DAPI染色以顯示細胞核(藍色)，將圖合并。(F)RT-PCR分析piPS細胞中內源性多能基因表達。(G)用亞硫酸氫鹽基因組測序法分析0ct4啟動子的甲基化?？招膱A和實心圓分別表示未甲基化和甲基化的CpG。
圖5 piPS細胞在體外和體內的多能性(I)。piPS細胞在體外有效地分化為三胚層的細胞Tujl :特征性的TUJl+神經元細胞-外胚層(紅色)；Bryt Brachyury+中胚層細胞(紅色)；以及Soxl7 :Soxl7+確定的內胚層細胞。將圖與DAPI (藍色)染色圖合并。圖6 :piPS細胞在體外和體內的多能性(II)。(A)RT-PCR分析piPS細胞的體外分化。(B)將piPS細胞聚集的胚胎轉移至假孕小鼠(上圖)后獲得嵌合胚胎(13. 5dpc, 7只中有2只，左圖)。在嵌合胚胎中分離的生殖嵴組織中，這種piPS細胞形成了生殖細胞(0ct4-GFP陽性)(下圖)。圖7 :轉導物質的蛋白表達載體的示意圖。His6 SEQ IDNO:59 ;效應結構域Ngn3(SEQ ID N0:8)、PDX1 (SEQ ID NO:9) ；MafA (SEQ ID N0:10)*Foxp3 (SEQ ID NO: 11);接頭SEQ ID NO:55。圖8 :在小鼠中通過轉導物質 His6-Ngn3-11R (SEQ IDNO:30)、His6-PDX1_11R(SEQID N0:31)和His6-MafA-llR (SEQ ID NO:32)將肝臟和胰腺外分泌細胞重編程為產 生胰島素的β細胞(I)。小鼠-I、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對照組)。小鼠 _4、小鼠-5 和小鼠-6 用 His6-Ngn3-1 lR、His6_PDXl_l IR 和 His6_MafA_l IR 處理(處理組)。A)小鼠-I肝臟的免疫熒光分析(IFA) ；B)小鼠-2肝臟的IFA分析；以及C)小鼠-3肝臟的IFA分析。圖9 :在小鼠中通過轉導物質 His6-Ngn3-11R、His6-PDX1_11R 和 His6-MafA_llR將肝臟和胰腺外分泌細胞重編程為產生胰島素的β細胞(II)。小鼠-I、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對照組)。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-llR處理(處理組)。A)小鼠_4肝臟的IFA分析(I) ；B)小鼠-4肝臟的IFA分析(2);C)小鼠-5肝臟的IFA分析(1);D)小鼠-5肝臟的IFA分析(2);E)小鼠-6肝臟的IFA分析(I) ；F)小鼠-6肝臟的IFA分析(2)。

圖10 :在小鼠中通過轉導物質 His6-Ngn3-llR、His6-PDXl-llR 和 His6-MafA-llR將肝臟和胰腺外分泌細胞重編程為產生胰島素的β細胞(III)。小鼠-I、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對照組)。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA_llR處理(處理組)。A)小鼠-I胰腺的IFA分析；B)小鼠-2胰腺的IFA分析(I) ；C)小鼠-2胰腺的IFA分析(2);以及D)小鼠-3胰腺的IFA分析。圖11 :在小鼠中通過轉導物質 His6-Ngn3-llR、His6-PDXl-llR 和 His6-MafA-llR將肝臟和胰腺外分泌細胞重編程為產生胰島素的β細胞(IV)。小鼠-I、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對照組)。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA_llR處理(處理組)。A)小鼠-4胰腺的IFA分析(I) ；B)小鼠-4胰腺的IFA分析(2);C)小鼠-5胰腺的IFA分析(1);D)小鼠-5胰腺的IFA分析(2);以及E)小鼠-6胰腺的IFA分析。圖12 :通過轉導物質His6-Foxp3-llR (SEQ IDNO:33)將T細胞重編程為Treg細胞(IA)。缺少⑶14單核細胞的PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達的流式細胞計數(shù)分析同型對照、PBS對照、樣品緩沖液對照以及蛋白(BSA100 μ g/ml)對照。圖13 :通過轉導物質His6-Foxp3_llR將T細胞重編程為Treg細胞(IB)。缺少⑶14單核細胞的PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達的流式細胞計數(shù)分析，所述PBMC用10 μ g/ml>20 μ g/ml 或 50 μ g/ml Hisl6-Foxp3_llR 處理。
