專利名稱：：抗家畜亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬免疫學(xué)及遺傳工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種抗AsiaI(亞洲I型)型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：國(guó)際獸醫(yī)局將口蹄疫列為A類傳染病之首?？谔阋呤钱?dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物。多年來，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，Asial型口蹄疫在我國(guó)呈蔓延之勢(shì)，在全國(guó)多個(gè)省市爆發(fā)，對(duì)畜牧業(yè)和畜產(chǎn)品出口造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，日益引起人們的關(guān)注。因此，構(gòu)建有效的亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗對(duì)我國(guó)的畜牧業(yè)及國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重大的意義。預(yù)防接種疫苗是控制該病毒的主要手段之一。在各種預(yù)防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景。與口蹄疫病毒(foot一and—mouthdiseasevirus,FMDV)免疫原性密切相關(guān)的是其外殼蛋白VP1基因，該蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位。在已有的口蹄疫基因工程多肽疫苗的研究中，主要是研究抗0型、A型的口蹄疫病毒，以VP1蛋白中的幾個(gè)不同抗原決定簇位點(diǎn)結(jié)合,構(gòu)建重組多肽疫苗。發(fā)明人前期的實(shí)驗(yàn)研究中，進(jìn)行AsiaI型口蹄疫病毒抗原表位篩選，篩選到在AsiaI型口蹄疫病毒VPl結(jié)構(gòu)蛋白中，存在一個(gè)誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位位點(diǎn)，即為VP1蛋白的133-163氨基酸片段，同時(shí)篩選到在VP2結(jié)構(gòu)蛋白中存在一個(gè)抗原表位位點(diǎn)，即VP2蛋白1-33氨基酸片段，該肽段能明顯增強(qiáng)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體的能力。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建一種有效的對(duì)抗Asial型口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗，組建成VP1(133-163)、VP2(l-33)抗原表位的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)，將該口蹄疫病毒主要抗原表位重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)與一大分子載體蛋白相連，構(gòu)成一融合蛋白，能有效地誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能有效的抗家畜Asial型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法。本發(fā)明已篩選到AsiaI型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸多肽(SEQIDNO.1,記為VP1(133-163))，VP2蛋白1-33位氨基酸多肽(SEQIDN0.2,記為VP2(1-33))，均為抗原表位，將這兩種抗原組成重復(fù)的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，實(shí)施例中為4VP1(133-163)-VP2(卜33)-VP1(133-163)重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)(SEQIDNO.3)，用化學(xué)合成的方法合成該不同抗原表位組成的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的DNA序列片段。并將該口蹄疫病毒主要抗原表位重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)與一大分子載體蛋白相連，構(gòu)成一融合蛋白，即得本發(fā)明的抗亞洲I型口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗。該多肽疫苗中兩種抗原多肽的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)可采用如下結(jié)構(gòu)的任一種方式X—Y—X、X_X—Y、X-Y-Y、Y-X-Y、Y—X—X或者Y-Y-X，其中，同一個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的"X"、"Y"肽段來源于Asial型口蹄疫病毒VPl或VP2蛋白序列，并且"X"肽段代表AsiaI型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸肽段(即VP1(133-163)),"Y"肽段代表VP2蛋白1-33位氨基酸肽段(即VP2(1-63))，"X"、"Y"肽段還可以分別是VP1(133-163)、VP2(1-33))前后浮動(dòng)適當(dāng)個(gè)數(shù)的氨基酸殘基，如VP1蛋白130-170、VP2蛋白1-40位氨基酸肽段；"X"、"Y"肽段中的氨基酸可因預(yù)防不同的口蹄疫病毒變異毒株的需要進(jìn)行調(diào)整，即"X"肽段可以是VP1(133-163)中有1一6個(gè)氨基酸可被置換，"Y"肽段可以是VP2(1-33)中有1一5個(gè)氨基酸可被置換。