專利名稱：聚乙二醇和姜黃素衍生物綴合的綴合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物化學領域，具體而言，本發(fā)明涉及可生物降解的姜黃素衍生物與聚乙二 醇綴合的綴合物。另外，本申請還涉及基于該綴合物的藥物組合物、制備方法以及作為藥物 方面的應用。
背景技術：
姜黃素(Curcumin，下文簡稱為Cur)為一種多酚類衍生物，為姜科植物姜黃塊根中的主 要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗誘變、抗衰老、抗HIV病毒、降血脂、抗動脈粥樣硬化、 藥物增敏及抗腫瘤等多種藥理活性；對心血管疾病、神經(jīng)性病變及癌癥等疾病具有一定的預 防和治療作用。美國國立癌癥研究所已將其列為第三代防癌藥物，并于2000年列入美國藥典； 2001年國立臺灣大學醫(yī)學院完成了對高?；虬┣安∽兓颊咭黄谂R床實驗，結果表明，姜黃素 具有化學防癌作用，患者口服姜黃素具有較好耐受性，最大劑量可達8.0g/天，并無明顯毒副 作用(Cheng AL, Hsu CH, Lin JK,W a/. Phase I clinical trial of curcumin， a chemopreventive agent, in patients with high-risk or pre國malignant lesions[J]. Anticancer Res. 2001，21(4B):2895-900.); 2006年M.D.安德森癌癥中心已完成姜黃素對晚期胰腺癌患者療效二期臨床評估，結果表明， 姜黃素對晚期胰腺癌有生物學活性(N. Dhillon, R. A. Wolff, J. L. Abbruzzese," a/. Phase II clinical trial of curcumin in patients with advanced pancreatic cancer[J]. Journal of Clinical Oncology,2006,24(18s): 14151.)。另外，姜黃素衍生物也被開發(fā)出來了，如四氫姜黃素、四氫 脫甲氧基姜黃素、四氫雙脫甲氧基姜黃素等(EP1108419A; WO2003/088927A)，也保留了姜 黃素的抗癌活性，并帶來了諸如雄激素拮抗性等作用。
盡管姜黃素毒副作用少，并具有多種很好的藥理活性，但其不穩(wěn)定，在無血清的培養(yǎng)液 中，30min內(nèi)90。/o被P爭解(Wang YJ, Pan MH, Cheng AL, " /. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products[J].J Pharm Biomed AnaU997，15:1867 - 1876.);另外，其水溶性差、胃腸道吸收差，因而生物利用度低，例如， 口服2g純姜黃素，lh后檢測血藥濃度不到10ng/ml (Shoba Q Joy D, Jos印h T， et al. Influence of pipeline on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers[J].Planta Med，1998, 64:353 - 356.);還有，其體內(nèi)代謝迅速，直接靜脈注射5h內(nèi)50%以上姜黃素經(jīng) 月旦汁排泄 (Ravindranath V, Chandrasekhara N. In vitro studies on the intestinal absorption ofcurcumin in rats[J]. Toxicol, 1981, 20: 251 - 257.)。
由于上述缺陷的存在，因而限制了姜黃素進一步的臨床應用。為此，眾多學者采用了多 種方法來克服部分或全部上述缺陷。例如，有人采用改進劑型的方法，如脂質(zhì)體、固體分散 體、環(huán)糊精復合物、殼聚糖復合物、生物可降解微球及自微乳化制劑等，以試圖改進姜黃素 特性促進臨床應用(如參見中國專利申請第200510042547.9號、第200610027827.7號、第 CN200610026576.0號)。但是，這些方案使用大量乳化劑和助溶劑，會引起消化道剌激反應， 并可能存在軟膠囊中藥物遷移和滲漏問題，而且都沒有從根本上解決機體首關效應及姜黃素 體內(nèi)代謝迅速等問題；另外，以上配方復雜，所用乳化劑靜注可能存在安全性問題，而且某 些制備工藝繁瑣，成本高。
