專利名稱：：分枝桿菌的電穿孔和抗原在分枝桿菌中的過量表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了具有改進(jìn)疫苗特性的分枝桿菌菌株，可以用作對(duì)抗肺結(jié)核的預(yù)防接種試劑。這些分枝桿菌菌株優(yōu)選選自被鑒定為具有有效免疫原性的親本株，不表現(xiàn)抗生素拮抗性，并且不顯示向革蘭氏陰性菌的水平轉(zhuǎn)移。本發(fā)明也提供了具有改進(jìn)特性的分枝桿菌，可以傳遞具有疫苗特性的轉(zhuǎn)基因，用于對(duì)抗其他疾病的預(yù)防接種和癌癥的治療。
背景技術(shù)：
：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Μ.tb)已經(jīng)感染了世界上三分之一的人群，每年引起8百萬人得病并殺死1.6-2.2百萬人，這些人大多數(shù)生活在發(fā)展中世界。結(jié)核病(TB)是一個(gè)全球比例的流行病，因?yàn)榻Y(jié)核病與艾滋病病毒的交叉?zhèn)鞑?，它正在增加并且變得甚至更加致命。結(jié)核病是患有艾滋病的人群的頭號(hào)殺手?？ń槊?BCG)是當(dāng)前被廣泛使用的結(jié)核病疫苗，在80多年前被研制出來，并且在其被測(cè)試時(shí)，它對(duì)抗肺結(jié)核的療效有很大的變化率，包括最近在印度所作的一次大范圍的試驗(yàn)中沒有有效性。(Fineetal.，Vaccine,16(20)1923-1928；1998；Anonymous,IndianJMedRes.，Aug；11056-69；1999)。盡管如此，世界衛(wèi)生組織目前仍然對(duì)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家的所有孩子(除了有艾滋病癥狀的那些孩子)在出生時(shí)或與檢疫部門第一次接觸時(shí)就推薦卡介苗。這個(gè)政策是基于卡介苗能防止嚴(yán)重的兒童時(shí)期的結(jié)核病。(Lanckriet等人.，IntJEpidemiol,24(5)1042-1049；1995；Rodrigues^A,JEpidemiolCommunityHealth,45(1):78-80;1991)?？ń槊鐚?duì)與超過幼兒時(shí)期的結(jié)核病的預(yù)防是一個(gè)引起爭(zhēng)議的話題，其有限的數(shù)據(jù)造成了混亂的結(jié)果。發(fā)展中國(guó)家的兒童與成年的結(jié)核病的高發(fā)生率，雖然在這些國(guó)家嬰兒的卡介苗的免疫接種是廣泛實(shí)行的，然而，這顯示了當(dāng)前給藥的卡介苗經(jīng)過這么多年，當(dāng)人們處于結(jié)核病的危險(xiǎn)之中時(shí)，并不是高度有效的，因此，卡介苗被不認(rèn)為是一個(gè)干預(yù)并控制結(jié)核病的合適的公共衛(wèi)生工具。大約有70%接觸結(jié)核病生物體的人，這些人有正常的免疫系統(tǒng)，不會(huì)被傳染，在被傳染的人中，大約只有5%在最初的兩年發(fā)展成疾病。大多數(shù)被感染的個(gè)體都會(huì)抑制住感染，這是與對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原的有力的細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)展相關(guān)的。當(dāng)免疫力下降時(shí)，另外的5%稍后重新激活。初次的和重新激活的這兩種疾病在帶有艾滋病毒的人群中非常常見，再一次強(qiáng)調(diào)了免疫性在防止和控制感染上的的重要性。
發(fā)明內(nèi)容因?yàn)榇蠖鄶?shù)人都能控制結(jié)核病，所以這里有很好的理由希望，通過誘導(dǎo)出合適種類的長(zhǎng)效的免疫性，從而有可能開發(fā)出有效的疫苗來防止接觸后初期的感染，防止早期的疾病的發(fā)展，防止從潛伏狀態(tài)重新激活，防止治療后的舊病復(fù)發(fā)。終極目標(biāo)是，它是系統(tǒng)疫苗的使用和化學(xué)治療的干預(yù)的組合來最終消除結(jié)核分枝桿菌成為人的病原體?？紤]到兒童時(shí)期的卡介苗接種被認(rèn)為在預(yù)防急性結(jié)核病時(shí)起著關(guān)鍵的作用，在沒有壓倒優(yōu)勢(shì)的證據(jù)證明新的結(jié)核病的疫苗是更好的產(chǎn)品時(shí)，那就很難在試驗(yàn)中替換卡介苗來評(píng)價(jià)候選的結(jié)核病疫苗。問題是結(jié)核分枝桿菌主要是人特異性的病原體，動(dòng)物模型只能模仿寄主-病原體相互作用的一部分。因此，證明新的結(jié)核病疫苗擁有改進(jìn)的效力的明確證據(jù)只能從人類的對(duì)照現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中獲得。這些考慮導(dǎo)致了許多研究者得出結(jié)論，得到改進(jìn)的結(jié)核病疫苗的的一個(gè)關(guān)鍵步驟將是開發(fā)改進(jìn)的卡介苗菌株，盡管動(dòng)物模型有它們的局限性，但它們?nèi)匀话凳玖四苓^量表達(dá)保護(hù)性抗原的重組卡介苗(rBCG)與卡介苗相比，其效力有所提高。某些結(jié)核分枝桿菌抗原具有疫苗的特性，并且當(dāng)作為疫苗制劑給藥于動(dòng)物時(shí)，這些抗原給予的保護(hù)與卡介苗單獨(dú)給藥時(shí)獲得的保護(hù)是類似的(Anderson，InfectImmun,62(6)2536-2544;1994)。為了推動(dòng)這些候選疫苗向前發(fā)展，已開發(fā)出一個(gè)策略來提高卡介苗中這些抗原的免疫原性。因此，卡介苗菌株被研制成能過量表達(dá)選定的結(jié)核分枝桿菌抗原，而且這些衍生于親本卡介苗菌株的重組卡介苗(rBCG)菌株與親本卡介苗菌株相比，顯示出能誘導(dǎo)更加強(qiáng)大的保護(hù)作用(Horwitzetal.，InfectImmun,72(4)1672-1679；2003)。在一項(xiàng)研究中，表達(dá)抗原85B(在此被稱為“Ag85B”)的重組卡介苗菌株與混合相同抗原的卡介苗相比，被證明是更具有效性(Horwitzetal.,supra,2003)0根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，該方法有著巨大的潛力。在某些情況下，過量表達(dá)抗原的卡介苗菌株可以用來安全地和有效地引起免疫應(yīng)答，起到避免結(jié)核病感染的保護(hù)作用。本發(fā)明提供了具有改進(jìn)疫苗特性的、遺傳工程化的(重組)分枝桿菌菌株，可以用作對(duì)抗結(jié)核病的預(yù)防接種試劑。它們具有很多特征，每一個(gè)都能起到提高菌株免疫原性的作用。本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株是從親本株發(fā)展而來，這些親本株是有目的地根據(jù)它們有效的免疫原性而選擇出來的。換句話說，被選為親本株用于進(jìn)行基因操作(比如去過量表達(dá)結(jié)核病抗原)的分枝桿菌菌株，它之所以被選中，是因?yàn)?，甚至在基因操作前，它在被接種的寄主身上已經(jīng)能引起有效的免疫應(yīng)答。卡介苗菌株Danish1331就是一個(gè)例子。然后優(yōu)選這些菌株被修飾，比如用來過量表達(dá)所研究的結(jié)核病抗原。更優(yōu)選地，在基因重組的分枝桿菌中使用一個(gè)可體內(nèi)被激活的啟動(dòng)子。另外，本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株被遺傳工程化后不需要根據(jù)抗生素拮抗來選擇，或者以根本不需要任何選擇性標(biāo)記的方式來構(gòu)造，這樣使得它們?cè)谌巳褐凶鳛榻臃N試劑使用時(shí)通常是安全的。例如，將分枝桿菌復(fù)制所需要的基因切除，并放置于一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中。另外，本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株并不會(huì)水平轉(zhuǎn)移成革蘭氏陰性菌，因此就不能從寄主生物體中“逃脫”。這樣也保證了它們?cè)谌巳褐凶鳛榻臃N試劑時(shí)的安全性。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明描述了通過質(zhì)粒表達(dá)的抗原85b被用作質(zhì)粒穩(wěn)定因子的應(yīng)用，這樣避免了需要抗生素選擇來維持培養(yǎng)。用高濃度的表達(dá)抗原Ag85B和其他抗原的最小質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化分枝桿菌菌株，并使用PCR陽(yáng)性選擇作為它們的確認(rèn)，產(chǎn)生的分枝桿菌菌株即使沒有抗生素或營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選擇，也具有質(zhì)粒的穩(wěn)定性并過量表達(dá)抗原。另外，本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株作為用于結(jié)核病疫苗很好的試劑的同時(shí)，它們也可以被遺傳工程化后表達(dá)或過量表達(dá)與結(jié)核病不相關(guān)的抗原，因此作為對(duì)抗其他疾病的疫苗試劑時(shí)也很有效。此外，過量表達(dá)結(jié)核病抗原或其他疾病重要的抗原的重組卡介苗可以與重組蛋白、連同作為加強(qiáng)劑的佐劑、重組病毒載體或DNA或RNA疫苗一起用在致敏加強(qiáng)劑體系中。本發(fā)明提供了一個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或其子代，它們引入了一個(gè)外源的核苷酸序列，該序列的復(fù)制和表達(dá)都在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(或子代)中進(jìn)行，其中該外源的核苷酸序列沒有與選擇性標(biāo)記連接。在一個(gè)具體化的實(shí)施方案中，該外源的核苷酸序列位于一個(gè)質(zhì)粒中，在一些具體的實(shí)施方案中，質(zhì)粒編碼存活所必需的基因，該存活所必需的基因已經(jīng)從轉(zhuǎn)化細(xì)菌的基因組中刪除。在另外一個(gè)具體的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含一個(gè)編碼用于逃出內(nèi)體(endosomeescape)的基因，比如pfo。在其他一些具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列編碼逃出內(nèi)體的基因，比如pfo。在另外一些具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列編碼抗原85a、抗原85b或者抗原85a/85b。仍然在另外的一些具體的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含一個(gè)編碼能維持和/或穩(wěn)定質(zhì)粒的蛋白質(zhì)的基因。在一些具體的實(shí)施方案中，編碼蛋白質(zhì)的基因編碼抗原85a、抗原85b或者抗原85a/85b。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，細(xì)菌是分枝桿菌。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列編碼細(xì)胞凋亡。在其他的具體的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含一個(gè)編碼細(xì)胞凋亡的基因。在本發(fā)明的又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列不能在革蘭氏陰性菌中復(fù)制。在一些具體的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型的。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列至少是單向穿梭載體的一部分。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了一種轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方法。本方法包含了弓丨入外源核苷酸序列的步驟，該序列的復(fù)制和表達(dá)都在細(xì)菌中進(jìn)行，并且該外源的核苷酸序列沒有與選擇性標(biāo)記連接。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，引入的步驟是通過電穿孔法完成的。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列位于一個(gè)質(zhì)粒上，電穿孔法是在以下的條件下完成的質(zhì)粒DNA與細(xì)菌細(xì)胞的比例范圍是1μg至5μg的質(zhì)粒DNA對(duì)應(yīng)1.25XIO8個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，這個(gè)比例是1.6μg的質(zhì)粒對(duì)應(yīng)大約1.25X108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。在本發(fā)明的一些具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列不能在革蘭氏陰性菌中復(fù)制。在另一些具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列至少是單向穿梭載體的一部分。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列定位于質(zhì)粒中，并且編碼存活所必需的基因，此基因已從細(xì)菌的基因組中刪除。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌或其子代，其包含一個(gè)外源的編碼所研究的基因的核苷酸序列，并且其中存在著以下一個(gè)或多個(gè)條件a)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌包括一個(gè)不能在革蘭氏陰性菌中復(fù)制的質(zhì)粒；b)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌不顯示抗生素拮抗性；C)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型；以及d)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌包含了一個(gè)單向穿梭載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列是質(zhì)粒的一部分。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，質(zhì)粒缺少選擇性標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，外源的核苷酸序列編碼存活所必需的基因，其中存活所必需的基因已經(jīng)從轉(zhuǎn)化的分枝桿菌的細(xì)菌基因組中刪除。在一些具體的實(shí)施方案中，存活所必需的基因是leuD。轉(zhuǎn)化的分枝桿菌或其子代可以進(jìn)一步包含可以在體內(nèi)被激活的啟動(dòng)子序列。轉(zhuǎn)化的分枝桿菌或其子代可能是減毒的。轉(zhuǎn)化的分枝桿菌或其子代有可能是卡介苗，舉例來說，可能是BCG1331,BCGPasteur,BCGTokyo或者BCGCopenhagen。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種疫苗，包括轉(zhuǎn)化的分枝桿菌或其子代，包含可以編碼研究中的基因的外源核苷酸序列，其中存在著以下一個(gè)或幾個(gè)條件a)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌包含一個(gè)不能在革蘭氏陰性菌中復(fù)制的質(zhì)粒；b)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌不顯示抗生素拮抗性；c)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型；以及d)轉(zhuǎn)化的分枝桿菌包含一個(gè)單向穿梭載體。