專利名稱：用于生產(chǎn)生長抑素亞單位疫苗的基因工程體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用于生產(chǎn)生長抑素亞單位疫苗的基因工程體，屬于生物技術(shù)高科技研究領(lǐng)域，專用于生產(chǎn)生長抑素亞單位疫苗的基因工程。
動(dòng)物生長除受遺傳因素、飼料和環(huán)境條件等因素外，同時(shí)受一系列生長軸激素的調(diào)控。其中生長激素(GH)起著核心的作用。而GH又受生長激素釋放因子(GRF)和生長抑素(SS)的雙向調(diào)控；前者促進(jìn)釋放，后者抑制釋放。早在80年代初期，Spencer等(1981、1986)、Lawrence等(1996)用SS偶聯(lián)于蛋白質(zhì)載體上，做成SS合成肽疫苗，用以免疫羊、牛、豬等，取得5～10％的增重效果。但他們用的都是合成肽疫苗，成本頗高，難以推廣應(yīng)用。
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)杜念興教授自1986年開始主持農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)課題“生長抑素因素工程疫苗研究”，先后由曾義祥等(1989)、莫曉群等(1991)完成由大腸桿菌和昆蟲桿狀病毒表達(dá)的二種SS基因工程疫苗，但由于表達(dá)水平太低，而未能開發(fā)應(yīng)用。徐文忠等(1992)進(jìn)一步將SS基因，連接于乙肝表面抗原(HbsAg)上，在痘苗病毒中表達(dá)，用以制備SS基因工程活載體疫苗，其表達(dá)產(chǎn)物SS/HBsAg融合蛋白，能組裝成大小20nm左右的病毒樣顆，具有良好的免疫原性?，F(xiàn)已由國家科委生物工程開發(fā)中心立項(xiàng)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)與農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)成都藥械廠合作進(jìn)行中試。該疫苗簡(jiǎn)稱激生1號(hào)疫苗，至1999年2月止已試生產(chǎn)激生1號(hào)雞胚凍干疫苗11批，發(fā)出進(jìn)行田試驗(yàn)的11000頭劑。經(jīng)返回信息豬2213頭、羊2096頭、牛55頭。結(jié)果表明，該疫苗給豬、羊、牛免疫均十分安全，未見有不良反應(yīng)。個(gè)別豬場(chǎng)進(jìn)行屠宰測(cè)定，證明免疫豬肉質(zhì)優(yōu)良，各種組份與對(duì)照豬無差異。豬免疫1次可持續(xù)增重2～3個(gè)月，增重自5～20％不等，平均在10％以上。
所有在豬和羊的試驗(yàn)中均反映以免疫后第2個(gè)月增重最快。第3個(gè)月已有下降趨勢(shì)。因此提出在初免后，2個(gè)月時(shí)應(yīng)加強(qiáng)免疫。
激生1號(hào)疫苗是一種以痘苗病毒為載體的活苗，不適于作加強(qiáng)免疫之用。
本發(fā)明的目的是構(gòu)建能高效表達(dá)SS融合蛋白的基因工程菌，用以生產(chǎn)能促進(jìn)家畜生長的SS基因工程亞單位疫苗(新的激生系列疫苗)。這一新的激生疫苗優(yōu)于目前正在中試的激生1號(hào)疫苗之處在于1)由大腸桿菌表達(dá)，適于大規(guī)模機(jī)械化生產(chǎn)，成本低廉；2)可用于多次加強(qiáng)免疫，以進(jìn)一步提高免疫效果；適用于生長期較長的肉?；蛉榕！⑷檠蛞蕴岣呷楫a(chǎn)量；3)除適用于各種家畜外，還適用于各種家禽，給蛋禽免疫可增加蛋產(chǎn)量。
本發(fā)明所提供的用于生產(chǎn)生長抑素亞單位疫苗的基因工程體，是通過以下實(shí)施方案獲得的先合成兩端含有Kph I(K)和Pst I(P)酶切位點(diǎn)的SS基因，將其插入pThioHis A質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-K/P質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，獲得能表達(dá)SS-K/P融合蛋白的工程菌；然后再從SS-K/P質(zhì)粒，用Kpn I(K)和Nsi I(N)切出SS基因，將其插入pThioHis質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-K/N質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-K/N融合蛋白的工程菌；再從SS-K/N質(zhì)粒，用Nco I(N)和Sac 1(S)將SS基因切出，將其插入PET 32a質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-N/X質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-N/X融合蛋白的工程菌；同樣從SS-K/N質(zhì)粒，用Nco I(N)和Sac I(S)將SS基因切出，將其插入PET-32C質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-N/S質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-N/S融合蛋白的工程菌；從SS-K/N質(zhì)粒，用Bam HI(B)和Xho I(X)將SS基因切出，將其插入PT7ZZa質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-B/X質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-B/X融合蛋白的工程菌；再從SS-K/N質(zhì)粒，用Bam HI(B)和Eco RI(E)將SS基因切出，將其插入PT7ZZa質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得能表達(dá)SS-B/E融合蛋白的工程菌。
