專利名稱：對由血管老化引起的癥狀或疾病具有預防或減緩作用的組合物的制作方法
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種能夠預防或減輕由血管老化引起的癥狀或疾病，以花生四烯酸或以由花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物作為活性成分的組合物和食品或飲料，以及它們的制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種含有花生四烯酸、花生四烯酸的醇酯、以花生四烯酸為脂肪酸部分的甘油三酯和磷脂中的至少一種作為活性成分，并對血管彈性下降、動脈硬化(例如，缺血性心臟病(心肌梗塞和心絞痛)或腦中風(腦出血和腦梗塞))具有預防或減緩作用的組合物，具有預防或減緩作用的食品或飲料，以及它們的制備方法。
2.相關技術說明近幾年來，醫(yī)藥的發(fā)展使得社會中老年人的比例迅速增長。與此同時，患有動脈硬化的病人數(shù)量也在增長。根據(jù)FY2000健康與福利白皮書以及日本對患有腦梗塞的老年人的措施研究報告的記載，在該國中，僅在FY2000就有1.5-1.6百萬病人患有動脈硬化。每14個65歲或更年長的老年人中就有1個患有動脈硬化。預計在2030年，會增長到每10個人中就有一個患者。動脈硬化可以被粗分為髓樣動脈硬化，中層鈣化和硬化，和動脈毛細血管硬化。
髓樣動脈硬化在臨床上很重要。最初的開始位置是從主動脈到四肢動脈、冠狀動脈、大腦前動脈等。如果動脈硬化繼續(xù)發(fā)展，就會出現(xiàn)缺血性心臟病、包括頸動脈狹窄的腦梗塞、和閉塞性動脈硬化的癥狀，并會妨礙日常生活和社會行為。髓樣動脈硬化的易患因素除了高膽固醇外還包括老化、高血壓、糖尿病、吸煙、家族冠狀動脈疾病史、低HDL-膽固醇等，然而，據(jù)信，各種因素一起導致了髓樣動脈硬化。(Yakkyoku(藥理學)54，2245-2249，2003)。
基于這種考慮，通常根據(jù)這些推測的易患因素采用利用高脂血癥藥物、高血壓藥物、糖尿病藥物等的主要預防性療法，和根據(jù)缺血性心臟病或腦梗塞的癥狀采用利用抗血小板藥物、ACE抑制劑、β-阻滯劑、抗凝血劑、護腦劑等的次級預防性療法治療動脈硬化型疾病(Yakkyoku(藥理學)54，2287-2303，2003)。然而，幾乎所有這些都是治療癥狀的方法，例如，用抗血小板凝血劑和抗凝血酶藥來抑制腦中血小板的形成，用護腦劑來抑制在腦缺血中細胞受損，用藥物來抑制高脂血癥(動脈硬化的易患因素)，用抑制劑來控制高血壓。目前根本沒有用來減緩隨血管老化而出現(xiàn)的變化的藥物。
動脈硬化型疾病牽涉血管。形成血管細胞膜的磷脂與作為脂肪酸部分的主要為花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的多不飽和脂肪酸鍵合。但是，這些多不飽和脂肪酸不能在動物體內(nèi)被重新合成，而且必須直接或間接從飲食中攝取(對于花生四烯酸，通過前體亞油酸，對于二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，通過前體α-亞麻酸)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸，包括亞油酸和α-亞麻酸，具有降低血液中膽固醇的作用，和預期的預防動脈硬化的效果。(ShokuryoEiyo Kenko(食品、營養(yǎng)、和健康)，72-78，1991)。
但是，另外一方面，據(jù)報道n-6-型多不飽和脂肪酸亞油酸的過多攝入相反會使動脈硬化惡化(Rinsho Eiyo(臨床營養(yǎng))87，254-259，1995)。為了預防動脈硬化，推薦有效攝入n-3-型多不飽和脂肪酸α-亞麻酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。進一步的，與藥物相同，二十碳五烯酸乙酯作為治療高脂血癥和閉塞性動脈硬化的藥物在市場上有售，但是這種機制是基于對膽固醇的降低作用而不是對血管細胞膜的作用。
因此，存在開發(fā)通過預防所述血管老化和保持所述血管自身彈性而預防或減輕由所述血管老化引起的癥狀或疾病的化合物的強烈需求，該化合物優(yōu)于運用在食品中并且?guī)缀鯖]有副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種具有預防或減輕由血管老化引起的癥狀或疾病作用，并具有以花生四烯酸或以由花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物作為活性成分的組合物，具有預防或減緩由血管老化引起的癥狀和疾病的食品或飲料，以及它們的制備方法。
具體而言，發(fā)明人試圖提供一種含有花生四烯酸、花生四烯酸的醇酯、以花生四烯酸為脂肪酸部分的甘油三酯、和磷脂中的至少一種作為活性成分，并對血管彈性下降、動脈硬化(例如，缺血性心臟病(心肌梗塞和心絞痛)或腦中風(腦出血和腦梗塞))具有預防或減緩作用的組合物，具有預防或減緩作用的食品或飲料，以及它們的制備方法。
為了解釋以花生四烯酸或以由花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物作為活性成分的組合物在預防或減緩由血管老化引起的癥狀或疾病方面的效果，申請人進行了深入的研究。結果，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在用大于20個月的老齡老鼠作實驗來確定血管松弛作用時，申請人澄清了本發(fā)明活性成分的作用。另外，在通過一種微生物生產(chǎn)至少含有20％花生四烯酸的甘油酸三酯的工業(yè)生產(chǎn)中，他們也獲得了成功，并且能夠?qū)⒋擞糜诒景l(fā)明的效果測定中，而且闡明了其效果。進一步的，他們在生產(chǎn)含有甘油酸三酯的油方面也獲得了成功，所述甘油酸三酯通過酶法在1，3-位鍵合有中等鏈長的脂肪酸，在2位鍵合有花生四烯酸，并且能夠?qū)⒋擞糜诒景l(fā)明的效果測定中，而且闡明了其效果。