近年來，聚乙二醇在配制藥物中的應用也越來越引起人們的重視。聚乙二醇具有兩親性， 生物相容性好。在人體內(nèi)，聚乙二醇主要以完整的分子形式通過肝臟(PEG>20kDa)和腎臟 (PEG<30kDa)排泄，毒副作用小；大分子聚乙二醇對小分子藥物起保護作用，能改善其體 內(nèi)組織分布，減小毒副作用，并可延長藥物血液循環(huán)半衰期。此外，由于正常組織血管內(nèi)皮 細胞排列緊密，大分子聚乙二醇難以像小分子藥物透過血管。而在類似于腫瘤等病變組織， 新生血管豐富，而且血管內(nèi)皮細胞彼此連接疏松間隙較大；因此大分子聚乙二醇藥物可以透 過進入病變組織，增加藥物在病變組織的分布，增強療效。因此，人們采用聚乙二醇與姜黃 素形成新的劑型、給藥系統(tǒng)、或負載體(中國專利第03143234.4號；WO2005079856A; W09921908A; JP6128120A; Salmaso S, et al. New cyclodextrin bioconjugates for active tumour targeting[J]. JOURNAL OF DRUG TARGETING, 2007, 15: 379-390;袁巍.姜黃色素和聚乙二醇 負載姜黃素抑制腫瘤作用的實驗研究.浙江中醫(yī)學院碩士論文(內(nèi)部資料))。但是，這些方案 仍舊會存在配方復雜，制備工藝步驟多，成本高等缺陷。
為此，本發(fā)明人經(jīng)過長期研究，獲得了一種姜黃素衍生物與聚乙二醇通過接頭共價綴合 的綴合物，它不但水溶性好，生物利用度高，生物相容性好，毒副作用小，而且能夠保留姜 黃素原有藥理活性，使以其為活性成分的劑型穩(wěn)定，易于長期保存，適合于大批量工業(yè)化生 產(chǎn)，更能夠適合目前臨床應用。盡管通常在綴合物中不重視對接頭的選擇，但是尤其令人驚 訝的是，我們發(fā)現(xiàn)選擇含有柔性氨基酸殘基的接頭具有更高的抗腫瘤的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種聚乙二醇與姜黃素衍生物通過接頭共價綴合的綴合物，其水 溶性高、生物相容性好并且具有姜黃素衍生物的藥理活性，尤其是其中含有柔性氨基酸殘基的的接頭結構，能夠顯著提高抗腫瘤活性。本發(fā)明的目的還在于提供了包含該綴合物的藥物 組合物，其毒副作用小、穩(wěn)定性好、療效好，并且可生物降解的，適于靜脈注射和大批量工 業(yè)化生產(chǎn)。另外，本發(fā)明還提供了這類綴合物的藥物應用以及制備方法。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了式1的聚乙二醇和姜黃素衍生物綴合的綴合物或 其藥學上可接受的鹽<formula>formula see original document page 6</formula>
式I
其中，R1和R2彼此獨立地選自硝基、氨基、二低級烷基氨基和低級烷氧基； R3和R4彼此獨立地選自鹵素、硝基和氫； R5是低級烷基或氫；
R6是氫，或是任選用低級垸基、硝基、羥基或巰基取代的低級烷基；和 n為1或2。
在本文中，"綴合"指的是小分子(如，姜黃素)和聚合物(如，聚乙二醇)任選通過接 頭的共價連接。因此，"綴合物"就是這種共價連接的產(chǎn)物。另外在本文中，"低級垸基"指 的是具有1至6個碳的烷基。因此，"低級烷氧基"指的是具有1至6個碳的烷氧基。在本文 中，"藥學上可接受的鹽"指適于與人或動物的組織接觸而且無過多的毒性、刺激或變態(tài)反應 等的鹽。與本發(fā)明的綴合物成的鹽基本上不改綴合物的活性。例如，通常能與本發(fā)明的綴合 物成鹽的酸有鹽酸、磷酸、硫酸、乙酸、琥珀酸、馬來酸、檸檬酸等；能與本發(fā)明的綴合物
成鹽的堿有堿金屬或堿土金屬的氫氧化物、銨等。