圖1.自殺載體pAF103的圖譜。每個(gè)DNA片段的含義如下L-側(cè)翼和R-側(cè)翼；分別是IeuD基因的左側(cè)翼和右側(cè)翼；aph是氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(基因庫(kù)登錄號(hào)X06402)，其賦予質(zhì)?？敲顾乜剐裕琌riE是pUC的復(fù)制起始點(diǎn)(基因庫(kù)登錄號(hào)AY234331)；Ble是基因(基因庫(kù)登錄號(hào)L36850)，賦予質(zhì)粒Zeocin抗性；SacB是基因(基因庫(kù)登錄號(hào)Y489048)，編碼果聚糖蔗糖酶，其賦予細(xì)菌蔗糖敏感性；Phsp6tl是熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子序列(即Rv0440)；MCS是顯示的限制性內(nèi)切酶的多克隆位點(diǎn)。注意，在兩個(gè)PacI位點(diǎn)之間的盒，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候可以被其他溶解內(nèi)體的酶基因取代。圖2.被當(dāng)前不同的疫苗株攻擊后通過肺CFU數(shù)量所測(cè)定的保護(hù)水平。圖3.用于將表達(dá)載體引入重組分枝桿菌，即重組卡介苗，的非抗生素表達(dá)載體的示意圖。該將在重組卡介苗中被表達(dá)的基因通過PacI位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒上。在電穿孔進(jìn)入重組卡介苗之前，質(zhì)粒被顯示的限制性內(nèi)切酶消化以便去除oriE和Kan區(qū)域，形成單向穿梭表達(dá)載體。每個(gè)DNA片段的含義如下=Pkv313ci是抗原Rv3130c的啟動(dòng)子序列；PAg85B是抗原85B的啟動(dòng)子序列(即Rv1886c)；抗原Y是分枝桿菌抗原TB10.4(即Rv0288)；Ag85B是編碼抗原85B的DNA序列(即Rv1886c)；Ag85A是編碼抗原85A的基因(即Rv3804c)；aph是氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(基因庫(kù)登錄號(hào)X06402)，其賦予質(zhì)粒卡那霉素抗性；OriE是PUC復(fù)制起始點(diǎn)(基因庫(kù)登錄號(hào)AY234331)；LeuD是編碼3-異丙基蘋果酸脫水酶的基因(即Rv2987c)；oriM是分枝桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)(基因庫(kù)登錄號(hào)M23557)。圖4.等位基因交換的主要步驟流程圖。圖5.選中的菌落的PCR分析，用于證明表達(dá)質(zhì)粒的存在。PCR根據(jù)材料和方法中所描述的進(jìn)行操作。PCR產(chǎn)物用含有1.0%瓊脂糖膠的凝膠電泳進(jìn)行分析。泳道1:DNA序列梯(Invitrogen)被用作1Kb加上DNA標(biāo)準(zhǔn)。泳道2=PCR模板陰性對(duì)照；泳道3卡介苗菌株Danish1331的PCR；泳道4到7編號(hào)分別是59，61，69和84的菌落的PCR；泳道8空白加樣孔；泳道9原始質(zhì)粒的PCR。圖6.電泳凝膠圖顯示抗原Ag85A和Ag85b在結(jié)核分枝桿菌菌株中的過量表達(dá)，此菌株包含了一個(gè)在抗原85B啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下的oriM質(zhì)粒，該質(zhì)粒有編碼抗原85A、抗原85B和TB10.4的序列，被稱為pAF-105。圖7.示意圖A-F顯示了在小鼠中AFRO-IrBCG比BCG更具免疫原性。圖8.示意圖A-D顯示用AFRO-IrBCG接種與用BCG接種一樣可以保護(hù)小鼠。圖9.示意圖A-B顯示用AFRO-IrBCG接種的小鼠甚至在17周后被攻擊仍然處于被保護(hù)狀態(tài)。圖10.圖表A-C呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明AFR0-1在豚鼠中是具有免疫原性的。圖11.圖表A-B呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明AFRO-IrBCG在豚鼠中起到的保護(hù)作用。圖12.示意圖和圖表A-E顯示了當(dāng)AFRO-IrBCG被Ad35-TBS加強(qiáng)后，在小鼠中免疫原性增強(qiáng)。圖13.圖表A-B顯示用Ad35-TBS加強(qiáng)后，AFR0-1致敏比BCG致敏產(chǎn)生了更多的IFN-Y陽(yáng)性CD8+T細(xì)胞。圖14.用BCG致敏的豚鼠與被Ad35_TBS加強(qiáng)的AFRO-IrBCG致敏的豚鼠的比較。圖15.表格和示意圖顯示了在非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物身上疫苗體系的免疫原性。圖16.柱狀圖顯示了在用Ad35_TBS加強(qiáng)之前和之后抗原特異性IFN-γ增殖反應(yīng)的差異。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了具有改進(jìn)疫苗特性的遺傳工程化的(重組)分枝桿菌菌株，可以用作對(duì)抗結(jié)核病的預(yù)防接種試劑。它們具有很多特征，每一個(gè)都能起到提高菌株免疫原性的作用。本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株是從親本株開發(fā)而來，這些親本株是有目的地根據(jù)它們有效的免疫原性而選擇出來。換句話說，被選為親本株用于進(jìn)行基因操作(比如用來過量表達(dá)結(jié)核病抗原)的分枝桿菌菌株，它之所以被選中，是因?yàn)?，甚至在基因操作前，它在被接種的寄主身上已經(jīng)能引起有效的免疫應(yīng)答。卡介苗菌株Danish1331就是一個(gè)例子。然后這些菌株被更好地修飾，比如用來過量表達(dá)研究中的結(jié)核病抗原。更優(yōu)選的是，在基因重組的分枝桿菌中使用在體內(nèi)被激活的啟動(dòng)子。另外，本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株經(jīng)遺傳工程化后不需要根據(jù)抗生素拮抗來選擇，這樣使得它們?cè)谌巳褐凶鳛榻臃N試劑使用時(shí)通常是安全的。例如，將復(fù)制所需要的基因切除掉，并放置于表達(dá)質(zhì)粒中。另外，本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株并不會(huì)水平轉(zhuǎn)移成革蘭氏陰性菌，因此就不能從寄主生物體中“逃脫”(即它們是“一個(gè)單向穿梭載體”)。這樣也保證了它們?cè)谌巳褐凶鳛榻臃N試劑時(shí)的安全性。另夕卜，本發(fā)明中的重組分枝桿菌菌株在作為用于結(jié)核病疫苗很好的試劑的同時(shí)，它們也可以被遺傳工程化后表達(dá)或過量表達(dá)與結(jié)核病不相關(guān)的抗原，因此作為對(duì)抗其他疾病的疫苗試劑時(shí)也是有用的。在本發(fā)明的優(yōu)選的具體的實(shí)施方案中，分枝桿菌菌株是減毒的菌株，比如卡介菌。然而，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)立即意識(shí)到的一樣，其他減毒的和非減毒的分枝桿菌菌株同樣可以被使用。其他種類的分枝桿菌的例子包括但是不限于田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti)，分枝桿菌H37Ra，牛匕牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)等等。卡介苗菌株選擇現(xiàn)有技術(shù)表明，卡介苗不是同種的菌株，而是已經(jīng)發(fā)展成一系列不同的遺傳譜系(Oettingeretal.,TuberLungDis.79(4):243_250;1999)。直到最近還不是很清楚，這些差異是否改變了卡介苗家族成員的免疫原性和效力。然而，正如這里所描述的，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)重組卡介苗(這里稱為rBCG)所來源于其的某個(gè)特定的菌株，造成了重組卡介苗的免疫原性的效力有很大的差異。下面的實(shí)例1中顯示，卡介苗菌株Danish1331(在此稱作“BCG1331”)與BCGTi。e相比，是一個(gè)更好的疫苗。因此，雖然在菌株rBCG30中過量表達(dá)抗原85B提高了rBCG30衍生來源的親本株BCGTi。e的免疫原性，但是在BCGtice菌株中過量表達(dá)抗原85B的rBCG30并不能獲得與BCG1331—樣的效力。因此，在疫苗構(gòu)建過程的起始階段，通過選擇一個(gè)有效力的親本株卡介苗菌株，可以在卡介苗過量表達(dá)抗原上獲得某些優(yōu)勢(shì)。文獻(xiàn)Horwitzetal.，ProcNatlAcadSciAcadSciUSA,97(25)13853-13858；2000顯示，至今為止，在構(gòu)建重組卡介苗疫苗的起始階段之前，首先確定親本卡介苗菌株是否顯示出足夠的效力，這一點(diǎn)并不是常用的或者認(rèn)為是必須的。這些菌株非常適合過量表達(dá)卡介苗和結(jié)核病的抗原或外源的抗原。有效的親本卡介苗菌株可以從下面的組中選擇包括但是不限于BCG1331,BCGPasteur，BCGTokyo和BCGCopenhagen。親本卡介苗菌株應(yīng)當(dāng)降低有活力的結(jié)核分枝桿菌攻擊生物體的水平，至少是比下面實(shí)例1中低劑量氣霧劑的豚鼠攻擊模型中使用的BCGTice低0.4XIOici倍。提高卡介苗的免疫原性正如上文討論的，卡介苗的免疫原性不是不變的。而且，實(shí)例1也給我們顯示了雖然卡介苗抗原的免疫原性可以通過卡介苗的基因修飾而得到提高，但是在豚鼠攻擊模型中如果重組體改變的親本卡介苗菌株失去效力，那么這樣的修飾是毫無意義的。由該規(guī)則得出的推論就是，進(jìn)一步提高卡介苗的免疫原性能更進(jìn)一步提高來源于該親本株的重組菌株的免疫原性。運(yùn)用上面詳述的方法去選擇一個(gè)合適的卡介苗菌株作為重組卡介苗疫苗和疫苗載體的親本株，再將基因修飾引入到此菌株中，產(chǎn)生想要得到的重組卡介苗疫苗和疫苗載體。用于構(gòu)建個(gè)體重組卡介苗菌株的方法對(duì)該發(fā)明來說并不是關(guān)鍵的，可以選自本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法中的任何一個(gè)或任何組合(Horwitzetal.，PNAS97(25)13853-13858；2000；Hessetal.，ProcNatlAcadSciUSA,95:5299_5304；1998)。更進(jìn)一步，重組卡介苗疫苗受益于在感染后在體內(nèi)被激活的啟動(dòng)子。比如，使用組成性活性啟動(dòng)子，例如抗原85B、抗原85A、Hsp60或者Rvl908c(KatG)的啟動(dòng)子，能使得抗原在免疫接種后在體內(nèi)組成性地表達(dá)。因此，在感染的過程中對(duì)于每個(gè)階段的感染都能引起強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答。當(dāng)選擇潛伏期的活性啟動(dòng)子比如來自基因Rv2032、RV3127、RV2031c或者Rv3030c等的啟動(dòng)子時(shí)，能使重組卡介苗表達(dá)這些選中的抗原，特別是在接種免疫后當(dāng)重組卡介苗疫苗在體內(nèi)進(jìn)入潛伏期時(shí)的那些潛伏期特異性抗原。表達(dá)載體非抗生素選擇性系統(tǒng)的研究如上所述，當(dāng)前在重組卡介苗菌株中用來過量表達(dá)保護(hù)性抗原的質(zhì)粒是不能接受的，因?yàn)樗鼈冃枰蕾囉诳股剞卓剐曰騺砭S持生存，而且這些質(zhì)粒有一個(gè)固有的能力，可將質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移給一系列微生物寄主，從而造成了向周圍的生物體散布抗生素拮抗性基因和抗原表達(dá)盒的威脅。為了克服這些重要的限制，本發(fā)明描述了一個(gè)新的非抗生素選擇性系統(tǒng)和單向穿梭系統(tǒng)，用于在分枝桿菌寄主菌株中如重組卡介苗中引入或維持表達(dá)載體。質(zhì)粒的非抗生素選擇性是通過在表達(dá)質(zhì)粒上先選擇性地刪除對(duì)于復(fù)制很重要的寄主基因、然后再引入功能性拷貝基因來補(bǔ)償該刪除部分來達(dá)到的。因此，細(xì)菌寄主依靠表達(dá)質(zhì)粒存活，形成了不經(jīng)抗生素選擇而在分枝桿菌寄主內(nèi)維持質(zhì)粒的機(jī)理。一個(gè)較佳的方法需要使基因失活來創(chuàng)建營(yíng)養(yǎng)缺陷型的表現(xiàn)型。例如，在結(jié)核分枝桿菌和卡介苗中，IeuD基因(GenomeSeqID#Mb3011C)的失活產(chǎn)生亮氨酸依賴型的表現(xiàn)型，帶有失活I(lǐng)euD基因的菌株是依賴于亮氨酸的添加來存活的(Hondalusetal.，InfectImmun.68(5)2888-98.2000)。另外，分枝桿菌ΔIeuD菌株是不能在體內(nèi)復(fù)制的(Hondalusetal.，supra,2000)，因此結(jié)核分枝桿菌和重組卡介苗ΔIeuD突變體將在體外和體內(nèi)都維持IeuD+質(zhì)粒。帶有其他缺陷的卡介苗菌株突變體，比如AlysA，可以用類似的方法得到。用于將營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變引入到目標(biāo)分枝桿菌菌株中的具體方法對(duì)于本發(fā)明來說不是很重要，可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉的任何等位基因交換方法(Parishetal.,Microbiology,145=3497-3503；1999)。同樣地，營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的補(bǔ)償通過在表達(dá)載體上引入失活基因的功能性拷貝來達(dá)到。表達(dá)載體同樣需要分枝桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)(例如OriM；Labidietal.，Plasmid，27(2)130-140；1992)以使得在目標(biāo)結(jié)核分枝桿菌和重組卡介苗菌株中能夠復(fù)制。帶有這種質(zhì)粒的分枝桿菌菌株在培養(yǎng)基中缺失亮氨酸時(shí)，其生存將會(huì)依賴于質(zhì)粒編碼的IeuD基因的表達(dá)。新的單向穿梭載體的研究上述的步驟描述了創(chuàng)建一個(gè)選擇系統(tǒng)用于維持結(jié)核分枝桿菌和重組卡介苗中的表達(dá)載體的方法。然而，該載體系統(tǒng)必須能夠在大腸桿菌中復(fù)制以便在引入分枝桿菌之前能夠?qū)|(zhì)粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行高效率的操作。此外，為了在質(zhì)粒構(gòu)建中擴(kuò)寬能被使用的潛在的重組大腸桿菌寄主菌株，從而允許研究人員使用便于質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌，優(yōu)選在表達(dá)載體中包括抗生素選擇性標(biāo)記(比如卡那霉素抗性)和一個(gè)廣泛寄主范圍的復(fù)制起點(diǎn)(比如OriE；Halpernetal.,ProcNatlAcadSciAcadSci，USA76(12)6137-6141；1979；Mosigetal.，NewBiol1(2)171-179；1989)。這些元件位于特定的限制性核酸內(nèi)切酶(消化位點(diǎn)比如NdeI)的側(cè)翼，以便在將這些質(zhì)粒引入目標(biāo)分枝桿菌菌株之前能夠除去抗生素抗性標(biāo)記和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。另外，包括可以引入抗原表達(dá)盒的特定的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(比如PacI)。一旦在大腸桿菌中完成了該步驟，希望得到的質(zhì)粒也已經(jīng)被識(shí)別和表征，那么重組質(zhì)粒的DNA將會(huì)被分離并且用限制性核酸內(nèi)切酶消化，釋放出抗生素選擇標(biāo)記和OriE。然后被消化的質(zhì)粒DNA用T4DNA連接酶連接。