因此根據(jù)本發(fā)明，提供了一種以花生四烯酸或以由花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物作為活性成分，并具有預防或減緩由血管老化引起的癥狀或疾病作用的組合物，一種能夠預防或減緩由血管老化引起的癥狀或疾病的食品或飲料，以及生產(chǎn)它們的方法。具體而言，可以提供一種含有花生四烯酸、花生四烯酸的醇酯、以花生四烯酸為脂肪酸部分的甘油三酯和磷脂中的至少一種作為活性成分，并對血管彈性下降、動脈硬化(例如，缺血性心臟病(心肌梗塞和心絞痛)或腦中風(腦出血和腦梗塞))具有預防或減緩作用的組合物，具有預防或減緩作用的食品或飲料，以及它們的制備方法。這對當代社會的人們尤其有用。
附圖的簡要說明從以下給出參考附圖的優(yōu)選實施方案的描述，可更加清晰地顯示本申請的這些或其他目的和特征，其中

圖1是在用老齡鼠的血管進行體外實驗時，乙酰膽堿濃度與血管松弛率之間的關系圖；圖2是含有花生四烯酸的飲食關于老齡大鼠胸動脈中花生四烯酸含量的效果圖；圖3是在老齡大鼠中血管中花生四烯酸含量和血管松弛率之間的關系圖。
優(yōu)選實施方案的說明以下將在以附圖為參考的情況下對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行詳細說明。
本發(fā)明涉及一種以花生四烯酸或以由花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物作為活性成分，并能夠預防或減緩由血管老化引起的癥狀或疾病的組合物，一種能夠預防或減緩由血管老化引起的癥狀或疾病的食品或飲料，以及生產(chǎn)它們的方法。這些由血管老化引起的癥狀或疾病是指血管彈性下降、動脈硬化(例如，缺血性心臟病(心肌梗塞和心絞痛)或腦中風(腦出血和腦梗塞))，但是本發(fā)明不局限于這些癥狀或疾病。包括所有由血管老化引起的癥狀或疾病。
P.Ghosh等報道了如果在交配前10天到出分娩第21天期間，對12-14周大的老齡雌鼠給予高油飲食(20％的油含量)，即使在斷奶后恢復到正常飲食(3％的油含量)，并被飼養(yǎng)到23周大，與在交配前10天到分娩后第21天期間給予正常飲食的一組相比，其由血管的乙酰膽堿引起的松弛反應(血管彈性的指示劑)變小了(J.Physiol.533，815-822，2001)。
進一步的，與由給予正常飲食的母體生出的大鼠相比，由高油含量飲食組母體生出的大鼠的血管磷脂中脂肪酸組合物的花生四烯酸含量降低了，即便這些大鼠在斷奶后是以正常飲食飼養(yǎng)的。但是，正常飲食包括0.13％的花生四烯酸，因此按常規(guī)考慮，無法期待花生四烯酸的效果。發(fā)明人注意到隨著老化，大鼠血管松弛反應也下降了，并發(fā)現(xiàn)花生四烯酸克服了常規(guī)判斷的效果，并由此而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的活性成分為花生四烯酸?？墒褂盟幸曰ㄉ南┧嶙鳛橹舅岵糠值幕衔?。對于以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物，可提及的有花生四烯酸鹽，例如鈣鹽和鈉鹽。進一步的，可提及的有花生四烯酸的低級醇酯，例如花生四烯酸甲酯、花生四烯酸乙酯等。進一步的，可使用以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯、磷脂、糖脂等。需要指出的是，本發(fā)明不局限于上述物質(zhì)。所有以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物都可被使用。
當考慮在食品中運用時，花生四烯酸優(yōu)選以甘油三酯或磷脂的形式使用，尤其是以甘油三酯的形式。在自然界中幾乎沒有提供含有花生四烯酸的甘油三酯(與脂肪酸部分的一部分或全部都為花生四烯酸的甘油三酯同義)的來源。申請人首次使含有花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯在工業(yè)上的應用變?yōu)榭赡?，并通過測定20月大的老齡大鼠血管的松弛效應而闡明了本發(fā)明活性成分的作用。它們證實了其中存在對由血管老化引起的癥狀或疾病的預防或減緩作用。
因此，在本發(fā)明中可使用含花生四烯酸的甘油三酯，其中部分或全部脂肪酸部分為作為本發(fā)明活性成分的花生四烯酸。當使用含有占構成甘油三酯的總脂肪酸至少20wt(w/w)％，優(yōu)選至少30wt％，更優(yōu)選至少40wt％的花生四烯酸的食品用油時，優(yōu)選含有花生四烯酸的甘油三酯。因此，任何通過培養(yǎng)能產(chǎn)生含花生四烯酸的油(甘油三酯)的微生物都可用在本發(fā)明中。
作為能產(chǎn)生含花生四烯酸的油(甘油三酯)的微生物，可提及的有那些屬于被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫霉屬、青霉屬、分支孢子菌屬、毛霉菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、紅類酵母菌屬、蟲霉屬、echinosporangium和水霉屬的微生物。
在屬于從屬于被孢菌屬的被孢霉亞屬的微生物中，可提及的有長被孢霉mortierella elongata、微小被孢霉mortierella exigua、喜濕被孢霉mortierella hygrophila、高山被孢霉mortierella alpina等。尤其可提及的是，長被孢霉mortierella elongata IFO8570、微小被孢霉mortierella exigua IFO8571、喜濕被孢霉mortierellahygrophila IFO5941、高山被孢霉mortierella alpina IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68或其他菌株。
