專(zhuān)利名稱(chēng)：抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
弧菌病是海水養(yǎng)殖動(dòng)物中常見(jiàn)的流行病，在現(xiàn)有的技術(shù)中，目前只有鰻弧菌菌體疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用，尚未見(jiàn)弧菌基因工程疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用。鰻弧菌菌體疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較專(zhuān)一的抗弧菌特異性，對(duì)抗鰻弧菌引起的疾病具有較高的抗性，但正是由于其作用專(zhuān)一，對(duì)其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用較差，在生產(chǎn)應(yīng)用中存在非常明顯的局限性。此外，傳統(tǒng)的細(xì)菌疫苗的生產(chǎn)工序上在最后環(huán)節(jié)加入滅活用藥物，殘留于疫苗中，導(dǎo)致存在副作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗，該疫苗適合作多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的抗弧菌病的免疫劑，外毒素基因的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)福爾馬林滅活后制成，產(chǎn)生菌種為最小弧菌，其特性能完全為作用動(dòng)物所接受。本發(fā)明所述的抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗的制備通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的1，外毒素氨基酸序列的測(cè)定及目的基因探針的設(shè)計(jì)對(duì)已提純的外毒素進(jìn)行氨基酸測(cè)序，根據(jù)氨基酸序列反推出外毒素基因編碼區(qū)可能的核酸序列，據(jù)此用DNA合成儀體外合成寡核苷酸片段，用DIG標(biāo)記后作探針，用以篩選及檢測(cè)外毒素基因。
2，外毒素基因的克隆及表達(dá)利用凝膠電泳分離等方法分離目的DNA片段。目的DNA片段與克隆載體質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)，確認(rèn)重組質(zhì)粒中插入片段為含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
目的DNA與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌體培養(yǎng)物用超聲波破碎，裂解物作SDS-PAGE，并用最小弧菌外毒素單克隆抗體作Western blotting，以檢測(cè)所表達(dá)的外毒素。
3，基因工程疫苗的制備外毒素基因與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行外毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的提純。用濃度為0.2％的福爾馬林對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行滅活處理，得到的滅活疫苗為基因工程疫苗。
本發(fā)明提供的弧菌基因工程疫苗的生產(chǎn)工藝，具體制備方案是這樣實(shí)現(xiàn)的1、最小弧菌活化后接種普通海水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基后，30℃、200rpm搖床培養(yǎng)18-20小時(shí)，培養(yǎng)物經(jīng)10000rpm離心30分鐘，取上清。
2、外毒素的提純采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法進(jìn)行提純。
3、對(duì)已提純的外毒素進(jìn)行氨基酸測(cè)序，根據(jù)氨基酸序列反推出外毒素基因編碼區(qū)可能的核苷酸序列，據(jù)此用DNA合成儀體外合成寡核苷酸片段，用DIG標(biāo)記后作探針。
4、應(yīng)用酚-氯仿法提取最小弧菌染色體DNA。選擇適當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶利用局部消化法處理基因組DNA，凝膠電泳分離，作Southern blotting，轉(zhuǎn)印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)。切取與陽(yáng)性反應(yīng)條帶位置相應(yīng)的凝膠條，用DNA回收試劑盒回收目的DNA片段。
克隆載體質(zhì)粒酶切后，與回收的目的DNA片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)16-18小時(shí)后，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)，確認(rèn)重組質(zhì)粒中插入片段為含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5、外毒素基因與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行外毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的提純。用濃度為0.2％的福爾馬林對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行滅活處理，得到的滅活疫苗為基因工程疫苗苗。
