專利名稱：：針對(duì)禽流感病毒的重組聯(lián)合dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種針對(duì)禽流感病毒的DNA聯(lián)合重組疫苗。它同時(shí)利用HA和NP兩種病毒蛋白而達(dá)到對(duì)于H5亞型禽流感病毒甚至更多禽流感病毒的抵抗，在防御禽流感方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
：禽流感(AvianInfluenza,AI)是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，是由A型流感病毒(AvianinfluenzavimstypeA)引起的一種從呼吸系統(tǒng)到全身敗血癥等多種癥狀的急性高度致死性的傳染病，被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為A類烈性傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。我國(guó)把它列為一類動(dòng)物傳染病。流感病毒由特異的不具交叉反應(yīng)的核糖核蛋白抗原區(qū)分為三個(gè)不同的抗原型，即A、B、C三型，禽流感病毒屬于A型。A型流感病毒根據(jù)其表面蛋白一一血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)分為若干亞型，目前已知的HME型有15個(gè)，N亞型有9個(gè)。世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7兩種亞型引起，目前在越南、韓國(guó)和日本等地流行的禽流感病毒屬H5N1型。但隨著人類感染禽流感病毒而發(fā)病的事例的出現(xiàn)，人們不得不意識(shí)到，高致病性禽流感病毒也有可能像SARS病毒一樣，引起一場(chǎng)大范圍傳染性災(zāi)難。高致病性禽流感具有幾個(gè)特點(diǎn)高傳播性，禽傳禽的特點(diǎn)和候鳥的遷徙帶來(lái)很大威脅，而禽傳人的可能又存在著相當(dāng)大的隱患；難預(yù)防，禽流感和普通流感的癥狀相差不多，初期很可能被忽視，可其致死率卻大大高于普通流感；高變異性，禽流感病毒的高變異性使得治療性藥物和疫苗的研發(fā)面對(duì)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。針對(duì)H5N1禽流感病毒，已經(jīng)有一些實(shí)驗(yàn)室開展了研究工作，并且取得了一定的成績(jī)。對(duì)于H5N1病毒的預(yù)防，疫苗是非常關(guān)鍵的一個(gè)手段。從國(guó)內(nèi)爆發(fā)禽流感疫情以來(lái)，很多生物公司都研制出不同的疫苗來(lái)抵御禽流感病毒，比較有代表性的有H5N2禽流感滅活疫苗、H5/H9二價(jià)禽流感滅活疫苗、H5N1重組禽流感病毒滅活疫苗和H5禽流感重組雞痘病毒載體活疫苗等。從現(xiàn)有技術(shù)已開發(fā)的疫苗來(lái)看，大多是采用滅活方法得到的蛋白疫苗。但是這種疫苗的應(yīng)用存在很多弊端，比如生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高，僅僅是利用雞胚培養(yǎng)病毒再進(jìn)行滅活的過(guò)程就要幾個(gè)月時(shí)間，而且對(duì)于雞胚等的消耗量非常大，得率卻很低，并且對(duì)于儲(chǔ)存條件的要求很高，這些都延長(zhǎng)了周期和提高了生產(chǎn)成本。而且蛋白類疫苗也無(wú)法有效面對(duì)禽流感病毒的高變異性，不管是效果還是生產(chǎn)制作的時(shí)間都有弊端。因此，本領(lǐng)域還需要開發(fā)對(duì)于防治禽流感更有效的疫苗，它不但可以降低生產(chǎn)成本，以最快的速度進(jìn)行合成，并且可以在一定程度上解決新亞型病毒出現(xiàn)的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于防治禽流感的聯(lián)合疫苗，其制備方法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組載體，所述的重組載體含有(1)操作性相連的啟動(dòng)子l，H5N1流感病毒血凝素(HA)編碼基因和終止子；和(2)操作性相連的啟動(dòng)子2，H5N1流感病毒核蛋白(NP)編碼基因和終止子。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子1或啟動(dòng)子2選自EF-la啟動(dòng)子，和/或CMV啟動(dòng)子；且，所述的啟動(dòng)子1和啟動(dòng)子2相同或不同。