其中，如式I所示，用于連接姜黃素衍生物和聚乙二醇的接頭包括柔性氨基酸殘基，其 通過肽鍵和酯鍵分別與聚乙二醇和姜黃素衍生物連接，這樣可以在生物體內(nèi)通過水解或酶解 而降解，釋放出作為藥物的姜黃素衍生物，發(fā)揮藥效。而且，尤其令人驚訝的是，包含柔性 氨基酸殘基的接頭而形成的綴合物藥用活性明顯較丁二酸為接頭的綴合物高。
在優(yōu)選的情況下，接頭中的R6可以是氫，或可以是低級烷基。例如，在本發(fā)明中，接
頭中的柔性氨基酸殘基可選自如下任一種氨基酸的殘基甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氮
酸、蛋氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，更優(yōu)選所述氨基酸殘基是L-型氨基酸的殘基，更優(yōu)選是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的殘基。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，R6是氫，即接頭 中包含的是甘氨酸(下文簡稱為GIy)的殘基。
如式I所示，接頭共價連接在姜黃素衍生物的酚羥基上。在本文中，"姜黃素衍生物"是 姜黃素或其衍生物，它可以是現(xiàn)有技術中已經(jīng)公開的姜黃素衍生物，包括但不限于如 EP1108419A、 WO2003/088927A中所述的那些。優(yōu)選式I中姜黃素衍生物上的Rl和R2彼此 獨立地是低級烷氧基；R3和R4彼此獨立地是氫；和/或，R5是低級烷基或氫。在本發(fā)明的 一個具體實施方式
中，姜黃素衍生物是姜黃素，即R1和R2是甲氧基；R3和R4是氫；和， R5是氫。
在式I中，接頭共價連接在聚乙二醇(下文簡稱為PEG)的末端羥基上。在本文中，如 果沒有其他的指示，聚乙二醇(PEG)指的是具有末端羥基基團的乙二醇結構重復連接而成 的聚合物。完全由乙二醇結構重復連接而成的聚乙二醇具有兩個末端羥基基團，因此這樣一 分子的聚乙二醇可以結合兩分子的接頭和姜黃素衍生物；而只有一個末端羥基基團的聚乙二 醇(如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，其一個末端羥基的氫被取代)，這樣的聚乙二醇僅可以一 分子結合一分子接頭和姜黃素衍生物。在本發(fā)明的具體實施方式
中，當PEG表示具有兩個末 端羥基的聚乙二醇時，式l中的n為2;而PEG表示只有一個末端羥基基團的聚乙二醇(如， 單甲氧基聚乙二醇(mPEG))時，n為l。 在本發(fā)明中，PEG的分子量為1000至30000Da, 優(yōu)選為1500至10000Da,更優(yōu)選為2000至6000Da。在本發(fā)明的具體實施方式
中，分別使用 了分子量為2000Da和5000Da的單甲氧基聚乙二醇(即mPEG2k和mPEG5k)、以及分子量為 6000Da的聚乙二醇(即PEG汰)。
在第二方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明第一方面所述的綴合物或其藥學 上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體。在本文中，"藥學上可接受的載體"指無毒固態(tài)、半 固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、緩沖劑、保護劑、防腐劑、包裹材料或其他制劑輔料。根據(jù)本 領域的公知技術，可以根據(jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該 組合物為單位劑量形式，如固體制劑有片劑、膜劑、丸劑、膠囊、粉劑、粉針劑、或顆粒劑 等，而液體制劑有糖漿劑和乳液劑、注射用溶液或懸浮液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、或針 劑等。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是注射劑，更優(yōu)選為靜脈注射劑。例如，可以用生理鹽水或 其他生理等滲液溶解本發(fā)明第一方面所述的綴合物，配制成靜脈注射劑。
