專利名稱：病證結合動物模型的創(chuàng)建及評價方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中醫(yī)證候研究技術領域，具體涉及病證結合動物模型的制備方 法以及評價體系的構建，是心肌缺血血瘀證及心肌缺血氣虛血瘀證動物模型的 制備方法及評價體系。
背景技術：
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目前中醫(yī)證候模型研制思路主要有以下五種(1)病因造模；(2)藥物 造模；(3)病理造模；(4)病因病理造模；(5)病證結合造?！，F(xiàn)有的各種 思路均有其局限性。如病因造模只是單純地考慮證候發(fā)生的某個或某些因素， 而忽視證候的動態(tài)性和時空性，并不能一次性地客觀地成功復制出證候模型； 再如藥物造模所致證型在臨床實際很少見到，且存在致病因素撤除后動物易恢 復，病m加強度難控制，模型評價困難等問題；而病理因素和病因病理因素 造模的思路雖然已經開始吸取西醫(yī)在造模方面的成功經驗，模擬出證候模型， 但仍存在證候屬性界定、評價困難及穩(wěn)定性不好等問題。病證結合模型已成為 中醫(yī)證候動物模型的最新趨勢，病證結合模型的優(yōu)勢體現(xiàn)在制作動物模型的同 時復制出證候動態(tài)性、階段性、個體性的特征。但現(xiàn)有的病證結合模型大多是 根據西醫(yī)理論復制疾病模型，再根據中醫(yī)理論復制證候模型，再將兩者結合起 來。這種結合只是造模方法的簡單疊加，忽視了 "病"與"證"之間的內在聯(lián) 系。而關于心肌缺血血瘀證的模型目前幾乎沒有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是創(chuàng)建出一套完整的符合中醫(yī)證候實質(證候是疾病某一階 段的病理生理變化的概括)的病證結合動物模型的制備方法及評價體系，通過 中華實驗小型豬及實驗大鼠兩種動物，構建心肌缺血血瘀證和心肌缺血氣虛血 瘀證動物模型的制備方法和評價體系。
中華小型豬心肌缺血血瘀證模型是通過在冠狀動脈放置Ameroid縮窄環(huán)建 立的，Ameroi(i縮窄環(huán)外層為不銹鋼環(huán)，環(huán)內襯墊親水性酪蛋白衍生物，酪蛋白 衍生物遇水向內緩慢膨脹，進而逐漸增加對套扎在其中的冠脈的壓迫，使得冠 脈逐漸縮窄，乃至閉塞。術后4周縮窄率可達到90%，因此能夠復制穩(wěn)定的慢性 心肌缺血模型，對模型動物手術后1-8周進行動態(tài)觀察、理化指標的檢測、心 電圖、超聲心動及冠脈造影。根據實驗觀察，可以明確術后4周左右符合心肌 缺血血瘀證的診斷。
SD大鼠心肌缺血氣虛血瘀證動物模型采用左冠狀動脈結扎法制備，在術后 3天進行心電圖評價，以I、 avL、 VI-V6至少出現(xiàn)6個異常Q波作為模型成功 標志。對模型動物術后1-30天進行動態(tài)觀察，觀察發(fā)現(xiàn)，術后7天左右符合心 肌缺血氣虛血瘀證的診斷，直到30天取材前仍支持氣虛血瘀證的診斷。
具體實施例方式
一、 中華實驗小型豬心肌缺血模型 (一)實驗方法 1構建模型1. 1術前準備
(1) 術前禁食24小時，適量飲水。
(2) 氯胺酮25mg/kg肌注誘導麻醉，并建立耳緣靜脈通路維持。
(3) 行氣管插管，成功后接麻醉機輔助呼吸。潮氣量12ml/kg (約300ml)， 呼吸頻率14次/分，吸呼比l: 2。
(4) 描記肢導及胸導心電圖，并行心臟超聲檢查。 1.2冠脈環(huán)縮術
(1) 無菌條件下，左第三肋間開胸，切開心包，充分暴露手術野。
(2) 于左冠狀動脈前降支第一間隔支起始部遠端鈍性分離前降支約4 6mm，穿 引導線，置放縮窄環(huán)(Research Instrument SW， USA內徑2. 75mm)，確定該 環(huán)固定良好。
(3) 縫合心包，依次關胸。