所有這些菌株可不受限制地得自大阪發(fā)酵研究所Institute forFermentation，Osaka(IFO)，美國菌種保藏中心(ATCC)，和Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS)。進一步的，還可使用由本發(fā)明研究組從土壤中分理出的長被孢霉mortierella elongataSAM0219(登記號為8703，保藏在發(fā)酵研究所)(登記號為1239，保藏在發(fā)酵研究所)。
為了培養(yǎng)本發(fā)明使用的菌株，將孢子、菌絲體、和由預先培養(yǎng)得到的預培養(yǎng)溶液移植到液體或固體培養(yǎng)基中，并在其中培養(yǎng)。對于液體培養(yǎng)基，作為碳源，可是用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、或其他經(jīng)常使用的資源，但是本發(fā)明不局限于這些物質(zhì)。
作為氮源，可使用蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、肉浸汁、酪蛋白水解物、玉米漿、大豆蛋白質(zhì)、脫脂大豆、棉籽渣、或其他天然氮源以及尿素和其他有機氮源，以及進一步的，硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、和其他無機氮源。此外，根據(jù)需要，可使用磷酸鹽、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銅、或其他無機鹽和維生素等作為微量營養(yǎng)素。這些培養(yǎng)基成分不受特殊局限，只要它們的濃度不阻礙微生物的生長就可。在實踐中，碳源濃度通常為0.1-40wt％，優(yōu)選1-25wt％。加入的氮源起始量為0.1-10wt％，優(yōu)選0.1-6wt％。還可能在培養(yǎng)期間加入一種氮源。
進一步的，通過控制培養(yǎng)基碳源濃度，還可使用一種含有至少45wt(w/w)％花生四烯酸作為活性成分的油(甘油三酯)。培養(yǎng)包括高達2-4個培養(yǎng)天的細胞生長期和從培養(yǎng)的第2-第4天的油形成期。碳源的起始濃度為1-8wt％，優(yōu)選1-4wt％。在細胞生長期和油形成階段初期相繼加入碳源。相續(xù)加入的碳源的總量為2-20wt％，優(yōu)選5-15wt％。需要指出的是，在細胞生長期和油形成階段初期相續(xù)加入的碳源量是通過根據(jù)起初初始氮源濃度的加入而得以控制的，從而使得培養(yǎng)基中碳源濃度從培養(yǎng)第7，優(yōu)選從培養(yǎng)第6天，更優(yōu)選從培養(yǎng)第4天時為零，由此獲得包含至少45wt％花生四烯酸的油(甘油三酯)。它在本發(fā)明中可用作活性成分。
產(chǎn)花生四烯酸的微生物的培養(yǎng)溫度取決于所用的微生物，但在5-40℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選20-30℃。進一步的，在通過培養(yǎng)細胞生長之后，為20-30℃，微生物可繼續(xù)在5-20℃中培養(yǎng)從而產(chǎn)生不飽和脂肪酸。最好通過這種溫度控制，提高所產(chǎn)脂肪酸中多不飽和脂肪酸的比例。培養(yǎng)基的pH值為4-10，優(yōu)選5-9。進行充氣攪拌培養(yǎng)，振動培養(yǎng)，或靜態(tài)培養(yǎng)。通常培養(yǎng)要進行2-30天，優(yōu)選5-20天，更優(yōu)選5-15天。
進一步的，除了控制介質(zhì)碳源濃度，作為提高含花生四烯酸的油(甘油三酯)中花生四烯酸比例的方法，還可選擇性水解含花生四烯酸的油從而獲得高花生四烯酸含量的油。用于這一選擇性水解的脂酶對甘油三酯沒有位置特異性，并且與雙鍵數(shù)量相比水解能力降低，因此水解的是脂肪酸的酯鍵而非多不飽和脂肪酸。進一步的，在所得的PUFA部分甘油酯之間發(fā)生了酯交換反應，從而導致具有增強的多不飽和脂肪酸的甘油三酯(“Enhancement of ArchidonicSelectiveHydrolysis of a Single-Cell Oil from Mortierella with Candidacylindracea Lipase”J.Am.Oil Chem.Soc.，72，1323-1327(1998))。
這樣就可使用由選擇性水解含花生四烯酸的油而獲得的含高濃度花生四烯酸的油(甘油三酯)作為本發(fā)明的活性成分。在本發(fā)明的含花生四烯酸的油(甘油三酯)中花生四烯酸相對總脂肪酸的比例因期望消除其他脂肪酸的作用而優(yōu)選高值，但是本發(fā)明不局限于高比例。實踐中，當應用于食品中時，花生四烯酸的絕對數(shù)量有時成為一個問題。使用含10wt％或更多花生四烯酸的油(甘油三酯)實際上也是可能的。
進一步的，作為部分或全部脂肪酸部分是由花生四烯酸構成的甘油三酯，可使用在1，3-位鍵合有中等鏈長脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯。進一步的，可使用至少5mol％，優(yōu)選至少10mol％，更優(yōu)選至少20mol％，最有選至少30mol％包含在1，3-位鍵合有中等鏈長脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯的油(甘油三酯)。使用的鍵合在甘油三酯的1，3-位上的中等鏈長脂肪酸可選自具有6至12個碳原子的脂肪酸中的一個。作為具有6-12個碳原子的脂肪酸，可提及的有例如辛酸或癸酸等。尤其優(yōu)選的是1，3-辛?；?2-花生四烯酰-甘油(此后同樣用“8A8”指代)。