本發(fā)明的藥物組合物可用于姜黃素衍生物所能治療的病況中，如用于抗炎、抗氧化、抗 誘變、抗衰老、抗HIV病毒、降血脂、抗動脈粥樣硬化、藥物增敏、或抗腫瘤等，尤其可用 于抗腫瘤。因此，在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽或本發(fā)明第二方面所述的藥物組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用。根據(jù)劑型，本發(fā) 明的藥物組合物可通過所屬領域技術人員所熟知的給藥方式來進行給藥，例如口服、直腸、 舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥。本發(fā)朋的藥物組合物優(yōu)選胃腸道外給藥， 如靜脈注射。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實 際治療所需的量可以由醫(yī)師根據(jù)實際情況(如，病人的病情、體重等)而方便地確定。對于 一般的成人，本發(fā)明的藥物組合物的劑量，以式I所示的綴合物計，可以是每kg成人體重lng -lOg，優(yōu)選是每kg體重100嗎-100mg，最優(yōu)選的是每kg lmg-10mg。
在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面所述的綴合物的制備方法，其包括(1)聚乙 二醇活化；(2)氨基酸連接；和(3)姜黃素衍生物連接。該制備方法包括三步合成步驟，具 有收率高、方法簡單而經(jīng)濟、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。具體而言，該制備方法包括以下步驟
(1) 用氯甲酸對硝基苯酯活化聚乙二醇末端羥基，得到活化產(chǎn)物；
(2) 將步驟(1)所得的活化產(chǎn)物與式II所示的氨基酸連接，得到連接產(chǎn)物
OH
，,CH~~…'-'…- C
O 式II
其中，R6是氫，或是任選用低級烷基、硝基、羥基或巰基取代的低級垸基；
(3) 將步驟(2)所得的連接產(chǎn)物與式III所示的姜黃素衍生物連接
O O
式m
其中，R1和R2彼此獨立地選自硝基、氨基、二低級垸基氨基和低級烷氧基； R3和R4彼此獨立地選自鹵素、硝基和氫；和 R5是低級烷基或氫。
在上述制備方法中，在步驟(1)、 (2)和/或(3)中還進一步包括結晶步驟。具體而言,
在步驟(1)的聚乙二醇活化中，用氯甲酸對硝基苯酯(下文簡稱為pNPC)在堿性條件下，
在溶劑中，活化聚乙二醇末端羥基；然后，在無水條件下、室溫避光反應6 12h，減壓濃縮，
8無水乙醚析晶；產(chǎn)物用干燥二氯甲垸溶解，無水乙醚重結晶，室溫真空干燥得PEG-(pNP)n-, 其中n為1或2。
優(yōu)選在步驟(1)中用氯甲酸對硝基苯酯活化聚乙二醇末端羥基時，所使用的溶劑選自無 水的N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、氯仿和二氯甲烷，優(yōu)選為干燥的二氯甲烷；氯甲酸對硝 基苯酯和聚乙二醇的投料摩爾比大于1.5n:l，優(yōu)選為3n:l，其中n為1或2;和/或優(yōu)選在氯 甲酸對硝基苯酯活化聚乙二醇末端羥基時，在堿性條件下進行，其中所用pH調(diào)節(jié)劑為干燥 的三乙胺或吡啶(下文簡稱為Py)，優(yōu)選為干燥的吡接。
在步驟(2)的氨基酸連接中，將PEG-(pNP)n與式II所示的氨基酸以小于l:4n的摩爾比 (優(yōu)選為l:8n)溶于蒸餾水，用三乙胺或碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至8 9，在室溫下攪拌反應6~12h， 用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，用乙醚萃取，然后水相再用氯仿萃取，收集氯仿層，無水硫酸鎂干燥， 抽濾，收集氯仿層，減壓濃縮，無水乙醚析晶，得PEG-(OCO-氨基酸)n;其中n為l或2。