(4) 術中心電監(jiān)測，術后即刻描記心電圖。
1. 3術后護理
(1) 動物恢復血壓呼吸后，拔除氣管插管，置動物于籠中。并于麻醉蘇醒期進 行監(jiān)控。
(2) 術后進行常規(guī)抗感染治療，肌肉注射青霉素480萬單位，日一次，共3日。
2. 模型評價
2. 1四診信息術后1-8周觀察動物的宏觀體征，具體如下按照中醫(yī)四診望、 聞、問、切分別進行觀察。以肉眼觀察配合數碼照相的方法進行觀察。望神即觀察動物在自然狀況下的精神意識、形體動作、何對外界的反應等各 個方面。觀察中盡量避免驚擾動物，通過實驗人員的觀察，參照表l，評定動物 的精神狀態(tài)。
望色即通過觀察小型豬被毛、口唇、鼻盤、眼睛、耳部等部位的色澤變化，
來了解動物模型證候的發(fā)展變化。我們所采用的觀察方法為動物保持清醒， 人工保定后，肉眼觀察各部位色澤的變化，同時用數碼相機拍照，采用casmatch 色卡校正，并經Adobe photoshop8. 0分析得到R、 G、 B值。
望舌舌與臟腑經絡有著密切的聯(lián)系。舌為心之苗，通過望舌色，可以了解 氣血運行情況，從而反映"心主血脈"的功能。因此，在心肌缺lftl動物模型的 四診信息采集上，望舌是重中之重，它對證候的診斷和評價都有著舉足輕重的 意義。因此，在動態(tài)觀察上，筆者及其團隊對舌象的觀察和采集也非常重視， 嘗試并摸索出了一套方法。先通過肉眼觀察，參照表2進行評定。由于人為因 素干擾較大，我們又采取數碼相機拍照舌象，再通過專業(yè)軟件進行分析以達到
客觀化。具體方法是動物在清醒狀態(tài)下，人工保定，待動物穩(wěn)定后， 一人用 開口器打開豬嘴，暴露舌部，另-人用數碼相機拍照記錄，并采用casmatch色 卡進行校正。需要注意的是拍照時盡量要統(tǒng)一光源，并使色卡與舌面保持在 同一平面上。得到的照片經Adobe photoshop8. 0分析得到R、 G、 B值。
2. 1. 2聞診
在動物觀察過程中，通過聽動物發(fā)出的聲音、嗅其發(fā)出的異常氣味、排出物的 氣味及所在環(huán)境的氣味來診察動物的狀況。同時可以借助聽診器檢査動物的心 臟情況。 .2.1.3問診
由于動物無法與人類交流，故對動物的問診采集是不可行的，但可以通過詢問 飼養(yǎng)員獲得動物近期的精神狀況、進食、進水、二便等信息。
2.1.4.切診 —
切脈對于脈象的研究，由于小型主動脈表面肌層豐富，難以觸及，故采用心 電圖的動態(tài)觀察來表示脈象能提示的部分信息。
體溫在中醫(yī)診斷學中，體溫寒熱屬于問診范圍，但對于動物模型上，筆者認
為應該屬于切診范圍，具體測定方法為動物清醒狀況下，人工保定后，將溫
度計插入肛門，保留5分鐘，測定肛溫。
2.2描記十二導聯(lián)心電圖，術前及術后即刻心電圖在動物麻醉情況下獲得，而 動態(tài)觀察中，保持動物清醒，人工固定。電極及導聯(lián)放置方式同臨床心電圖的 使用規(guī)則。主要觀察心率、心律、ST段改變、異常Q波等。每周一次。
2.3血液流變學改變每周一次。頸部前腔靜脈采血5ml，置肝素抗凝管(抗 凝劑100ul/5ml全血)中抗凝，并立即送檢。于采血6小時內檢測包括全血黏 度1/150、全血黏度]/38、全血黏度1/10、全血黏度1/5、還原黏度1/150、還 原黏度1/38、還原黏度1/10、還原黏度1/5、血漿黏度、壓積測定值、聚集指 數、聚集指數積分面積、變形指數、變形指數積分面積等血液流變學指標。
2.4其他血液理化指標第四周及第八周時，頸部前腔靜脈采血3ml，采用 EDTANa廠消炎痛抗凝，4"C， 3500轉./分，離心25分鐘，收集上清，分裝后-80 。C保存，用于檢測血栓素B2 (Thromboxane B2， TXB2) 、 6-酮-前列腺素Fla (6-keto-PGR,,, 6-K-PGFla)。樣品在室溫復溶后，采用放免法檢測。頸部前腔靜脈采血3ml，采用EDTANa廠抑肽酶抗凝，4°C， 3500轉/分，離心25 分鐘，收集上清，分裝后-8(TC保存，用于檢測內皮素-1 (Endothelin-1， ET-1)、 降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene-Related P印tide， CGRP)。樣品在室溫 復溶后，采用放免法檢測。