在1，3-位鍵合有中等鏈長脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯是對老年人來說最理想的油。一般而言，當油(甘油三酯)被攝取并進入小腸時，它就會被胰脂酶水解，但是這種胰脂酶是1，3-位置特異性的。甘油三酯的1，3-位置裂解形成兩分子的游離脂肪酸。同時，產(chǎn)生了一分子2-單酰基甘油(2-MG)。這種2-MG在膽汁酸中具有極高的溶解性并很容易被吸收，因此通常認為2-位置的脂肪酸很容易被吸收。進一步的，當2-MG溶于膽汁酸中時它具有表面活性劑的作用并可起到提高脂肪酸吸收的作用。
接著，這些脂肪酸和2-MG與膽固醇或磷脂等一同產(chǎn)生了膽汁酸復合物膠束。它們被吸收進入小腸上皮細胞，在這里發(fā)生了三酰基甘油的再次鍵合。最后，產(chǎn)物作為乳糜微粒被釋放到淋巴。然而，對于這種胰脂酶的脂肪酸性質(zhì)，其在飽和脂肪酸中很高，而花生四烯酸很難裂解。還有一個問題就是胰脂酶的活性隨著老化而下降，所以對于易患由血管老化引起的癥狀或疾病的老年人來說，在1，3-位鍵合有中等長鏈脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯是最理想的油(甘油三酯)。
作為在1，3-位鍵合有中等長鏈脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯的一種具體生產(chǎn)方法，可能在存在含花生四烯酸和中等長鏈脂肪酸的油(甘油三酯)時導致僅在甘油三酯的1，3-位酯鍵上起作用的脂酶反應。作為原材料的油(甘油三酯)是具有花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯。當花生四烯酸相對構成甘油三酯的總脂肪酸的比例高時，通過保持溫度在30-50℃中，優(yōu)選40-50℃，高于20-30℃的普通酶反應溫度，而防止由未反應的油(原料甘油三酯和僅包含一個在1，3-位置上由中等長鏈脂肪酸構成的甘油三酯)的增加而導致的反應產(chǎn)率的降低。
作為在甘油三酯的1，3-位酯鍵上特異性反應的脂酶，可提及的有，例如，由例如根霉菌屬、根毛霉屬、曲霉屬這樣的微生物產(chǎn)生的那些和豬胰脂酶等。對于這種脂酶，可使用現(xiàn)有商品。例如，可提及的有Rhizopus delemar的脂酶(由Tanabe Seiyaku生產(chǎn)的Talipase)，米赫根毛霉的脂酶(由Novo Nordisk生產(chǎn)的LipozymeIM)，黑曲霉素的脂酶(由Amano Seiyaku生產(chǎn)的LipaseA)等，但是本發(fā)明不局限于這些酶。可以使用所有1，3-位特異性的脂酶。
由于為了提高反應效率，將溫度控制在至少30℃，優(yōu)選40℃，因此對于這種脂酶的應用方式，優(yōu)選使用為了賦予酶耐熱性而被固化在固化載體上的脂酶。作為這種固化載體，可提及的有，具有至少約100?？讖降亩嗫?高度多孔)樹脂型離子交換數(shù)值載體，例如，DowexMARATHON WBA。然而本發(fā)明并不局限于這些固化載體。可以應用所有能賦予耐熱性的固化載體。
將1，3-位-特異性脂酶混懸于相對于固化載體0.5-20倍量的水性溶液中。在攪拌中向該混懸液中徐徐加入冷的丙酮(例如-80℃)從而形成沉淀?？稍谡婵罩懈稍锼贸恋硪孕纬晒袒浮＿M一步的，可使用簡單的方法溶解相對于在最低水量中固化載體0.05-0.4倍量的1，3-位-特異性的脂酶，攪拌使其混合于固化載體中，并在真空中干燥所得產(chǎn)物從而制成固化酶。通過這一操作，大約90％的脂酶被固化在載體上，但是隨著這一結果的產(chǎn)生，根本沒有出現(xiàn)酯交換作用。通過在加入了1-10wt％(w/v)水的基質(zhì)，優(yōu)選在加入了1-3wt％水的基質(zhì)中進行預處理，該固化酶可被有效地活化并在生產(chǎn)中使用。
根據(jù)酶的類型，向反應體系中加入的水量非常重要。當沒加入水時，酯交換很難進行。進一步的，當水量很高時，便發(fā)生了水解，并且甘油酯的回收率降低(如果發(fā)生水解，產(chǎn)生了甘油二酯和單甘油酯)。然而，在此情況下，通過使用由預處理活化的固化酶，向反應體系中加入的水量變得不再重要了，即使在根本不含水的體系中也可發(fā)生有效的酯交換反應。進一步的，通過選擇酶劑的類型，還可省略預處理。
這樣，通過使用具有耐熱性的固化酶并提高該酶反應的溫度，即使在含對1，3-位-特異性酶具有低反應性的花生四烯酸的油(甘油三酯)中，反應效率也不會降低并可有效制備出在1，3-位鍵合有中等長鏈脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯(8A8)。
在制備對由血管老化引起的癥狀或疾病具有預防或減緩作用的產(chǎn)品或飲料中，可在花生四烯酸和/或以花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物中單獨或一起混入一種基本不含或含微量的花生四烯酸的食品或飲料成分。在此，“微量”是指即使食品或飲料成分含有花生四烯酸，即使一種含有花生四烯酸的食品組合物被人攝取，還不足以達到本發(fā)明在后解釋的每日花生四烯酸攝取量。
尤其，當部分或全部脂肪酸部分是由花生四烯酸組成的甘油三酯時，可應用的油(甘油三酯)不受限制?？勺鳛槭称?、飲料、化妝品和藥物的原料或添加劑。使用對象和用量不受任何限制。