在步驟(3)的姜黃素連接中，將PEG-(OCO-氨基酸)n與式II所示的姜黃素衍生物混合， 其摩爾比l:1.5n至l:3.5n，優(yōu)選l:2n;將反應物溶于干燥二氯甲垸，加入4-二甲基氨基吡啶 (下文簡稱為DMAP)做催化劑，并加入N， N-二環(huán)己基碳二亞胺(下文簡稱為DCC)為縮 合劑，于冰浴反應12 24h;過濾除去二環(huán)己基脲(下文簡稱為DCU)，濾液減壓濃縮，用干 燥異丙醇于4'C析晶，抽濾，產(chǎn)物重新用干燥二氯甲垸溶解，干燥異丙醇重結晶，得產(chǎn)物 PEG-(OCO-氨基酸-姜黃素衍生物)n;其中n為1或2。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指 出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領域的普通 技術人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些 修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清 楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明 說明書中重復敘述過一樣。


圖1: mPEG2K-OCO-Gly ^-NMR譜圖。
圖2: mPEG2K-OCO-Gly-Cur !H-NMR譜圖。
圖3: mPEG2K-Suc ^-NMR譜圖。圖4: mPEG汰墨Suc-Cur ^-NMR譜圖。 具體實施方案
以下本文將通過具體的實施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領域技術人員 所熟悉的《有機合成試劑制備手冊》(科學出版社，北京，2005年)、《實用精細有機合成手 冊》(化學工業(yè)出版社，北京，2000年)、《PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, (A WILEY-INTERSCIENCE PUBLICATION, New York, 1999)等手冊以及本文所 引用的參考文獻中所列的方法來實施。另外，實施例中所使用的材料除有特別說明外，均可 通過商業(yè)途徑從市場上購買。
實施例l:單甲氧基聚乙二醇wOCO-甘氨酸-姜黃素(mPEGwOCO-Glv-Cur)的合成
1、 mPEG汰-pNC的合成稱取mPEG2K (購自Fluka公司)20.0g (lO.Ommol)，加入 100ml甲苯溶解，60'C減壓蒸除；加入200ml臨時干燥的CH2Cl2溶解，然后稱取pNPC6.465g
GO.Ommol)加入上述體系，攪拌加入6ml臨時干燥Py，室溫(20。C左右)避光攪拌反應約 12h; 35。C左右減壓濃縮，用1000ml無水乙醚4。C析晶2h;抽濾，無水乙醚潤洗，無水乙醚 重結晶一次，真空干燥的白色產(chǎn)物20.85g，收率96.32%。
準確稱取上述產(chǎn)物適量，用0.1MNaOH溶解，于402nm測定吸光度值，根據(jù)摩爾吸光 系數(shù)18400cm"M—1計算釋放的對硝基苯酚量，推算得產(chǎn)物純度大于93.5%。
2、 mPEG2K-OCO-Gly的合成稱取甘氨酸3.028g (40.0 mmol)，用90ml蒸餾水溶解， 加入60ml乙腈(H20/CH3CN=3/2)禾Q 10.825g (5.0mmol) mPEG2k-pNC，用三乙胺調(diào)節(jié)體系 pH值在8.5，室溫攪拌反應12h左右；反應完畢后，體系用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2左右，500ml 乙醚萃取，然后水相再用500ml氯仿萃取，合并氯仿層，加入大量無水MgS04干燥過夜；抽 濾，濃縮，500ml無水乙醚析晶，真空干燥得產(chǎn)物9.696g，收率92.3%。
準確稱取上述產(chǎn)物適量，用0.01MNaOH滴定羧基含量，推算得產(chǎn)物純度大于88.69%。 所得產(chǎn)物！H-NMR見圖1。
3、 mPEG2K-OCO-Gly-Cur的合成稱取姜黃素(購自上海三愛思試劑有限公司)2.104g (5.711mmo1) 、 DCC1.756g (8.567mmo1) 、 DMAP 0.334g (2.856mmo1)，用150ml臨時干