2.5 超聲檢査術后第四周及第八周，檢查超聲心動圖。動物麻醉，左側臥 位，探頭頻率1.33Hz，獲取胸骨旁左室長軸，二尖瓣、乳頭肌、心尖部3個水 平的胸骨旁左室短軸及心尖四腔切面。采用二維、M型及多普勒超聲心動圖，檢 測左室舒張末內徑(Left ventricular internal diameter at end-diastolic， LVIDd)，左室收縮末內徑(Left ventricular internal diameter at end-systolic, LVIDs)，左室舒張末容積(End--diastolic volume, EDV)，左 室收縮末容積(End- systolic volume, ESV) ， 二尖瓣E峰，A峰等，并計算出 射血分數(Ejection fraction, EF)，短軸縮短率(Fractional shortening, FS)，每搏輸出量(Stroke volume, SV) 、 E/A等以評價心臟整體的收縮及舒 張功能(EDV、 ESV、 EF值采用Si即son法測定、計算)；檢測室間隔厚度，二 尖瓣、乳頭肌、心尖部3個水平的左室前壁厚度，并計算收縮期室壁增厚率(△ T%)等值，結合半定量的評分方法，以評價心肌局部的結構改變以及收縮、舒 張功能。
SV二 EDV- ESV
FS= (LVIDd—LVIDs) / LVIDdX100%
T%=(收縮期室壁厚度一舒張期室壁厚度)/舒張期室壁厚度X100。/。
前壁局部收縮功能的評價通過超聲動態(tài)錄像回放，觀察、記錄二尖瓣、^L頭肌、 心尖部3個節(jié)段的左室前壁運動狀況。以上述三個節(jié)段得分的均值作為該動物前壁收縮功能的分數。通過以下方法將其運動分為4級，進行評價。
(1) 運動正常收縮朗心內膜向內運動幅度和室壁增厚均正常，l分；
(2) 輕度減弱受累心肌較正常運動幅度減弱，2分； -(3)運動消失受累心肌室壁運動完全消失，3分；
(4)矛盾運動受累心肌收縮期向外運動，4分；
2.6 冠脈造影術后四周及八周進行兩次冠狀動脈造影，計算Ameroid環(huán)放 置處冠脈狹窄程度。
(1) 動物麻醉及輔助呼吸同前所述。
(2) 左側腹股溝備皮，消毒，鋪巾。
(3) 腹股溝韌帶下l 1.5cm縱行切皮，鈍性分離暴露股動脈，遠端結扎。
(4) 2號穿刺針穿剌股動脈插入引導鋼絲，送7F鞘管，經鞘管給予肝素200U/kg 進行肝素化，ACT〉300秒。
(5) 在X線透視下置入引導導管至左冠狀動脈口，與血管近端同軸。 _
(6) 注射200y g硝酸甘油后，選擇LAO 60°進行冠狀動脈造影。
、Ta 一 D — d
D I d 狹窄(％)=——xlOO%
(7) 計算Ameroid環(huán)放置處冠脈狹窄程度。
(8) 評價前降支血流分級
根據心肌梗死溶栓治療試驗(Th咖bolysis in Myocacardil Infarction Trial,TIMI)建議，將冠狀動脈血流速度分為4級
TIMI0級無再灌注或閉塞遠端無血流，l分。
TIMI I級造影劑部分通過閉塞部位，梗塞區(qū)供血冠狀動脈充盈不完全，2分。
TIMI II級部分再灌注或造影劑能完全充盈冠狀動脈遠端，但造影劑進入和清
除的速度都較正常的冠狀動脈慢，3分。
TIMI III級完全再灌注，造影劑在冠狀動脈內能迅速充盈和清除，4分。
(二)實驗結果
1. 疾病性質 —
