專利名稱：：抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑及其制備方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，特別涉及一種抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑及其制備方法。技術(shù)背景犬痘熱，又名狗痘等，由犬痙熱病毒感染購引起的。犬痙熱病毒屬副黏病毒科，麻滲病毒屬。本病對幼犬為高死亡率的傳染病。其早期病癥為眼睛及鼻腔的膿樣分泌物，呼吸及消化系統(tǒng)的異常，末期則有神經(jīng)系統(tǒng)損害。其中少數(shù)病例其鼻鏡及足墊會因過度角質(zhì)化而呈現(xiàn)硬固，俗稱硬胝癥，而成為本病臨床上之特異性病癥。自然宿主為犬科動物(犬、狼、封、狐等)，鼬科動物(貂、臭助、黃鼠狼等)，浣熊科動物(浣熊、小熊貓等)。本病一年四季均可發(fā)生，以寒冷季節(jié)多發(fā)。不同年齡、性別、品種的犬均可感染，幼犬、純種犬易感性高，病情嚴重，死亡率高。本病呈高度接觸性傳染，患犬為主要傳染源，患犬的鼻液、唾液、淚液、呼吸道飛沫、組織器官、血液中有大量病毒存在并能通過尿液長期排毒。有些病犬臨床恢復后，可長時間向外排毒，成為帶毒犬，也是不為人們注意的傳染源。試驗表明其傳播途徑主要是呼吸道，其次是消化道。犬瘟熱之臨床癥狀及其病程之長短不一，個體間差異也很大。病犬在感染后約第四天體溫升高，持續(xù)l-2日并伴隨有稍微厭食及眼結(jié)膜炎；出現(xiàn)體溫再度提升、精神不佳、厭食、嘔吐、下痢、腸炎及鼻炎、支氣管肺炎等消化及呼吸系統(tǒng)的癥狀。急性型病犬常因明顯的厭食、嚴重脫水、失重或伴隨有全身抽搐的神經(jīng)癥狀最后而死亡。但也有些病犬雖有嚴重的上述病狀，經(jīng)治療后并獲得改善，但仍有遺留下神經(jīng)性的功能不良后遺癥。犬痙熱可造成高死亡率的原因多為病毒在顱內(nèi)所引發(fā)的腦炎，因破壞白血球及血小板的制造功能，而造成對免疫系統(tǒng)的抑制作用，致使病犬易并發(fā)肺炎及腸炎的二次性感染，因此如能對于二次性感染癥予以適當?shù)姆婪叮捎行У慕档筒∪乃劳雎?。犬瘟熱必須以防為主，做好預防接種工作。早期應大量應用高免血清或免疫球蛋白、強力犬康、干擾素、單克隆卵黃抗體等做好緊急被動免疫。初期用抗感染、抗病毒、抗休克的藥物進行對癥治療。由于犬瘟熱病毒基因組的變異性很強，疫苗免疫效果不夠理想。目前，至今尚無有效的防治犬瘋熱藥物和防治方法，所以，犬痙熱的治愈率低?？谷翢崧腰S抗體是防治抗犬瘟熱的特異性生物制品，是一種被動免疫制劑，同時還有鑒別診斷和緊急預防接種等作用，具有較高的推廣應用價值。卵黃抗體的使用，在免疫學理論中可成為被動免疫。當免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失敗時，可利用卵黃抗體注射替代主動免疫接種，發(fā)揮抗病作用。在獸醫(yī)臨床上，卵黃抗體已廣泛用于雞(傳染性法氏嚢、新城疫、雞白痢等)、鴨(肝炎)、鵝(小鵝瘟)、犢牛(腹瀉)、仔豬(黃白痢、豬輪狀病毒腹瀉)、羔羊(輪狀病毒腹瀉)等疫病的緊急治療和預防。卵黃抗體制備簡單，而且具有性質(zhì)均一、易提取、可有效避免非特異性免疫反應發(fā)生等特性，在免疫技術(shù)、免疫監(jiān)測、人畜治療等方面有很大的發(fā)展?jié)摿?。國?nèi)的研制工作主要集中在對禽類疾病的防治，江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院畜牧獸醫(yī)研究所已獲得防治雞傳染性法氏嚢、新城疫、雞白痢、鴨肝炎、小鵝痕等多聯(lián)高免卵黃抗體注射液；華西醫(yī)科大學一項防治禽病的卵黃抗體針劑已取得生物獸藥證書；四川省養(yǎng)豬研究所研制了大腸桿菌卵黃抗體注射液。卯黃抗體注射劑在對犬瘟熱病的防治研究尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗犬痙熱卵黃抗體注射劑及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的實施方式如下一種抗犬瘕熱卵黃抗體注射劑，其特征在于以犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，再收集免疫產(chǎn)蛋母雞卵黃抗體并提取、制備。