圖14 :通過轉導物質His6-Foxp3-llR將T細胞重編程為Treg細胞(IIA)。PBMC中CD4和CD25蛋白表達的流式細胞計數(shù)分析同型對照和PBS對照。圖15 :通過 轉導物質His6-Foxp3_llR將T細胞重編程為Treg細胞(IIB)。PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達的流式細胞計數(shù)分析樣品緩沖液對照以及蛋白(BSA 100 μ g/ml)對照。圖16:通過轉導物質Hi s6-Foxp3-l IR將T細胞重編程為Treg細胞(I IC)。PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達的流式細胞計數(shù)分析，所述PBMC用10 μ g/ml或50 μ g/mlHisl6-Foxp3-llR 處理。圖17 :通過轉導物質His6-Foxp3_llR將T細胞重編程為Treg細胞(IID)。以100 μ g/mlHisl6-Foxp3-llR處理的PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達的流式細胞計數(shù)分析，所述 PBMC 用 100 μ g/ml Hisl6-Foxp3_llR 處理。圖18 :通過轉導物質將心肌成纖維細胞重編程為成熟的心肌細胞，所述轉導物質為 His6-Gata4-11R、His6-Mef2c_llR 和 His6_Tbx 5-1 IR (GMT) (b)、GMT 和戊丙酸(c)、GMT和異羥肟酸(d)，以及作為對照的緩沖液(a)。熒光顯微鏡圖片顯示在啟動子a MHC的控制下的GFP的表達。a MHC僅在成熟的心肌細胞中表達。圖19 :通過轉導物質將尾尖成纖維細胞重編程為成熟的心肌細胞，所述轉導物質為 His6-Gata4-11R、His6-Mef2c_llR 和 His6_Tbx 5-1 IR (GMT) (b)、GMT 和戊丙酸(c)、GMT和異羥肟酸(d)，以及作為對照的緩沖液(a)。熒光顯微鏡圖片顯示在啟動子a MHC的控制下的GFP的表達。a MHC僅在成熟的心肌細胞中表達。圖20 :示例性效應結構域的序列。圖21 :示例性轉導物質效應結構域-IlR的序列。圖22 :示例性轉導物質His6_效應結構域-IlR的序列。發(fā)明詳述本披露的一方面涉及包含效應結構域的轉導物質。在某些實施方式中，本披露所用的轉導物質是指非DNA或非來源于DNA的物質或分子，其能夠穿過或轉導或被穿過生物樣品的膜(例如，細胞膜)，以至于轉導物質可以從生物樣品的外部進入或被帶入生物樣品的內部，并發(fā)揮重編程功能。例如，轉導物質可以與細胞表面受體相互作用，通過受體介導的內吞作用促進物質進入細胞。在某些實施方式中，轉導物質是選擇性轉導物質，相比于其它生物樣品，其更容易轉導進入特定類型的生物樣品(例如，癌或腫瘤細胞)或在生物樣品中或周圍的特定微環(huán)境(例如，癌或腫瘤周圍的微環(huán)境)中變得可轉導。例如，選擇性轉導物質包含將選擇性轉導物質優(yōu)先遞送進入特定類型生物樣品的轉導結構域，或在生物樣品周圍微環(huán)境中變得可轉導的轉導結構域(例如，細胞靶向性肽或激活的細胞穿膜肽)。不限定于任何理論，預期轉導物質可以穿過細胞膜，進入細胞質對諸如翻譯、翻譯后修飾、信號通路、凋亡通路等細胞質中的活動進行重編程。進一步預期，轉導物質可以穿過核膜，對DNA或染色體復制、基因轉錄以及RNA剪接進行重編程或調節(jié)。效應結構域是一旦在生物樣品內部就能夠使生物樣品發(fā)生重編程改變的基序或分子。效應結構域可以與生物樣品中(如在細胞質中或細胞核中)的分子(例如，蛋白、DNA、RNA、糖以及脂質)相互作用，導致如增殖、分化、去分化、轉分化、反分化、轉決定、凋亡以及形態(tài)發(fā)生等改變。