生成的質(zhì)粒包含寄主分枝桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因，但是不呈現(xiàn)抗生素拮抗性，而且不能在革蘭氏陰性菌中復(fù)制。該質(zhì)粒同樣也包含抗原表達(dá)盒，使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔法的步驟將質(zhì)粒引入目標(biāo)分枝桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體。包含質(zhì)粒的重組菌株通過在缺少生長(zhǎng)所必需的代謝產(chǎn)物(比如亮氨酸)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而被分離出來。該系統(tǒng)獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)在于，最終的表達(dá)質(zhì)粒不再帶有抗生素抗性基因。因此它就不會(huì)像當(dāng)前通常使用的表達(dá)質(zhì)粒那樣將抗生素抗性基因傳播到環(huán)境中。另外，本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒不能在廣泛的寄主范圍內(nèi)再?gòu)?fù)制，因?yàn)槟軌驈?fù)制的基因元件被刪除了。這種載體被命名為“單向”穿梭載體。結(jié)核病抗原的過量表達(dá)在本發(fā)明中，基因先引入至位于單向穿梭載體中的表達(dá)盒中，然后再引入到重組卡介苗中，此基因可能編碼結(jié)核分枝桿菌免疫原。結(jié)核分枝桿菌免疫原可能是，比如是完整長(zhǎng)度的內(nèi)在蛋白質(zhì)，是兩個(gè)或更多結(jié)核分枝桿菌免疫原或類似的嵌合融合體，或者來自于結(jié)核分枝桿菌的結(jié)核分枝桿菌免疫原的一個(gè)片段或多個(gè)片段。結(jié)核分枝桿菌抗原在啟動(dòng)子的控制下被單向穿梭載體表達(dá)，此啟動(dòng)子在體內(nèi)至少在分枝桿菌感染的一個(gè)感染階段中是激活的。該特定的啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明不是很重要的，可以是選自組成性激活的啟動(dòng)子，比如抗原85B、Hsp60、抗原85A、Rvl908c(KatG)和/或在潛伏期激活的啟動(dòng)子，比如基因Rv3130C(Florczyketal.，InfectImmun71(9)5332-5343；2003；Voskuiletal.，JExrMed198(5):705_713；2003)、Rv2032、Rv3127和/或Rv2031c的啟動(dòng)子。為了提高抗原表達(dá)的水平，產(chǎn)生小型細(xì)胞的分枝桿菌載體菌株的衍生菌株的有可能被使用。產(chǎn)生小型細(xì)胞的分枝桿菌種類的菌株是通過過量表達(dá)FtsZ(基因組文庫(kù)#Mb2174c)或通過whiB3位點(diǎn)定向失活得到的。FtsZ表達(dá)水平的改變或whiB3的失活是可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)基因方法來實(shí)現(xiàn)。比如，F(xiàn)tsZ過量表達(dá)是可以通過在一個(gè)強(qiáng)大的啟動(dòng)子的控制下將ftsZ基因引入單向穿梭載體中來實(shí)現(xiàn)的。這些啟動(dòng)子諸如抗原85B、抗原85A、Hsp60或Rvl908c(KatG)的啟動(dòng)子，是組成性激活的，和/或是在潛伏感染期激活的啟動(dòng)子，諸如基因Rv2032、Rv3127、Rv2031c和Rv3130C的啟動(dòng)子(Florczyketal.，supra；2003；Voskuiletal.，supra,2003)whiB3位點(diǎn)定向的失活是通過使用下面概括的步驟進(jìn)行等位基因交換來實(shí)現(xiàn)的。可以插入重組分枝桿菌的外源抗原的實(shí)例在本發(fā)明中，分枝桿菌攜帶的單向穿梭載體中的表達(dá)盒可以編碼免疫原，該免疫原可以是來自病毒、細(xì)菌或寄生病原體的外源免疫原，或者是內(nèi)源免疫原，比如但不限制是自體免疫的抗原或腫瘤抗原。這些免疫原可能是，例如，一個(gè)完整長(zhǎng)度的天然蛋白質(zhì)；外源免疫原和內(nèi)原性蛋白質(zhì)或類似的之間的嵌合融合體；或來源于病毒、細(xì)菌和寄生病原體的免疫原的一個(gè)片段或一些片段。在這里使用的術(shù)語“外源免疫原”是指蛋白或它的片段，不是在受體動(dòng)物細(xì)胞或者組織中正常表達(dá)的，例如但不限于，病毒蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)、寄生物蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)因子或治療試劑。“內(nèi)源免疫原”是指蛋白或它的一部分，是在受體動(dòng)物細(xì)胞或者組織中天然存在的，例如但不限于，內(nèi)源細(xì)胞蛋白質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)因子或治療試劑。另外地或補(bǔ)充的，免疫原可以由人工合成基因編碼、也可以用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的傳統(tǒng)的重組DNA方法來構(gòu)建。在外源免疫原進(jìn)入動(dòng)物寄主、在動(dòng)物寄主中集群或復(fù)制之前或過程中，外源的免疫原可以是被任何病毒、細(xì)菌或寄生病原體表達(dá)的任何分子。重組卡介苗可以表達(dá)來自于病毒、細(xì)菌和寄生病原體的免疫原或者其部分。這些病原體可以在人、家畜或野生動(dòng)物的寄主中傳染。病毒病原體，病毒抗原由其衍生而來，包括但不限于正黏病毒，例如流感病毒(分類學(xué)編號(hào)ID59771)；逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如呼吸道合胞體病毒、HTLV-1(分類學(xué)編號(hào)ID39015)和HTLV-II(分類學(xué)編號(hào)ID11909)；皰疹病毒，例如EBV(分類學(xué)編號(hào)ID10295)；巨細(xì)胞病毒(分類學(xué)編號(hào)ID10358)或者單純皰疹病毒(ATCC#:VR_1487)；慢病毒，例如人體免疫缺損病毒-1(分類學(xué)編號(hào)ID12721)和人體免疫缺損病毒_2(分類學(xué)編號(hào)ID11709)；棒狀病毒，例如麻痹型狂犬病；微小RNA病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒(分類ID學(xué)編號(hào)12080)；痘病毒，例如牛痘(分類學(xué)編號(hào)ID:10245)；輪狀病毒(分類學(xué)編號(hào)ID:10912)；和細(xì)小病毒，例如腺-相關(guān)病毒1(分類學(xué)編號(hào)ID85106)。病毒抗原的例子如下組所示，包括但不限于人類免疫缺陷型病毒抗原Nef(國(guó)家研究院過敏反應(yīng)和感染疾病HIV貯藏庫(kù)目錄號(hào)183；基因庫(kù)登錄號(hào)AF238278)、Gag、EnV(國(guó)家研究院過敏反應(yīng)和感染疾病HIV貯藏庫(kù)目錄號(hào)2433；基因庫(kù)登錄號(hào)U39362)、Tat(國(guó)家研究院過敏反應(yīng)和感染疾病HIV貯藏庫(kù)目錄號(hào)827；基因庫(kù)登錄號(hào)M13137)、Tat的突變體衍生物例如Tat-A31-45(Agwaleetal.Proc.Natl.Acad.Sci.inpress.Jul8th；2002)>Rev(國(guó)家研究院過敏反應(yīng)和感染疾病HIV貯藏庫(kù)目錄號(hào)2088；基因庫(kù)登錄號(hào)L14572)、以及Pol(國(guó)家研究院過敏反應(yīng)和感染疾病HIV貯藏庫(kù)目錄號(hào)238；基因庫(kù)登錄號(hào)AJ237568)；以及T細(xì)胞和B細(xì)胞的gpl20表位(HankeandMcMichael,AIDSImmunolLett.,66177；1999；Hanke,etal.,Vaccine,17589；1999；Palkeretal,J.Immunol.，142:3612_3619；1989)；HIV-1Env和gpl20的嵌合衍生物，例如但不限于gpl20和CD4的融合體(Foutsetal.,J.Virol.2000,7411427-11436；2000)；HIV-1env截?cái)嗟幕蛐揎椀难苌?，例如但不限于gpl40(Stamatosetal.JVirol，72:9656_9667；1998)，或者HIV-1Env和/或gpl40的衍生物(Binley,etal.JVirol,76:2606_2616；2002；Sanders,etal.JVirol,745091-5100；2000；Binley,etal.JVirol,74:627_643；2000)、乙型肝炎表面抗原(基因庫(kù)登錄號(hào)AF043578；ffuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:4726_4730；1989)；輪狀病毒，例如VP4(基因庫(kù)登錄號(hào)AJ293721；Mackowetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,87518-522；1990)和VP7(基因庫(kù)登錄號(hào)AY003871；Greenetal.，J.Virol.，621819-1823；1988)，流感病毒抗原例如血凝素(基因庫(kù)登錄號(hào)AJ404627;PertmerandRobinson,Virology,257406；1999)；核蛋白(基因庫(kù)登錄號(hào)AJ289872;Linetal,Proc.Natl.Acad.Sci.,97=9654-9658；2000)；單純性皰疹病毒例如胸腺嘧啶核苷激酶(基因庫(kù)登錄號(hào)AB047378；Whitleyetal,In:NewGenerationVaccines,pages825-854；2004)。細(xì)菌性病原體，細(xì)菌抗原由其衍生而來，包括但不限于分枝桿菌屬(Mycobacteriumspp.),幽門螺桿菌(Helicobacterpylori),沙門氏菌(Salmonellaspp.),志賀氏桿菌(Shigellaspp.),大腸桿菌(E.coli),立克次氏體(Rickettsiaspp.),李其if特菌屬(Listeriaspp.),月市炎軍團(tuán)桿菌(Legionellapneumoniae),假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)，弧菌(Vibriospp.)，禾口伯氏疏螺方寵體(Borelliaburgdorferi)。細(xì)菌病原體的保護(hù)性抗原的例子包括產(chǎn)腸毒的大腸桿菌的菌體抗原，例如CFA/I菌毛抗原(Yamamotoetal.,Infect.Immun.,50:925_928；1985)和熱不穩(wěn)定毒素的無毒的B亞基(Klipsteinetal.，Infect.Immun.,40:888_893；1983)；百日咳桿菌的粘附素(Robertsetal.，Vacc.，10:43_48；1992)，百日咳桿菌的腺苷酸環(huán)化酶_溶血素(Guisoetal.，Micro.Path.，11:423_431；1991)，破傷風(fēng)桿菌的破傷風(fēng)毒素的片段C(Fairweatheretal.，Infect.Immun.,58:1323—1326；1990)，伯氏疏螺旋體的0spA(Sikand，etal.，Pediatrics,108123-128；2001)；ffallich,etal.,InfectImmun,692130-2136；2001),普氏立克次氏體和莫氏立克次氏體的保護(hù)性的不完全結(jié)晶-表面-層蛋白(Carl，etal.,ProcNatlAcadSciUSA，87:8237_8241;1990)，單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌的李斯特菌素(也稱為“Llo”和“Hly”)和/或過氧化物歧化酶(同樣被稱為“S0D”和“p60”)(Hess,J.,etal.,Infect.Immun.651286-92；1997；Hess,J.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.931458-1463；1996；Bouwer,etal.，J.Exp.Med.1751467-71；1992)，幽門螺桿菌脲酶(Gomez-Duarte,etal.,Vaccine16,460-71；1998；Corthesy-Theulaz,etal.,Infection&Immunity66，581-6;1998)，和炭疽芽胞桿菌的致死毒素及或保護(hù)性抗原的受體-結(jié)合區(qū)域(Price,etal.，Infect.Immun.69,4509-4515；2001)。寄生的病原體，寄生抗原由此衍生而來，包括但不限于瘧原蟲(Plasmodiumspp.)，比如鐮狀瘧原蟲(ATCC號(hào)30145)；錐體蟲(Trypanosomespp.)例如克氏錐蟲(ATCC號(hào)50797)；賈弟蟲(Giardiaspp.)，例如腸賈第蟲(Giardiaintestinalis)(ATCC號(hào)30888D)；牛蜱(Boophilusspp.)；巴貝西蟲(Babesiaspp.)，例如果氏巴貝西蟲(Babesiamicroti)(ATCC號(hào)30221)；內(nèi)阿米巴(Entamoebaspp.)，例如痢疾內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)(ATCC號(hào)30015)；艾美球蟲(Eimeriaspp.)，例如巨型艾美球蟲(Eimeriamaxima)(ATCC號(hào)40357)；利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)(分類學(xué)編號(hào)ID38568)，血吸蟲(Schistosomespp.)；布魯格絲蟲(Brugiaspp.)；Fascidaspp.，惡絲蟲(Dirofilariaspp.)；吳策線蟲(ffuchereriaspp.)禾口Onchocereaspp.。寄生病原體保護(hù)性抗原的例子包括瘧原蟲環(huán)子孢子抗原(Sadoffetal.,Science,240=336-337；1988)，例如P.bergerii的環(huán)子孢子抗原或者惡性瘧原蟲的環(huán)子孢子抗原；瘧原蟲的裂殖性孢子的表面抗原(Spetzleretal.,Int.J.Pept.Prot.Res.,43351-358；1994)；痢疾阿米巴半乳糖特異性的凝集素(Mannetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,88:3248_3252；1991)；利什曼蟲的gp63(Russelletal.，J.Immunol.，140:1274-1278；1988；XuandLiew,Immunol.,84:173-176；1995)；碩大利什曼蟲的gp46(Handmanetal.，Vaccine，18:3011_3017;2000)；馬來絲蟲的副肌球蛋白(Lietal.，Mol.Biochem.Parasito1.,49:315_323；1991)；曼氏血吸蟲的丙糖-磷酸鹽異構(gòu)酶(Shoemakeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,89:1842-1846；1992)；類似蛇形毛圓線蟲蛋白質(zhì)的分泌球蛋白(Frenkeletal.，Mol.Biochem.Parasitol.，50:27_36；1992)；Frasciolahepatica的谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶(Hi1Iyeretal.,Exp.Parasitol.,75:176-186；1992)；牛血吸蟲和日本裂體吸蟲(Bashiretal.，Trop.Geog.Med.，46255-258；1994)；以及牛血吸蟲和日本裂體吸蟲的KLH(Bashiretal.，supra1994)。如上所述，重組卡介苗可以編碼內(nèi)源的免疫原，該免疫原可以是任何細(xì)胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)因子或治療試劑、或其部分，其也可以在受體細(xì)胞中表達(dá)。該免疫原包括但不限制于腫瘤免疫原、移植免疫原和自身免疫免疫原，或腫瘤免疫原、移植免疫原和自身免疫免疫原的片段和衍生物。因此，在本發(fā)明中，重組卡介苗可以編碼腫瘤免疫原、移植免疫原或自身免疫的免疫原、或者其部分和衍生物。