SS是由10個(gè)氨基酸組成的短肽，共遺傳保守性很強(qiáng)，各種鳥類和哺乳動(dòng)物之間無種屬差異。因其分子量較小，必需與載體蛋白連接形成SS-載體融合蛋白才有免疫原性。因此只須構(gòu)建能高效表達(dá)，即可用其表達(dá)產(chǎn)物制備SS亞單位疫苗，用于各種家畜和家禽的免疫。
本發(fā)明選擇表達(dá)系統(tǒng)和最佳的插入位點(diǎn)是技術(shù)關(guān)鍵，為保證研究目標(biāo)的順利完成，采用了pThioHis、PET32和PT7Za 3個(gè)大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)，每個(gè)系統(tǒng)用2個(gè)插入位點(diǎn)，共構(gòu)建6個(gè)可供選擇的工程菌。
本發(fā)明還進(jìn)一步研制了適用于多次免疫的SS基因工程亞單位苗。經(jīng)2年努力，已構(gòu)建了3個(gè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，每個(gè)表達(dá)系統(tǒng)用2種插入位點(diǎn)，共獲得6株高效表達(dá)的工程菌，其中PET32c表達(dá)系統(tǒng)的SS-N/S和SS-N/X2個(gè)工程菌表達(dá)水平均在30％左右。用SS-N/S和SS-N/X融合蛋白制成SS基因工程亞單位疫苗。分別免疫小鼠做實(shí)驗(yàn)小試；以載體蛋白(硫氧還蛋白)和生理苗水作對(duì)照。每組公母各10頭，每周稱重至第11周結(jié)束。結(jié)果對(duì)母鼠，這二種融合蛋白分別比硫氧還蛋白對(duì)照提高10.3％和15.6％；比生理鹽水對(duì)照提高30.5％和36.9％。激生1號(hào)疫苗對(duì)小鼠免疫效果不明顯。用SS-32C融合蛋白疫苗免疫仔豬，3個(gè)月可提高增重7.2％。免疫妊娠母豬，所產(chǎn)仔豬28日齡時(shí)體重比對(duì)照母豬所產(chǎn)仔豬增重19.6％，44日齡提高增重18％。用以免疫母羔羊，58天時(shí)，比接種硫氧還蛋白對(duì)照母羔羊增重15.6％，90天時(shí)，提高增重28.2％。


圖1重組質(zhì)粒SS-K/P的構(gòu)建圖2重組質(zhì)粒SS-K/N的構(gòu)建圖3重組質(zhì)粒SS-N/X構(gòu)建圖4重組質(zhì)粒SS-N/S的酶切鎦定圖5重組質(zhì)粒SS-B/X的構(gòu)建圖6重組質(zhì)粒SS-B/E的構(gòu)建圖7SS-N/X融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)后不同時(shí)間表達(dá)結(jié)果電泳圖泳道1 誘導(dǎo)后0h泳道4 誘導(dǎo)后2h泳道2 誘導(dǎo)后0.5h 泳道5 誘導(dǎo)后3h泳道3 誘導(dǎo)后1h泳道6 誘導(dǎo)后4h圖8SS-N/S融合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)硫氧還蛋白(紫色)SS(紅色) 連接部分(橙色)圖9SS-N/X融合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)尾部(黃色) 硫氧還蛋白(橙色) SS(紅色) 連接部分和尾部(綠色)實(shí)施例；1.PthioHis SS-K/P重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.1SS基因合成以天然SS的基因序列為標(biāo)準(zhǔn)，將大腸桿菌使用頻率較低的4個(gè)密碼子(AAG、ACT、ACA和TGT)分別更換成使用頻率較高的密碼子(AAA、ACC和TGC)；并在SS基因的兩端設(shè)計(jì)Kpn I和Pst I 2個(gè)酶切位點(diǎn)，以便插入，設(shè)計(jì)如下；SS基因序列5′ CC ATG GCT GGC TGC AAA AAC TTC3′ CAT GGG TAC CGA CCG ACG TTT TTG AAGTTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC CTG CA3′AAG ACC TTT TGG AAG TGG AGG ACG G5′由中科院植生所基因合成室協(xié)助合成，并經(jīng)PAGE純化。2條合成的單鏈DNA按常規(guī)方法等摩爾混合，置90℃水浴中，自然冷卻至室溫退火，即成兩端有粘性末端的SS基因。
1.2SS基因克隆1.2.1表達(dá)系統(tǒng)來源pThioHis(His-Patch Thio Fusion TM)表達(dá)系統(tǒng)及Top10菌株購自Invitrogen Corporation，USA。
1.2.2pThioHis A質(zhì)粒的提取參照[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》上介紹的方法進(jìn)行。
