專利名稱：：含納米羥基磷灰石/膠原微粒的骨修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含納米羥基磷灰石/膠原微粒的可注射型骨修復(fù)材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
：殼聚糖是一種天然生物多糖，來源廣泛，無細(xì)胞毒性、生物相容性好且沒有抗原性，可吸收，易于加工，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已用于人工皮膚、可吸收縫線、止血海棉、防粘連劑及藥物緩釋膠囊等。根據(jù)殼聚糖溶液離子之間的相互作用力，2000年，chenite等人(AChenite，CChaput，DWang，etal.Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanfrombiodegradablegelsinsitu.Biomaterials，2000，21:2155-2161)開發(fā)出溫敏性殼聚糖水凝膠。具體做法是殼聚糖水溶液中加入多元醇鹽如e—甘油磷酸鈉(GP)，在氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用的協(xié)同下，殼聚糖溶液在室溫條件下保持液態(tài)，而溫度升高到體溫時(shí)則轉(zhuǎn)變?yōu)橄履z(殼聚糖/GP)。這種凝膠復(fù)合物由于具有溫度敏感的特性，可以用作藥物及生長因子緩釋載體的研究，并在Long—Evans大鼠皮下成功構(gòu)建可注射性的組織工程化軟骨。2005年，Hoemann等人(HoemarmCD，SunJ，BuschmannMD，etal.Tissueengineeringofcartilageusing肌injectableandadhesivechitosan-based-celldeliveryvehicle.OsteoarthritisCartilage,2005，13:318-329)改進(jìn)了殼聚糖/GP體系，以殼聚糖、甘油磷酸鈉、葡糖胺為原料，通過調(diào)節(jié)溶液的溫度及pH值也制備出溫敏性殼聚糖水凝膠，并與經(jīng)乙基纖維素混懸的原代小牛軟骨細(xì)胞一起注射到裸鼠背部皮下構(gòu)建組織工程化軟骨，同時(shí)將沒有攜帶細(xì)胞的殼聚糖水凝膠直接注射到兔的關(guān)節(jié)缺損部位進(jìn)行缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)，術(shù)后1周觀察發(fā)現(xiàn)，該材料的植入對(duì)軟骨缺損有一定的修復(fù)作用，但未做長時(shí)間作用效果的觀察。2006年，第三軍醫(yī)大學(xué)的王東武等人(王東武，楊柳，段小軍等.可注射溫固化支架復(fù)合異體軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.重慶醫(yī)學(xué)，2006;35(12):1082-1084)將殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠與異體軟骨細(xì)胞復(fù)合后注射到兔關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)進(jìn)行了修復(fù)實(shí)驗(yàn)，取得了較好的軟骨缺損修復(fù)效果。但單純的殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠不具有骨缺損修復(fù)效果。本發(fā)明涉及一種用于骨修復(fù)的礦化多肽材料。其微結(jié)構(gòu)為附著鈣磷鹽晶體的多肽纖維的三維網(wǎng)絡(luò)，其中的纖維由包裹著納米鈣磷鹽晶體的多肽組成。其中多肽的氨基酸序列具有重復(fù)的Gly-X-Y結(jié)構(gòu)，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分別為甘氨酸之外的任何一種氨基酸，其中納米鈣磷鹽晶體可以為羥基磷灰石、二水合磷酸氫鈣等。本發(fā)明的礦化多肽材料，成份和結(jié)構(gòu)接近天然骨，其鈣磷鹽晶體為納米尺寸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可促進(jìn)骨再生，并隨新骨的生成最終降解。解決了以往骨材料存在病毒隱患和免疫反應(yīng)，在治療骨缺損和骨折等骨修復(fù)中可達(dá)到自體骨的效果，具有優(yōu)異的骨誘導(dǎo)性能(200610112992.2)。但單純的礦化多肽材料呈微粒狀，不是一種可注射原位成型的骨修復(fù)材料，應(yīng)用不方便。本發(fā)明涉及的礦化多肽材料由北京奧精醫(yī)藥科技有限公司提供，主要成分是納米羥基磷灰石/膠原，商品名稱nHAC。馮慶玲等公布了一種海藻酸鈣基可注射原位固化骨修復(fù)材料的制備方法。按質(zhì)量比取去離子水加入磷酸鈉和海藻酸鈉粉末充分?jǐn)嚢?，得到海藻酸鈉溶液；往所述海藻酸鈉溶液中加入納米羥基磷灰石/膠原(nHAC)微粒，充分?jǐn)嚢璧玫秸吵響覞嵋?；加入硫酸鈣微粒，充分?jǐn)嚢韬?，即得到所述海藻酸鈣基可注射原位固化骨修復(fù)材料。所得液態(tài)可注射骨修復(fù)材料具有優(yōu)異的可注射性，2小時(shí)內(nèi)即可原位固化，能夠顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù)(200610144009.5)。本發(fā)明是一種殼聚糖基的可注射溶膠一凝膠骨修復(fù)材料，能夠在37攝氏度生理pH環(huán)境下自發(fā)轉(zhuǎn)變成凝膠，具有溫度和pH雙重敏感性，而海藻酸基的溶膠凝膠體系對(duì)溫度不敏感，如果不加入固化劑硫酸鈣微粒，不能在生理環(huán)境下自發(fā)轉(zhuǎn)變成凝膠，與之相比，本專利公開的方法能在10min內(nèi)即形成凝膠，凝膠速度更快，使用起來更方便。