一種抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑的制備方法，實施步驟如下(1)分離犬瘟熱病毒進行增殖培養(yǎng)，當具有抗原性后制備成滅活犬瘟熱疫苗；(2)利用制備成犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，第一輪次免疫注射時免疫劑量為1.0-2.0ml;10-15天后進行第二輪次免疫注射，免疫劑量為首免的2倍；再過10-15天后進行第三輪次免疫注射，免疫劑量為首免的4倍；以后每隔一個月再以首免的4倍劑量進行免疫；誘導產(chǎn)蛋母雞持續(xù)性產(chǎn)生犬痕熱抗體；(3)第三輪次免疫結(jié)束后10天，用1%新潔爾滅消毒蛋殼，在無菌條件下4收集卵黃，用無菌蒸餾水對倍稀釋，置組織搗碎機中用3000r/min勻漿lmin，勻漿后加入乳酸液，在l-4。C溫度下靜止3-4h或過夜，去除雜蛋白，收集上清液，上清液中加入硫酸銨至飽和度20-50%進行鹽析，4000r/min離心20min,收集沉淀，加入生理鹽水，調(diào)整IgY的濃度分裝，該注射劑內(nèi)含有效價》1:256的抗犬痘熱的卵黃抗體，即得本發(fā)明的抗犬瘋熱卵黃抗體注射劑。本發(fā)明的有益效果是抗犬瘟熱卵黃抗體都是通過^^高犬機體對犬瘟熱的抗體水平來防治抗犬痙熱的。抗犬瘋熱卵黃抗體注射劑治療犬瘟熱，l-2天見效，臨床有效率可達88.6%以上。使用本發(fā)明的卵黃抗體注射治療患犬瘟熱的犬，試驗組臨床癥狀比對照組明顯減輕，且試-瞼組的死亡率顯著低于對照組。將本發(fā)明提供的卵黃抗體在寵物醫(yī)院中應用，也產(chǎn)生了明顯的預防和治療作用。本發(fā)明的抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑防治犬瘟熱效果顯著。該方法成本低，見效快，無副作用，不會產(chǎn)生耐藥性菌林，制備工藝簡單，原料來源廣泛。具體實施方式以下結(jié)合實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施方式詳述如下實施例l一種抗犬痙熱卵黃抗體注射劑，其特征在于以犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，再收集免疫產(chǎn)蛋母雞卵黃抗體并提取、制備?？谷偀崧腰S抗體的注射劑的制備方法，實施步驟如下(1)分離犬瘟熱病毒進行增殖培養(yǎng)，當具有抗原性后制備成犬瘟熱疫苗。(2)利用制備成犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，第一輪次免疫注射時免疫劑量為1.0ml;IO天后進行第二輪次免疫注射，免疫劑量為首免的2倍；再過10天后進行第三輪次免疫注射，免疫劑量為首免的4倍；以后每隔一個月再以首免的4倍劑量進行免疫。誘導產(chǎn)蛋母雞持續(xù)性產(chǎn)生犬瘟熱抗體。(3)第三輪次免疫結(jié)束后10天，用1%新潔爾滅消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，用無菌蒸餾水對倍稀釋，置組織搗碎機中用3000r/min勻漿lmin，勻漿后加入乳酸液，在l-4。C溫度下靜止3-4h或過夜，去除雜蛋白，收集上清液，上清液中加入吸取上清，加入50%的飽和硫酸銨，搖勻，4。C鹽析2h。4000r/min離心20min,棄上清，沉淀以100ml的PBS(pH7.4)完全溶解。用30%的飽和硫酸銨重復鹽析3次，沉淀用PBS透析24h或過夜，沉淀中加入生理鹽水，同時加青霉素、鏈霉素各200.0IU/mL,調(diào)整IgY的濃度分裝于滅菌玻璃瓶中，該注射劑內(nèi)含有效價》1:256的抗犬瘟熱的卵黃抗體，即得本發(fā)明的抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑。其lgY的得率達95。/。以上，一個免疫卵一般可得IgY80-110mg。初診為犬腹瀉的犬，按每千克體重0.5-l毫升的劑量確定用量，選擇肌肉豐滿的部位進行多點肌肉注射，嚴重者間隔3-4日可再次注射。同時要飲用白糖水、維生素或葡萄糖水溶液，輔助給予青飼料等含維生素豐富的食物。實施例2一種抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑，其特征在于以犬瘋熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，再收集免疫產(chǎn)蛋母雞卵黃抗體并提取、制備?？