1.2.3pThioHis質(zhì)粒的酶切與回收取適量pThioHis A質(zhì)粒進(jìn)行Kpn I/PSTI(以下簡(jiǎn)稱K/P)雙酶切，0.7％的瓊脂糖電泳回收酶切大片段，并用膠回收試劑盒純化回收的大片段質(zhì)粒。
1.2.4SS基因與質(zhì)粒載體pThioHisA的連接與轉(zhuǎn)化因合成的SS基因片段末端無磷酸不能自連，為了提高連接效率，按摩爾數(shù)之比載體/插入片段＝1/100的比例相混合，用T4連接酶于16℃恒溫水浴中連接過夜，連接體積10μl。次日取2～3μl連接液轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞的制備與連接方法均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》中的操作方法進(jìn)行)。此轉(zhuǎn)化的大腸桿菌即SS-K/P克隆株。(圖1)1.2.5SS-K/P克隆株的酶切鑒定在上述DH5a氨芐平板上挑選8株大小適中的轉(zhuǎn)化菌落，用堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，0.7％的瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒大小，挑取與空載體質(zhì)粒大小類似的質(zhì)粒進(jìn)行Nco I單酶切鑒定，對(duì)有此位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行Kpn I和Pst I雙酶切，(然后加2μl 0.8M PH8.0的Tris緩沖液及1μl Pst I繼續(xù)酶切2h)，酶切混合物用12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定[參照A.Harwood(1996)的方法進(jìn)行]。電泳完畢后將膠置于0.5μg/ml的EB染液中染色30～50，紫外燈下觀察結(jié)果在該泳道的相應(yīng)位置上有1條核酸帶，證實(shí)所得到重組質(zhì)粒含有插入的SS基因。
1.2.6SS-K/P克隆株的序列測(cè)定挑選一株經(jīng)酶切鑒定后基本正確的重組菌和合成的基因一起送寶生物工程(大連)有限公司幫助進(jìn)行序列測(cè)定。上述經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定正確的克隆株，系用于克隆基因保存和擴(kuò)增重組質(zhì)粒之用，一般基因工程實(shí)驗(yàn)室多保存重組質(zhì)粒，表達(dá)前重新轉(zhuǎn)化用于高效表達(dá)的Top 10等感受態(tài)大腸桿菌。
2.pThioHis SS-K/N重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.1SS基因片段的制備從上述SS-K/P質(zhì)粒中，用Kpn I和Pst I雙酶切出SS基因，參照Adrian J.Harwood(1996)介紹的方法，電泳回收此DNA片段。
2.2pThioHisA質(zhì)粒的酶切片段制備用堿裂解法小量制備質(zhì)粒pThioHisA，利用Pst I酶切末端可與Nsi I酶切末端互補(bǔ)的特點(diǎn)，用Kpn I和Nsi I雙酶切質(zhì)粒pThioHisA，0.7％瓊脂糖電泳回收酶切大片段，用膠回收試劑盒回收、純化K/N酶切大片段，并取樣電泳檢查回收DNA的質(zhì)量。
2.3SS-K/N的克隆與鑒定按載體/插入段段＝1/3的比例將純化的pThioHisA K/N片段與純化的SS片段相混合，在10μl的反應(yīng)體系，16℃恒溫水浴中用T4 DNA連接酶連接14h，取2～3μl連接液轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，擴(kuò)增細(xì)菌，提取質(zhì)粒，用Nco I單酶切檢查是否存在該酶切位點(diǎn)(注Nco I是合成SS基因時(shí)帶上的一個(gè)酶切位點(diǎn)，而載體中無此酶切位點(diǎn)，故可用此酶來鑒定SS基因的存在)。此質(zhì)粒即SS-K/N。(圖2)3.PET 32a SS-N/X重組質(zhì)粒的構(gòu)建3.1表達(dá)系統(tǒng)來源PET32表達(dá)系統(tǒng)購自Novagen公司。BL21、BL21(DE3)和BL21(DE3)Plys菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
3.2基因片段的制備用Nco I/Xho I(簡(jiǎn)稱N/X)雙酶切質(zhì)粒SS-K/N，PAGE電泳，膠回收66bp的酶切小片段，用膠“壓碎與浸泡”法回收并純化小片段DNA。該小片段DNA即為要插入的含有SS的基因片段。
3.3PET-32a克隆載體的制備用Nco I/Xho I雙酶切載體質(zhì)粒PET-32a，0.7％的瓊脂糖電泳回收酶切大片段，膠回收試劑盒純化膠回收的DNA，即為待克隆的載體DNA。
3.4SS-N/X質(zhì)粒的構(gòu)建將純化的SS DNA插入片段與載體DNA按3∶1(摩爾比)的比例相混合，用T4連接酶于16℃水浴中連接過夜，次日轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(圖3)。第3天挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，37℃搖床中擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，用N/X雙酶切鑒定是否存在插入的SS小片段DNA。(圖3)4.PET32C SS-N/S重組質(zhì)粒的構(gòu)建4.1SS基因的制備用Nco I/Sal I(簡(jiǎn)稱N/S)雙酶切質(zhì)粒SS-K/N，PAGE電泳，膠回收104bp的小片段，用膠“壓碎與浸泡”法回收并純化含SS的小片段DNA。