心電圖表現(xiàn)為胸部導聯(lián)ST段壓低；冠脈造影顯示前降支狹窄90%以上；超聲提 示心尖局部室壁結構改變，運動減弱，左室收縮末、舒張末內徑及容積擴大， 舒張功能輕度減低。以上均支持模型動物術后4周為缺血性心臟病的診斷。
2. 證候類型
(1) 四診信息
① 一般行為無虛證的表現(xiàn)；
② 舌診是臨床血瘀證診斷的主要依據，模型動物舌診的舌色分析，見B比增大、 R比減??；
③ 動物的脈搏難以觸及，用心電圖反映部分信息，未見明顯的心律失常。
(2) 實驗室指標
①術后4周，冠造顯示前降支狹窄90%以上；② 左室舒張末及收縮末內徑非常顯著性大于假手術組；
③ 6-K-PGF,。顯著降低，6-K-PGF,。/TXB2之間的平衡破壞，動物表現(xiàn)為血栓形成的 傾向性。
④ 血液流變學在術后4周表現(xiàn)為明顯的高粘、高聚及低變形性。模型動物術后4 周可診斷為血瘀證。
綜上所述，該模型動物術后四周可以被診斷為心肌缺血血瘀證。 二、實驗大鼠氣虛血瘀證模型
(一)實驗方法 1.構建模型 1. 1術前準備
(1) 麻醉稱量大鼠體重，P/。戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射
(2) 備皮待大鼠麻醉后，將其背位固定在木板上，備皮范圍為商界胸骨上沿， 下界為劍突左界為胸骨左緣，右界為左腋中線。
(3) 氣管插管
(4) 記錄術前動物的心率、呼吸頻率。 1. 2冠狀動脈結扎術
(1) 術區(qū)碘伏消毒，鋪巾。以腋窩線為手術切口
(2) 沿手術切口依次切開皮膚、胸大肌，暴露肋骨。
(3) 連接呼吸機，呼吸頻率80次/min，吸呼比1: 2，潮氣量3ml/kg。(4) 以胸骨柄為第2肋標志，定位第3肋，沿第3、 4肋間打開胸膜，開胸器 將胸腺與肋骨撐開，輕輕撕開心包膜，暴露心臟，在左心耳邊緣進針，肺動脈 圓錐處出針，進行結扎左冠狀動脈。
(5) 結扎后即刻，心臟表面點利多卡因注射液1-2滴，腹腔注射利多卡因注射 液O. 1-0. 2ml，呋塞米O. 1-0. 2 ml。
(6) 用棉球將胸腔內液體吸凈，依次縫合3、 4肋間，肌層和皮膚。 1.3術后護理
(1) 術后密切觀察大鼠心率、心律和呼吸情況。
(2) 術后進行常規(guī)抗感染治療，腹腔注射青霉素800萬單位，防止感染。 2.模型評價
2.1 四診信息在術后3、 7、 14、 21、 28天觀察模型動物的體質量、體溫、 舌象、毛發(fā)、爪甲、耳廓、心率、呼吸頻率等；取材即日觀測臟器(心、腎、 肝、肺)質量及與體重的比值。
2.1.1 —般狀態(tài)術后第7、 14、 21、 28天上午，安靜環(huán)境下，對模型進行觀察。
2. 1.2體重術后第7、 14、 21、 28天上午，安靜環(huán)境下，天平稱量動物體重。
2. 1.3體溫術后第7、 14、 21、 28天上午，安靜環(huán)境下，將體溫計放入動物 肛門內10min，取出讀數，測定動物肛溫。
2.1.4呼吸頻率術后第7、 14、 21、 28天上午，安靜環(huán)境下，待動物安靜后 查胸腹起伏數，2人同時查，取平均值。2.1.5游泳力竭時間術后第8、 15、 22、 29天上午，水深50cm，水溫30土1
。C大鼠負重體重6。/。的中午，計算大鼠力竭時間，以大鼠頭沉入水中10s為力竭
標志o
2.1.6爪甲、耳廓的觀察術后7、 14、 21、 28天上午，大鼠清醒狀態(tài)，輕柔 固定大鼠爪甲、耳廓，并與標準比色卡對照拍攝。舌象舌度分析采用 photoshop6. 0軟件。
2.2 描記心電圖術后3、 7、 14、 21、 28天描記心電圖，記錄異常Q、 ST段 改變、心率等情況。上午9點，大鼠1°/。戊巴比妥鈉30mg/g腹腔麻醉，背位固定， 用福田7200型12導聯(lián)心電圖機采集心電圖，走紙速度設為50mm,/sec，檢測指 標包括心率、異常Q波導聯(lián)數、S異常Q波幅度及ST段變化導聯(lián)數。