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子l是EF-la啟動(dòng)子；所述的啟動(dòng)子2是CMV啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述的重組載體是pBudCE4.1。在本發(fā)明的第二方面，提供一種基因工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的重組載體。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是HEK293T細(xì)胞。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的重組載體的用途，用于制備防治禽流感的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于提高動(dòng)物體內(nèi)的IFN-Y值。在本發(fā)明的第四方面，提供一種防治禽流感的組合物，所述組合物含有有效量(0.00001-50wt。/o;較佳的0.0001-10wt。/。；更佳的0.01-lwt0/。，如0.1%)的所述重組載體；以及藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的第五方面，提供一種防治禽流感的藥盒，所述的藥盒中含有所述的組合物，或所述的重組載體。另一方面，還提供一種防治禽流感的方法，所述方法包括給予需要防治的對(duì)象有效量的所述的重組載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖lA顯示了p-HA，p-NP和p-HA+NP分別被Notl/XholI和BamHI/HindlII酶切后的DNA片段；其中，p-HA+NP即為本發(fā)明的雙價(jià)重組DNA疫苗；HA和NP的基因片段約為1.7K和1.5K。圖lB顯示了pBudCE4.1(Vector),p-HA，p-NP和p-HA+NP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的表達(dá)情況。這兩張圖證明了p-HA+NP的聯(lián)合重組是成功克隆的。圖2顯示了免疫2次后7天抗體滴度的情況，其中陽(yáng)性(邊)和陽(yáng)性(H5N2)都是陽(yáng)性血清對(duì)照，Vecl是陰性血清對(duì)照，NP1和HA是單價(jià)疫苗的血清，HA+NP是聯(lián)合疫苗的血清。這張圖證明了聯(lián)合疫苗可以得到高的抗體滴度。圖3顯示的是T淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)(即CTL實(shí)驗(yàn))。其中HA和NP代表單價(jià)疫苗得到的殺傷率，H+N代表的是聯(lián)合重組疫苗得到的殺傷率，Vector是陰性對(duì)照。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究和反復(fù)的試驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)將H5N1流感病毒血凝素(HA)和H5N1流感病毒核蛋白(NP)的編碼基因克隆入攜帶雙啟動(dòng)子的載體中，制成的雙價(jià)DNA疫苗在免疫動(dòng)物后，可在動(dòng)物體內(nèi)良好地誘發(fā)分別抗HA和NP的抗體，且抗體的效價(jià)很高。并且，所述雙價(jià)DNA疫苗在免疫動(dòng)物后，可誘導(dǎo)體內(nèi)高的IFN-Y值，從而有效提高動(dòng)物的免疫抵抗能力。本發(fā)明提供了一種重組載體(雙價(jià)DNA疫苗)，所述的重組載體含有(1)操作性相連的啟動(dòng)子l，H5N1流感病毒血凝素(HA)編碼基因，終止子；和(2)操作性相連的啟動(dòng)子2，H5N1流感病毒核蛋白(NP)編碼基因和終止子。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，從多種禽流感病毒相關(guān)蛋白(包括NA，M，NP，HA，NS等)中選擇HA蛋白和NP蛋白，將所述蛋白的編碼基因克隆入具有雙啟動(dòng)子的載體中，獲得了高效的可抵御多種不同亞型禽流感病毒的疫苗。HA蛋白和NP蛋白均是H5N1流感病毒的蛋白。H5N1流感病毒的染色體基因組是由分子量不同的8個(gè)單鏈RNA片段組成，每個(gè)片段分別轉(zhuǎn)錄和復(fù)制不同的蛋白質(zhì)。本病毒顆粒呈球形、桿狀或長(zhǎng)絲狀，為多形性，其直徑約80-120nm，表面有一層棒狀和蘑菇狀的纖突(Spike)，對(duì)紅細(xì)胞有凝集性，稱血凝素(HA)。