另外，重組卡介苗可以編碼人工合成基因(如上所述)，其編碼腫瘤特異性抗原、移植抗原或自身免疫抗原或其部分。腫瘤特異性抗原例子包括前列腺特異抗原(Gattusoetal.，HumanPathol.,26123-126；1995)，TAG-72和CEA(Guadagnietal.，Int.J.Biol.Markers,9:53_60；1994)、MAGE-1和酪氨酸酶(Coulieetal.，J.Immunothera.，14104-109；1993)。最近顯示，用表達(dá)腫瘤抗原的非惡性腫瘤細(xì)胞免疫接種小鼠，可以提供疫苗的作用，以及針對(duì)顯示相同抗原性的惡性腫瘤細(xì)胞，能幫助動(dòng)物增加清除惡性腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答(Ko印penetal.,Anal.N.Y.Acad.Sci.，690:244_255；1993)。移植抗原的例子包括在T細(xì)胞上的CD3分子(Alegreetal.，Digest.Dis.Sci.，4058-64；1995)。用CD3受體的抗體進(jìn)行治療顯示出快速的清除循環(huán)T細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞“介導(dǎo)的移植排斥(Alegreetal.，supra,1995)。自身免疫抗原的例子包括IAS3鏈(Tophametal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91:8005-8009;1994)。用來自于IAS0鏈的18個(gè)氨基酸的肽免疫接種小鼠，表明可以給帶有實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的小鼠提供保護(hù)和治療(Tophametal.,supra,1994)0表達(dá)佐劑的重組卡介苗的研究重組卡介苗可以被構(gòu)建成能編碼免疫原和佐劑，而且可以用來提高寄主對(duì)重組卡介苗的應(yīng)答。另外，重組卡介苗可以被構(gòu)建成能編碼佐劑，和其他重組卡介苗混合在一起，可以用來提高寄主對(duì)配對(duì)的卡介苗編碼的免疫原的應(yīng)答。重組卡介苗編碼的特定的佐劑對(duì)于本發(fā)明來說不是至關(guān)重要的，它可能是霍亂毒素的一個(gè)亞基(即CtxA；基因庫(kù)登錄號(hào)X00171、AF175708、D30053、D30052)、或者其部分和/或突變體衍生物(比如Ctx的A亞基的A1功能域(即CtxAl；基因庫(kù)登錄號(hào)K02679)，來自任何典型的霍亂弧菌(比如霍亂弧菌菌株395，ATCC號(hào)39541)或者ElTor霍亂弧菌(比如霍亂弧菌菌株2125，ATCC號(hào)39050)菌株?？蛇x地，細(xì)菌二磷酸腺苷-核糖基化外毒素家庭成員的任何細(xì)菌毒素(KruegerandBarbier，Clin.Microbiol.Rev.，834；1995)，可以用于替代CtxA例如腸毒性大腸桿菌(基因庫(kù)登錄號(hào)M35581)的熱不穩(wěn)定毒素的亞基(在此稱為EltA)、百日咳毒素1的亞基(比如ptxSl，基因庫(kù)登錄號(hào)AJ007364、AJ007363、AJ006159、AJ006157等)；進(jìn)一步可選擇的佐劑可以是百日咳桿菌的腺苷酸環(huán)化酶溶血素(ATCC號(hào)8467)、支氣管敗血性博代桿菌(ATCC號(hào)7773)或者副百日咳博德特氏菌(ATCC號(hào)15237)，比如百日咳桿菌的cyaA基因(基因庫(kù)登錄號(hào)X14199)、副百日咳博德特氏菌(基因庫(kù)登錄號(hào)AJ249835)或者支氣管敗血性百日咳桿菌(Bordetellabronchis印tica)(基因庫(kù)登錄號(hào)Z37112)。表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子的重組卡介苗的研究重組卡介苗可以被構(gòu)建成能編碼免疫原和細(xì)胞因子，而且可以用來提高寄主對(duì)重組卡介苗的應(yīng)答。另外，重組卡介苗可以被構(gòu)建成能只編碼上述細(xì)胞因子，和其他重組卡介苗混合在一起，可以用來提高寄主對(duì)配對(duì)卡介苗編碼的免疫原的反應(yīng)。重組卡介苗編碼的特定的細(xì)胞因子對(duì)于本發(fā)明來說不是至關(guān)重要的，可以包括但不限于白介素_4(在此稱為“IL-4”;基因庫(kù)登錄號(hào)AF352783(鼠IL-4)或NM_000589(人IL-4))，IL-5(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_010558(鼠IL-5)或NM_000879(人IL-5))，IL-6(基因庫(kù)登錄號(hào)M20572(鼠IL-6)或M29150(人IL-6))，IL-IO(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_010548(鼠IL-10)或AF418271(人IL-10))，11-12p40(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_008352(鼠IL_12p40)或AY008847(人IL-12p40))，IL-12p7(l(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_008351/NM_008352(鼠IL_12p35/40)或AF093065/AY008847(人IL-12p35/40))，TGF3(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_011577(鼠TGFβ1)或Μ60316(人TGFβ1))，禾口TNFα基因庫(kù)登錄號(hào)Χ02611(鼠TNFα)或Μ26331(人TNFα)).細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序死亡，它與細(xì)胞壞死死亡在誘導(dǎo)與結(jié)果上有顯著的不同。包含外源抗原的細(xì)胞凋亡是已知的應(yīng)對(duì)這種抗原的細(xì)胞免疫的強(qiáng)大刺激。包含抗原的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞免疫性的過程有時(shí)被稱為交叉_致敏。(Heath，W.R.，G.T.Belz,G.M.Behrens,C.M.Smith,S.P.Forehan,I.A.,Parish,G.Μ.Davey,N.S.Wilson,F.R.Carbone,andJ.A.Vi1landangos.2004.Cross-presentaion,dentriticcellsubsets,andthegenerationofimmunitytocellularantigens.ImmunolRev1999；Gallucci,S.,Μ.Lolkema,andP.Matzinger.1999.Naturaladjuvants!Endogenousactivatorsofdendriticcells.NatureBiotechnology.51249；Albert,M.L.,B.Sauter,andN.Bhadrdwaj.1998.DendtriticcellsacquireantigenfromapoptoticcellsandinduceclassI-restrictedCTLs.Nature392:86).導(dǎo)致抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性增加的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有幾種機(jī)理。胱天蛋白酶8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致了抗原特異性的細(xì)胞免疫保護(hù)。由重組卡介苗生成的胱天蛋白酶8和在重組卡介苗表達(dá)外源抗原的情況下重組卡介苗在真核細(xì)胞中分泌胱天蛋白酶8，針對(duì)卡介苗過量表達(dá)卡介苗和其他結(jié)核病抗原以及針對(duì)卡介苗本身的抗原，將會(huì)導(dǎo)致高水平的抗原特異性細(xì)胞免疫。死亡受體-5(DR-5)也稱為TRAIL-R2(TRAIL受體2)或者TNFR-SF-10B(腫瘤壞死因子-超家族成員10B)同樣調(diào)節(jié)胱天蛋白酶8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(Sheridan，J.P.，S.A.Marsters,R.Μ.Pitti,Α.Gruney,Μ.Skutbatch,D.Baldwin,L.Ramakrishnan,C.L.Gray,K.Baker,ff.I.Wood,A.D.Goddard,P.Godowski,andA.Ashkenazi.1997.ControlofTrailinducedapoptosisbyafamilyofsignalinganddecoyreceptors.Science277:818)。呼吸道腸道病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過TRAIL-DR介導(dǎo)的，導(dǎo)致了隨后的病毒的清除(Clarke，P.，S.M.Meintzer，S.Gibson，C.Widmann,T.P.Garrington，G.LJohnson，andK.LTyler.2000Reovirus-inducedapoptosisismediatedbyTRAIL.J.Virol74:8135)。通過重組卡介苗表達(dá)DR-5會(huì)提供一個(gè)強(qiáng)大的輔助效果，用于誘導(dǎo)針對(duì)重組卡介苗表達(dá)的抗原的抗原特異性細(xì)胞免疫。也可以誘導(dǎo)表達(dá)抗原的細(xì)胞通過Fas連接進(jìn)行細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as連接是用于誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)有力的剌激(Chattergoon，M.A.，J.J.Kim,J.S.Ymig，T.M.Robbinson，D.J.Lee,T.Dentchev，D.M.Wilson,V.Ayyavoo,andD.B.Weiner.2000.Targetedantigendeliverytoantigen-presentingcellsincludingdendriticcellsbyengineeredFas-mediatedapoptosis.NatBiotechnology18:974)0表達(dá)Fas或Fas胞漿結(jié)構(gòu)域/⑶4胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)的重組體卡介苗會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過重組卡介苗使得細(xì)胞免疫增強(qiáng)，產(chǎn)生了如上所述的細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)子，并不限于卡介苗抗原或重組卡介苗特異性編碼的過量表達(dá)的抗原，還包括上述的重組卡介菌可以侵入的真核細(xì)胞中的任何抗原。舉例來說，如果將重組卡介苗傳遞給腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，接著將會(huì)誘導(dǎo)針對(duì)重要的腫瘤抗原的細(xì)胞免疫，消除、減少或防止了腫瘤和/或轉(zhuǎn)移。當(dāng)卡介苗局部給藥時(shí)，比如膀胱癌的例子，此抗腫瘤作用是卡介苗產(chǎn)生的普通抗腫瘤作用之外的作用。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過產(chǎn)生細(xì)胞凋亡特異性的介導(dǎo)因子而增強(qiáng)的重組卡介苗，被傳送至腫瘤或其他細(xì)胞里面，在其中重組卡介苗也產(chǎn)生了外源抗原，針對(duì)這些外源抗原強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答被增強(qiáng)，重組卡介苗針對(duì)這些含有外源抗原的細(xì)胞將誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞應(yīng)答。這些細(xì)胞應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的毀滅，更進(jìn)一步地交叉致敏并且誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤或其他重要抗原的細(xì)胞免疫，和隨后的腫瘤和/或轉(zhuǎn)移的減少或防止。這種外源抗原的一個(gè)例子是不同于寄主HLA抗原的HLA抗原，針對(duì)該抗原，將會(huì)建立強(qiáng)烈的異源性細(xì)胞應(yīng)答。重組卡介苗的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)特性通過細(xì)胞凋亡的特異性介導(dǎo)因子的表達(dá)而增強(qiáng)，它同時(shí)也表達(dá)特異性的腫瘤抗原，重組卡介苗會(huì)針對(duì)這些腫瘤抗原誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的抗原特異性細(xì)胞應(yīng)答，包括破壞這些抗原的某些耐受性，不需要將重組卡介苗直接傳遞到腫瘤本身就可以導(dǎo)致腫瘤和/或轉(zhuǎn)移的消除、減少或防止。緊接著DNA損傷后的細(xì)胞凋亡或者胱天蛋白酶9可誘導(dǎo)某些抗原的耐受性(Hugues,S.,E.Mougneau,ff.Ferlin,D.Jeske,P.Hofman,D.Homann,L.Beaudoin,D.Schrike,M.VonHerrath,A.Lehuen,andN.Glaichenenhaus.2002).Tolerancetoisletantigensandpreventionfromdiabetesinducedbylimitedapoptosisofpancreaticbetacells.Immunity16:169)。耐受性的誘導(dǎo)在控制或防止自身免疫性疾病上是很重要的，例如但不限于糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，局限性回腸炎(Crohnsdisease)，炎性腸病和多發(fā)性硬化。在細(xì)胞中，例如但不限于B胰細(xì)胞、結(jié)腸直腸細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，通過重組卡介苗產(chǎn)生胱天蛋白酶9或其他的細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的耐受性誘導(dǎo)蛋白，會(huì)產(chǎn)生有限的細(xì)胞凋亡，可以在細(xì)胞中誘導(dǎo)出針對(duì)自身免疫的抗原靶的耐受性，從而治療或者防止自身免疫性疾病的病情。涉及自身免疫應(yīng)答的特異性的抗原的識(shí)別，通過重組卡介苗產(chǎn)生這些抗原和胱天蛋白酶9或者其他的能誘導(dǎo)出細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的耐受性的分子，將允許誘導(dǎo)出針對(duì)這些自身免疫標(biāo)靶抗原的耐受性。這種重組卡介苗可以治療和/或防止這些自身免疫性疾病。引入功能性的表達(dá)盒產(chǎn)生能夠在真核細(xì)胞或組織中表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子的重組卡介苗的重組DNA和RNA步驟如下所述。下面的實(shí)施例被認(rèn)為是本發(fā)明不同方面的示例，并不對(duì)本發(fā)明的實(shí)施進(jìn)行限制。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以理解可選的材料、條件和步驟有可能會(huì)不同，并且仍然在技術(shù)人員的技術(shù)知識(shí)范圍之內(nèi)，并沒有超出說明書所述的本發(fā)明的一般范圍之外。實(shí)施例方法分枝桿菌菌株的培養(yǎng)被選的卡介苗菌株在液體培養(yǎng)基例如Middlebrook7H9或Saulton合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選在37°C下培養(yǎng)。菌株可以在靜置或振蕩培養(yǎng)中維持。