效應結構域可以是1)多肽，或其片段或模擬物；2)多核苷酸，它不是一旦轉導或包含進生物樣品的基因組就進行表達的基因，也不會導致遺傳修飾，但是卻能夠與生物樣品中的分子相互作用(例如，核酶、反義分子、siRNA或miRNA、寡核苷酸等等及諸如此類)；以及3)小分子或其它化學化合物(例如，化學治療藥物)。在某些實施方式中，效應結構域是天然可轉導的，例如roxi (例如SEQ ID N0:9)以及NeuroD (例如 SEQ ID N0:7)。效應結構域的一個例子是多肽，如轉錄因子、染色體重塑蛋白、抗體、或其片段或模擬物。效應結構域的另一個例子是小分子，它不是聚合物，且能夠與如蛋白、核酸或多糖等生物聚合物結合，并且改變生物聚合物的活性或功能。小分子的例子包括，但不限于，乙?；种苿⑥D錄活化劑、信號通路活化劑、信號通路抑制劑以及甲基化抑制劑。在另一個實施方式中，效應結構域可以是至少一種多肽，其將體細胞重編程為干·細胞或將細胞狀態(tài)由一種變?yōu)榱硪环N。例如，效應結構域可以是1)選自下組的多肽Klf4(例如 SEQ ID N0:3)、Sox2 (例如 SEQ ID N0:2)、Lin28 (例如 SEQ ID N0:5)、0ct4 (例如SEQ ID N0:l)、cMyc (例如 SEQ ID NO:4),Nanog (例如 SEQ ID N0:6)以及其任意組合；2)選自下組的多肽Klf4、Sox2、0ct4、cMyc及其任意組合；3)選自下組的多肽Sox2、0ct4、Lin28、Nanog及其任意組合；4)選自下組的多肽Ngn3 (例如SEQ IDN0:8)、PDX1 (例如SEQID NO:9), MafA (例如 SEQ ID NO: 10)、NeuroD (例如 SEQID NO:7)及其任意組合；5)包含F(xiàn)oxp3 (例如 SEQ ID NO: 11)的多肽；6)選自下組的多肽0ct4、Sox2、Klf4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1> MafA> NeuroD> Foxp3 及其任意組合；7)多妝 0ct4、Sox2、Klf4 以及 cMyc的組合；8)多肽Ngn3、PDXl以及MafA的組合；9)選自下組的多肽Nkx2. 5、GATA4(例如SEQ ID N0:68)、Mef-2C (例如 SEQID NO: 69)、ISLl、Wtl、Tbxl8、Tbx5 (例如 SEQ ID NO:70),Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C (其為STAT3的突變版本)，及其任意組合(示例性的序列如表I所示)；10)多肽Gata4、Mef2c和Tbx5的組合；以及11)選自下組的多肽:0ct4、Sox2、Klf4> Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1> MafA> NeuroD> Foxp3、Gata4、Mef2c 和 Tbx5,及其任意組合；以及 11)選自下組的第一多肽Nkx2. 5、GATA4、Mef_2C、ISLU Wtl、Tbxl8、Tbx5、Ref-1、Baf60c, STAT3、STAT3-C，及其任意組合；以及選自下組的第二多肽0ct4、Sox2、Klf4> Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1> MafA> NeuroD 和 Foxp3。表I效應結構域的示例性序列
效應結構域小·例性CM ' > 小·例性Mmn
(數(shù)據終:)________
Nkx2.5NP—004378」 _ 20(a)
(NCBI參考O
權利要求
1.一種包含效應結構域的轉導物質，其中所述效應結構域為多肽、小分子或多核苷酸，并且其中所述多肽選自Nkx2. 5、GATA4、Mef_2C、IslU WtU Tbxl8、Tbx5、Ref-1、Baf60c,STAT3、STAT3-C、其同源序列和其任意組合。
2.如權利要求I所述的轉導物質進一步包含蛋白，所述蛋白選自0ct4、Klf4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDXU MafA> NeuroD> Foxp3、其同源序列和其任意組合。
3.如權利要求I所述的轉導物質，其中所述同源序列指的是與所述蛋白中至少一個的序列至少70%相同的氨基酸序列。