病毒內(nèi)部的核蛋白(NP)主要用途是"挾持"并潛入宿主細(xì)胞。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，單純以HA或者NP的基因來(lái)制備DNA疫苗，只能發(fā)揮局限性的作用，誘發(fā)的細(xì)胞免疫產(chǎn)生的IFN-Y值也不夠高。采用本發(fā)明的雙價(jià)DNA疫苗，在出現(xiàn)H5亞型禽流感疫情時(shí)，可以迅速的發(fā)揮有針對(duì)性的抵抗作用，甚至產(chǎn)生中和性抗體及時(shí)清除病毒。在出現(xiàn)非H5亞型禽流感疫情時(shí)，由于NP蛋白的相對(duì)保守性，其產(chǎn)生的抗體和CTL反應(yīng)可以盡可能的抵抗多種亞型禽流感病毒，達(dá)到延遲病毒侵襲的作用。這種聯(lián)合疫苗同時(shí)發(fā)揮了兩種關(guān)鍵蛋白的優(yōu)勢(shì)，使得高效且廣譜地抵御未知禽流感成為可能。并且，采用本發(fā)明的雙價(jià)疫苗，可顯著地提高IFN-Y值，從而增強(qiáng)免疫動(dòng)物的免疫抵抗能力。與融合表達(dá)HA和NP的DNA疫苗相比，本發(fā)明可更完整地保留HA和NP的抗原決定簇，效果更優(yōu)異。所述的重組載體是雙啟動(dòng)子的載體，優(yōu)選的，所述的載體還具有至少一個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。所述的啟動(dòng)子是適合迸行真核表達(dá)的啟動(dòng)子。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的啟動(dòng)子選自EF-la啟動(dòng)子，和/或CMV啟動(dòng)子。其中，所述的啟動(dòng)子1和啟動(dòng)子2可以是相同或不同的。更佳的，所述的啟動(dòng)子l是EF-lci啟動(dòng)子，用于驅(qū)動(dòng)HA的表達(dá)；所述的啟動(dòng)子2是CMV啟動(dòng)子，用于驅(qū)動(dòng)NP的表達(dá)。終止子的設(shè)置是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)。所述的重組載體通常是一種真核載體，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的重組載體是插入了HA基因和NP基因的pBudCE4.1載體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，pBudCE4.1載體特別適合于用于構(gòu)建本發(fā)明的重組載體，作為DNA疫苗。本發(fā)明的DNA疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其可以誘導(dǎo)產(chǎn)生殺傷性T淋巴細(xì)胞，對(duì)病毒、細(xì)菌、寄生蟲所引起的傳染病有重要的預(yù)防作用和潛在的治療作用。它與滅活疫苗等蛋白疫苗產(chǎn)品相比，具有以下非常顯著的特點(diǎn)無(wú)感染危險(xiǎn)、誘發(fā)針對(duì)天然蛋白質(zhì)表位的抗體、誘發(fā)特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞免疫反應(yīng)、長(zhǎng)期持續(xù)的免疫反應(yīng)、穩(wěn)定性不受溫度影響、純化容易，生產(chǎn)成本低、具備預(yù)防和免疫治療雙重功能、定向誘導(dǎo)以Thl為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的DNA疫苗在免疫動(dòng)物后，可同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)HA和NP的抗體，滴度約1:50000左右；對(duì)于HA的肽和NP的肽混合進(jìn)行細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)超過(guò)51%;對(duì)于H5N1滅活病毒進(jìn)行細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)超過(guò)42M。本發(fā)明還提供了一種基因工程化的細(xì)胞(宿主細(xì)胞)，所述的細(xì)胞含有所述的重組載體。大量制備本發(fā)明的重組質(zhì)粒的方法是本領(lǐng)域人員已知的，通常是將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入適合的宿主細(xì)胞中，大量培養(yǎng)細(xì)胞后收集細(xì)胞，然后進(jìn)行質(zhì)粒提取。