上述VP1(133-163)、VP2(l-33)的重復(fù)串聯(lián)基因片段與載體蛋白基因相連，融合蛋白的載體蛋白可以是家畜IgG重鏈恒定區(qū)氨基酸序列的同源序列，長(zhǎng)度可以是250-329個(gè)氨基酸；或者是P—半乳糖苷酶從第一個(gè)氨基酸開始共250-590個(gè)氨基酸肽段的同源序列。本發(fā)明分別以家畜igG重鏈恒定區(qū)蛋白或e—半乳糖苷酶蛋白為載體蛋白，將合成的VP1(133-163)、VP2(l-33)抗原多肽重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的DNA序列片段分別插入到上述兩種載體蛋白基因的C端，構(gòu)建兩種不同的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒，分別為pTl和pT2。抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，可以是用化學(xué)合成方法分別合成編碼Asial口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸序列的核苷酸序列，VP2蛋白1_33位氨基酸的核苷酸序列，然后用基因工程克隆方法將這些基因以多拷貝的方式串聯(lián)，組建成AsiaI型口蹄疫病毒抗原多肽基因長(zhǎng)片段?？谔阋卟《净蚬こ潭嚯囊呙绲闹苽浞椒?，包括基因制備、重組及融合蛋白的表達(dá)，其特征在于具體步驟如下(1)用化學(xué)合成方法合成編碼由VP1(133-163)、VP2(l-33)組成的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA序列，將此基因與igG重鏈恒定區(qū)基因或者e—半乳糖苷酶基因c末端相連，構(gòu)成融合基因；(2)將上述融合基因插入表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株；(3)將陽性菌株在3(TC到37'C之間誘導(dǎo)培養(yǎng)8到25小時(shí)，然后收集菌體；(4)將菌體破碎收集表達(dá)的融合蛋白乳化，配制成本發(fā)明多肽疫苗。該抗Asial型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，也可以是融合基因插入到表達(dá)載體以后，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中表達(dá)出融合蛋白，用HiTrap親和層析柱純化回收融合蛋白，再乳化配制成本發(fā)明有關(guān)的多肽疫苗。免疫佐劑可以是任何一種有效的免疫佐劑。包括礦物質(zhì)佐劑和油類佐劑、微生物類佐劑或細(xì)胞因子佐劑等。將本發(fā)明制備的有效抗家畜AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，經(jīng)免疫豚鼠后檢測(cè)到豚鼠產(chǎn)生較高的中和抗體，另外經(jīng)過動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)表明該疫苗在豚鼠上的抗病毒保護(hù)效果達(dá)到100%，免疫豚鼠能全部抵抗劑量為100ID5Asial型口蹄疫病毒得攻擊。本發(fā)明的抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，同樣適用于動(dòng)物如牛、羊、豬以及偶蹄類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物或野生動(dòng)物的免疫接種。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:以牛IgG重鏈恒定區(qū)肽段為載體蛋白構(gòu)建口蹄疫AsiaI型口蹄疫多肽疫苗pTl。合成AsiaI口蹄疫病毒VPl基因中編碼133-163位氨基酸肽段的DNA序列，VP2基因中編碼1-33位氨基酸肽段的DNA序列，將其組建成VPl(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)結(jié)構(gòu)(SEQIDNO.3),其中VPl蛋白133-163氨基酸抗原片段重復(fù)一次，中間連接VP2蛋白1-33氨基酸片段。各個(gè)抗原表位間以含有幾個(gè)氨基酸的接頭連接，氨基酸接頭分別為PG和QFELEFMVPSR。通過化學(xué)合成的方法合成得到VP1(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)串聯(lián)目的基因片段。通過限制性內(nèi)切酶酶切目的基因片段，將該片段與表達(dá)載體連接，構(gòu)建以牛的IgG重鏈恒定區(qū)氨基酸為載體蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒(記為SEQIDNO.4)。在T4ligase等作用下發(fā)生連接反應(yīng)。獲得的重組DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于氨芐青霉素平板中，37'C倒置過夜。隨意挑取轉(zhuǎn)化子，分別以酶切鑒定，DNA測(cè)序分析鑒定轉(zhuǎn)化子，從而獲得陽性克隆。序列分析證明插入的基因序列與設(shè)計(jì)相符。將此克隆命名為pTl。將pTl以含50ug/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，37'C攪拌速度6000rpui通氣培養(yǎng)2小時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)IO小時(shí)后收集菌體。再將菌體懸浮于破壁液中，用95W功率的超聲儀破壁5分鐘，觀察超聲效果可重復(fù)超聲幾次，超聲后5000rpm離心20分鐘收集包涵體。用含8mol/L尿素的變性液處理包涵體，待包涵體完全變性后經(jīng)過HiTrap親和純化柱純化包涵體，收集目的蛋白，將純化后的包涵體與ISA206油配成油乳劑，即可獲得一種新型的AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。實(shí)施例2:以e—半乳糖苷酶從第一個(gè)氨基酸開始共280個(gè)氨基酸肽段為載體蛋白構(gòu)建AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗pT2。實(shí)施例1中，已合成得到VP1(133-163)-VP2(1-33)-VP1(133-163)抗原表位的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的DNA片段，通過PCR特異性擴(kuò)增反應(yīng)改變?cè)揇NA片段兩末端的酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物回收后經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與e—半乳糖苷酶基因的C末端相連接。構(gòu)建AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗表達(dá)載體pT2。以實(shí)施例1中同樣的方法，用pT2制備得AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。用上述基因工程疫苗免疫豚鼠后中和抗體的消長(zhǎng)分別用基因工程苗pTl和pT2免疫豚鼠，結(jié)果見表1和表2。表1中的結(jié)果是基因工程苗pTl和pT2經(jīng)過2次免疫豚鼠6只后，豚鼠的中和抗體消長(zhǎng)結(jié)果，A組為兩次免疫IgG為載體蛋白苗，B組為兩次免疫pTl苗，C組為兩次免疫e一半乳糖苷酶空白載體蛋白，D組為兩次免疫pT2苗，免疫劑量為各組分蛋白單次免疫500第一次免疫14天后進(jìn)行第二次免疫，第二次免疫21天后心臟采血測(cè)定豚鼠血清中和抗體效價(jià)；CK組為陰性對(duì)照組，不免疫任何蛋白；從表l的結(jié)果中說明，用pTl和pT2這兩種苗去免疫豚鼠后，中和抗體均見明顯的增長(zhǎng)，而以igG為載體蛋白的pTi比以e_半乳糖苷酶作為載體蛋白的pT2所引起的中和抗體水平要稍高。表2中的結(jié)果是比較基因工程苗pTl和pT2分別經(jīng)過一次免疫和二次免疫豚鼠后，豚鼠的中和抗體消長(zhǎng)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定免疫豚鼠組為1-5組及ck組，l組為兩次免疫IgG為載體蛋白苗，2組為兩次免疫pTl苗，3組為兩次免疫e—半乳糖苷酶空白載體蛋白，4組為兩次免疫pT2苗，免疫劑量為各組分蛋白單次免疫500ug，第一次免疫14天后進(jìn)行第二次免疫，第二次免疫21天后心臟采血測(cè)定豚鼠血清中和抗體效價(jià)；5組為一次免疫pTl苗，免疫劑量為單次免疫lmg目的蛋白，1次免疫28天后采血測(cè)定中和抗體水平。ck組為不免疫任何疫苗空白對(duì)照組。從表2的結(jié)果中說明，基因工程苗pTl苗分別經(jīng)過l次免疫和2次免疫豚鼠后，中和抗體均有明顯的增長(zhǎng)。表1.二次免疫豚鼠中和抗體效價(jià)測(cè)定每組各只豚鼠血清中和抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.比較一次免疫和二次免疫豚鼠產(chǎn)生中和抗體水平<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1和表2的說明血清中和抗體效價(jià)測(cè)定采用微量血清中和試驗(yàn)，將滅活的血清樣品用MEM培基進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋(1/2-1/512)，每個(gè)稀釋度接4個(gè)孔，每孔50yl，并按同樣方法設(shè)立陰陽血清對(duì)照。每個(gè)孔中加入100TCID5。/50yl的口蹄疫病毒。充分混勻后，37。C中和lh。加入分散好的細(xì)胞懸液體100y1(每孔細(xì)胞數(shù)量在l(T數(shù)量級(jí))微量板加蓋，平放于37t:，5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3天。培養(yǎng)終止時(shí)，甩去微量培養(yǎng)板內(nèi)液體，每孔加入50ul細(xì)胞染色液，染色lh,自來水沖洗。當(dāng)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清對(duì)照都成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果的判讀。采用Reedmuench法計(jì)算中和抗體效價(jià)，效價(jià)采用PDs。表示，即半數(shù)細(xì)胞保護(hù)時(shí)血清稀釋度。用上述基因工程疫苗免疫豚鼠后AsiaI型口蹄疫病毒攻毒結(jié)果為了證明兩種基因工程苗對(duì)豚鼠的保護(hù)效果，分別用lmg的抗原融合蛋白免疫豚鼠。用兩種疫苗免疫豚鼠，免疫組號(hào)與表2的免疫豚鼠組號(hào)相同(具體見表2)。一定時(shí)間后以Asial口蹄疫病毒進(jìn)行攻擊，攻毒劑量為100ID5。，結(jié)果顯示該兩種不同疫苗經(jīng)一次免疫豚鼠后，28天后攻毒，豚鼠的抗病毒保護(hù)效果有70%，而經(jīng)兩次免疫豚鼠后21天攻毒，豚鼠的抗病毒保護(hù)效果均有100%。說明這兩種疫苗在豚鼠上都有很好的抗病毒保護(hù)結(jié)果，是一種有效的抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。(見表3)表3融合蛋白對(duì)豚鼠的免疫保護(hù)效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表SEQIDNO.1KTTYGETTARRG薩ALAQRLSGRLPTSFNYSEQIDNO.2DKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTSEQIDNO.3SRKTTYGETTARRG腿ALAQRLSGRLPTS麗SEQIDNO.4IgG-VPl(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)SEQIDNO.5LacZ-VPl(133-163)_VP2(1-33)-VPl(133-163)權(quán)利要求1、一種抗家畜亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，其特征在于以亞洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