另外，卡介苗的生長(zhǎng)速率可以通過添加油酸(0.06%v/v；ResearchDiagnostics產(chǎn)品目錄號(hào)01257)和去污劑例如四丁酚醛(0.05%v/v；ResearchDiagnostics產(chǎn)品目錄號(hào)70400)來增強(qiáng)。通過將卡介苗培養(yǎng)物在磷酸緩沖鹽溶液中(在此稱作PBS)連續(xù)稀釋(比如從整10_8以10倍梯度稀釋)后，以100微升的等份均勻涂布在含有25-30毫升的固體培養(yǎng)基例如Middlebrook7H10的3.5英寸的平板上，可以對(duì)卡介苗培養(yǎng)物的純度進(jìn)行評(píng)估。另外，培養(yǎng)物的純度也可進(jìn)一步的通過使用市場(chǎng)上可買到的試劑盒例如thiglycolate培養(yǎng)基(ScienceLab，產(chǎn)品目錄號(hào)1891)和大豆-酪蛋白培養(yǎng)基(BD，產(chǎn)品目錄號(hào)211768)來進(jìn)行評(píng)估。卡介苗種子罐以0.l-2X107cfu/ml的密度在_80°C保存。液體培養(yǎng)物是在相對(duì)于無菌對(duì)照樣的光學(xué)密度(在600nm處)為0.2-4.0時(shí)進(jìn)行收獲；培養(yǎng)物被放置在大小合適的離心管中，并且生物體在8，OOOxg下離心5-10分鐘。丟棄上清液，生物體在含有10-30%(V/V)甘油的Middlebrook7H9組成的貯存溶液中，以密度0.1-2X107cfu/ml再懸浮。這些懸浮液以1ml等份被分配到1.5ml的無菌硼硅酸鹽冷凍管中，然后放置在-80°C。普通分子生物學(xué)技術(shù)限制性內(nèi)切酶(在此為“RE”)；NewEnglandBiolabsBeverly，T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,馬薩諸塞州)和Taq聚合酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,馬里蘭州)根據(jù)廠家的操作手冊(cè)使用，質(zhì)粒DNA使用小批量(QiagenMiniprepEkit,SantaClarita,力口州)或大批量(QiagenMaxiprepEkit,SantaClarita，加州)的質(zhì)粒DNA純化試劑盒，根據(jù)廠家的操作手冊(cè)(Qiagen，SantaClarita,加州)進(jìn)行制備；無核酸酶，分子生物學(xué)級(jí)別的milli-Q水，Tris-HCl(pH7.5)，EDTApH8.0，1MMgCl2,100%(v/v)乙醇，超純的瓊脂糖和瓊脂糖凝膠電泳緩沖液是從LifeTechnologies(Gaithersburg，馬里蘭州)公司購(gòu)買。限制性內(nèi)切酶消化、PCR、DNA連接反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳是按照已知的步驟實(shí)施的(Sambrook，etal.,MolecularCloningALaboratoryManual.1,2,3；1989)；Straus,etal.,ProcNatlAcadSciUSA.Mar；87(5)1889-93；1990)。下文中描述的用來驗(yàn)證每個(gè)重組質(zhì)粒DNA序列的核苷酸序列是通過傳統(tǒng)的DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù)，使用AppliedBiosystems公司的自動(dòng)測(cè)序儀(型號(hào)為373A)來完成。PCR引物是從供應(yīng)廠商例如Sigma(St.Louis，密蘇里州)公司購(gòu)買，并且通過使用AppliedBiosystems公司的DNA合成儀(型號(hào)為373A)進(jìn)行合成。PCR引物的使用濃度是150_250mM,并且用軟件Clonemanagersoftwareversion4.1(ScientificandEducationalSoftwareInc.，Durham，北羅卡萊納州)確定PCR反應(yīng)的退火溫度。PCR在型號(hào)為400880的StrategeneRobocycler(Strategene,LaJolla，加州)中進(jìn)行。用于擴(kuò)增的PCR弓|物通過使用CloneManagersoftwareversion4.1(ScientificandEducationalSoftwareInc.，Durham，北羅卡萊納州)來設(shè)計(jì)。該軟件能夠設(shè)計(jì)PCR引物并且能識(shí)別與被操作的特定的DNA片段相適配的RE位點(diǎn)。PCRs在熱循環(huán)儀器中進(jìn)行，例如型號(hào)為400880的StrategeneRobocycler(Strategene)，并且PCRs中引物退火、延長(zhǎng)和變性的時(shí)間根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來設(shè)定(Strausetal.，supra，1990)。RE消化和PCRs隨后通過瓊脂糖凝膠電泳按照標(biāo)準(zhǔn)程序來分析(Strausetal.,supra,1990；andSambrooketal.,supra,1989)。陽(yáng)性克隆被定義為是顯示合適的RE模式和/或PCR模式的克隆。通過該步驟識(shí)別的質(zhì)粒也可以如上所述使用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序步驟被進(jìn)一步評(píng)估。大腸埃希氏桿菌菌株，例如DH5和Sable2R，是購(gòu)買自Technologies(Gaithersburg,馬里蘭州)，并且如下面的實(shí)施例所述，是作為重組質(zhì)粒的起始寄主。重組質(zhì)粒通過使用高壓電脈沖儀器例如GenePulser(BioRadLaboratories,Hercules,加州)經(jīng)電穿孔被引入進(jìn)大腸桿菌，操作設(shè)置在100-200W、15_25mF和1.0-2.5kV，如文獻(xiàn)(Strausetal.，supra,1990)所述。最佳的電穿孔條件是通過導(dǎo)致每個(gè)細(xì)菌DNA微克數(shù)的最大轉(zhuǎn)化效率的設(shè)定來確定的。按照該廠家的說明，菌株在胰蛋白酶水解的(tryptic)豆胨瓊脂(Difco，Detroit，密歇根州)或胰蛋白酶水解的豆胨培養(yǎng)液(Difco，Detroit，密歇根州)中培養(yǎng)。除非另有說明，所有細(xì)菌都是在371、5%0)2卜/力、輕度振蕩下生長(zhǎng)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，在培養(yǎng)基中添加抗生素(Sigma，St.Louis，密蘇里州)。菌株于_80°C下在含有30%(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，密蘇里州)的(Difco)中以每毫升約109個(gè)菌落形成單位(在此稱為"cfu")懸浮保存?？ń槊缰械牡任换蚪粨Q現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了將改變的等位基因引入到分枝桿菌菌株的方法，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能解釋并實(shí)行此方法(Parishetal.，Microbiology1461969-1975；2000)一種產(chǎn)生等位基因質(zhì)粒交換的新方法需要合成的DNA。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于質(zhì)粒產(chǎn)物有高度明確的來歷，并且與政府的規(guī)章相適應(yīng)。反之，以前的使用方法雖然有效，但是缺乏實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)記錄，因此不大可能被應(yīng)允。如果產(chǎn)品要被美國(guó)和歐洲權(quán)威機(jī)構(gòu)許可在人的身上使用，就必需與該法規(guī)相適應(yīng)。在分枝桿菌中用于等位基因交換的自殺載體是一個(gè)質(zhì)粒，它可以在大腸桿菌中復(fù)制，但是不能在分枝桿菌例如結(jié)核分枝桿菌和卡介苗中復(fù)制。本發(fā)明中的用于等位基因交換步驟的具體的自殺載體不是很重要，可以選自學(xué)術(shù)(Parishetal.，supra，2000)和商業(yè)來源。一個(gè)用于等位基因交換的較好的自殺基因的設(shè)計(jì)如圖1所示。該質(zhì)粒包括以下幾個(gè)DNA片段oriE序列是用于質(zhì)粒在大腸桿菌(基因庫(kù)登錄號(hào)L09137)中復(fù)制的，卡那霉素抗性序列用于在大腸桿菌和分枝桿菌(基因庫(kù)登錄號(hào)AAM97345)中進(jìn)行篩選的，另一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記(例如zeocin抗性基因(基因庫(kù)登錄號(hào)AAU06610)，是受分枝桿菌啟動(dòng)子(例如hsp60啟動(dòng)子)控制的。第二個(gè)抗生素選擇標(biāo)記不是必需的，但是被包括時(shí)，會(huì)使得雙重篩選能抑制在等位基因交換過程中自發(fā)的卡那霉素抗性分離株的生長(zhǎng)暈(Garbeetal.,Microbiologyl40133-138；1994)。這種自殺載體的構(gòu)建可以通過使用如這里所述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。然而，當(dāng)前的規(guī)章的標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)增加了引入朊病毒顆粒的恐懼，此病毒顆粒是從和含有BSE-傳染物質(zhì)的牛產(chǎn)品接觸的產(chǎn)物中獲得的。為了避免將不知來源的物質(zhì)(比如DNA序列)引入目標(biāo)菌株，因此將所有的在自殺載體中的DNA通過商業(yè)來源(比如Picoscript，Inc.)進(jìn)行合成是比較合適的。因此，構(gòu)建自殺載體的較合適的方法就是用DNA軟件(例如CloneManager)來匯編DNA序列設(shè)計(jì)，然后通過任何一個(gè)提供此項(xiàng)服務(wù)的供應(yīng)商(比如PicoscriptInc.)在付費(fèi)的基礎(chǔ)上合成DNA。該方法是用來產(chǎn)生一個(gè)自殺載體一pAF100(未圖示)，然后將它進(jìn)一步修飾用于本申請(qǐng)中(pAF103，在圖1中用示意圖描繪，并在表1中進(jìn)一步描述)。表1.自殺載體<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>這種自殺載體具有優(yōu)點(diǎn)，例如含有兩個(gè)抗生素選擇標(biāo)記，因此減少對(duì)一種抗生素呈現(xiàn)出抗性的自發(fā)突變的選擇，這種突變發(fā)生率是每代大約1/108。對(duì)兩種抗生素都自發(fā)產(chǎn)生抗性是極度罕見的，每一代發(fā)生率在大約1/1016。因此，培養(yǎng)基中出現(xiàn)雙重抗性菌株、被用在等位基因交換步驟上的概率小于1/106。對(duì)于等位基因交換過程中的陰性選擇，能賦予蔗糖敏感型的表型的sacB基因(GenomeSeqID#NT01BS4354)被包含，用于富集培養(yǎng)已經(jīng)進(jìn)行最終的DNA重組步驟和完成等位基因交換的菌株。制劑和接種策略疫苗制劑的策略是建立在研究的基礎(chǔ)上來確定整個(gè)制造過程中最大存活率和穩(wěn)定性。其包括，使用各種經(jīng)常用到的培養(yǎng)基用于分枝桿菌的培養(yǎng)，包括添加甘油、糖、氨基酸和去污劑或鹽，來測(cè)定在培養(yǎng)過程中最高生物存活率(從活到死)。培養(yǎng)后細(xì)胞通過離心或者正切流向過濾收獲，并且再懸浮在能給予冷凍或冷凍_干燥過程中細(xì)胞保護(hù)的穩(wěn)定的培養(yǎng)基中。經(jīng)常使用的穩(wěn)定劑包括谷氨酸鈉，或氨基酸或氨基酸派生物，甘油，糖或經(jīng)常使用的鹽。最后的制劑將提供足夠多的活的生物體通過皮內(nèi)、經(jīng)皮注射、輸液或口服而被釋放，具有足夠的穩(wěn)定性來維持以及可用于分布和使用的足夠的儲(chǔ)存期。結(jié)核病疫苗的臨床前評(píng)估一般的安全性試驗(yàn)六只一組BALB/c老鼠用研究中的2X106CFU重組卡介苗和類似的親本株進(jìn)行腹膜內(nèi)感染。動(dòng)物在感染后14天內(nèi)被監(jiān)控一般的健康和體重。接受卡介苗和重組卡介苗的動(dòng)物保持健康，在觀察期內(nèi)即沒有體重減輕，也沒有顯示出明顯的疾病癥狀。新的重組卡介苗菌株在具有免疫能力的小鼠中的毒性15只具有免疫能力的BALB/c小鼠分別用2X106個(gè)重組卡介苗和卡介苗親本株進(jìn)行靜脈內(nèi)感染。感染后的第一天，每組三個(gè)小鼠被處死，并分析脾、肺和肝中的菌落形成單位CFU，以確保每個(gè)動(dòng)物有相同的感染劑量。在感染后的第4、8、12、16周，每組處死三個(gè)小鼠，檢測(cè)脾、肝和肺中的CFU，與親本卡介苗菌株相比，用來評(píng)估重組卡介苗在體內(nèi)的生長(zhǎng)。預(yù)計(jì)重組卡介苗顯示出與親本株卡介苗相似的毒性。免疫功能不全的小鼠的嚴(yán)格安全性試驗(yàn)擁有SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷病)的免疫功能不全的小鼠10只一組分別用2X106cfu的重組卡介苗和親本株卡介苗菌株進(jìn)行靜脈內(nèi)感染。感染后的第一天，每組三個(gè)小鼠被處死，評(píng)估脾、肝和肺中的菌落形成單位CFU，用來驗(yàn)證接種劑量。每組中剩下的七只小鼠被監(jiān)控一般的健康和體重。追蹤這些小鼠的存活，當(dāng)整個(gè)觀察期內(nèi)重組卡介苗感染的小鼠的存活不比親本株感染的動(dòng)物差時(shí)，這就是成功的結(jié)果。豚鼠的安全性試驗(yàn)與在人身上已經(jīng)很好地建立了安全性輪廓的親本株卡介苗疫苗相比，重組卡介苗菌株的安全性也要在豚鼠中被評(píng)估。首先，檢查疫苗對(duì)動(dòng)物的一般健康狀態(tài)的影響，包括體重增加。豚鼠用107(接種劑量的100倍)cfu的重組和親本卡介苗菌株進(jìn)行肌肉注射接種，并且監(jiān)控動(dòng)物的一般健康和體重六周。對(duì)死在六周前的動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖檢查。在感染后的六周末，所有的動(dòng)物都被處死，進(jìn)行宏觀病理學(xué)研究。在六周后的尸體解剖中，體重沒有減輕，沒有異常行為并且所有的器官都顯示正常。當(dāng)重組卡介苗_Pfo疫苗對(duì)健康沒有不利的影響、并且動(dòng)物的體重增加與用親本株接種的動(dòng)物相比以正常的速度增加時(shí)，這就表明了這是個(gè)成功的試驗(yàn)。同時(shí)，動(dòng)物器官中的細(xì)菌水平也被監(jiān)控。對(duì)用親本株或重組卡介苗疫苗接種的豚鼠在接種后在不同的時(shí)間間隔內(nèi)使之安樂死，之后在肺、脾和局部(腹股溝)淋巴結(jié)處檢測(cè)卡介苗或重組卡介苗的cfu.毒性試驗(yàn)為了評(píng)估重組卡介苗的毒性，分別用人類使用的重組卡介苗菌株、卡介苗菌株或鹽水以一倍劑量、高于單劑量的四倍、低于單劑量的四倍，對(duì)每組的12只豚鼠進(jìn)行皮內(nèi)接種疫苗。在接種后的第三天，六只動(dòng)物被處死，來評(píng)估疫苗在這些動(dòng)物身上的急性作用。在接種后的第28天，剩余的六只動(dòng)物被處死，來評(píng)估在這些動(dòng)物身上的慢性作用。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每只動(dòng)物的體重被稱重，并且檢查了宏觀病理學(xué)和注射部位的外部特性。取血用于血液化學(xué)檢查，并且檢查了內(nèi)臟器官的組織病理學(xué)和注射部位。測(cè)定保護(hù)作用的研究鼠的保護(hù)研究C57B1/6小鼠(雌性，5-6周齡)13只一組經(jīng)皮下免疫接種106CFU重組卡介苗、親本卡介苗和鹽水。另一組小鼠作為健康對(duì)照。接種后八周，通過包含總共107CFU的攻擊菌株的10ml單細(xì)胞懸浮液的氣霧劑，小鼠被結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)攻擊，如前所述，這個(gè)劑量釋放100個(gè)活性細(xì)菌到每個(gè)動(dòng)物的肺部。