質(zhì)粒的提取可按照本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)?？蛇x擇的，在提取質(zhì)粒后，對(duì)所獲得的質(zhì)粒進(jìn)行純化，這也可采用本領(lǐng)域常規(guī)的純化技術(shù)。由于所述的重組載體可良好地誘導(dǎo)防御性抗體的產(chǎn)生，只需給予受試者較低劑量的本發(fā)明的重組載體即可具有良好的免疫效果。本發(fā)明的重組載體與單獨(dú)采用攜帶HA基因的載體或攜帶NP的載體相比，產(chǎn)生相同的免疫效果所需的給予的量顯著降低，有效避免了基因浪費(fèi)，提高免疫的效率，且操作簡(jiǎn)易。本發(fā)明還提供了所述的重組載體的用途，用于制備防治(特別是預(yù)防)禽流感的組合物。其還用于制備提高動(dòng)物體內(nèi)的IFN-Y值的組合物。本發(fā)明還提供一種防治禽流感的組合物，所述組合物是指將本發(fā)明的重組載體和藥學(xué)上可接受的載體混合后獲得的可用于防治(特別是預(yù)防)禽流感的組合物。所述"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。對(duì)于疫苗，所述的藥學(xué)上可接受的載體例如包括一種佐劑。在用于給藥時(shí)，通常0.1-10mg/kg體重，較佳的0.5-2mg/kg體重是適合的；優(yōu)選的可進(jìn)行多次給藥，以產(chǎn)生良好的免疫效果，例如可間隔l-3周進(jìn)行重復(fù)給藥。本發(fā)明還提供了一種防治禽流感的藥盒，其中含有所述的組合物，或所述的重組載體。此外，為了方便給藥，所述的藥盒中還可含有注射用的針，和/或藥學(xué)上可接受的載體，和/或使用說(shuō)明書。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l重組疫苗的構(gòu)建以H5Nl病毒(獲自武漢病毒所)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以5TTGCGGCCGCATGGAGAAAATAGT3;和5CCGCTCGAGAGAATGCAAATTCTGC3為引物，擴(kuò)增獲得HA(GenBank登錄號(hào)AY950232)編碼基因，用限制性內(nèi)切酶Notl/XholI酶切后插入到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pBudCE4.1載體(購(gòu)自Invitrogen)上，位于EF-la啟動(dòng)子后，獲得pBudCE4.1-HA(p-HA)。以H5Nl病毒反轉(zhuǎn)獲得的cDNA為模板，以5CCCAAGCTTGATGGCGTCTCAAGGC3;禾卩5CGCGGATCCATTGTCATACTCCTC3為引物，擴(kuò)增獲得NP(GenBank登錄號(hào)AY950253)基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI/HindlII酶切后插入到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pBudCE4.1-HA載體上，位于CMV啟動(dòng)子后，獲得pBudCE4.1-H+N(p-HA+NP，p-H+N)。此外，將NP基因用限制性內(nèi)切酶BamHI/HindlII酶切后插入到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pBudCE4.1載體上，位于CMV啟動(dòng)子后，獲得pBudCE4.1-NP(p-NP)。將前述構(gòu)建的載體常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coliDH5a(購(gòu)自TaKaRa公司)，從而進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化。實(shí)施例2DNA疫苗的大量合成培養(yǎng)轉(zhuǎn)入前述構(gòu)建的直立的E.coliDH5cc，收集菌體，采用德國(guó)QIAGEN公司大抽試劑盒抽提和純化質(zhì)粒，純化獲得的質(zhì)粒作為DNA疫苗。用上述方法獲得的各DNA疫苗的濃度約為1000-2000)ag/ml(表l)。取少量上述獲得的DNA疫苗，酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1A所示。