作為食品組合物，例如，可提及的有普通食品、功能食品、營養(yǎng)補劑、特殊健康用途的食品、早產(chǎn)兒的乳配方、嬰兒乳配方、嬰兒食品、孕婦及產(chǎn)后婦女的食品、老年人食品。作為含有油的食品的例子，可提及的有肉、魚、堅果或其他本身含有油的天然食品、湯和其他在制備過程中加入了油的食品、油炸圈餅和其他使用油作為烹飪加熱介質(zhì)的食品、奶油和其他油型食品、餅干和其他在制備過程中加入了油的加工食品、硬烤瓷餅和其他在完工時噴有或包裹有油的食品等。進一步的，還可將本發(fā)明的組合物加入到農(nóng)產(chǎn)品、發(fā)酵食品、畜牧產(chǎn)品、海產(chǎn)品和飲料中。進一步的，功能食品或藥物的形式是可能的。例如，腸內(nèi)營養(yǎng)素、粉末、顆粒、錠劑、體內(nèi)液體藥物、懸浮液、乳劑、糖漿和其他經(jīng)加工形式都是可能的。
進一步的，除了本發(fā)明的活性成分外，本發(fā)明的組合物還可包括通常用于食品和飲料的、藥物和準藥物的各種載體和添加劑。優(yōu)選包括用于預防本發(fā)明活性成分氧化的抗氧化劑。作為抗氧化劑，可提及的例如維生素E、黃銅衍生物、葉甜素、曲酸、五倍子酸衍生物、兒茶素、蜂斗酸、棉酚、吡嗪衍生物、芝麻酚、愈創(chuàng)醇、愈創(chuàng)木酸guaiacicacid、對-香豆酸p-cumaric acid、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、甾醇、萜、核酸堿、類胡蘿卜素、木酚素、或其他天然抗氧化劑和抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸硬脂酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥甲苯(BHT)、單-t-丁基苯酚(HMBP)、和其他合成抗氧化劑。
在維生素E中，可提及的有α-維生素E、β-維生素E、γ-維生素E、δ-維生素E、ε-維生素E、ζ-維生素E、η-維生素E和維生素E酯(維生素E乙酸酯等)和進一步作為類似化合物的tocotriethanol。進一步的，在類胡蘿卜素中，可提及的例如有β-胡蘿卜素、胡蘿卜黃色素cantaxanthin、蝦青素等。
除了本發(fā)明的活性成分，本發(fā)明的組合物還可包括作為載體的各種載體、膨脹劑、稀釋劑、稠化劑、分散劑、賦型劑、粘結溶液(例如水、乙醇、植物油)、助溶劑、緩沖劑、溶解促進劑、凝膠劑、懸浮劑、面粉、米粉、淀粉、玉米淀粉、多糖、乳蛋白質(zhì)、膠原、米糠油、卵磷脂等。作為添加劑，可提及的例如有維生素、增甜劑、有機酸、著色劑、調(diào)味劑、抗潮劑、纖維、電解質(zhì)、礦物質(zhì)、營養(yǎng)素、抗氧化劑、防腐劑、香料、保濕劑、天然植物提取物、植物提取物等，但是本發(fā)明不局限于這些物質(zhì)。
花生四烯酸和以花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物的主要活性成分為花生四烯酸。據(jù)報道，在日本的Kanto地區(qū)，每日從飲食中攝取的花生四烯酸為0.14g，在Kansai地區(qū)為0.19-0.20g(ShishitsuEiyogaku(Lipid Nutrition)4，73-82，1995)?？紤]到老年人對油的攝取下降，胰脂酶活性下降等這些事實，就有必要攝入相當大量甚至更多的花生四烯酸。因此，要求成人(例如體重為60kg)每日攝取轉化為花生四烯酸量為0.001-20g，優(yōu)選0.01-10g，更優(yōu)選0.05-5g，最優(yōu)選0.1-2g的花生四烯酸和以花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物。
當將本發(fā)明的活性成分實際應用于食品或飲料時，混入在食品中的花生四烯酸的絕對量同樣重要。然而，即使混入在食品或飲料中的絕對數(shù)量依賴于其混入其中的食品或飲料的攝取變化，因此當將含有部分或全部脂肪酸部分是由花生四烯酸構成的甘油三酯的甘油三酯混入食品中時，優(yōu)選混合使得至少0.001wt％，優(yōu)選至少0.01wt％，更優(yōu)選至少0.1wt％為花生四烯酸。進一步的，當將在1，3-位鍵合有中等長鏈脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯混入食品或飲料時，優(yōu)選混合使得至少0.0003wt％，優(yōu)選至少0.003wt％，更優(yōu)選至少0.03wt為花生四烯酸。
當使用本發(fā)明的組合物作為藥物時，可通過制藥領域中的常用方法制備，例如，在日本藥典中記載的方法或基于日本藥典的方法。進一步的，當使用本發(fā)明的組合物作為藥物時，該組合物中所含活性成分的量并不受到特殊局限，只要可達到本發(fā)明的目的即可?？梢允褂眠m宜的或適當?shù)谋嚷省?br> 當使用本發(fā)明的組合物作為藥物時，優(yōu)選以用藥單元形式給藥，優(yōu)選口服給藥。本發(fā)明組合物的劑量可根據(jù)年齡、體重、癥狀、劑量數(shù)目等改變，但是例如，應當每天分為1-3個劑量，對每個成年人(假設約60kg)每天施用轉化為花生四烯酸量通常約為0.001g-20g，優(yōu)選0.01g-10g，更優(yōu)選0.05g-5g，最優(yōu)選0.1g-2g的本發(fā)明的花生四烯酸和/或以花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物。
組成血管細胞膜的磷脂具有高不飽和脂肪酸，主要是花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，作為與其鍵合的脂肪酸部分。當考慮到平衡問題時，優(yōu)選與二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的組合。進一步的，最優(yōu)選其中花生四烯酸/二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸在花生四烯酸和二十二碳六烯酸的組合中的比例為0.25-8的食品或飲料。
實施例接下來，將通過實施例具體解釋本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不局限于這些實施例。