燥的CH2Cl2溶解，冰浴15min;然后稱取mPEG2K- OCO-Gly 6.0g (2.856mmo1)，用30ml 臨時干燥的CHbCl2溶解，并加入到上述體系，冰浴攪拌反應24h左右；反應完畢，減壓濃縮， 4'C冷藏析晶，抽濾除去DCU;濾液減壓濃縮，趁熱加入500ml臨時干燥的異丙醇，體系呈渾濁，并置于-20'C冷藏過夜。抽濾，濾餅用異丙醇潤洗數(shù)次，濾餅用適量干燥CH2Cl2重新 溶解，加入干燥異丙醇-2(TC重結晶，抽濾，異丙醇潤洗，無水乙醚潤洗，真空干燥，得產(chǎn)物 6.71g，收率95.86%。
所得產(chǎn)物iH-NMR見圖2。
準確稱取上述終產(chǎn)物50.0mg于潔凈的玻璃試管中，每隔5min加入2(^1雙蒸水并搖晃促 使產(chǎn)物溶解，加至80pl時全部溶解，澄清透明，計算得產(chǎn)物溶解度^).25pmol/^U，相對而言， 姜黃素的溶解度僅為1.63x10—、mol小l，增溶效果顯著，這表明該法所制備的姜黃素綴合衍生 物具有極大的水溶性，很好地解決了姜黃素水溶性問題。
實施例2:單甲氧基聚乙二醇Mc-OCO-甘氨酸-姜黃素(mPEGw-OCO-Glv-Cur)的合成 其制備方法與實施例1基本相同，各步驟主要不同點為
1、 mPEG5K-pNC的合成稱取mPEG5K (購自Fluka公司)40.0g (8.0mmol)，加入200ml 左右甲苯溶解，6(TC減壓蒸除；加入300ml臨時干燥的CH2Cl2溶解，然后稱取pNPC 7.257g
(36.0mmol)加入上述體系，攪拌加入6ml臨時干燥Py,室溫避光攪拌反應12h;得產(chǎn)物39.86g， 收率96.47%,純度大于95.64%。
2、 mPEG5K-OCO-Gly合成稱取甘氨酸(下文簡稱為Gly)2.402g (32.0 mmol)，用150ml 蒸餾水溶解，加入100ml乙腈(H20/CH3CN=3/2)和20.66g (4.0 mmol) mPEG5k-pNC，用三 乙胺調(diào)節(jié)體系pH值在8.5，室溫攪拌反應12h左右；得產(chǎn)物19.56g，收率95.88%，純度大于 87.58%。
3、 mPEG5K-OCO-Gly-Cur合成稱取取姜黃素(購自上海三愛思試劑有限公司)1.449g (3.923mmol) 、 DCC 1.213g (5.881mmol)和DMAP 0.240g (l細mmol)，用200ml臨時
干燥的CH2Cl2溶解，冰浴15min;然后稱取mPEG5K-OCO-Gly 10.0g (L960mmo1)，用30ml 臨時干燥的CH2Cl2溶解，并加入到上述體系，冰浴攪拌反應24h;得產(chǎn)物10.376g，收率97.04%。 準確稱取上述終產(chǎn)物50.0mg于潔凈的玻璃試管中，每隔5min加入20pl雙蒸水并搖晃促 使產(chǎn)物溶解，加至lOOul時全部溶解，澄清透明，計算得產(chǎn)物溶解度^).09^imol"l，相對而言， 姜黃素的溶解度僅為1.63x10—、mol"l，增溶效果顯著；但稍比mPEG2k為載體的綴合物溶解 性差，這與PEG溶解度隨分子量增大而降低一致。
實施例3:聚乙二醇化-(OCO-甘氨酸-姜黃素),「PEGw- (OCO-Glv-Cur),l的合成
制備方法與實施例l基本相同，各步驟主要不同點為1、 PEG汰-(pNC)2合成稱取PEG汰(購自Fluka公司)20.0g (3.33腿o1)，加入150ml 甲苯溶解，60。C減壓蒸除；加入350ml臨時干燥的CH2C12溶解，然后稱取pNPC 4.031g
(20.00mmo1)加入上述體系，攪拌加入6ml臨時干燥Py，室溫避光攪拌反應約12h;得產(chǎn) 物19.99g，收率94.84%，純度大于93.12%。
2、 PEG汰-(0C0-Gly)2合成:稱取甘氨酸2.40g (32.0醒ol)，用150ml蒸餾水溶解， 加入100ml乙腈(H20/CH3CN=3/2)禾Q 12.66g (2.0 mmol) PEG6k-(pNC)2，用三乙胺調(diào)節(jié)體 系pH值在8.5,室溫攪拌反應12h;得產(chǎn)物11.19g，收率卯.21%，純度大于86.92%。