本發(fā)明所述疫苗在生產(chǎn)應(yīng)用中的效果本發(fā)明所提供的抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病基因工程疫苗的用途，是可應(yīng)用于海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的免疫，這種疫苗能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)性，其免疫保護(hù)率平均可達(dá)84％。該疫苗適用于免疫多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，并具有提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的效果。利用上述制備的疫苗經(jīng)浸泡免疫養(yǎng)殖動(dòng)物，其保護(hù)效果見(jiàn)下表
表1 疫苗在網(wǎng)箱養(yǎng)殖真鯛中的試用效果

表2 疫苗在網(wǎng)箱養(yǎng)殖石斑魚(yú)中的試用效果

具體實(shí)施例方式實(shí)例11，取經(jīng)活化的最小弧菌10ml，接種于1000ml經(jīng)過(guò)濾的普通海水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，30℃、200rpm搖床培養(yǎng)18-20小時(shí)，培養(yǎng)物經(jīng)10000rpm離心30分鐘，取上清。
2，外毒素的提純采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法進(jìn)行提純。
硫酸銨分級(jí)鹽析離心上清中加入固體硫酸銨至20％的飽和度，置于4℃靜置4小時(shí)，10000rpm離心30分鐘，棄沉淀，再于上清中加固體硫酸銨至60％的飽和度，置于4℃靜置4小時(shí)，10000rpm離心30分鐘，去上清，沉淀溶于濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液中，對(duì)相同緩沖液透析過(guò)夜，收集即為粗提外毒素1。
DEAE-纖維素離子交換層析粗提外毒素1加入已平衡的DEAE-纖維素柱上(Phamacia產(chǎn)品，2.6cm×30cm)。用濃度為0~1mol/L的NaCl以及濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液梯度洗脫，流速為5ml/cm2/小時(shí)，每4ml收集一管，同時(shí)測(cè)定每管的溶血價(jià)。合并蛋白峰洗脫液，用濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜。用聚乙二醇PEG100濃縮膠濃縮，然后再對(duì)濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜，即為粗提外毒素2。
Sephadex-G100層析粗提外毒素2加入已平衡的Sephadex-G100層析柱中(Phamacia產(chǎn)品，1.6cm×100cm)，用濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液洗脫，流速為6ml/cm2/小時(shí)，每4ml收集一管，同時(shí)測(cè)定每管的溶血價(jià)。合并蛋白峰，用PEG100濃縮膠濃縮，然后再對(duì)濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜，即為純化外毒素。
3，對(duì)已提純的外毒素進(jìn)行氨基酸測(cè)序，根據(jù)氨基酸序列反推出外毒素基因編碼區(qū)可能的核苷酸序列，據(jù)此用DNA合成儀體外合成寡核苷酸片段，用DIG標(biāo)記后作探針。
4，應(yīng)用酚-氯仿法提取最小弧菌染色體DNA。選擇適當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶利用局部消化法處理基因組DNA，凝膠電泳分離，作Southernblotting，轉(zhuǎn)印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)。切取與陽(yáng)性反應(yīng)條帶位置相應(yīng)的凝膠條，用DNA回收試劑盒回收目的DNA片段。
克隆載體質(zhì)粒酶切后，與回收的目的DNA片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)16-18小時(shí)后，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)，確認(rèn)重組質(zhì)粒中插入片段為含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5，外毒素基因與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行外毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的提純。用濃度為0.2％的福爾馬林對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行滅活處理，得到的滅活疫苗為基因工程疫苗。
實(shí)例21，取經(jīng)活化的最小弧菌10ml，接種于1000ml經(jīng)過(guò)濾的普通海水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，27℃、200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時(shí)，培養(yǎng)物經(jīng)10000rpm離心30分鐘，取上清。
2，外毒素的提純采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法進(jìn)行提純。