參考實施例1.以花生四烯酸為脂肪酸部分的甘油三酯的制備方法使用高山被孢霉mortierella alpina CBS754.68作為產(chǎn)花生四烯酸的微生物。在10kl培養(yǎng)池中制備6kl含1.8％葡萄糖，3.1％脫脂大豆粉，0.1％大豆油、0.3％KH2PO4，0.1％Na2SO4，0.05％CaCl2-2H2O，和0.05％MgCl2-6H2O的培養(yǎng)基。將起始pH值調(diào)至6.0。接種30升的預培養(yǎng)溶液，在26℃，以360m3/h充氣，200kPa池內(nèi)壓的條件下進行充氣攪拌培養(yǎng)8天。注意調(diào)節(jié)攪拌速度，以使溶質(zhì)氧濃度保持在10-15ppm。進一步的，利用補料分批法控制葡萄糖的濃度，以使直至第4天時葡萄糖在培養(yǎng)基中的濃度在1-2.5％的范圍內(nèi)，以后在0.5-1％的范圍內(nèi)(上述％為重量(W/V)％)。
培養(yǎng)結束后，利用過濾和干燥回收含有以花生四烯酸為脂肪酸部分的甘油三酯的細胞。通過己烷萃取將所得細胞轉化為油。對食用油進行純化處理后(脫膠、脫氧、除臭和脫色)，得到150kg的含花生四烯酸的甘油三酯(包含含花生四烯酸，其中部分或全部的脂肪酸部分為花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯)。所得的油(甘油三酯)是經(jīng)甲基-酯化的，用氣相色譜分析所得脂肪酸甲基酯，發(fā)現(xiàn)花生四烯酸在總脂肪酸中的比例為40.84％。
發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、雙高-γ-亞麻酸等為11.63％、7.45％、7.73％、9.14％、2.23％和3.27％。進一步的，上述含花生四烯酸的油(甘油三酯)是乙基-酯化的，通過現(xiàn)有的高效液相色譜從含40％花生四烯酸乙基酯的脂肪酸乙基酯混合物中分離并提純出99％的花生四烯酸乙基酯。
參考實施例2.制備含至少5％在1，3-位鍵合有中等長鏈脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯(8A8)將100g離子交換樹脂載體(Dowex MARATHON WBADow Chemical)懸浮于80ml的Rhizopus delemar脂酶水溶液(Talipase粉末，12.5％Tanabe Seiyaku)，攪拌加入240ml的冷丙酮(-80℃)，在真空中干燥該混合物從而獲得固化脂酶。
接著，在30℃下攪拌(130rpm)中使參考實施例1中所得的80g含40％花生四烯酸的甘油三酯(SUNTGA40S)，160g辛酸，12g上述固化脂酶，和4.8ml水發(fā)生反應48小時。反應結束后，除去反應溶液從而獲得活化的固化酶。
接著，將10g固化酶(Rhizopus delemar脂酶，載體DowexMARATHON WBA)裝入夾層玻璃柱(1.8×12.5cm，柱31.8ml)。使包含參考實施例1中SUNTGA40S和辛酸的1∶2混合物的反應油以連續(xù)反應的固定流速(4ml/h)通過該柱，從而得到400g反應油。注意柱溫保持在40-41℃。通過分子蒸餾將未反應的辛酸和游離脂肪酸從所得的反應油中除去，并使產(chǎn)物通過食用油的提純過程(脫膠、脫氧、除臭和脫色)，從而獲得含有8A8的油(甘油三酯)。
進一步的，使用氣相色譜和高壓液相色譜研究8A8在所得的含8A8的油(甘油三酯)中的比例，發(fā)現(xiàn)該比例為31.6％(注意8P8、808、8L8、8G8和8D8的比例為0.6、7.9、15.1、5.2和4.8％。鍵合在甘油三酯的2-位上的脂肪酸P、O、L、G和D為棕櫚酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、和雙高-γ-亞麻酸，8P8是指1，3-辛?；?2-油酰-甘油，808是指1，3-辛?；?2-油酰-甘油，8L8是指1，3-辛酰基-2-亞油酰-甘油，8G8是指1，3-辛?；?2-γ-亞麻酰-甘油，和8D8是指1，3-辛?；?2-雙高-亞麻酰-甘油)。注意通過已知的高壓液相色譜法從所得的含8A8的油(甘油三酯)中分離并提純出96mol％8A8。
實施例1.由乙酰膽堿血管松弛反應試驗對SUNTGA40S的測定用大鼠研究了在參考實施例1中制備的以花生四烯酸為脂肪酸部分的甘油三酯(含花生四烯酸的油(SUNTGA40S))對乙酰膽堿血管松弛反應的作用。作為試驗組的老齡大鼠，將15只19月大的雄性Fisher大鼠分為對照飲食組(8只大鼠OC組)和一個SUNTGA40S化合物飲食組(7只大鼠OA組)。給予對照飲食和SUNTGA40S飲食的組顯示在表1中。進一步的，使用年幼大鼠作為對照組，對10只1月大的雄性Fisher大鼠給予對照飲食，顯示在表1中。
表1.實驗飲食
大鼠的攝入量約為20g，每只大鼠每日的SUNTGA40S攝入量為100mg。在參考實施例1中制備的與含花生四烯酸的油(SUNTGA40S)鍵合的總脂肪酸的40％為花生四烯酸，所以每只大鼠每日的花生四烯酸的攝入量為40mg。該40mg被轉化為人的攝入量時相當于133mg/60kg/天。
在飼養(yǎng)的第三個月中(對于老齡大鼠，為22月大，對于年幼大鼠，為4月大)，切離胸動脈。部分用于體外血管松弛反應試驗，而剩余的血管用于脂肪酸組合物的分析。血管松弛反應試驗需要用謹慎切除的胸動脈制成血管環(huán)從而不破壞通過苯福林可形成提前皺縮的血管內(nèi)皮，然后用10-9M-10-6M濃度的乙酰膽堿測量松弛反應。結果，與年幼大鼠相比，老齡大鼠的血管松弛反應明顯下降，但是對含花生四烯酸的油的攝入提高了老齡大鼠的血管的松弛反應(圖1)。