監(jiān)控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及沒有被攻擊的動(dòng)物的存活率。攻擊后，緊接著監(jiān)控動(dòng)物的體重?fù)p失和常規(guī)的一般的健康狀況。攻擊后的第一天，每組三個(gè)小鼠被處死，檢測(cè)CFU來確定攻擊的劑量，還有一只被處死用于脾和肺的組織病理學(xué)。攻擊后的五周，每組九只動(dòng)物被處死，進(jìn)行動(dòng)物的組織病理學(xué)檢查和微生物學(xué)分析。來源于六只小鼠的肺和脾組織的cfu計(jì)數(shù)被評(píng)估(用帶有選擇性添加物的平板區(qū)分疫苗菌株和攻擊菌株)。如果用H37RV-卡那霉素抗性菌株攻擊，將用卡那霉素或TCH區(qū)分攻擊菌株和疫苗菌株。如果結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株用于攻擊，將用TCH區(qū)分疫苗菌株和攻擊菌株(卡介苗是敏感的，但結(jié)核分枝桿菌是自然抗性的。)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的誘導(dǎo)無特異病原的(SPF)豚鼠用103個(gè)重組卡介苗或卡介苗親本株經(jīng)皮內(nèi)接種。接種后九周，動(dòng)物的背部被刮毛，經(jīng)皮內(nèi)注射含有10ygPPD的100yl磷酸鹽緩沖溶液。24小時(shí)后，硬塊的直徑被測(cè)量。重組卡介苗菌株誘導(dǎo)的DTH相等或大于被親本卡介苗菌株誘導(dǎo)的DTH。豚鼠的攻擊研究為了確定重組卡介苗疫苗針對(duì)肺結(jié)核分枝桿菌攻擊的效力，豚鼠12只一組，分別用重組卡介苗、親本卡介苗菌株或鹽水來免疫(年輕成年SPFHartley，250-300克，雄性)。疫苗和對(duì)照用106cfu經(jīng)皮內(nèi)給藥。接種后10周，重組卡介苗、卡介苗和假的免疫的動(dòng)物將被含有結(jié)核病分枝桿菌的氣霧劑攻擊，氣霧劑來自于總共含有107cfu的結(jié)核病分枝桿菌的10ml單細(xì)胞懸浮液。如前所述(Brodinetal.，JInfectDis.190(1)，2004)，該步驟釋放了大約100個(gè)活性細(xì)菌到每個(gè)動(dòng)物的肺部。攻擊后，監(jiān)控動(dòng)物以及沒有被接種的健康組、沒有被攻擊的動(dòng)物的存活率。攻擊后，監(jiān)控動(dòng)物的體重?fù)p失和一般的健康狀況。攻擊后10周，每組六只動(dòng)物被處死，每組剩余的六只在攻擊后70周進(jìn)行長(zhǎng)期評(píng)估。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，都要進(jìn)行動(dòng)物的組織病理學(xué)檢查和微生物學(xué)分析。肺和脾組織的組織病理學(xué)和cfu計(jì)數(shù)被評(píng)估(用帶有選擇性補(bǔ)充物的平板區(qū)分疫苗菌株和攻擊菌株)。如果用H37RV-卡那霉素抗性菌株攻擊，將用卡那霉素或TCH區(qū)分攻擊菌株和疫苗菌株。如果用肺結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株攻擊，將用TCH(卡介苗是敏感的，但是肺結(jié)核分枝桿菌是自然抗性的)區(qū)分疫苗菌株和攻擊菌株)。當(dāng)假的免疫的動(dòng)物在攻擊后迅速的死去、而用重組卡介苗免疫的動(dòng)物比用卡介苗親本株免疫接種的動(dòng)物存活的長(zhǎng)時(shí)，則表示成功。靈長(zhǎng)類動(dòng)物的安全性和攻擊性研究近年來，獼猴被用作針對(duì)結(jié)核病分枝桿菌的疫苗的評(píng)估。在人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物之間的演化關(guān)系和肺結(jié)核在這些物種上相似的臨床和病理學(xué)的表現(xiàn)使得非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型用于肺結(jié)核疾病和疫苗效力的實(shí)驗(yàn)研究很有吸引力。該模型，肺部空泡的發(fā)展作為特征，顯示出可以運(yùn)用到人類的結(jié)核病上。感染和疾病的過程被X光追蹤并測(cè)定體重減輕和各種血液實(shí)驗(yàn)，包括紅細(xì)胞沉降率(ESR)、外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活性、和抗體應(yīng)答。感染后，獼猴特發(fā)展成有特征性病變的肺部病癥，并且取決于攻擊的劑量，在感染后的四-六周內(nèi)由于急性的呼吸道感染而死亡。低的感染劑量可以導(dǎo)致沒有疾病的慢性感染，更像在人類體內(nèi)。研究設(shè)計(jì)這項(xiàng)研究將直接比較不同劑量的卡介苗親本菌株與重組卡介苗菌株，單獨(dú)給藥或繼之以用含有重組卡介苗構(gòu)建中過量表達(dá)的序列的疫苗來兩次加強(qiáng)免疫。后者可以作為基于合適的佐劑的重組蛋白、DNA或Ad35構(gòu)建體而被釋藥。第一項(xiàng)研究評(píng)估了在沒有免疫加強(qiáng)的情況下親本株卡介苗對(duì)比重組卡介苗構(gòu)建體的保護(hù)效果。這項(xiàng)研究包括了三個(gè)組(每個(gè)組10只動(dòng)物)，設(shè)計(jì)如下包括卡介菌、重組卡介苗和鹽水各個(gè)一組。每個(gè)組有兩只動(dòng)物用重組卡介苗構(gòu)建體過量表達(dá)的抗原做皮膚測(cè)試，以及用標(biāo)準(zhǔn)PPD和鹽水作對(duì)照。與卡介苗相比，重組卡介苗組陽(yáng)性的和大的硬塊表明了體內(nèi)疫苗的攝取和引發(fā)了免疫應(yīng)答。每組的剩余的八只動(dòng)物被低劑量的結(jié)核病分枝桿菌Erdman菌株氣霧劑攻擊，并且通過攻擊后16周的細(xì)菌負(fù)荷的減少或結(jié)束時(shí)的存活率測(cè)定保護(hù)作用。隨后的卡介苗致敏步驟與上面所述的基本一樣，不同的是動(dòng)物首先用卡介苗、重組卡介苗和鹽水接種后，接著用過量表達(dá)的抗原兩次加強(qiáng)免疫。非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中的免疫原性和保護(hù)作用的研究目的在于研究獼猴肺結(jié)核的免疫生物學(xué)和免疫病理學(xué)方面，用于重組卡介苗構(gòu)建體的效力研究。這些動(dòng)物是被籠養(yǎng)的青少年到青壯年動(dòng)物，在開始試驗(yàn)前經(jīng)全面調(diào)控平均體重從2到3Kg。接種前的研究包括基準(zhǔn)的血液測(cè)試，包括常規(guī)的血液學(xué)研究和紅細(xì)胞沉降率以及淋巴細(xì)胞增殖分析。用PPD測(cè)定的皮膚試驗(yàn)是用來確保對(duì)結(jié)核菌缺乏敏感性，以及獲得胸部X光作為感染前概況的一部分。免疫接種期間總體持續(xù)21周，包括在0周時(shí)用卡介苗或重組卡介苗的最初的免疫接種和在12和16周時(shí)的抗原免疫加強(qiáng)?？乖禺愋悦庖呤峭ㄟ^淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)中測(cè)定增殖和干擾素Y(IFNY)的分泌來進(jìn)行評(píng)估。淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFNg的頻率通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISP0T)或熒光活化細(xì)胞分類器(FACS)確定。最后，血樣在相對(duì)于最初接種免疫0、4、8、12、16、20周時(shí)采集。在上次免疫后的四到六周時(shí)，在同一天用相同的制備的3ml(l，000cfU)的結(jié)核病分枝桿菌Erdman經(jīng)氣管裝置攻擊動(dòng)物。評(píng)估感染過程的體重減少、發(fā)熱、升高ESR、DTH至PPD、體外PPD刺激的PBMC的增殖反應(yīng)和重組卡介苗過量表達(dá)抗原后的生成的IFN-g水平的測(cè)定。進(jìn)行胸部的X光檢測(cè)來檢查與肺部肺結(jié)核病相一致的異常情況，最后，在攻擊后的12-16周時(shí)進(jìn)行尸體剖檢。結(jié)核病載體和疫苗的臨床評(píng)估安全性和毒性研究按照規(guī)章指南的要求進(jìn)行的臨床前的安全性和毒性研究作為上述的臨床前毒性和安全性研究，這些研究之后接著要進(jìn)行人的安全性研究。這些研究最初在健康的Quantiferon陰性成年人身上進(jìn)行，接著年齡降低在孩子和嬰兒身上進(jìn)行。免疫原性研究小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的免疫原性研究可以使用但不限于評(píng)估細(xì)胞免疫的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如短期和長(zhǎng)期抗原或肽刺激下的INFy、ELISP0T和/或流式細(xì)胞術(shù)。相似的方法學(xué)被使用在人體反應(yīng)的評(píng)估上。四聚物研究被運(yùn)用在人接種后的CD4和CD8反應(yīng)的評(píng)估上。致敏-加強(qiáng)策略的優(yōu)化；重組卡介苗可很好地作為針對(duì)肺結(jié)核或其他的疾病的單一疫苗，為此它被工程化為能表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)基因。在此處使用的，“轉(zhuǎn)基因”是與分枝桿菌的啟動(dòng)子功能性地連接并能表達(dá)所研究的蛋白的DNA片段。此處描述的重組卡介苗作為肺結(jié)核病的疫苗或表達(dá)轉(zhuǎn)基因保護(hù)避免其他疾病，也可以用重組蛋白與輔助劑或病毒或細(xì)菌攜帶的抗原混合，在致敏免疫系統(tǒng)用于加強(qiáng)免疫上很好地工作。在動(dòng)物的臨床前研究和人的研究上，卡介苗致敏接著被重組蛋白/輔助劑或載體加強(qiáng)免疫，其體系和劑量被優(yōu)化。因?yàn)榭ń槊缰旅舻男ЯΓ@些致敏加強(qiáng)策略是將免疫力引入人體中的最有效的方法，特別體現(xiàn)在本發(fā)明中，接著通過重組蛋白或載體集中和提高免疫系統(tǒng)的加強(qiáng)反應(yīng)。在動(dòng)物中接觸后的治療疫苗研究20C57BL/6小鼠被用于建立潛伏期感染；在低劑量的感染誘導(dǎo)可忽略不計(jì)的肺結(jié)核分枝桿菌特異性免疫時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，以及，在肺結(jié)核分枝桿菌特異性免疫減少和被記憶T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的那個(gè)時(shí)間點(diǎn)，治療的疫苗將給小鼠接種。疫苗治療的優(yōu)點(diǎn)將在小鼠上次治療疫苗釋藥后的二和五個(gè)月中通過在個(gè)體小鼠的肺和脾中cfu計(jì)數(shù)來評(píng)估。用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法分析小鼠組的cfu計(jì)數(shù)，并且結(jié)果將用來表明治療疫苗是否顯著地減少潛伏的肺結(jié)核分枝桿菌對(duì)小鼠的感染；在必要時(shí)相似的方法學(xué)可以用在其他動(dòng)物反應(yīng)的評(píng)估上。卡介苗載體的臨床評(píng)估重組卡介苗的口服給藥本發(fā)明中用重組卡介苗對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的口服接種也可以用以前描述的方法完成(Milleretal.，CanMedAssocJ121(1):45_54;1979)。口服給藥重組卡介苗的量將取決于受試者的種類以及疾病或被治療的狀況而不同。一般地，采用的劑量大約是103至1011個(gè)活生物體，更優(yōu)選105至109個(gè)生物體。重組卡介苗通常與藥學(xué)上容許的的載體或稀釋劑一起給藥。具體的藥學(xué)上允許被使用的載體或稀釋劑對(duì)本發(fā)明來說不是關(guān)鍵性的。稀釋劑的例子包括磷酸鹽緩沖溶液，緩沖胃中胃酸的緩沖溶液例如含蔗糖的檸檬酸鹽緩沖溶液(PH7.0)，單一的碳酸氫鹽緩沖溶液(Levineetal,J.Clin.Invest.,79:888_902；1987；andBlacketal.，J.Infect.Dis.,155=1260-1265；1987)，或者含有抗壞血酸、乳糖和任選的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的碳酸氫鹽緩沖溶液(PH7.0)。載體的例子包括蛋白質(zhì)例如在脫脂奶中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，糖類例如蔗糖，或者聚乙烯吡咯烷酮。一般地這些載體在濃度大約是0.1-90%(w/v)是被使用，在1-10%(w/v)的范圍時(shí)更合適。實(shí)施例實(shí)施例1.親本卡介苗菌株在豚鼠中的效力重組卡介苗30對(duì)豚鼠的保護(hù)作用研允。舉一個(gè)用現(xiàn)有的重組卡介苗30疫苗進(jìn)行的研究的實(shí)施例，進(jìn)行大規(guī)模的豚鼠研究目的在于比較兩個(gè)批次的重組卡介苗30和親本卡介苗Tice菌株自身、以及其他在全世界人身上使用的市場(chǎng)上可買到的的卡介苗菌株(SSI——1331菌株)相比的保護(hù)效力。這兩個(gè)批次的重組卡介苗30，或者在實(shí)驗(yàn)室條件下生產(chǎn)(重組卡介苗30-UCLA)，或者在GMP條件下制備(重組卡介苗30-KIT)用于人類使用。豚鼠(每組10只動(dòng)物)通過皮下注射途徑用每種卡介苗疫苗的103cfu的單劑量免疫。在本研究中包括了一個(gè)陰性對(duì)照組(用鹽水免疫)。在接種后的第八周，動(dòng)物被有毒的Erdman菌株通過氣霧劑途徑攻擊，通過校準(zhǔn)Middlebrook空氣傳染裝置的噴霧器小室釋放大約10-15個(gè)細(xì)菌到肺部。動(dòng)物在攻擊后的第10周被處死。在尸體解剖中，肺和脾從動(dòng)物身上取出，活菌的數(shù)量通過在培養(yǎng)基Middlebrook7H11上用依次10倍稀釋的肺葉和脾的組織均漿涂平板來確定。在37°C、5%(v/v)C02下培養(yǎng)21天后計(jì)數(shù)形成的細(xì)菌菌落。數(shù)據(jù)以回收的細(xì)菌的平均值的loglO來表示。結(jié)果(圖2)顯示與陰性鹽水對(duì)照相比，所有的疫苗針對(duì)肺結(jié)核分枝桿菌的攻擊都有保護(hù)作用，疫苗之間的不同趨向于下述兩組重組卡介苗30(UCLA)和卡介苗Danish1331具有更多的保護(hù)性；以及卡介苗(親本Tice菌株)和重組卡介苗30(KIT)有較少的保護(hù)性。因此，可合理地得出結(jié)論在實(shí)驗(yàn)室條件下產(chǎn)生、而非GMP條件等級(jí)的重組卡介苗30(UCLA)，顯示能誘導(dǎo)出比親本Tice菌株更好的保護(hù)作用，但此保護(hù)效果最多也只能比得上市場(chǎng)上可買到的卡介苗SSI。因此，卡介苗Danish1331的改善應(yīng)當(dāng)成為產(chǎn)生新的重組卡介苗疫苗的目標(biāo)。實(shí)施例2.構(gòu)建寄主作為沒有抗生素抗性標(biāo)記的表達(dá)載體的攜帶者敲除卡介菌Danish1331菌株的leuD基因的質(zhì)粒構(gòu)建LeuD基因的左、右lkb側(cè)翼區(qū)通過DNA合成(DNA2.0，CA)組裝在一起，形成了兩端帶有pacl位點(diǎn)的2kb的DNA片段。使用PacI限制酶消化之后連接，該DNA片段被克隆進(jìn)上述等位基因交換質(zhì)粒，形成了LeuD敲除質(zhì)粒。LeuD基因的等位基因滅活LeuD基因的滅活按所述的方法進(jìn)行，除了將50yg/ml亮氨酸添加到LeuD基因敲除的菌株的培養(yǎng)基中。該操作的主要步驟的流程圖在圖4中給出oLeuD敲除的驗(yàn)證表型試驗(yàn)測(cè)試獲得的菌株的生長(zhǎng)對(duì)亮氨酸的依賴性。具體地，該細(xì)菌在存在或缺乏50iig/ml亮氨酸的情況下，在含有10%0ADC和0.05%(v/v)四丁酚醛添加物的7H9培養(yǎng)基中被培養(yǎng)，通過測(cè)量0D_值監(jiān)控細(xì)菌的生長(zhǎng)?；蚪M區(qū)域序列分析構(gòu)建的菌株的基因組DNA如上面描述的方法被制備。與目標(biāo)基因左、右lkb側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)的引物對(duì)被用于PCR擴(kuò)增，由染色體得到一個(gè)大約2kb的片段。該P(yáng)CR產(chǎn)物被測(cè)序來確證該區(qū)域的leuD基因的缺失。