4.如權利要求3所述的轉導物質，其中所述同源序列與所述蛋白中至少一個具有基本相同的活性。
5.如權利要求I所述的轉導物質進一步包含轉導結構域。
6.如權利要求5所述的轉導物質，其中所述轉導結構域與效應結構域共價、非共價或通過接頭相連接。
7.如權利要求I所述的轉導物質，其中所述效應結構域是天然可轉導的。
8.如權利要求I所述的轉導物質，其中所述效應結構域選自GATA4、Mef-2C、Tbx5、其同源序列和其任意組合。
9.如權利要求8所述的轉導物質，其中所述效應結構域具有氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO: 70、其同源序列和其組合。
10.如權利要求5所述的轉導物質，其中所述轉導結構域選自蛋白轉導結構域、細胞穿膜肽、細胞滲透肽、激活的細胞穿膜肽、細胞祀向性肽、聚合物及超荷電蛋白質(supercharged protein)。
11.如權利要求10所述的轉導物質，其中所述蛋白轉導結構域選自TAT、聚精氨酸、穿膜肽、突觸足穿膜肽、VP22、轉運肽、MAP、MTS、ΡΕΡ-l、精氨酸/色氨酸類似物、RRWRRWWRRWWRRW、聚胍類肽、聚胍類肽、天然蛋白轉導結構域、SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57、HIV-lRev、獸棚病毒衣殼肽、DNA結合肽、c-Fos、c_Jun、酵母GCN4、融合HA2肽以及超荷電GFP (supercharged GFP)。
12.如權利要求10所述的轉導物質，其中所述細胞靶向性肽是具有選自下列氨基酸序列的多肽NGR、RGD、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48、SEQ IDN0:49、SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53、SEQ IDN0:54 和 SEQID N0:58。
13.如權利要求10所述的轉導物質，其中所述聚合物選自陽離子脂類聚合物和納米粒。
14.如權利要求I所述的轉導物質，其中所述轉導物質能夠選擇性地轉導進入一種或多種特定生物樣品中，或者能夠在所述生物樣品周圍特定環(huán)境中變得可轉導。
15.如權利要求6所述的轉導物質，其中所述接頭具有SEQID:55所示的氨基酸序列。
16.如權利要求15所述的轉導物質，其中所述蛋白轉導結構域是聚精氨酸。
17.如權利要求16所述的轉導物質，其中所述轉導物質包含多肽，所述多肽含有選自SEQ ID N0:71、SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73、其同源序列和其任意組合多肽的氨基酸序列。
18.如權利要求5所述的轉導物質進一步包含一個或多個基序，所述基序不妨礙所述效應結構域或所述轉導結構域的功能。
19.如權利要求18所述的轉導物質，其中所述基序共價連接于所述效應結構域或所述轉導結構域。
20.如權利要求19所述的轉導物質，其中所述基序具有SEQID: 59所示的氨基酸序列。
21.如權利要求20所述的轉導物質，其中所述轉導物質包含多肽，所述多肽含有選自SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、其同源序列及其組合的氨基酸序列。
22.—種重編程生物樣品的方法，包括將所述生物樣品暴露于至少一種如權利要求I所述的轉導物質中。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述生物材料來源于生物體的細胞、組織或器官。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述生物體是微生物、植物或動物。
25.如權利要求22所述的方法，其中所述生物樣品被重編程，以引起增殖、分化、轉分化、反分化、轉決定、去分化、凋亡或形態(tài)發(fā)生。
26.如權利要求23所述的方法，其中所述細胞被重編程，從第一種類型的細胞改變?yōu)榈诙N類型的細胞。
27.如權利要求26所述的方法，其中所述第一種類型的細胞是成纖維細胞，所述第二種類型的細胞是心肌細胞、心臟干細胞或心臟祖細胞。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述第一種類型的細胞是心肌成纖維細胞或真皮成纖維細胞，并且所述第二種類型的細胞是心肌細胞、心臟干細胞或心臟祖細胞。