4.2PET-32c克隆載體的制備用N/S雙酶切PET-32c質(zhì)粒DNA，0.7％的瓊脂糖電泳回收酶切大片段DNA，用膠回收試劑盒純化載體酶切大片段。
4.3SS-N/S質(zhì)粒的構(gòu)建將純化的SS-N/S酶切小片段與PET-32c N/S酶切大片段按3∶1(摩爾比)的比例混合，按同1.3.3同樣的方法鑒定出含SS插主基因的重組質(zhì)粒SS-N/S。(圖4)5.PT7ZZa SS-B/X重組質(zhì)粒的構(gòu)建
5.1表達(dá)系統(tǒng)來源PT7ZZ表達(dá)系統(tǒng)；購自Royal Institute of Technology，Sweden菌種DH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。
5.2SS基因的制備用BamH I/Xho I(B/X)和BamH I/EcoR I(B/E)分別雙酶切質(zhì)粒SS-K/N，PAGE電泳，膠回收95bp和106bp的小片段DNA，用膠“壓碎與浸泡”法回收并純化小片段DNA(Harwood，1996)。這兩種小片段DNA即為要插入的含有SS基因的DNA片段。
5.3PT7ZZa克隆載體的制備分別為B/X和B/E雙酶切載體質(zhì)粒PT7ZZa，0.7％的瓊脂糖電泳回收酶切大片段，用膠回收試劑盒純化膠回收的DNA，即可分別得到待克隆的載體DNA-B/X和DNA-B/E。
5.4SS-B/X和SS-B/E質(zhì)粒的構(gòu)建分別將純化的SS-B/X和SS-B/E DNA插入片段與相應(yīng)載體DNA按3∶1(摩爾比)的比例相混合，用T4 DNA ligase于16℃水浴中連接過夜，次日轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，第3天挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，37℃搖床中擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，分別用B/X和B/E雙酶切鑒定是否存在插入的SS小片段DNA。(圖5、圖6)本發(fā)明所提供的工程體SS融合蛋白表達(dá)如下1.pThioHis系統(tǒng)SS-K/P和SS-K/N克隆株的表達(dá)1.1SS-K/P和SS-K/N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌取大腸桿菌Top 10菌種劃LB平板，挑大小適中的單菌落做感受態(tài)細(xì)胞，將經(jīng)鑒定帶有SS基因的上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，獲得2株能高效表達(dá)的工程菌。
1.2 SS-K/P和SS-K/N融合蛋白的表達(dá)參照His-Patch ThioFusioTMExpressionSystem操作手冊(cè)中的方法進(jìn)行。挑取大小適中的SS-K/P新轉(zhuǎn)化菌落于3ml LB中，37℃搖床中過夜(轉(zhuǎn)速250rpm，下同)，次日按5％的量接種于含30ml LB的150ml的三角瓶中，于37℃搖床中擴(kuò)增至OD600達(dá)0.5時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。并分別于誘導(dǎo)時(shí)和誘導(dǎo)后0.5、1、2、3、4、5h時(shí)取樣進(jìn)行10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。具體方法按Hermann Schagger等(1987)報(bào)道的(Tricine-Sodium電泳緩沖系統(tǒng))方法進(jìn)行。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)(R250)染色，脫色后用凝膠灰度掃描儀測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)含量。
2.PET 32系統(tǒng)SS-N/X和N/S克隆株的表述2.1SS-N/X表達(dá)菌株的構(gòu)建將鑒定正確的SS-N/X和SS-N/S質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)Plys感受態(tài)細(xì)胞，所得轉(zhuǎn)化菌株即為表達(dá)用菌株。