谷翢崧腰S抗體的注射劑的制備方法，實施步驟如下(1)分離犬瘟熱病毒進行增殖培養(yǎng)，當具有抗原性后制備成犬瘟熱疫苗。(2)利用制備成犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，第一輪次免疫注射時免疫劑量為1.5ml;15天后進行第二輪次免疫注射，免疫劑量為首免的2倍；再過15天后進行第三輪次免疫注射，免疫劑量為首免的4倍；以后每隔一個月再以首免的4倍劑量進行免疫。誘導產(chǎn)蛋母雞持續(xù)性產(chǎn)生犬痘熱抗體。(3)第三輪次免疫結(jié)束后10天，用1%新潔爾滅消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，用無菌蒸餾水對倍稀釋，置組織搗碎機中用3000r/min勻漿lmin，勻漿后加入乳酸液，在l-4。C溫度下靜止3-4h或過夜，去除雜蛋白，收集上清液，上清液中加入吸取上清，加入35%的飽和硫酸銨，搖勻，4。C鹽析4h。4000r/min離心20min，棄上清，沉淀沉淀用PBS透析24h或過夜，沉淀中加入生理鹽水，同時加青霉素、鏈霉素至終濃度各2'00.0IU/mL,調(diào)整IgY的濃度分裝于滅菌玻璃瓶中，該注射劑內(nèi)含有效價為512的抗犬瘟熱的卵黃抗體，即得本發(fā)明的抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑。初診為犬痘熱的犬，按每千克體重0.5-l毫升的劑量確定用量，選擇肌肉豐滿的部位進行多點肌肉注射，嚴重者間隔3-4曰可再次注射。同時要飲用白糖水、維生素或葡萄糖水溶液，輔助給予青飼料等含維生素豐富的食物。應用實例抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑對犬瘟熱的臨床療效試驗一、材^h與方法(一)試驗材料抗犬瘋熱卵黃抗體注射劑，批號070411，卯黃抗體效價為l:512,IgY含量為0.1mg/ml。用法用量為月幾肉注射，lml/只犬。毒抹犬瘟熱(CDV)強毒分離林。實驗動物3月齡外觀健康的土種犬60只。(二)試驗方法1.犬痕熱(CDV)強毒抹的分離經(jīng)臨床診斷、組織包涵體檢查后，篩選出可疑病犬，然后取腦、肝、肺組織抽提RNA進行RT-PCR檢測，將確認為犬瘟熱陽性的病犬組織勻漿后，經(jīng)青鏈霉素處理，作為攻毒用毒抹。2.對實驗動物進行CDV診斷每只動物采血分離血清，用北京世紀元亨抗體，若為陽性，則淘汰掉，再補充實驗動物，重新;險測，直至得到60只犬瘟熱卵黃抗體陰性犬。3.分組試驗犬60只隨機分為A、B、C、D四組，每組15只，A組攻毒后用抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑治療，B組攻毒后用病毒唑治療，C組為攻毒對照組，D組為健康對照組。4.攻毒A、B、C三組結(jié)合點眼、滴鼻和腹腔注射三種方式接種犬瘟熱病毒，D組以生理鹽水作對照，也按照點眼、滴鼻和腹腔注射三種方式進行。其中點眼每次0.5毫升，滴鼻每次l毫升，腹腔注射每次3毫升。5.治療A組15只犬于接種犬瘟熱病毒后24小時、48小時按lml/只犬注射抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑進行治療；B組15只犬于接種犬痙熱病毒后24小時、48小時分別按2毫克//>斤體重注射病毒唑進行治療；C組、D組不進行任何治療。6.記錄觀察并記錄臨床癥狀，統(tǒng)計死亡數(shù)。(三)試驗結(jié)果及分析抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑對犬痙熱的臨床治療效果，詳見表l。由表1可見，抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑對犬瘋熱的治療效果要遠遠優(yōu)于病毒哇。A組于攻毒后24小時和48小時連續(xù)兩次肌注抗犬痙熱卵黃抗體注射劑治療，結(jié)果僅6只出現(xiàn)食欲減退和精神不振的癥狀，但狀態(tài)好于B組攻毒犬，且未出現(xiàn)咳嗽和嘔吐癥狀，死亡數(shù)為l只，死亡率為3.3%。B組于攻毒后24小時和48小時連續(xù)兩次肌注病毒唑治療，結(jié)果有21只出現(xiàn)食名夂減退和精神不4展的癥狀，出現(xiàn)咳嗽和嘔吐癥狀，死亡16只，死亡率為52.3%。