29.如權利要求27所述的方法，其中所述轉導物質包含多肽，所述多肽選自Nkx2. 5、GATA4、Mef_2C、ISLU WtU Tbxl8、Tbx5、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C、Nkx2.5-11R、 GATA4-11R、 Mef_2C_llR、 Isll-llR、 Wtl-llR、 Tbxl8_llR、 Tbx5_llR、Ref-1-11R、Baf60c-11R、STAT3-11R、STAT3-C-11R、His6_Nkx2. 5-11R、His6-GATA4_11R、His6-Mef-2C-11R、His6_Isl 1-1 IR、His6-Wtl_lIR、His6-Tbxl8_llR、His6-Tbx5_lIR、His6-Ref-l-llR、His6-Baf60c-llR、His6-STAT3-llR 和 His6-STAT3-C_11R。
30.一種包含權利要求I所述的轉導物質的藥物組合物。
31.如權利要求30所述的藥物組合物進一步包含表觀遺傳試劑。
32.如權利要求31所述的藥物組合物，其中所述表觀遺傳試劑包括曲古抑菌素A、丙戊酸、氮雜_2’ -脫氧胞苷或異羥肟酸。
33.一種包含生物樣品和權利要求I所述轉導物質的組合物，其中所述轉導物質已經轉導進入所述生物樣品。
34.一種將權利要求I所述的轉導物質用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療生物體的心血管疾病或狀況。
35.如權利要求34所述的用途，其中所述心血管疾病或狀況選自心肌梗塞、局部 缺血、心臟梗塞、梗塞后過程(post-infarction process)、心臟損傷、酒精性心肌病、冠狀動脈疾病、先天性心臟病、心臟受影響的營養(yǎng)病、缺血性(或缺血性)心肌病、高血壓性心肌病、瓣膜心肌病、炎性心肌病、系統(tǒng)代謝性疾病繼發(fā)性心肌病、心肌營養(yǎng)不良(myocardiodystrophy)、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制性心肌病和內心肌病。
36.一種治療生物體的疾病或狀態(tài)的方法，包括從所述生物體中取出生物樣品；將所述生物樣品暴露于如權利要求I所述的轉導物質；并將所述轉導物質轉導過的所述生物樣品移植回所述生物體。
37.一種開發(fā)基于細胞的療法的方法，所述療法針對各種疾病或狀態(tài)，所述方法包括 通過將iPSC、胚胎干細胞或祖細胞暴露于至少一種如權利要求I所述的轉導物質中而使所述iPSC、所述胚胎干細胞或所述祖細胞重編程為可移植的體細胞或可移植的祖細胞； 將所述可移植的體細胞或祖細胞移植進生物樣品或生物體中；以及 評估所述可移植的體細胞或祖細胞的治療效果。
38.一種開發(fā)疾病模型的方法,包括 將iPSC、胚胎干細胞或祖細胞暴露于至少一種如權利要求I所述的轉導物質中而使之重編程為可移植的體細胞或可移植的祖細胞； 將所述可移植的體細胞或祖細胞移植進生物樣品或生物體中；開發(fā)具有所述可移植的體細胞或祖細胞的疾病模型。
39.一種開發(fā)藥物篩選或毒性模型的方法,包括 通過暴露于至少一種權利要求I所述的轉導物質而使體細胞、祖細胞或多潛能細胞重編程為iPSC ； 通過或不通過暴露于所述轉導物質而從iPSC產生衍生細胞；并且 用所述iPSC和/或所述iPSC衍生的細胞來篩選不同化合物的效果和/或毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及重編程其他細胞(比如成纖維細胞)成為心肌細胞的組合物和方法，所述重編程不引入外源基因。本發(fā)明尤其涉及能夠轉導進入生物樣品的轉導物質，所述轉導物質不是基因、也不會導致遺傳修飾。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的轉導組合物重編程生物樣品的通路或治療疾病的方法。
文檔編號C12N15/12GK102947444SQ201180031080
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權日2010年6月23日
發(fā)明者朱勇, 吳時麗, 包駿 申請人:帷幄生物技術公司