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可注射型殼聚糖/GP/納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)骨修復(fù)材料及其制備方法。以納米羥基磷灰石/膠原微粒復(fù)合材料為基礎(chǔ)制備可注射型骨修復(fù)材料，既可以保持仿天然骨結(jié)構(gòu)的特征，又賦予了材料新的可注射性能，適用于微創(chuàng)手術(shù)，具有更加廣闊的應(yīng)用范圍。按此方法制備的水凝膠可在體內(nèi)原位形成，其臨床應(yīng)用方便。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供一種骨修復(fù)材料，含納米羥基磷灰石/膠原微粒1-2重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉2-3重量份。例如可以是含納米羥基磷灰石/膠原微粒2重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉2.5重量份；含納米羥基磷灰石/膠原微粒1重量份、殼聚糖1重量份和P—甘油磷酸鈉3重量份；或含納米羥基磷灰石/膠原微粒1.5重量份、殼聚糖1重量份和6—甘油磷酸鈉2重量份。本發(fā)明還提供上述骨修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟1)將殼聚糖(脫乙酰度8099%)溶于鹽酸或醋酸中，攪拌溶解至澄清；2)將GP溶解于蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的GP溶液；3)用堿性鹽溶液將殼聚糖溶液的pH值調(diào)到37之間；4)將GP溶液加入殼聚糖溶液中，使共混溶液的pH值位于6.57.4之間；5)將納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中，攪拌至充分混合。將共混溶液置于凝膠溫度中或注射入體內(nèi)，即可原位形成凝膠。其中，所用堿性鹽為碳酸氫鈉，磷酸鈉或氫氧化鉀，堿性鹽用量須保證殼聚糖溶液的pH值調(diào)到37之間。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于采用殼聚糖，e-甘油磷酸鈉，納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)制備的溫度響應(yīng)型可注射型殼聚糖/GP/納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)骨修復(fù)材料,通過調(diào)控與水分子間相互作用，實(shí)現(xiàn)溶膠一凝"交轉(zhuǎn)變的溫敏化。復(fù)合物體內(nèi)凝膠化特性可調(diào)，能適應(yīng)不同形狀骨缺損的修復(fù)。組分的優(yōu)化使其適于注射應(yīng)用，按此方法制備的支架材料可通過注射在體內(nèi)原位形成，不僅保留了殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)的生物相容性，生物降解性，且其臨床應(yīng)用方便。殼聚糖是一種天然生物多糖，來源廣泛，無細(xì)胞毒性、生物相容性好且沒有抗原性，可吸收，易于加工。納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)以膠原分子為模板，調(diào)制鈣磷鹽沉積到有序排列的膠原纖維上，自組裝成具有天然骨分級(jí)結(jié)構(gòu)的礦化多肽材料微粒(nHAC),目前這種材料已經(jīng)由北京奧精醫(yī)藥科技有限公司商業(yè)生產(chǎn)，可由商業(yè)途徑購買得到。在殼聚糖溶液中加入納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)形成的溶膠凝膠體系，增強(qiáng)了其對(duì)骨組織的仿生程度，使此可注射支架材料更適合于骨重建，同時(shí)材料具有可注射性，操作方便。圖1:植入材料后X—ray觀察圖譜(a)術(shù)后；(b)植入凝膠A12周。圖2:植入凝膠A材料后的生理切片H&E染色圖(a)8周100倍；(b)12周25倍；(c)12周100倍。具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明的突出特點(diǎn)，僅在于說明本發(fā)明而決不限制本發(fā)明，亦即，本發(fā)明的突出特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，決不限于下述實(shí)例。本專利提到的納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)均購買自北京奧精醫(yī)藥科技有限公司，由北京奧精醫(yī)藥科技有限公司商業(yè)生產(chǎn)。實(shí)施例1:含納米羥基磷灰石/膠原微粒2重量份、殼聚糖1重量份和e—甘油磷酸鈉2.5重量份。將200mg殼聚糖(脫乙酰度99X)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP500mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的GP溶液(50%，w/v);用lM的碳酸氫鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調(diào)到4，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH值為7.15，將400mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將共混溶液注入15mmX5mmX5mm模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，即可原位形成凝膠A。