3、 PEG6K-(OCO-Gly-Cur)2合成稱取姜黃素2.21g (6.Ommo0 、 DCC 1.86g (6.0mmo1) 和DMAP 0.37g G.Ommol)，用300ml臨時干燥的CH2C12溶解，冰浴15min;然后稱取 PEG6K-(OCO-Gly)29.30g (1.5mmo1)，用50ml臨時干燥的CH2C12溶解，并加入到上述體系， 冰浴攪拌反應24h左右；得產(chǎn)物9.55g，收率92.27%。
實施例4 (比較例l):單甲氧基聚乙二醇^-丁二酸-姜黃素(mPEGy-Suc-Cur)的合成
1、 mPEG2K-Suc合成稱取mPEG2k lO.Og (5.0mmol)于圓底燒瓶中，加入50ml甲苯溶 解，6(TC減壓除去甲苯；加入10ml臨時干燥CHCl3溶解，加入丁二酸(下文簡稱為Sue) 2.0g
(20.0mmo1)和干燥的吡啶2.0ml,于6(TC攪拌回流反應24h。反應完全后，取下圓底燒瓶于 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀6(TC蒸發(fā)除去氯仿，冷卻后用飽和碳酸氫鈉冰浴溶解，濃鹽酸調(diào)pH2，用氯仿萃 取，合并氯仿層，加入無水硫酸鎂干燥過夜。過濾，濃縮，無水乙醚析晶得產(chǎn)物9.5g，收率 90.48%。
準確稱取上述產(chǎn)物適量，用0.01M NaOH滴定羧基含量，推算得產(chǎn)物純度大于97.5%。 所得產(chǎn)物iH-NMR見圖3。
2、 mPEG2K-Suc-Cur合成稱取姜黃素1.47g (4.0mmol)禾B DMAP0.24g (2.0mmol)， 用20ml臨時干燥二氯甲垸溶解，然后加入上述產(chǎn)物mPEG2K-Sue-Pro 4.2g (2.28mmol)，冰 浴冷卻后加入DCC 1.24g (6.0mmol)，冰浴攪拌反應24h;反應完畢后濃縮，4t:析晶，過 濾除去DCU，濃縮，干燥異丙醇析晶；產(chǎn)物用二氯甲垸溶解，干燥異丙醇重結晶，真空干燥 得產(chǎn)物4.51g，收率92.04%。
所得產(chǎn)物^-NMR見圖4。
實施例5 (比較例2):單甲氧基聚乙二醇化-丁二酸-姜黃素(mPEGw-Suc-Cur)的合成 制備方法基本與實施例4基本相同，各步驟主要不同點為1、 mPEGsK-Suc合成稱取mPEG5k 25.0g (5.0mmol)于圓底燒瓶中，加入80ml甲苯溶 解，60。C減壓除去甲苯；加入20ml臨時干燥CHCl3溶解，加入Suc2.0g (20.0mmol)和干燥 吡啶2.0ml，于6(TC攪拌回流反應24h;得產(chǎn)物mPEG5K-Suc 23.5g，收率92.16%，純度大于 96.5%。
2、 mPEG5K-Suc-Cur合成稱取Cur 1.47g (4.0腿o1) ， DMAP 0.24g (2.0rnrno1)，用 20ml臨時干燥二氯甲垸溶解，然后加入上述產(chǎn)物mPEG5K-Suc 10.2g (2.0mmol),冰浴冷卻 后加入DCC1.24g (6.0mmol),冰浴攪拌反應24h;得產(chǎn)物I0.14g，收率93.3%。
實施例6:姜黃素綴合物的抗腫瘤作用
將以上實施例制備的姜黃素綴合物加入到96孔板的孔中，處理48h，其中每個孔分別含 有相應的人源腫瘤細胞株，其細胞密度為1.0><104個/孔。檢測不同濃度的姜黃素綴合物對各 細胞株的抑制率，得出半抑制濃度(IC5o)。結果如表l所示，本發(fā)明的姜黃素綴合物對多種 人源腫瘤細胞具有明顯的抗腫瘤活性，而且令人1C訝的是，包含柔性氨基酸的接頭的綴合物 的活性比丁二酸接頭的明顯高約1倍。
表1 姜黃素綴合物人源腫瘤細胞的抑制作用
i樣
mPEG5K-OCO-Gly-CurmPEG2K-OCO-Gly-CurmPEG5K-Suc-CurmPEG2K-Suc-Cur
人膠質(zhì)47.62 ± 0.5842.20 ± 0.4991.64 ±0.4577.74 ± 0.35
瘤U251
人宮頸52.35 ±0.6145.40 ±0.5496.32 ±0.3888.29 ± 0.49