AlysA卡介苗菌株與上面所述的步驟相似，我們已經(jīng)由Danishi1331的衍生物構(gòu)建了AlysA卡介苗菌株，其也表達(dá)被引入到ureC位點(diǎn)的突變的pfoA等位基因，允許生物體逃離增加的MHCI類的提呈抗原的吞噬體。LysA基因編碼內(nèi)消旋二氨基庚二酸鹽脫羧酶(DAPDC)。此酶催化賴氨酸的生物合成途徑的最后步驟，通過吡哆醛-5'-磷酸酯(PLP)依賴機(jī)制將內(nèi)消旋二氨基庚二酸(DAP)轉(zhuǎn)化成L-賴氨酸。在免疫功能不全的的小鼠中結(jié)核病分枝桿菌H37Rv的lysA基因被確定對(duì)于細(xì)菌的存活是必須的，說明了新的生物合成的賴氨酸對(duì)于在體內(nèi)存活是至關(guān)重要的，并表明了與賴氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的質(zhì)粒應(yīng)當(dāng)在體內(nèi)和體外都是被穩(wěn)定攜帶的。菌株通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法經(jīng)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)而被創(chuàng)建。實(shí)施例3.在重組卡介苗菌株中過量表達(dá)肺結(jié)核分枝桿菌抗原DNA操作肺結(jié)核分枝桿菌的抗原TB10.4(Rv0288)、Ag85B(Rvl886c)和Ag85A(Rv3804c)，使用來自Ag85BplusRv3130的啟動(dòng)子按照描述的順序(Florczyketal.，supra,2003)被多順反子地(polycistronically)表達(dá)。具有KDEL序列編碼肽段的DNA序列被放置在抗原的末端，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)來提高每個(gè)抗原的抗原提呈。另外，設(shè)置5’-環(huán)狀結(jié)構(gòu)和3’-轉(zhuǎn)錄終止子序列用來確保轉(zhuǎn)錄的多順反子mRNA的穩(wěn)定性。最終，限制性內(nèi)切酶PacI序列被用在兩個(gè)末端的側(cè)翼，以便將表達(dá)盒克隆進(jìn)表達(dá)載體。所有表達(dá)盒里的DNA通過基因合成被制備(PicoscriptInc，TX)。表達(dá)盒通過使用PacI位點(diǎn)被克隆進(jìn)表達(dá)載體。在大腸桿菌中擴(kuò)增后，質(zhì)粒被Ndel消化以除去oriE和卡那霉素抗性基因，接著通過連接產(chǎn)生單向穿梭載體，然后使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔步驟(Parishetal.Microbiology,145；3497-3503；1999)被引入到分枝桿菌leuD營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體中。圖3用示意圖描述了示范性的非抗生素表達(dá)載體。使用非抗生素選擇系統(tǒng)的肺結(jié)核分枝桿菌抗原的表達(dá)卡介苗Danish1331的亮氨酸自養(yǎng)型，被用作非抗生素選擇系統(tǒng)的寄主，在添加10%0AD(油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶)、0.05%(v/v)四丁酚醛和50i!g/ml亮氨酸的7H9培養(yǎng)集中培養(yǎng)。在電穿孔后，含有抗原表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株在沒有亮氨酸的情況下通過涂布在7H10平板(BDDifco)上而被分離。該細(xì)菌的存活是取決于通過質(zhì)粒的leuD基因的抗原表達(dá)，其反過來又作為維持細(xì)胞中的質(zhì)粒的機(jī)理。生成的單個(gè)菌落被分離，并培養(yǎng)在上述的7M培養(yǎng)基中，除了沒有亮氨酸添加物。表達(dá)的驗(yàn)證每個(gè)抗原的表達(dá)經(jīng)過蛋白印跡(Westernblot)分析來檢測(cè)。具體來說，培養(yǎng)物的上清液被收集，并按照以前描述的方法進(jìn)行處理(Harthetal.,InfectImmun65(6)=2321-2328；1997)。然后表達(dá)的抗原在SDS-PAGE凝膠電泳上分離，并與抗原85A、85B和10.4的抗體雜交。通過定量測(cè)定每個(gè)特定條帶的強(qiáng)度，與表達(dá)質(zhì)粒陰性寄主產(chǎn)生的條帶相比較，來評(píng)估每個(gè)抗原的表達(dá)水平。實(shí)施例4.在沒有抗生素選擇性的分枝桿菌中表達(dá)選定的抗原材料和方法用于電穿孔的質(zhì)粒和分枝桿菌的制備重組質(zhì)粒DNA被分離并被限制性內(nèi)切酶Ndel(NewEnglandBiolabs)消化，釋放出抗生素選擇標(biāo)記(例如抗卡那霉素)和大腸桿菌復(fù)制區(qū)域的起始點(diǎn)(OriE)。然后，根據(jù)產(chǎn)品說明，被消化的質(zhì)粒DNA片段用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)環(huán)化。生成的質(zhì)粒，含有分枝桿菌復(fù)制起始點(diǎn)和選定的抗原，沒有抗生素抗性基因，不能在革蘭氏陰性細(xì)菌中復(fù)制，將此質(zhì)粒引入到選定的分枝桿菌中。為了制備用于電穿孔的分枝桿菌，卡介苗Danish1331細(xì)菌于37°C下在含有10%0ADC添加物的Middlebrook7H9培養(yǎng)基(BDBiosciences)中培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期。Tyloxapol(0.05%v/v,ResearchDiagnosticsCat.No.70400)被用來分散細(xì)菌。細(xì)胞在10%甘油加0.05%四丁酚醛中清洗三次，在電穿孔前除去培養(yǎng)基。每次電穿孔，每1.25X108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞使用1.6iig質(zhì)粒。電穿孔在2.2kV、25iiF電容和l.OkQ電阻下進(jìn)行。電穿孔后，細(xì)胞以10倍連續(xù)稀釋涂布在Middlebrook7H10瓊脂(BDBiosciences)的平板上，并在37°C下孵育。含有表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌菌落的PCR篩選；重組菌株通過PCR進(jìn)行第一次篩選，使用正向引物GTTAAGCGACTCGGCTATCG(SEQIDNO1)和反向引物ATGCCACCACAAGCACTACA(SEQIDNO2)擴(kuò)增表達(dá)質(zhì)粒中的oriM區(qū)域的DNA序列。PCR參數(shù)如下第一步95°C4分鐘，一個(gè)循環(huán)；第二步:95°C1分鐘，60°C1分鐘，接著72°C1分鐘，總共30個(gè)循環(huán)；第三步72°C10分鐘，1個(gè)循環(huán)。第四步4°C儲(chǔ)存。生成的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析來確證細(xì)胞中質(zhì)粒的存在。結(jié)果被設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增質(zhì)粒起始點(diǎn)(OriM)的PCR是用來篩選生成的含有過量表達(dá)質(zhì)粒的菌落。因?yàn)檫@個(gè)區(qū)域不在細(xì)菌的染色體中，細(xì)胞中該區(qū)域的存在強(qiáng)烈的暗示了質(zhì)粒已經(jīng)被引入細(xì)胞中。在被篩選的重組卡介苗的菌落中，一些菌落產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，正如通過凝膠電泳分析的一樣，其在大小上與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)類似。相反，親本卡介苗細(xì)菌不能產(chǎn)生任何PCR產(chǎn)物，如圖5所示。該試驗(yàn)提供了初步證據(jù)，即質(zhì)粒已經(jīng)成功的被引入到分枝桿菌中，并且含有質(zhì)粒的細(xì)菌的克隆在沒有使用抗生素選擇的情況下被分離出來。討論常規(guī)的用在重組分枝桿菌菌株上的質(zhì)粒包括復(fù)制區(qū)和選擇標(biāo)記(通常是抗生素抗性基因，例如抗卡那霉素或補(bǔ)償代謝缺陷的基因，比如leuD或ascKGalanetal.，Gene，9429；1990))，作為必不可少的質(zhì)粒元件用于重組DNA的實(shí)驗(yàn)。一般的，抗生素是用來選擇含有重組質(zhì)?？寺〉?。然而，這就面臨著一個(gè)危險(xiǎn)，在被抗生素抗性遺傳修飾的生物體將要被用于實(shí)驗(yàn)室之外的情況下，抗生素抗性基因被無意地傳播開來。在上述的研究中，我們引入了一個(gè)能表達(dá)抗原的重組質(zhì)粒到細(xì)菌中，它既不包含oriE區(qū)域也不包含抗生素選擇標(biāo)記，并且在沒有使用選擇的情況下成功地分離了含有質(zhì)粒的克隆。雖然現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)使用oriM作為質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)，但是可以預(yù)見到其他的質(zhì)粒復(fù)制區(qū)也可以作為替換物，例如pMF1復(fù)制區(qū)(Bachrachetal.，Microbiol.，146297；2000)。該系統(tǒng)獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)在于重組質(zhì)粒不再帶有抗生素抗性基因。因此，它就不會(huì)像當(dāng)前通常使用的表達(dá)質(zhì)粒一樣，將抗生素抗性基因無意地傳播到環(huán)境中。另外，本發(fā)明的單向穿梭載體表達(dá)質(zhì)粒不能再在廣泛的寄主范圍內(nèi)復(fù)制，因?yàn)槟軌驈?fù)制的基因元件被刪除了。該限制對(duì)重組質(zhì)粒加了第二個(gè)層次的限制，因此顯著減少了將遺傳修飾生物體(GM0)釋放到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)。盡管現(xiàn)在的結(jié)果顯示，在沒有選擇性的情況下將重組質(zhì)粒引入減毒的分枝桿菌菌株中是有可能的，但是其他的因子可能在分枝桿菌中無選擇標(biāo)記的質(zhì)粒的穩(wěn)定性上起到作用。因此，復(fù)制區(qū)域包括的基因可以促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制并介導(dǎo)質(zhì)粒分離進(jìn)入同胞細(xì)胞中，從而使得具有不經(jīng)選擇就能識(shí)別含有質(zhì)粒克隆的能力。不經(jīng)選擇就能分離含有質(zhì)粒的克隆的一個(gè)可能的因素是在當(dāng)前方法中使用了較高的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的比例。這種較高的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的比例增加了細(xì)胞接受質(zhì)粒的概率，減少不含質(zhì)粒的細(xì)胞數(shù)目。在本項(xiàng)研究中，質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的比例比利用選擇系統(tǒng)的常規(guī)方法中用到的比例高了大約10倍。在理論上，更高的質(zhì)粒與細(xì)胞比例會(huì)導(dǎo)致更多含有質(zhì)粒的克隆，直到到達(dá)質(zhì)粒飽和的臨界點(diǎn)，其可能抑制質(zhì)粒DNA被電穿孔的細(xì)胞接受。在本發(fā)明的較好的具體實(shí)施方案中，質(zhì)粒與細(xì)菌的比例是大約0.5iig到10iig質(zhì)粒DNA對(duì)應(yīng)大約1.25X108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，更好的是1Pg到5iig質(zhì)粒DNA對(duì)應(yīng)1.25X108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。另外，肺結(jié)核病的抗原被質(zhì)粒pAF105過量表達(dá)，可能在質(zhì)粒穩(wěn)定性上起到重要的作用。該質(zhì)粒過量表達(dá)抗原85復(fù)合物(Ag85A(Rv3804c)和Ag85B(Rvl886c))的兩種蛋白質(zhì)，兩者都有分枝酰轉(zhuǎn)移酶(mycolyltranferase)活性，其在海藻糖二霉菌酸酯的生物合成中是必需的，海藻糖二霉菌酸酯是維持細(xì)胞壁完整的必需的主要結(jié)構(gòu)。因此，如果無選擇性質(zhì)粒給予了包含該質(zhì)粒的細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，則過量表達(dá)至少一種抗原就有可能對(duì)穩(wěn)定性起到作用，從而不經(jīng)選擇就能夠識(shí)別含有質(zhì)粒的克隆。比較例分枝桿菌中抗原的過量表達(dá)根據(jù)在此處描述的步驟，我們已經(jīng)構(gòu)建了一種菌株，其能不經(jīng)抗生素選擇而由質(zhì)粒穩(wěn)定地過量表達(dá)肺結(jié)核分枝桿菌抗原85A、85B和TB10.4。編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4的基因被編碼在處于Ag85B啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的被稱為pAF-105的oriM質(zhì)粒上。Ag85A和85B在培養(yǎng)物上清液中的過量表達(dá)如圖6所示。該菌株，在下文中被稱為AFR0-1，顯示出在體外培養(yǎng)和在豚鼠中都能穩(wěn)定地維持質(zhì)粒。為了比較AFR0-1和卡介苗的免疫原性和保護(hù)效果，C57B1/6和BALB/c小鼠(15只小鼠/組)經(jīng)皮下注射用5X105CFU的一種或另一種疫苗免疫接種。8周后從每組3只小鼠中制備脾細(xì)胞，培養(yǎng)3天后通過測(cè)定上清液中的IFN-Y來評(píng)估對(duì)分枝桿菌抗原的回憶應(yīng)答(圖7)。在圖7中，C57B1/6小鼠(圖A-C)和BALB/c小鼠(圖D-F)沒有被接種(圖A、D)、或者經(jīng)皮下注射接種了5X105CFU的卡介苗1331(圖B、E)或重組卡介苗AFR0-1(圖C、F)。接種后第八周，每組3只小鼠被處死，脾細(xì)胞被分離、匯集，并且在體外用Ag85A、Ag85B、TB10.4、Ag85復(fù)合物或CFP刺激3天。通過ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y。柱狀圖是3個(gè)重復(fù)孔的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。參照?qǐng)D7，在C57B1/6小鼠中未檢測(cè)出卡介苗的免疫應(yīng)答(圖B)。然而，在C57B1/6和BALB/c小鼠的脾細(xì)胞中，AFR0-1誘導(dǎo)了針對(duì)分枝桿菌抗原的顯著的IFN-Y反應(yīng)應(yīng)答(圖C和F)。雖然卡介苗在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)了顯著的IFN-y反應(yīng)應(yīng)答(圖E)，但不像在C57B1/6小鼠中(圖B)那樣，AFR0-1尤其增強(qiáng)了對(duì)CFP的應(yīng)答，這也許是由于與單個(gè)抗原相比CFP有較復(fù)雜的成分。該實(shí)驗(yàn)中剩余的每組12只小鼠(圖7)在用卡介苗或AFR0-1重組卡介苗接種八周后的通過氣霧劑用毒性的結(jié)核病分枝桿菌攻擊。具體而言，參照?qǐng)D8，C57Bl/6(圖A、B)或BALB/c小鼠(圖C、D)在用5X105CFU的卡介苗1331或者重組卡介苗AFR0-1接種八周后，動(dòng)物被通過氣霧劑感染大約100CFU毒性結(jié)核病分枝桿菌ErdmanK01菌株。小鼠被處死，并且肺(圖A、C)和脾(圖B、D)被勻漿化并涂布在7H10瓊脂板上來測(cè)定細(xì)菌負(fù)荷。柱狀圖代表每組12只小鼠的平均值士SE(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。在柱狀圖上面的數(shù)字是相對(duì)于未接種的對(duì)照動(dòng)物的減少的百分比。