從圖中可以看出，聯(lián)合疫苗經(jīng)過(guò)酶切后可以得到和單價(jià)疫苗p-HA相同的HA片段，也可以得到和單價(jià)疫苗p-NP相同的NP片段。圖lB顯示了pBudCE4.1(Vector)，p-HA，p-NP和p-HA+NP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后蛋白的表達(dá)情況。圖1A-B證明，p-HA+NP的聯(lián)合重組是成功克隆的。各載體(DNA疫苗)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，上述方法培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行質(zhì)粒抽提、純化后，便可用于免疫小鼠。純化得到質(zhì)粒的各項(xiàng)指標(biāo)由Gene-QuantIIRNA/DNACalculator(Biotech公司生產(chǎn))測(cè)量得到(表1)。表1重組表達(dá)載體ABS(吸光值)Ratio(A260/A280)濃度pBudCE4.10.7581.7001999.2ug/mlpBudCE4.1-HA(P隱HA)0.4831.7082677.7iig/mlpBudCE4.1-NP(P-NP)0.2891.7641751.9Pg/mlpBudCE4.1-H+N(p-HA+NP)0.4891.6531291.7iig/ml實(shí)施例3免疫方法與血清的抗體滴度取6-8周齡的Balb/c雌鼠，每只按照50ugDNA疫苗/100u1PBS進(jìn)行免疫，使用小型胰島素注射器注射大腿內(nèi)側(cè)肌肉，進(jìn)針時(shí)針口面朝外慢慢推入，每只大腿注射50ulPBS，拔出針頭后在針孔兩側(cè)以針孔為中心迸行電擊。電極和儀器為ECM830購(gòu)自美國(guó)BTX公司。一共免疫3次，兩次免疫之間的時(shí)間間隔為3周。在免疫第2次或第3次后7天進(jìn)行靜脈取血，將血液在4。C下沉淀24小時(shí)后離心，取上方無(wú)色或淡黃色的血清。H5Nl滅活病毒抗原包被濃度為10ug/mL，一抗為各個(gè)免疫組血清(50iU/孔，1:100起)，二抗用羊抗鼠-HRP檢測(cè)。免疫第2次后7天抗體滴度的情況見圖2，可見聯(lián)合疫苗可以得到高的抗體滴度。進(jìn)一步的驗(yàn)證結(jié)果可以得知，p-HA+NP組可在體內(nèi)得到分別針對(duì)HA和NP的抗體，且所需使用的劑量更低。實(shí)施例4IFN-Y值小鼠經(jīng)各DNA疫苗免疫之后，取脾細(xì)胞(去紅細(xì)胞)在96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，刺激物分別是空、BSA(10ug/ml)、H5N1滅活病毒(10Hg/ml)、ConA(lOyg/ml),在37。C/5。/。C02環(huán)境中剌激48小時(shí)，之后取上清測(cè)定其IFN-Y值。取出ELISA專用板，加入IFN-Y標(biāo)準(zhǔn)品包被液在4t放置過(guò)夜。之后棄去包被液，每孔加200ul封閉液，封好口，室溫放置3小時(shí)。用PBS-TWEEN20洗液洗5minX3次。用稀釋液稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加100ul。封好口，室溫放置2小時(shí)，其中IFN-y標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度為0.00，62.50，125.00，250.00，500.00，1000.00，2000.00，4000.00pg/ml。洗后，稀釋液稀釋生物素化的抗IFN-Y檢測(cè)抗體(購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司)2ug/ml，每孔加100ul(注意要加到底部)。封好口，室溫1小時(shí)。洗后再用稀釋液稀釋親和素辣根過(guò)氧化物酶Av-HRP(購(gòu)自Sigma美國(guó)Sigma公司)h1000，每孔加100iU(注意要加到底部)。封好口，室溫30分鐘(少見光)。最后洗后每孔加100ul底物進(jìn)行顯色。結(jié)果見圖3，圖中BSA作為無(wú)關(guān)抗原，H5N1是主要抗原，刀豆素A(ConA)是陽(yáng)性對(duì)照。HA和NP用于對(duì)照用。橫坐標(biāo)代表的是各個(gè)DNA疫苗的免疫組，縱坐標(biāo)代表的是IFN-Y濃度值。從圖中數(shù)據(jù)可以看出，p-HA+NP疫苗組經(jīng)H5Nl滅活病毒的刺激能夠得到比單價(jià)疫苗更高的IFN-Y值，從而說(shuō)明其可以引起很顯著的Thl方向的反應(yīng)，從而使被免疫的動(dòng)物具備優(yōu)秀的免疫抵抗能力。