接著，通過福爾茨方法從切離的胸動脈中提取出總脂。從提取的脂肪中除去水作為與乙醇的共沸混合物，然后通過氣相色譜用10％鹽酸-甲醇分析該脂肪酸組合物為脂肪酸甲酯。結果，與年幼大鼠相比，老齡大鼠的每單位血管重的花生四烯酸的量明顯下降，但是由于含花生四烯酸的油的攝入，老齡大鼠的每單位血管重的花生四烯酸的量增加了(圖2)。進一步的，研究了老齡大鼠每單位胸動脈重的花生四烯酸含量與由10-7M乙酰膽堿引起的血管松弛率之間的相互關系。結果發(fā)現(xiàn)與花生四烯酸含量的顯著的高的相關(R＝0.92)(圖3)。這樣就首次顯示出了通過攝入含花生四烯酸的油，血管松弛能力或血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮功能。這就首次闡明了該作用是由花生四烯酸產(chǎn)生的。
實施例2.通過乙酰膽堿血管松弛反應試驗對8A8(96mol％)的測定用大鼠研究了在參考實施例2中制備的在1，3-位鍵合有中等長鏈脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯(8A8)對乙酰膽堿血管松弛反應的作用。作為試驗組的老齡大鼠，將15只19月大的雄性Fisher大鼠分為對照飲食組(8只大鼠OC組)和一個8A8飲食組(7只大鼠OB組)。給予對照飲食和8A8飲食的組顯示在表2中。進一步的，使用年幼大鼠作為對照組，對10只1月大的雄性Fisher大鼠給予對照飲食，顯示在表2中(10只大鼠YC)。注意對于8A8飲食使用的8A8，使用的是由參考實施例2中獲得的96mol％8A8。
表2.實驗飲食
大鼠的攝取量約為20g，8A8的分子量為628.7，因此實驗飲食的分配要使8A8組中每只大鼠每日的花生四烯酸攝取為40mg。這一40mg轉化為人的攝入量時相當于133mg/60kg/天。
在飼養(yǎng)的第三個月后(對于老齡大鼠，為22月大，對于年幼大鼠，為4月大)，切離胸動脈。部分用于體外血管松弛反應試驗，而剩余的血管用于脂肪酸組合物的分析。血管松弛反應試驗需要用謹慎切除的胸動脈制成血管環(huán)從而不破壞通過苯福林可形成提前皺縮的血管內(nèi)皮，然后用10-9M-10-6M濃度的乙酰膽堿測量松弛反應。
結果，對于攝入對照飲食的年幼大鼠，由10-7M乙酰膽堿形成的血管松弛率平均為80.5％，對于攝入對照飲食的老齡大鼠為52.3％，對于攝入8A8飲食的老齡大鼠為62.7％。老齡大鼠對8A8的攝取提高了血管松弛反應。
實施例3.制備含以花生四烯酸為脂肪酸部分的油(甘油三酯)的膠囊向100重量份的明膠和35重量份的食物添加甘油中加入水從而在50-60℃中將它們?nèi)芙?，并制備粘度?000cp的明膠包衣。接著，將0.05wt％維生素E油與在參考實施例1中獲得的含花生四烯酸的油(甘油三酯)混合從而制備內(nèi)容物1。將0.05wt％維生素E和在參考實施例2中獲得的含32mo l％8A8的油混合從而制備內(nèi)容物2。
接著，將在制備實施例1中獲得的50wt％含花生四烯酸的油(甘油三酯)與50wt％魚油(金槍魚油二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸在總脂肪酸中分別為5.1％和26.5％)混合，然后混入0.05wt％維生素E油從而制備內(nèi)容物3。將80wt％含花生四烯酸的油(甘油三酯)與20wt％魚油(金槍魚油二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸在總脂肪酸中分別為5.1％和26.5％)混合，然后混入0.05wt％維生素E油從而制備內(nèi)容物4。向在參考實施例1中獲得的99％花生四烯酸乙酯中混入0.05wt％維生素E油從而制備內(nèi)容物5。周內(nèi)容物1-5，通過常規(guī)方法制備并干燥膠囊從而生產(chǎn)出每個膠囊含有200mg內(nèi)容物的軟膠囊。
實施例4.在脂肪浸劑中的應用加入400g含32％在參考實施例2中制備的8A8的油(甘油三酯)，48g純化卵黃卵磷脂、20g油酸，100g甘油，和40ml 0.1N苛性鈉，并用均漿器將其分散，加入注射用蒸餾水將其稀釋至4升。用高壓噴霧型乳化器將所得物乳化從而制備脂質(zhì)乳劑。將該脂質(zhì)乳劑以每次200ml注射入塑料袋，然后在121℃下高壓蒸汽消毒20分鐘從而獲得脂肪浸劑。
實施例5.在果汁中應用向20ml 20％的乙醇水溶液中加入2gβ-環(huán)糊精。用攪拌器攪拌下，加入100mg在參考實施例1中獲得的含花生四烯酸的甘油三酯(含0.05wt％的維生素E)，并在50℃下將所得物培養(yǎng)2小時。將該混合物冷卻至室溫(約1小時)，然后在4℃不斷攪拌下進一步培養(yǎng)10小時。通過離心分離回收所產(chǎn)沉淀物，用n-己烷洗滌，然后冷凍干燥從而獲得1.8g的包含含花生四烯酸的甘油三酯的環(huán)糊精包封化合物。將1g這種粉末與10升果汁混合均勻從而制備包含含花生四烯酸的甘油三酯的果汁。
雖然本發(fā)明是通過參考以例證目的選用的具體實施方案而描述的，但應當明確的是本領域的技術人員可在不背離本發(fā)明的基本概念和范圍的情況下作出多種更改。
權利要求
1.一種對由血管老化引起的癥狀或疾病具有預防或減緩作用的組合物，包括花生四烯酸和以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物中的任意一種。
2.一種權利要求1所述的組合物，其中所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物是花生四烯酸的醇酯、以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯、和磷脂中的任意一種。
3.一種權利要求2所述的組合物，其中在所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯中，所述花生四烯酸在包括所述甘油三酯的總脂肪酸中的比率為至少20％。