將200mg殼聚糖(脫乙酰度99X)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP560mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的GP溶液(56%，w/v);用lM的碳酸氫鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調(diào)到4，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH值為7.15，將溶液注入15mmX5mmX5mm模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，即可原位形成不含納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)的凝膠B。將以上A、B兩種凝膠進(jìn)行效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)，15mmX5咖X5mm的凝膠A和凝膠B進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。新西蘭兔12只(體重2.5-3kg)隨機(jī)分為2組，3%戊巴比妥鈉肌注麻醉0.3mg/kg，常規(guī)脫毛、固定、消毒、鋪單，取右側(cè)前肢前外側(cè)切口，依次切開皮膚、皮下、深筋膜，沿肌間隙分離并顯露橈骨。于橈骨中上段1/3處用手持牙科打磨機(jī)截?cái)?，造?5mm骨于骨膜節(jié)段性缺損，實(shí)驗(yàn)組植入凝膠A，對(duì)照組植入凝膠B，逐層縫合不行固定，置于相同條件下飼養(yǎng)。分別于術(shù)后4、8、12周處死動(dòng)物取材。觀察術(shù)后動(dòng)物飲食、活動(dòng)及傷口愈合情況。取材后觀察缺損部位的變化，脫鈣后縱向剖開觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。術(shù)后4、8、12周在麻醉下拍攝前肢正位片，條件為55kv、50mA、0.2sec，觀察各組動(dòng)物骨修復(fù)情況。組織切片及蘇木精一伊紅染色(服E)，觀察新骨的形成。觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有動(dòng)物傷口愈合良好，無一例感染或積液。凝膠B植入組12周內(nèi)骨缺損未修復(fù)，縱剖面可見材料形態(tài)較為完整，與骨折端分界清晰，組織切片可見大量纖維結(jié)締組織充填孔隙；而凝膠A植入4周雙側(cè)骨皮質(zhì)達(dá)到連接，縱剖面見材料形態(tài)保持，12周后材料內(nèi)部有較多的新骨形成，材料輪廓逐漸崩散，組織切片示植入4周后材料邊緣既有初步的骨連接,材料內(nèi)部新生骨小梁隨著時(shí)間的推移而增加。圖1是植入凝膠A后12周愈合的x-ray結(jié)果。圖2是8周和12周的生理切片結(jié)果，(a)圖中我們看見新生的骨小梁進(jìn)入材料中間，而多孔材料中細(xì)胞聚集，在骨小梁的表面有連續(xù)的成骨細(xì)胞，(b)圖是12周大體觀察可知骨組織已經(jīng)基本代替了材料，髓腔已通，有更多的新生骨小梁對(duì)材料進(jìn)行分割和取代。本實(shí)驗(yàn)表明在殼聚糖溶液中加入納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)形成的溶膠凝膠體系，增強(qiáng)了其對(duì)骨組織的仿生程度，使此可注射支架材料更適合于骨重建，其骨缺損愈合效果得到了有力的證實(shí)。同時(shí)材料具有可注射性，操作方便。實(shí)施例2:含納米羥基磷灰石/膠原微粒1重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉3重量份。將200mg殼聚糖(脫乙酰度80%)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP600mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的GP溶液(56。％，w/v);用1M的K0H溶液將殼聚糖溶液的pH值調(diào)到5，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH值為7.2，將200mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將將溶液注入15腿X5ramX5mm模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，5分鐘即可原位形成凝膠C。按照專利200610144009.5公布的一種海藻酸鈣基可注射原位固化骨修復(fù)材料的制備方法。按質(zhì)量比取去離子水100g加入3g磷酸鈉和2g海藻酸鈉粉末充分?jǐn)嚢瑁玫胶Ｔ逅徕c溶液；往所述海藻酸鈉溶液中加入2g納米羥基磷灰石/膠原(nHAC)微粒，充分?jǐn)嚢璧玫秸吵響覞嵋?；加?.4g硫酸鈣微粒，充分?jǐn)嚢韬?，將溶液注?5腿X5mmX5咖模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，0.5小時(shí)才可原位形成凝膠D。與之相比，本專利公開的方法能在10min內(nèi)即形成凝膠，凝膠速度更快，使用起來更方便，也更安全。將以上C、D兩種凝膠進(jìn)行效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)，15mmX5mmX5mm的凝膠C和凝膠D進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。新西蘭兔12只(體重2.5-3kg)隨機(jī)分為2組，3%戊巴比妥鈉肌注麻醉0.3mg/kg，常規(guī)脫毛、固定、消毒、鋪單，取右側(cè)前肢前外側(cè)切口，依次切開皮膚、皮下、深筋膜，沿肌間隙分離并顯露橈骨。