白中133-163位氨基酸，VP2蛋白中1-33位氨基酸為抗原表位，前者記為VP1(133-163)，序列為SEQIDNO1，前者記為VP2(1-33)，序列為SEQIDNO2，將這兩個(gè)抗原表位組成重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)，化學(xué)合成該重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的基因片段；將該重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的基因片段與載體蛋白基因相連，該載體蛋白是家畜自體IgG或細(xì)菌的β—半乳糖苷酶，口蹄疫病毒重復(fù)串聯(lián)抗原表位基因連接在載體蛋白基因的C末端，構(gòu)成一融合蛋白；其中所述抗原表位的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)形式為X—Y—X、X—X—Y、X-Y-Y、Y-X-Y、Y—X—X或者Y-Y-X，同一個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的“X”、“Y”肽段分別來源于AsiaI型口蹄疫病毒VP1和VP2蛋白序列，并且“X”肽段代表VP1(133-163)，“Y”肽段代表VP2(1-33)；或者“X”、“Y”肽段分別是VP1(133-163)和VP2(1-33)中前后浮動(dòng)適當(dāng)個(gè)數(shù)的氨基酸殘基的肽段。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于融合蛋白的載體蛋白是家畜IgG重鏈恒定區(qū)氨基酸序列的同源序列，長(zhǎng)度是250-329個(gè)氨基酸；或者是e—半乳糖苷酶從第一個(gè)氨基酸開始共250-590個(gè)氨基酸肽段的同源序列。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于"X"、"Y"肽段中的氨基酸進(jìn)行如下調(diào)整"X"肽段中有1一6個(gè)氨基酸被置換，"Y"肽段中有1一5個(gè)氨基酸被置換。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于所述抗原表位的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)形式為VP1(133-163)-VP2(1-33)-VP1(133-163)，該重復(fù)串聯(lián)片段基因序列編碼的重復(fù)抗原多肽氨基酸序列為SEQIDNO.3,載體蛋白為動(dòng)物自體IgG重鏈恒定區(qū)蛋白，其構(gòu)建的串聯(lián)基因結(jié)構(gòu)序列為SEQIDNO.4;載體蛋白為e—半乳糖苷酶，其構(gòu)建的串聯(lián)基因結(jié)構(gòu)序列為SEQIDNO.5。5、根據(jù)權(quán)利要求1中所述的多肽疫苗，其特征在于所用免疫佐劑為礦物質(zhì)佐劑、油類佐劑、微生物類佐劑或細(xì)胞因子佐劑。6、如權(quán)利要求1所述的亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，其特征在于是用化學(xué)合成方法或PCR體外特異性擴(kuò)增方法合成編碼亞洲I口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸序列的核苷酸序列，VP2蛋白l-33位氨基酸的核苷酸序列，然后用基因工程克隆方法將這些基因以多拷貝的方式串聯(lián)，組建成亞洲I型口蹄疫病毒抗原多肽基因長(zhǎng)片段。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，包括基因制備、重組及融合蛋白的表達(dá)，其特征在于具體步驟如下(1)用化學(xué)合成方法合成編碼由VP1(133-163)和VP2(1-33)組成的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA序列，將此基因與IgG重鏈恒定區(qū)基因或者e—半乳糖苷酶基因相連，構(gòu)成融合基因；(2)將上述融合基因插入表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株；(3)將陽性菌株在3(TC到37'C之間培養(yǎng)8到25小時(shí)，然后收集菌體；(4)將菌體破碎收集表達(dá)的融合蛋白；(5)將融合蛋白純化，并乳化配制成本發(fā)明有關(guān)的多肽疫苗。全文摘要本發(fā)明屬于免疫學(xué)與遺傳工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種抗家畜亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法。本疫苗利用亞洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白中133-163位氨基酸這一B細(xì)胞表位，以及VP2蛋白中1-33位氨基酸的T細(xì)胞表位，用化學(xué)方法合成編碼這兩種抗原表位基因組成的重復(fù)串聯(lián)基因序列，將這一串聯(lián)重復(fù)基因序列分別插入牛IgG重鏈恒定區(qū)基因的C末端，或β-半乳糖苷酶基因的C末端構(gòu)建兩種表達(dá)載體，經(jīng)發(fā)酵后分別表達(dá)兩種融合蛋白，超聲并純化后制備成疫苗，檢測(cè)該兩種疫苗的安全性及對(duì)動(dòng)物的免疫保護(hù)作用，經(jīng)動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)證明兩種疫苗對(duì)豚鼠有良好的保護(hù)效果，免疫豚鼠100％抵抗100ID₅₀劑量的AsiaI型口蹄疫病毒攻擊。文檔編號(hào)A61K47/48GK101422606SQ20081003656公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年4月24日優(yōu)先權(quán)日2008年4月24日發(fā)明者嚴(yán)維耀,劉明秋,王加龍,鄭兆鑫,姬韓申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)