實(shí)施例5細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)(CTL)按照實(shí)施例3的方法，分別用pBudCE4,l-HA(HA)、pBudCE4.1-NP(NP)、pBudCE4.1-H+N(H+N)免疫6周齡Balb/C雌性小鼠。從Nai'veBalb/C小鼠體內(nèi)分離脾細(xì)胞(去紅細(xì)胞)，將其分成兩部分一部分用HA肽和NP肽以10ug/ml(或病毒以50ixg/ml)的濃度在37。C時(shí)刺激l小時(shí)(或?qū)τ诓《緸榇碳?小時(shí))；另一部分不作處理。之后，將進(jìn)行過(guò)刺激處理的脾細(xì)胞染CFSE(購(gòu)自美國(guó)MolecularProbes公司)5PM，未進(jìn)行過(guò)刺激處理的脾細(xì)胞染CFSE0.5uM。最后將兩部分細(xì)胞以相同的數(shù)量混合，對(duì)已經(jīng)分別免疫過(guò)pBudCE4.1(空載體)、pBudCE4.1-HA、pBudCE4.1-NP或pBudCE4.1-H+N的DNA疫苗的Balb/C小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，每只小鼠2乂107個(gè)細(xì)胞/400111PBS。殺傷4小時(shí)后，取小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞(去紅細(xì)胞)再進(jìn)行流式檢測(cè)。CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2的結(jié)果證明，聯(lián)合疫苗可以得到比單價(jià)疫苗更好的殺傷率，且證實(shí)了其對(duì)于HA和NP肽分別的殺傷作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種重組載體，其特征在于，所述的重組載體含有(1)操作性相連的啟動(dòng)子1，H5N1流感病毒血凝素編碼基因和終止子；和(2)操作性相連的啟動(dòng)子2，H5N1流感病毒核蛋白編碼基因和終止子。2.如權(quán)利要求l所述的重組載體，其特征在于，所述的啟動(dòng)子1或啟動(dòng)子2選自EF-la啟動(dòng)子，和/或CMV啟動(dòng)子；且，所述的啟動(dòng)子1和啟動(dòng)子2相同或不同。3.如權(quán)利要求l所述的重組載體，其特征在于，所述的啟動(dòng)子l是EF-la啟動(dòng)子；所述的啟動(dòng)子2是CMV啟動(dòng)子。4.如權(quán)利要求l所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體是pBudCE4.1載體。5.—種基因工程化的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有權(quán)利要求l所述的重組載體。6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。7.權(quán)利要求l所述的重組載體的用途，其特征在于，所述的重組載體用于制備防治禽流感的組合物。8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于提高動(dòng)物體內(nèi)的IFN-Y值。9.一種防治禽流感的組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的權(quán)利要求l所述的重組載體；和藥學(xué)上可接受的載體。10.—種防治禽流感的藥盒，其特征在于，所述的藥盒中含有權(quán)利要求9所述的組合物，或權(quán)利要求l所述的重組載體。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組載體(DNA疫苗)，所述的重組載體含有操作性相連的啟動(dòng)子1，H5N1流感病毒血凝素(HA)編碼基因，終止子；和操作性相連的啟動(dòng)子2和H5N1流感病毒核蛋白(NP)編碼基因，終止子。本發(fā)明還公開了含有所述重組載體的組合物以及藥盒。文檔編號(hào)A61P31/16GK101575608SQ200810037040公開日2009年11月11日申請(qǐng)日期2008年5月7日優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日發(fā)明者兵孫,靚孫,可徐申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院