C組于攻毒后第3天起出現(xiàn)厭食，眼角出現(xiàn)膿性或漿液性分泌物，伴有咳嗽、嘔吐等癥狀，于攻毒后10~15天有28只病犬死亡，死亡率為93.3%。D組未出現(xiàn)4壬何臨床癥狀，死亡只數(shù)為0。表1抗犬瘋熱卵黃抗體注射劑對犬瘟熱的療效試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實驗結(jié)果如下本次試驗結(jié)果表明，本發(fā)明抗犬痘熱卵黃抗體注射劑治療犬瘟熱有效率為88.6%，經(jīng)統(tǒng)計分析，A組與B組、C組、D組差異非常顯著(P<0.01),說明本發(fā)明抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑對犬瘟熱病具有顯著的治療作用。犬瘟熱病毒的感染，嚴重威脅犬的健康，造成了重大經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)上，一般使用病毒唑來治療犬瘟熱，病毒唑是一種單磷酸次黃噪呤核苦脫氬酶抑制劑，能抑制病毒復制所需酶的合成，從而防止病毒細胞內(nèi)的復制，對于病毒入侵細胞則起不到封閉阻斷作用。病毒唑雖然對多種病毒感染有效且價格低廉，但效果往往不佳。當犬發(fā)生犬痘熱病時，可立即注射卵黃抗體，能阻止犬瘟熱病毒進入細胞，中和病毒數(shù)量，經(jīng)2-10小時就可發(fā)現(xiàn)犬精神好轉(zhuǎn)，食欲增加。綜上所述，抗犬痘熱卵黃抗體是治療犬痘熱的有效藥物之一。本試驗結(jié)果表明，抗犬瘟熱卯黃抗體注射劑對于犬痘熱具有良好的治療效果。上述參照實施例對該抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑及其制備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑，其特征在于以犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，再收集免疫產(chǎn)蛋母雞卵黃抗體并提取、制備。2、一種根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑的制備方法，實施步驟如下(1)分離犬瘟熱病毒進行增殖培養(yǎng)，當具有抗原性后制備成滅活犬瘟熱疫苗；(2)利用制備成犬瘟熱疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，第一輪次免疫注射時免疫劑量為1.0-2.0ml;10-15天后進行第二輪次免疫注射，免疫劑量為首免的2倍；再過10-15天后進行第三輪次免疫注射，免疫劑量為首免的4倍；以后每隔一個月再以首免的4倍劑量進行免疫；誘導產(chǎn)蛋母雞持續(xù)性產(chǎn)生犬瘟熱抗體；(3)第三輪次免疫結(jié)束后10天，用1%新潔爾滅消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，用無菌蒸餾水對倍稀釋，置組織搗碎機中用3000r/min勻漿lmin,勻漿后加入乳酸液，在l-4。C溫度下靜止3-4h或過夜，去除雜蛋白，收集上清液，上清液中加入硫酸銨至飽和度20-50%進行鹽析，4000r/min離心20min,收集沉淀，加入生理鹽水，調(diào)整IgY的濃度分裝，該注射劑內(nèi)含有效價^1:256的抗犬瘟熱的卵黃抗體，即得本發(fā)明的抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑及其制備方法。所述抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑，以犬瘟熱疫苗疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，再收集免疫產(chǎn)蛋母雞卵黃抗體并提取、制備。所述抗犬瘟熱疫苗卵黃抗體是通過提高犬機體對犬瘟熱的抗體水平來防治疾病的。本發(fā)明的有益效益是抗犬瘟熱卵黃抗體注射劑在犬瘟熱發(fā)病后使用，藥效更快。本發(fā)明療效顯著，成本低、見效快，無毒副作用，不會產(chǎn)生耐藥性菌株；制備簡單，原料來源廣泛，使用方便，易于推廣。文檔編號A61P31/14GK101259274SQ20081005280公開日2008年9月10日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者古長慶申請人:天津生機集團股份有限公司