于撓骨中上段1/3處用手持牙科打磨機(jī)截?cái)啵斐?5mm骨于骨膜節(jié)段性缺損，實(shí)驗(yàn)組植入凝膠A，對(duì)照組植入凝膠B，逐層縫合不行固定，置于相同條件下飼養(yǎng)。分別于術(shù)后4、8、12周處死動(dòng)物取材。觀察術(shù)后動(dòng)物飲食、活動(dòng)及傷口愈合情況。取材后觀察缺損部位的變化，脫鈣后縱向剖開觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。術(shù)后4、8、12周在麻醉下拍攝前肢正位片，條件為55kv、50mA、0.2sec，觀察各組動(dòng)物骨修復(fù)情況。組織切片及蘇木精一伊紅染色(H&E)，觀察新骨的形成。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種凝膠均能達(dá)到骨缺損愈合效果，但凝膠C的骨修復(fù)速度大于凝膠D組，可能原因在于殼聚糖在體內(nèi)的降解速度大于海藻酸，為骨組織的長入提供了生長的空間，從而加速了骨愈合。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本專利更有優(yōu)越性。實(shí)施例3:含納米羥基磷灰石/膠原微粒1.5重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉2重量份。將200mg殼聚糖(脫乙酰度90%)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP400mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的GP溶液(50%，w/v);用1M的磷酸鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調(diào)到5，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH值為7.4，將300mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將共混溶液置于37度環(huán)境中，5rnin即可原位形成凝膠。實(shí)施例4:含納米羥基磷灰石/膠原微粒i重量份、殼聚糖2重量份和e—甘油磷酸鈉2.5重量份。將400mg殼聚糖(脫乙酰度60X)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP500mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的GP溶液(45%，w/v);用1M的磷酸鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調(diào)到5，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH值為7.4，將200mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將共混溶液置于37度環(huán)境中，不能原位形成凝膠。權(quán)利要求1.一種骨修復(fù)材料，含納米羥基磷灰石/膠原微粒1-2重量份、殼聚糖1重量份和β-甘油磷酸鈉2-3重量份。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨修復(fù)材料，其特征在于，所述骨修復(fù)材料含納米羥基磷灰石/膠原微粒2重量份、殼聚糖1重量份和e—甘油磷酸鈉2.5重量份。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨修復(fù)材料，其特征在于，所述骨修復(fù)材料含納米羥基磷灰石/膠原微粒1重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉3重量份。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨修復(fù)材料，其特征在于，所述骨修復(fù)材料含納米羥基磷灰石/膠原微粒1.5重量份、殼聚糖1重量份和^—甘油磷酸鈉2重量份。5.制備權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述骨修復(fù)材料的方法，包括如下步驟1)將脫乙酰度8099%的所述量殼聚糖溶于酸中，攪拌溶解至澄清；2)將所述量3—甘油磷酸鈉溶解于蒸餾水中，得到清亮均質(zhì)的e_甘油磷酸鈉溶液；3)用堿性鹽溶液將步驟l)制備的溶液的pH值調(diào)至37;4)將步驟2)制備的e—甘油磷酸鈉溶液加入步驟3)制備的溶液中，調(diào)節(jié)pH值至6.57.4;5)將所述量納米羥基磷灰石/膠原微粒加入步驟4)制備的溶液中，充分混合。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟l)中所述酸為鹽酸或醋酸。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)中所述堿性鹽為碳酸氫鈉，磷酸鈉或氫氧化鉀。全文摘要本發(fā)明涉及一種含納米羥基磷灰石/膠原微粒的骨修復(fù)材料及其制備方法。本發(fā)明提供一種骨修復(fù)材料，含納米羥基磷灰石/膠原微粒1-2重量份、殼聚糖1重量份和β-甘油磷酸鈉2-3重量份。(此處補(bǔ)充給組分的重量配比)本發(fā)明還提供上述骨修復(fù)材料的制備方法。將上述骨修復(fù)材料置于37℃或注射入體內(nèi)，即可原位形成凝膠。本發(fā)明提供的骨修復(fù)材料既可以保持仿天然骨結(jié)構(gòu)的特征，又賦予了材料新的可注射性能，而且具有溫度敏感性，適用于微創(chuàng)手術(shù)，臨床應(yīng)用方便。文檔編號(hào)A61L27/46GK101297980SQ20081011602公開日2008年11月5日申請(qǐng)日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者馮慶玲,崔福齋,堃胡,智黃申請(qǐng)人:北京奧精醫(yī)藥科技有限公司