2.2SS-N/X融合蛋白的表達(dá)取單個(gè)新鮮轉(zhuǎn)化菌落于含3ml LB培養(yǎng)基的試管中擴(kuò)增菌種(37℃搖床中過夜)，次日轉(zhuǎn)接于含30ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃搖床中培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5～0.6時(shí)，加入0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。分別于誘后0、0.5、1、2、3、4h時(shí)取樣0.5ml，離心，棄上清，沉淀加20ul ddH2O懸浮，再加等量2X上樣緩沖液，混勻，100℃水浴3～5min，離心后按7ul/孔的量上樣，進(jìn)行10％的SDS-PAGE電泳。電泳完畢后用考馬斯亮蘭染色，再經(jīng)脫色后用凝膠成像處理系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度掃描。全泳道掃描測(cè)定表達(dá)目的蛋白與總蛋白之比；目的蛋白條帶掃描，比較目的蛋白條帶間的相對(duì)含量。(圖7)3.PT7ZZa系統(tǒng)SS-B/X和SS-B/E克隆株的表達(dá)3.1SS-B/X和SS-B/E表達(dá)菌株的構(gòu)建將鑒定正確的SS-B/X和SS-B/E質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，所得轉(zhuǎn)化菌株即為表達(dá)用菌株。
3.2SS-B/X和SS-B/E融合蛋白的表達(dá)分別取單個(gè)新鮮轉(zhuǎn)化菌落于含3ml LB培養(yǎng)基的試管中擴(kuò)增菌種(37℃搖床中過夜)，次日轉(zhuǎn)接于含30ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃搖床中培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5～0.6時(shí)，加入0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。分別于誘后0、0.5、1、2、3、4h時(shí)取樣0.5ml，離心，棄上清，沉淀加20ul ddH2O懸浮，再加等量2倍濃度上樣緩沖液，混勻，100℃水浴3～5min，離心后按7ul/孔的量上樣，進(jìn)行10％的SDS-PAGE電泳。電泳完畢后用考馬斯亮蘭染色，再經(jīng)脫色后用凝膠成像處理系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度掃描。全泳道掃描測(cè)定表達(dá)目的蛋白與總蛋白之比；目的蛋白條帶掃描，比較目的蛋白條帶間的相對(duì)含量。
結(jié)果分析1.6株能高效表達(dá)的重組質(zhì)粒成功地構(gòu)建了3個(gè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，2個(gè)插入位點(diǎn)共6株表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)雙酶鑒定和序列測(cè)定，證實(shí)插入已正確。質(zhì)粒經(jīng)保存后，多次轉(zhuǎn)化大腸桿菌，均能穩(wěn)定表達(dá)，穩(wěn)定性好。見表1表1 表達(dá)SS融合蛋的6株重組質(zhì)粒
—未做2.影響SS融合蛋白表達(dá)的因素和基因表達(dá)的最適條件2.1最佳表達(dá)培養(yǎng)基的選擇分別選擇LB、2YT和TB三種常用培養(yǎng)基對(duì)SS-K/P進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)，菌種擴(kuò)增和誘導(dǎo)后培養(yǎng)均在37℃搖床中進(jìn)行。誘導(dǎo)時(shí)OD600分別為0.5138，0.4167和0.6383。誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)3h結(jié)束，并分別取等量樣品上10％SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后，用凝膠灰度掃描儀對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行相對(duì)含量測(cè)定。
結(jié)果顯示，SS-K/P融合蛋白在TB培養(yǎng)基中表達(dá)效果最好，LB居中，2YT培養(yǎng)基表達(dá)效果最差。從培養(yǎng)基的營養(yǎng)水平來看，TB＞2YT＞LB，但在2YT中菌體的生長速度和表達(dá)產(chǎn)量均較低，提示該培養(yǎng)基不適合Top 10菌株的生長和表達(dá)。TB培養(yǎng)基與另兩種培養(yǎng)基相比突出的表現(xiàn)在酵母提取物用量較高(24g/L)，另外還添加了甘油和磷酸鹽緩沖液，這種配方使?fàn)I養(yǎng)成份更加全面豐富。另外還有一個(gè)重要的有利于重組菌生長和表達(dá)的原因甘油作為碳源在代謝過程中不易產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞生長和表達(dá)有嚴(yán)重?fù)p害作用的乙酸鹽，但可產(chǎn)生酸，中和了蛋白胨代謝產(chǎn)NH+4造成的PH升高，使PH保持相對(duì)穩(wěn)定，有利于細(xì)胞的生長和蛋白的表達(dá)。
2.2最佳誘導(dǎo)OD600值的選擇表達(dá)菌株培養(yǎng)后，以生長后細(xì)菌混度(OD600)為指標(biāo)，工程菌(SS-K/P)接種后于30℃搖床中培養(yǎng)至不同的OD600值時(shí)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后置37℃搖床中繼續(xù)培養(yǎng)4h結(jié)束。按同樣的方法設(shè)一pThioHis A載體對(duì)照。最后各組樣品統(tǒng)一上10％的SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)(R250)染色，脫色后，用凝膠灰度掃描儀全泳道掃描測(cè)定表達(dá)目的蛋白與總蛋白之比；目的蛋白條帶掃描，比較目的蛋白條帶間的相對(duì)含量。