2.3 超聲心動圖檢查術后30天，進行超聲心動圖檢査。動物1%的戊巴比妥 鈉30rag/g腹腔麻醉，背位固定，采用那個飛利浦HDI5000超聲心動儀，探頭頻 率11.4MHz，獲取胸骨旁左心室長軸和乳頭肌水平短軸切面。檢測指標包括室間 隔收縮末期厚度(IVSTs)、室間隔舒張末期厚度(IVSTd)、左室收縮末期內徑
(LVEDs)、左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室射血分數(LVEF)、短軸縮窄率(FS)、 左室收縮末期后壁厚度(LVPWTs)、左室舒張末期后壁厚度(LVPWTd)。
2.4 游泳力竭時間檢測術后第8、 15、 22、 29天，水深50cm，水溫30士 it:，大鼠負重體重6%的重物，進行游泳實驗，計算大鼠力竭時間，以大鼠頭沉 入水中IO秒中為力竭標志。
2.5 病理檢查取材后，心肌HE、 MASON染色；舌、腎、肺、肝HE染色。 (二)實驗結果1. 疾病性質
心電圖表現(xiàn)I、 avL、 VI-V6導聯(lián)出現(xiàn)異常Q波。心電圖表現(xiàn)從術后3天即可出 現(xiàn)，并一直持續(xù)至實驗結束。大鼠超聲心動圖結果顯示，與假手術組相比，室 間隔舒張期、收縮期厚度明顯下降，左室前壁僵硬、順應性下降、左室腔明顯 增大EF和FS顯著下降，左室收縮、舒張功能不全。心電圖及超聲心動圖結果 證明模型為典型心肌缺血。
2. 證候類型
2.1 —般狀態(tài)術后1-3d,模型及假手術大鼠出現(xiàn)毛發(fā)雜亂、活動緩慢、精神 遲鈍等表現(xiàn)。術后4-7d假手術組動物從手術創(chuàng)傷中恢復，毛發(fā)整齊、活動靈活， 一般狀態(tài)與正常大鼠無明顯差異。而模型動物毛發(fā)雜亂、活動緩慢、精祌遲鈍。 7-10d，大鼠自身恢復能力快，從宏觀角度，模型動物與假手術無顯著差異。
2.2游泳力竭時間同一時間點模型組與假手術組相比，游泳力竭時間顯著下 降，模型組不同時點游泳力竭時間無差異。
2.3呼吸頻率術后第7、 14、 21、 28d，模型組與假手術組相比呼吸頻率顯著 增加。
2.4舌象模型組舌質紫暗，有瘀點瘀斑，而同一時間點的假手術組舌質淡紅。
數碼拍攝舌象分析R、 G、 B、 L值顯著下降。
綜上所述，模型在術后7天可診斷為心肌缺血氣虛血瘀證。
權利要求
1、一種用于心肌缺血血瘀證動物模型的制備方法及評價體系，其特征在于冠狀動脈放置Ameroid縮窄環(huán)建立模型，通過多種指標判定術后4周左右符合心肌缺血血瘀證的診斷。
2、 一種用于心肌缺血氣虛血瘀證動物模型的制備方法及評價—體系，其特征在 于左冠狀動脈結扎法建立模型，通過多種指標判定術后7天左右符合心肌缺 血氣虛血瘀證的診斷，直到30天取材前仍支持氣虛血瘀證的診斷。
3、 如權利要求1或2所述的方法在用于制備及評價病證結合動物模型的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種心肌缺血血瘀證及心肌缺血氣虛血瘀證動物模型的制備方法及評價體系，屬于中醫(yī)證候研究技術領域，可用于病證結合動物模型的制備及評價；心肌缺血血瘀證模型是通過在冠狀動脈放置Ameroid縮窄環(huán)建立的，對模型動物手術后1-8周進行動態(tài)觀察、理化指標的檢測、心電圖、超聲心動及冠脈造影，術后4周左右符合心肌缺血血瘀證的診斷；心肌缺血氣虛血瘀證動物模型采用左冠狀動脈結扎法制備，對模型動物手術后30天進行動態(tài)觀察、心電圖、超聲心動、病理檢測，發(fā)現(xiàn)術后7天左右符合心肌缺血氣虛血瘀證的診斷，直到30天取材前仍支持氣虛血瘀證的診斷。
文檔編號A61B19/00GK101612063SQ20081012644
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月27日 優(yōu)先權日2008年6月27日
發(fā)明者偉 王, 郭淑貞 申請人:王 偉;郭淑貞