4.一種權利要求2所述的組合物，其中所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯是從下述的任意一種微生物中提取出的，所述微生物為被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫霉屬、青霉屬、分支孢子菌屬、毛霉菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、紅類酵母菌屬、蟲霉屬、echinosporangium和水霉屬。
5.一種權利要求2所述的組合物，其中所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯是包括至少5％在1，3-位鍵合有中等鏈長脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯。
6.一種權利要求5所述的組合物，其中所述的中等鏈長脂肪酸選自具有6至12個碳原子的脂肪酸。
7.一種權利要求1-6中任意一項所述的組合物，其中所述的由血管老化引起的癥狀為血管彈性的下降。
8.一種權利要求1-6中任意一項所述的組合物，其中所述的由血管老化引起的癥狀為動脈硬化，且所述的疾病為缺血性心臟病。
9.一種權利要求8所述的組合物，其中所述的缺血性心臟病為心肌梗塞和心絞痛中的一種。
10.一種權利要求1-6中任意一項所述的組合物，其中所述的由血管老化引起的癥狀為動脈硬化，且所述的疾病為腦中風。
11.一種權利要求10所述的組合物，其中所述的腦中風為腦出血和腦梗塞中的一種。
12.一種對由血管老化引起的癥狀或疾病具有預防或減緩作用的食品或飲料，包括花生四烯酸和以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物中的任意一種。
13.一種權利要求12所述的食品或飲料，其中所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物是花生四烯酸的醇酯、以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯、和磷脂中的任意一種。
14.一種權利要求13所述的食品或飲料，其中在所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯中，所述花生四烯酸在包括所述甘油三酯的總脂肪酸中的比率為至少20％。
15.一種權利要求13所述的食品或飲料，其中所述的以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯是從下述的任意一種微生物中提取出的，所述微生物為被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫霉屬、青霉屬、分支孢子菌屬、毛霉菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、紅類酵母菌屬、蟲霉屬、echinosporangium和水霉屬。
16.一種權利要求13所述的食品或飲料，其中所述的含有以花生四烯酸作為脂肪酸部分的甘油三酯為包括至少5％在1，3-位鍵合有中等鏈長脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯。
17.一種權利要求16所述的食品或飲料，其中所述的中等鏈長脂肪酸選自具有6至12個碳原子的脂肪酸。
18.一種權利要求12至17中所述的對由血管老化引起的癥狀或疾病具有預防或減緩作用的食品或飲料，其中所述的食品或飲料為功能食品、營養(yǎng)補充劑、特殊健康用食品和老年病學食品中的任意一種。
19.一種權利要求12至17中任意一項所述的食品或飲料，其中所述的由血管老化引起的癥狀為血管彈性的下降。
20.一種權利要求12至17中任意一項所述的食品或飲料，其中所述的由血管老化引起的癥狀為動脈硬化，且所述的疾病為缺血性心臟病。
21.一種權利要求20所述的食品或飲料，其中所述的缺血性心臟病為心肌梗塞和心絞痛中的一種。
22.一種權利要求12至17中任意一項所述的食品或飲料，其中所述的由血管老化引起的癥狀為動脈硬化，且所述的疾病為腦中風。
23.一種權利要求22所述的食品或飲料，其中所述的腦中風為腦出血和腦梗塞中的一種。
24.一種由花生四烯酸與二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一種的聯(lián)合構成的食品或飲料，其中花生四烯酸與二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一種的比例范圍為0.25-8。
25.一種包括至少0.001％(重量)的在1，3-位鍵合有中等鏈長脂肪酸并在2位鍵合有花生四烯酸的甘油三酯的食品或飲料。
26.一種權利要求25所述的食品或飲料，其中所述的中等鏈長脂肪酸選自具有6至12個碳原子的脂肪酸。
27.一種制備對由血管老化引起的癥狀或疾病具有預防或減緩作用的食品或飲料的方法，包括單獨將花生四烯酸和以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物中的至少一種單獨或一起與食品或飲料成分混合，在該食品或飲料中基本不含有或含有微量的花生四烯酸。
28.一種預防或治療由血管老化引起的癥狀或疾病的方法，包括對有此治療需求的受治療者施用花生四烯酸和以花生四烯酸作為脂肪酸部分的化合物中的一種。
全文摘要
一種包含花生四烯酸或具有花生四烯酸為脂肪酸部分的化合物，并具有預防或減緩由血管老化引起的癥狀或疾病的作用的組合物和食品或飲料。
文檔編號A61P9/00GK1723016SQ20048000175
公開日2006年1月18日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權日2003年10月29日
發(fā)明者石倉義之, 堀川千賀, 小野佳子, 秋元健吾, 松村靖夫 申請人:三得利株式會社