結(jié)果SS-K/P-硫氧還蛋白和SS-K/N-硫氧還蛋白均在OD6000.4～1.4之間的不同時(shí)間誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)產(chǎn)量無明顯的影響，但以O(shè)D600在0.5～0.6左右時(shí)誘導(dǎo)為最佳。與載體pThioHisA中硫氧還蛋白的表達(dá)量相比，SS-K/P和SS-K/N2種融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)量稍低一些。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果還看出，OD600值在0.4～1.4的一個(gè)較廣的范圍內(nèi)用IPTG誘導(dǎo)，SS融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)量并無太大的變化，提示對(duì)OD600值的要求并不太嚴(yán)格。但以O(shè)D600值在0.5～0.6之間誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)量為最高，提示這一OD值應(yīng)視為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
2.3IPTG誘導(dǎo)后最佳收獲時(shí)間的選擇當(dāng)工程菌在LB培養(yǎng)基上，37℃搖床培養(yǎng)至OD5.0～6.0用1mM IPTG誘導(dǎo)后不同時(shí)間收獲，電泳后用滅變掃描法測(cè)表達(dá)蛋白的相對(duì)含量，結(jié)果SS-K/P和SS-K/N均在IPTG誘導(dǎo)后4h表達(dá)量最高，在4～5h基本保持穩(wěn)定，SS-N/X和SS-N/S均在誘導(dǎo)后3h達(dá)高峰，5h后稍有下降。SS-B/X和SS-BE亦已誘導(dǎo)后2～3h達(dá)最高。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，雖然SS-硫氧還蛋白融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)2h以后與總蛋白的比值增長較為緩慢，但單位體積中融合蛋白的絕對(duì)量卻仍有明顯的增長，至4h時(shí)方達(dá)高峰，5h時(shí)稍有下降。因此，IPTG誘導(dǎo)后4h(37℃)應(yīng)為最佳收獲菌作時(shí)間。
2.4IPTG和乳糖最適誘導(dǎo)劑量取8個(gè)內(nèi)盛40ml LB培養(yǎng)基的200ml三角瓶，按2％的量接種新鮮培養(yǎng)SS-N/S表達(dá)菌種，37℃搖床中培養(yǎng)至OD6000.5～0.6時(shí)，分別用1Mm、0.5mM、0.1mM、0.05mM的IPTG和2％、1％、0.5％的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后分別取樣0.5ml菌體。用乳糖誘導(dǎo)的3個(gè)組再繼續(xù)培養(yǎng)4h(共8h)，然后取出，分別取樣0.5ml菌體。處理后，電泳，并進(jìn)行條帶灰度掃描。
結(jié)果顯示IPTG在1～0.05mM對(duì)SS融合蛋白表達(dá)產(chǎn)量的影響并不太大，但單位體積內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)量以0.5mM時(shí)為最高。乳糖誘導(dǎo)的效果明顯低于IPTG，以2％乳糖誘導(dǎo)效果最好，可達(dá)0.05mMIPTG誘導(dǎo)結(jié)果的74％。將乳糖誘導(dǎo)的時(shí)間延長至8h可顯著提高乳糖誘導(dǎo)的效果，2％的乳糖可達(dá)到同IPTG同樣的誘導(dǎo)效果，1％和0.5％的乳糖也可接近IPTG的誘導(dǎo)效果。0.05mM完全可以達(dá)到有效的誘導(dǎo)效果。
2.5低溫培養(yǎng)對(duì)SS融合蛋白表達(dá)的影響SS-N/X和SS-N/S在26℃和30℃條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)后6h菌體，超聲裂解，離心后沉淀恢復(fù)到原體積，上清與沉淀取等量樣品，用10％SDS-PAGE測(cè)定，條帶用灰度掃描定量。先設(shè)定同種蛋白中某一條帶的光密度值為100，對(duì)其他條帶進(jìn)行相對(duì)定量，再將其換算成超聲裂解原液中可溶性蛋白(上清中)與包涵體蛋白所占百分比。在26℃條件下表達(dá)，SS-N/S可溶性融合蛋白占39.8％，不可溶性融合蛋白占60.2％；而SS-N/X融合蛋白的不可溶部分僅占24.1％，可溶性蛋白達(dá)到75.8％。顯示SS-N/X融合蛋白的水溶性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SS-N/S融合蛋白。30℃的低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)，SS-N/X融合蛋白主要為可溶性的，占75.8％沉淀中僅占24.2％；而SS-N/S融合蛋白則主要以包涵體的形式存在，包涵體占81.1％，而可溶性蛋白僅占18.9％；32℃載體所表達(dá)的硫氧還蛋白則居二者中間，可溶性蛋白與包涵體蛋白幾乎等比例出現(xiàn)。在此溫度下誘導(dǎo)，SS-N/S還可超量表達(dá)，SS-N/S融蛋白的表達(dá)量可達(dá)總菌體蛋白的40.9％。