癌Hela
人胃癌46.85 ±0.4844.42 ± 0.5889.93 ±0.6184.50 ±0.51
SGC
人肝癌114.41 ±0.59108.14 ±0.48203.78 士 0.38198.92 ±0.43
HepG權利要求
1，式1的聚乙二醇和姜黃素衍生物綴合的綴合物或其藥學上可接受的鹽式I其中，R1和R2彼此獨立地選自硝基、氨基、二低級烷基氨基和低級烷氧基；R3和R4彼此獨立地選自鹵素、硝基和氫；R5是低級烷基或氫；R6是氫，或是任選用低級烷基、硝基、羥基或巰基取代的低級烷基；而且n為1或2。
2，權利要求1所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中， Rl和R2彼此獨立地是低級烷氧基； R3和R4彼此獨立地是氫； R5是低級烷基或氫；和 R6是氫，或是低級烷基。
3，權利要求1或2所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中，Rl和R2是甲氧基；R3和R4是氫；R5是氫；和R6是氫。
4，前述權利要求之任一所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中，PEG的分子量為1000 至30000Da，優(yōu)選為1500至10000Da,更優(yōu)選為2000至6000Da。
5，藥物組合物，其包括權利要求l-4之任一所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上 可接受的載體。
6，權利要求5所述的藥物組合物，其為注射劑，優(yōu)選為靜脈注射劑。
7，權利要求5或6所述的藥物組合物，其用于抗腫瘤。
8，權利要求1-4之任一所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽或權利要求5-7之任一所述的藥 物組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用。
9，權利要求l-4之任一所述的綴合物的制備方法，其包括以下步驟(1) 用氯甲酸對硝基苯酯活化聚乙二醇末端羥基，得到活化產(chǎn)物；(2) 將步驟(1)所得的活化產(chǎn)物與式II所示的氨基酸連接，得到連接產(chǎn)物<formula>formula see original document page 3</formula> 式II其中，R6是氫，或是任選用低級垸基、硝基、羥基或巰基取代的低級烷基; (3)將步驟(2)所得的連接產(chǎn)物與式III所示的姜黃素衍生物連接-<formula>formula see original document page 3</formula> 式III其中，R1和R2彼此獨立地選自硝基、氨基、二低級烷基氨基和低級烷氧基； R3和R4彼此獨立地選自鹵素、硝基和氫；和 R5是低級垸基或氫。
10，權利要求9所述的制備方法，其中在步驟(1)、 (2)和域(3)中包括結晶步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學領域，具體而言，本發(fā)明涉及式1的聚乙二醇和姜黃素衍生物綴合的綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R1和R2彼此獨立地選自硝基、氨基、二低級烷基氨基和低級烷氧基；R3和R4彼此獨立地選自鹵素、硝基和氫；R5是低級烷基或氫；R6是氫，或是任選用低級烷基、硝基、羥基或巰基取代的低級烷基；而且n為1或2。該綴合物具有很好的水溶性，克服了姜黃素水溶性差、生物利用度低等缺點，制備成本低，并且具有較好的抗腫瘤活性。另外，本申請還涉及基于該綴合物的藥物組合物、制備方法以及作為藥物方面的應用。
文檔編號A61K31/12GK101524546SQ20081012230
公開日2009年9月9日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權日2008年11月7日
發(fā)明者丁志山, 呂圭源, 蔣福升, 波 金, 陳鈮鈹, 高承賢 申請人:浙江中醫(yī)藥大學