盡管AFR0-1與卡介苗相比增強(qiáng)了免疫原性，但是卡介苗和AFR0-1接種都導(dǎo)致了C57B1/6和BALB/c小鼠中肺(圖8，圖A、C)和脾(圖8，圖B、D)的分枝桿菌負(fù)荷的顯著并且大致相等的減少。當(dāng)接種與攻擊之間的間隔從8周延長(zhǎng)至17周時(shí)，我們同樣比較了AFR0-1和AFV-12與卡介苗在BALB/c小鼠中保護(hù)作用(圖9)。BALB/c小鼠(20只/組)經(jīng)皮下注射接種了5X105CFU標(biāo)準(zhǔn)的、凍干的卡介苗1331、在液體培養(yǎng)基中的卡介苗1331、AFV-102重組卡介苗、或者AFR0-1重組卡介苗。在17周后，這些小鼠被通過氣霧劑感染毒性的結(jié)核病分枝桿菌，并在感染后第13周處死。肺(圖A)和脾(圖B)被勻漿化并涂布在7H10瓊脂板上以便測(cè)定細(xì)菌的負(fù)荷。柱狀圖代表每組20只小鼠的平均值士SE。在圖9中，柱狀圖上面的數(shù)字是相對(duì)于未接種的對(duì)照動(dòng)物的減少的百分比。圖9顯示了在17周后，被接種的小鼠被氣霧劑的結(jié)核病分枝桿菌攻擊，并且在13周后處死來測(cè)定的細(xì)菌的負(fù)荷。所有的疫苗菌株在肺(圖A)和脾(圖B)中引發(fā)了相等的保護(hù)作用，與未接種的動(dòng)物相比，每種疫苗減少了大約llog的分枝桿菌數(shù)量。盡管在保護(hù)方面重組卡介苗沒有優(yōu)于卡介苗、或者AFR0-1沒有優(yōu)于AFV-102的明顯優(yōu)勢(shì)，但這有可能只是反應(yīng)了用于評(píng)估肺結(jié)核疫苗的小鼠模型的局限性。我們因此在豚鼠中延伸這些研究來確定AFR0-1重組卡介苗的免疫原性和保護(hù)作用。圖10顯示了當(dāng)豚鼠(20只動(dòng)物/組)被單劑量的卡介苗或AFR0-1重組卡介苗接種時(shí)的結(jié)果。參見圖10，Hartly豚鼠(每組20只)經(jīng)皮內(nèi)接種1X104CFU標(biāo)準(zhǔn)的、凍干的卡介苗1331(黑色柱)，或者接種在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)中的1X104CFU或1X105CFU的卡介苗1331或AFR0-1重組卡介苗。在10周后，每組3只動(dòng)物被處死，并且它們的肺和脾被摘除。制備來自于這些組織的單細(xì)胞懸浮液，并且在體外用Ag85A、Ag85B、TB10.4和PPD刺激24小時(shí)。接著，來自細(xì)胞的RNA被純化，被反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并且使用對(duì)豚鼠IFN-Y(圖A)、TNF(圖B)和IL-10(圖C)特異的引物進(jìn)行了實(shí)時(shí)RT-PCR。相對(duì)于在未刺激的細(xì)胞中的每個(gè)基因的表達(dá)量，計(jì)算每個(gè)基因的誘導(dǎo)倍數(shù)。柱狀圖是3個(gè)動(dòng)物的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。注意，對(duì)于不同的細(xì)胞因子和不同的刺激以及必要應(yīng)用的不同規(guī)模，表達(dá)量也有很大的不同。用卡介苗接種的豚鼠的肺細(xì)胞和脾細(xì)胞對(duì)單個(gè)分枝桿菌抗原的應(yīng)答表達(dá)了很少的IFN-y，雖然它們確實(shí)對(duì)較復(fù)雜的PPD的刺激有應(yīng)答。正相反，用AFR0-1接種的動(dòng)物的肺細(xì)胞對(duì)所有3種分枝桿菌刺激的應(yīng)答大大增加了IFN-y的表達(dá)量，同時(shí)在AFR0-1接種的動(dòng)物的脾細(xì)胞中也觀察到了對(duì)這三種抗原的顯著的應(yīng)答(圖10，圖A)。肺細(xì)胞和脾細(xì)胞中對(duì)單個(gè)分枝桿菌抗原的應(yīng)答只是輕微地誘導(dǎo)了高于基線的TNF的表達(dá)，雖然注意到在PPD刺激之后脾細(xì)胞中TNF轉(zhuǎn)錄有很大上調(diào)(圖10，圖B)。最后，當(dāng)Ag85A被用來刺激AFR0-1接種的豚鼠的脾細(xì)胞時(shí)，IL-10的表達(dá)極強(qiáng)烈地誘導(dǎo)(圖10，圖C)。每組中剩余的17只豚鼠被攻擊，并在10周后被處死，以便對(duì)在動(dòng)物肺和脾中的細(xì)菌負(fù)荷進(jìn)行計(jì)數(shù)。雖然動(dòng)物之間每個(gè)器官上分枝桿菌的數(shù)目有很大不同，但是AFR0-1和卡介苗對(duì)于肺結(jié)核分枝桿菌的攻擊給予了保護(hù)作用(圖11)。參見圖11，接種十周后，剩余的每組17只豚鼠被用肺結(jié)核分枝桿菌Erdman氣霧劑攻擊，并且在攻擊10周后，肺和脾上的細(xì)菌負(fù)荷通過將器官的勻漿涂布在7H10瓊脂板上來確定。柱狀圖代表17只豚鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。雖然每組中動(dòng)物之間的差異很大，但是在本研究中卡介苗和AFR0-1重組卡介苗給予了相似程度的保護(hù)作用這一點(diǎn)是很清楚的。然而，差異的程度是沒有預(yù)料到的，本研究會(huì)被重復(fù)來確證這些結(jié)果。而且，將這些數(shù)據(jù)綜合起來考慮，AFR0-1重組卡介苗顯示出是安全的，在小鼠和豚鼠中比卡介苗更具免疫原性，并且有至少與卡介苗一樣的保護(hù)作用。與單個(gè)疫苗或者用相同、同種疫苗作為加強(qiáng)劑的疫苗相比，使用異種疫苗的“致敏-加強(qiáng)”疫苗策略能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，對(duì)于可能的兒童疫苗體系，受試者將會(huì)用改進(jìn)的重組卡介苗菌株致敏，然后用另一個(gè)候選疫苗來加強(qiáng)。以前已經(jīng)表明，我們重組的Ad35載體化的肺結(jié)核疫苗(在此稱為Ad35-TBS.AERAS-402)能在卡介苗致敏的小鼠中加強(qiáng)免疫性，我們?cè)u(píng)估當(dāng)小鼠首先用我們的重組卡介苗AFR0-1致敏時(shí)是否可以得到更大的作用。于是，小鼠被卡介苗或AFR0-1致敏，然后，10周后，相同的小鼠接受了單劑量的Ad35-TBS肌肉注射加強(qiáng)，在一周后評(píng)估對(duì)分枝桿菌抗原的免疫應(yīng)答(圖12)。參見圖12，BALB/c小鼠經(jīng)皮下注射用5X105CFU卡介苗1331(圖B、D)或AFRO-1重組卡介苗(圖C、E)致敏，10周后有些組被Ad35-TBS5X109毒性顆粒肌肉注射加強(qiáng)(圖D、E)。未接種的對(duì)照組沒有接受任何注射(圖A)。一周后從每組6只小鼠中摘除脾，每組的脾細(xì)胞被收集，并在體外用Ag85A、Ag85B、TB10.4和CFP以1和5yg/ml刺激3天。用ELISA測(cè)定上清液中的IFN-Y。柱狀圖是3個(gè)重復(fù)孔的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。參照?qǐng)D10，只接受卡介苗或AFR0-1致敏的小鼠的脾細(xì)胞當(dāng)在體外受到分枝桿菌抗原刺激時(shí)只產(chǎn)生了很少的IFN-Y(圖B、C)。相反，用單劑量Ad35-TBS加強(qiáng)的卡介苗致敏的小鼠的脾細(xì)胞當(dāng)在體外受到刺激時(shí)產(chǎn)生了顯著較多的IFN-y(圖D)。然而，Ad35-TBS加強(qiáng)的AFR0-1致敏的小鼠誘導(dǎo)脾細(xì)胞，與用卡介苗致敏的小鼠的脾細(xì)胞相比，在受到刺激時(shí)產(chǎn)生多得多的IFN-Y(比較圖D和E)。另外，我們?cè)隗w外用重疊的分枝桿菌肽刺激后使用細(xì)胞內(nèi)染色(ICS)來分析這些小鼠的脾細(xì)胞。在體外用蛋白抗原刺激3天后，用IFN-yELISA較好地評(píng)估CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，而肽刺激后的ICS能更好地評(píng)估CD8+T細(xì)胞的IFN-Y應(yīng)答。此項(xiàng)分析表明，與BCG致敏相比，用AFR0-1致敏在Ad35-TBS增強(qiáng)一周后誘導(dǎo)出更大的⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答(圖13)。參見圖13，BALB/C小鼠經(jīng)皮下注射5X105CFU卡介苗-133或AFR0-l致敏，在10周(圖A)或17周(圖b)后用5\109個(gè)々(135185病毒顆粒來加強(qiáng)動(dòng)物。小鼠在1周后被處死，并且脾細(xì)胞被重疊的分枝桿菌肽刺激6小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞被透化，并且與熒光標(biāo)記的抗IFN-γ反應(yīng)，固定，然后用抗⑶4和抗⑶8標(biāo)記。細(xì)胞用Partec流式細(xì)胞儀分析，相對(duì)于DMSO單獨(dú)孵育后的百分比，計(jì)算刺激后的IFN-γ陽(yáng)性的⑶8+T細(xì)胞的百分比。柱狀圖代表6只小鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。因此，當(dāng)我們的AFR0-1重組卡介苗被用于致敏、隨后被Ad35_TBS加強(qiáng)的小鼠時(shí)，與卡介苗相比顯示了更強(qiáng)的免疫原性。在該體系中，AFR0-1的優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)在能較好評(píng)估CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)上(圖12)、以及測(cè)定CD8+T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)上(圖13)。在小鼠模型中表明AFR0-1重組卡介苗比卡介苗有更強(qiáng)免疫原性的這些發(fā)現(xiàn)，將被進(jìn)一步延伸，以便在豚鼠中進(jìn)行當(dāng)用兩個(gè)(不是一個(gè))劑量的Ad35-TBS加強(qiáng)時(shí)AFR0-1與卡介苗的比較(圖14)。作為較大的研究項(xiàng)目中的一部分，32只一組的豚鼠被卡介苗或重組卡介苗AFR0-1致敏。一個(gè)對(duì)照組(#1)的17只動(dòng)物只接受鹽水注射，同時(shí)另一個(gè)對(duì)照組(#2)只接受卡介苗的單個(gè)疫苗接種。組#3和#4分別在卡介苗或AFR0-1致敏后的第14周、接著第16周，被用Ad35-TBS肌肉注射增強(qiáng)。組#5和#6是這些研究中不相關(guān)的分支。接著這些疫苗體系之后，所有的動(dòng)物通過氣霧劑用毒性的肺結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株感染，并監(jiān)控超過1年的時(shí)間，在此期間，存活率、細(xì)菌負(fù)荷和肺部的病理學(xué)將被評(píng)估(圖14)。感染將在最后一次加強(qiáng)八周后(本研究開始38周后)進(jìn)行。動(dòng)物的存活率將被監(jiān)控。肺部的組織病理學(xué)和細(xì)菌負(fù)荷將在尸體解剖后確定。因此，這項(xiàng)研究將提供有效性數(shù)據(jù)，即，當(dāng)用Ad35-TBS增強(qiáng)時(shí)，比較用卡介苗或AFR0-1重組卡介苗致敏的接種體系，以及預(yù)計(jì)顯示當(dāng)AFR0-1重組卡介苗被用于致敏時(shí)比較優(yōu)越或至少相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。我們同樣也開始了相似的研究來顯示一些候選疫苗在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物上的免疫原性和保護(hù)效力(圖15)。這項(xiàng)研究的一個(gè)分支是當(dāng)用Ad35-TBS加強(qiáng)兩次時(shí)直接比較卡介苗和AFR0-1的免疫原性(圖15，圖A，第1組和第2組)。參見圖15的圖A，恒河猴(總共33只)被分成6組(圖A)。四組用IXIO4CFU卡介苗(參照菌株SSI-1331，組1、3、4)或AFR0-1重組卡介苗(組2)經(jīng)皮內(nèi)致敏。未接種的對(duì)照組(#5)只接受鹽水注射。組#1和#2在14周后用3XIOltVpAd35-TBS經(jīng)肌肉注射加強(qiáng)，然后12周后再一次加強(qiáng)。第3、4、6組是另一個(gè)研究的組成部分。如紅色箭頭(圖B)所示，每隔一定時(shí)間在所有的猴子身上采血并且用于分析針對(duì)分枝桿菌抗原的免疫應(yīng)答。圖16表明，用AFR0-1致敏的獼猴(見圖15A中的第2組)對(duì)Ag85A和Ag85b產(chǎn)生了更強(qiáng)的致敏反應(yīng)，正如通過Ad35-TBS增強(qiáng)前后抗原特異性淋巴組織增殖反應(yīng)之間的差異被測(cè)定的一樣。這些動(dòng)物現(xiàn)在已經(jīng)被毒性肺結(jié)核分枝桿菌Erdman攻擊，接著被確定保護(hù)作用。上述的和在該比較例中的研究表明了在重組分枝桿菌中質(zhì)粒表達(dá)抗原，并且表明它們可作為候選疫苗使用。通過使用上述技術(shù)，我們也設(shè)計(jì)出并且已構(gòu)建出表達(dá)其他結(jié)核病分枝桿菌抗原(包括Rv3407、Rv3133c、Rv0867c、Rvl884c、Rv2389c、Rvl009和Rv2450c)的重組卡介苗的疫苗，。另外，我們已經(jīng)構(gòu)建出表達(dá)HIV抗原Gag、Nef、Env、RT的重組卡介苗疫苗，并且連接了來源于大量的HIV蛋白交叉分支的T細(xì)胞表位。類似地，我們已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)部分惡性瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的重組卡介苗，此蛋白質(zhì)能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫性。這些構(gòu)建體證明，我們的表達(dá)技術(shù)的能力并不限于結(jié)核病分枝桿菌蛋白，并且我們能從生物體中表達(dá)異源抗原，包括真核生物。權(quán)利要求一種轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或它的子代，其引入了在其中復(fù)制并被表達(dá)的外源核苷酸序列，其中，所述外源核苷酸序列不與選擇性標(biāo)記相連，所述外源核苷酸序列位于質(zhì)粒上，以及所述外源核苷酸序列編碼下述中的至少之一a)存活所必需的蛋白質(zhì)；b)編碼用于逃出內(nèi)體的蛋白質(zhì)；以及c)免疫原或免疫調(diào)制蛋白2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或它的子代，其特征在于，所述外源核苷酸序列至少編碼a)、b)和c)中的兩個(gè)。3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或它的子代，其特征在于，所述質(zhì)粒編碼a)、b)和C)O4.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或它的子代，其特征在于，所述細(xì)菌是轉(zhuǎn)化的分枝桿菌5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或它的子代，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化的卡介苗是Danish菌株1331。6.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或它的子代，其特征在于，所述免疫原或免疫調(diào)節(jié)蛋白選自由抗原85a、抗原85b和抗原TB10.4中的一個(gè)或多個(gè)所組成的組。全文摘要本發(fā)明提供了具有改進(jìn)疫苗特性的重組分枝桿菌菌株，可以用作接種試劑。重組分枝桿菌菌株的親本株是根據(jù)它們有效的免疫原性選擇而來。分枝桿菌菌株不顯示抗生素拮抗性，并且沒有表現(xiàn)出向革蘭氏陰性菌水平轉(zhuǎn)移。文檔編號(hào)A61K39/04GK101801408SQ200880100241公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者大衛(wèi)·邁克爾·霍恩,孫榮改,杰拉爾德·C·薩多夫申請(qǐng)人:Aeras全球Tb疫苗基金會(huì)