3.對(duì)SS基因工程亞單位苗6株候選克隆株的評(píng)估3.1pThioHis系統(tǒng)的SS-K/p和SS-K/n的開發(fā)前景SS-K/P和SS-K/N2種融合蛋白主要為水溶性蛋白，沉淀中幾乎不存在該蛋白。良好的水溶性有利SS形成正確的空間結(jié)構(gòu)，即有利于抗原決定簇的形成。超聲裂解上清液中SS抗原性的測(cè)定結(jié)果顯示，SS-K/P和SS-K/N兩種融合蛋白均有很強(qiáng)的抗原性，說明SS的抗原決定簇是暴露在融合蛋白表面的，可推測(cè)用該融合蛋白免疫動(dòng)物應(yīng)具有良好的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗SS的抗體。另外，該融合蛋白水溶性好也為對(duì)該融合蛋白進(jìn)行提取純化和疫苗制備提供了方便條件。
3.2PET32系統(tǒng)的SS-N/S和N/X的開發(fā)前景本系統(tǒng)的2個(gè)克隆株因其表達(dá)水平高，因而是SS亞單位苗的首選的候選株，但二者均能形成包涵體，水溶性較差。按一般規(guī)律，降低溫度可提高融合蛋白的水溶性，但我們的多次表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明，在較低溫度(26℃～30℃)下表達(dá)時(shí)PET-32a表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的SS-N/X融合蛋白水溶性增加較為明顯，而PET-32C表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的SS-N/S融合蛋白的水溶性增加并不明顯，而且空載體32C本身所表達(dá)的硫氧還蛋白也有近一半為包涵體表達(dá)。這說明SS-N/S融合蛋白的性質(zhì)受溫度的調(diào)控較小，而主要與表達(dá)系統(tǒng)本身的性質(zhì)有關(guān)。但在低溫下SS-N/S可超量表達(dá)SS融合蛋白，其表達(dá)量可達(dá)菌體蛋白的40.94％。超量表達(dá)是宿主菌在多種條件都適宜的情況下，對(duì)目的蛋白表達(dá)水平的一種最佳發(fā)揮，在一般情況下是很難達(dá)到的。低溫有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定，可能同時(shí)也有利于宿主菌各種生理功能的協(xié)調(diào)發(fā)揮。如果能把這一超量表達(dá)條件穩(wěn)定下來，無疑會(huì)大大提高融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，將來生產(chǎn)該疫苗時(shí)也就會(huì)大大提高經(jīng)濟(jì)效益。
3.3PT7ZZa系統(tǒng)的SS-B/X和SS-B/E的開發(fā)前景SS-B/X和SS-B/E兩種融合蛋白的水溶性均很高，這有利于該二種融合蛋白的分離和純化，加之本系統(tǒng)所表達(dá)的載體蛋白為SPA，它和多種動(dòng)物的IgG有高親合性，可用以快速純化表達(dá)產(chǎn)物——SS-SPA。有利于下一步SS基因工程亞單位疫的制備，開發(fā)前景良好。
4.SS基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物促生長試驗(yàn)4.1小白鼠免疫增重試驗(yàn)以SS-N/X和SS-N/S2種融合蛋白，加不完全福氏佐劑1∶1混合，高速勻漿制成SS亞單位疫苗，實(shí)用用Blab/C純系21日齡斷乳小鼠100只，分5個(gè)組，每組公、母各10只，第1組為注射SS-N/X亞單位苗免疫組，第2組為注射SS-N/S亞單位苗免疫組，第3組為注射空載體(硫氧還蛋白)對(duì)照組，第4組為生理鹽水對(duì)照組，第5組注射激生1號(hào)苗作為對(duì)照。各皮下注射0.2ml。免疫前稱重，免疫后每周稱重1次，共觀察稱重11周。
結(jié)果在接種后第1周，所有接種SS亞單位苗免疫組和空載體對(duì)照組均反應(yīng)強(qiáng)烈，皮毛粗亂，精神不振，普遍減食，所有試驗(yàn)鼠均不增重。第2周開始，反應(yīng)消失，增重迅速，很快趕上鹽水對(duì)照和1號(hào)苗對(duì)照，至11周試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)組母鼠增重十分明顯，SS-N/X組比空載體對(duì)照增重10.28％，比鹽水對(duì)照增重30.54％；SS-N/S組比空載體對(duì)照增重15.63％，比鹽水對(duì)照增重36.88％。而激生1號(hào)苗僅比鹽水對(duì)照增重2.79％，增重不顯著。
4.2免疫懷孕母豬，觀察對(duì)所產(chǎn)仔豬的影響選擇品種、年齡、體重均相近的初產(chǎn)母豬4頭，隨機(jī)分為兩組，于分娩前30天左右分別于耳根背部皮下注射實(shí)驗(yàn)疫苗和空載體對(duì)照疫苗。注苗后觀察母豬的反應(yīng)，分娩后稱仔豬的初生重、28日齡體重和44日齡斷乳體重。疫苗制備方法同7.2。結(jié)果見表3。
表3免疫母豬后所產(chǎn)仔豬增重比較(kg/頭)
結(jié)果表明，給懷孕母豬免疫不影響仔豬初生重，而至44d斷乳時(shí)，以空載體對(duì)照增重18％(P＜0.05)。
4.3 羔羊免疫增重試驗(yàn)選擇2-3月齡的雙胞胎羔羊，隨機(jī)將兩只羔羊分為實(shí)驗(yàn)羊和對(duì)照羊，并適當(dāng)照顧性別平衡。每只羔羊注苗2ml，并分別于注苗后0、58和92天稱體重。結(jié)果表4。
表4母羔羊增重試驗(yàn)(kg/頭)
—未計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)母羔羊的增重效果非常明顯，58天增重15.64％(P＜0.01)，90天增重28.2％(P＜0.01)。該實(shí)驗(yàn)雖僅免疫了一次，但增重效果卻達(dá)到甚至超過了國外用SS合成肽疫苗，反復(fù)多次免疫羊的增重效果(Laarveld et al，1986；Mears，1990 and 1995；Sunet al，1990)。這說明用基因工程方法表達(dá)的SS融合蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，一次免疫即可達(dá)到明顯促進(jìn)母羊增重的目的。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)生長抑素(SS)亞單位疫苗的基因工程體，該工程體是通過以下實(shí)施方案獲得的先合成兩端含有Kph I(K)和Pst I(P)酶切位點(diǎn)的SS基因，將其插入pThioHisA質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-K/P質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，獲得能表達(dá)SS-K/P融合蛋白的工程菌；然后再從SS-K/P質(zhì)粒，用Kpn I(K)和Nsi I(N)切出SS基因，將其插入pThioHis質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-K/N質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-K/N融合蛋白的工程菌；再從SS-K/N質(zhì)粒，用Nco I(N)和Sac 1(S)將SS基因切出，將其插入PET 32a質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-N/X質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-N/X融合蛋白的工程菌；同樣從SS-K/N質(zhì)粒，用Nco I(N)和Sac I(S)將SS基因切出，將其插入PET-32C質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-N/S質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-N/S融合蛋白的工程菌；從SS-K/N質(zhì)粒，用Bam HI(B)和Xho I(X)將SS基因切出，將其插入PT7ZZa質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成SS-B/X質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后獲得能表達(dá)SS-B/X融合蛋白的工程菌；再從SS-K/N質(zhì)粒，用Bam HI(B)和Eco RI(E)將SS基因切出，將其插入PT7ZZa質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得能表達(dá)SS-B/E融合蛋白的工程菌。
全文摘要
本發(fā)明用于生產(chǎn)生長抑素(SS)亞單位疫苗的基因工程體,屬于生物技術(shù)高科技研究領(lǐng)域。工程體的獲得方案如下:先合成兩端含有Kph I(K)和Ps tI(P)酶切位點(diǎn)的SS基因,將其插入pThioHis A質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建成SS－K/P質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后,獲得能表達(dá)SS融合蛋白的系列工程菌。本發(fā)明選擇表達(dá)系統(tǒng)和最佳的插入位點(diǎn)是技術(shù)關(guān)鍵,采用了pThioHis、PET32和PT7Za 3個(gè)大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng),每個(gè)系統(tǒng)用2個(gè)插入位點(diǎn),共構(gòu)建6個(gè)可供選擇的工程菌。進(jìn)一步研制了適用于多次免疫的SS基因工程業(yè)單位苗。分別免疫小鼠和免疫妊娠母豬等做實(shí)驗(yàn)小試;結(jié)果比對(duì)照提高18—36.9%。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1273127SQ0010567
公開日2000年11月15日 申請(qǐng)日期2000年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月17日
發(fā)明者杜念興, 劉永慶, 趙國屏, 成志恒, 陳溥言 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)