硫酸銨分級(jí)鹽析離心上清中加入固體硫酸銨至20％的飽和度，置于4℃靜置4小時(shí)，10000rpm離心30分鐘，棄沉淀，再于上清中加固體硫酸銨至60％的飽和度，置于4℃靜置4小時(shí)，10000rpm離心30分鐘，去上清，沉淀溶于濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液中，對(duì)相同緩沖液透析過(guò)夜，收集即為粗提外毒素1。
DEAE-纖維素離子交換層析粗提外毒素1加入已平衡的DEAE-纖維素柱上(Phamacia產(chǎn)品，2.6cm×30cm)。用濃度為0~1mol/L的NaCl以及濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液梯度洗脫，流速為5ml/cm2/小時(shí)，每4ml收集一管，同時(shí)測(cè)定每管的溶血價(jià)。合并蛋白峰洗脫液，用濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜。用聚乙二醇PEG100濃縮膠濃縮，然后再對(duì)濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜，即為粗提外毒素2。
Sephadex-G100層析粗提外毒素2加入已平衡的Sephadex-G100層析柱中(Phamacia產(chǎn)品，1.6cm×100cm)，用濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液洗脫，流速為6ml/cm2/小時(shí)，每4ml收集一管，同時(shí)測(cè)定每管的溶血價(jià)。合并蛋白峰，用PEG100濃縮膠濃縮，然后再對(duì)濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜，即為純化外毒素。
3，對(duì)已提純的外毒素進(jìn)行氨基酸測(cè)序，根據(jù)氨基酸序列反推出外毒素基因編碼區(qū)可能的核苷酸序列，據(jù)此用DNA合成儀體外合成寡核苷酸片段，用DIG標(biāo)記后作探針。
4，應(yīng)用酚-氯仿法提取最小弧菌染色體DNA。選擇適當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶利用局部消化法處理基因組DNA，凝膠電泳分離，作Southernblotting，轉(zhuǎn)印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)。切取與陽(yáng)性反應(yīng)條帶位置相應(yīng)的凝膠條，用DNA回收試劑盒回收目的DNA片段。
克隆載體質(zhì)粒酶切后，與回收的目的DNA片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)16-18小時(shí)后，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)，確認(rèn)重組質(zhì)粒中插入片段為含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5，外毒素基因與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行外毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的提純。用濃度為0.2％的福爾馬林對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行滅活處理，得到的滅活疫苗為基因工程疫苗。
實(shí)例31，取經(jīng)活化的最小弧菌10ml，接種于1000ml經(jīng)過(guò)濾的普通海水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)18-20小時(shí)，培養(yǎng)物經(jīng)10000rpm離心30分鐘，取上清。
2，外毒素的提純采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法進(jìn)行提純。硫酸銨分級(jí)鹽析離心上清中加入固體硫酸銨至20％的飽和度，置于4℃靜置4小時(shí)，10000rpm離心30分鐘，棄沉淀，再于上清中加固體硫酸銨至60％的飽和度，置于4℃靜置4小時(shí)，10000rpm離心30分鐘，去上清，沉淀溶于濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液中，對(duì)相同緩沖液透析過(guò)夜，收集即為粗提外毒素1。
DEAE-纖維素離子交換層析粗提外毒素1加入已平衡的DEAE-纖維素柱上(Phamacia產(chǎn)品，2.6cm×30cm)。用濃度為0~1mol/L的NaCl以及濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液梯度洗脫，流速為5ml/cm2/小時(shí)，每4ml收集一管，同時(shí)測(cè)定每管的溶血價(jià)。合并蛋白峰洗脫液，用濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜。用聚乙二醇PEG100濃縮膠濃縮，然后再對(duì)濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜，即為粗提外毒素2。
Sephadex-G100層析粗提外毒素2加入已平衡的Sephadex-G100層析柱中(Phamacia產(chǎn)品，1.6cm×100cm)，用濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液洗脫，流速為6ml/cm2/小時(shí)，每4ml收集一管，同時(shí)測(cè)定每管的溶血價(jià)。合并蛋白峰，用PEG100濃縮膠濃縮，然后再對(duì)濃度為50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)緩沖液透析過(guò)夜，即為純化外毒素。
3，對(duì)已提純的外毒素進(jìn)行氨基酸測(cè)序，根據(jù)氨基酸序列反推出外毒素基因編碼區(qū)可能的核苷酸序列，據(jù)此用DNA合成儀體外合成寡核苷酸片段，用DIG標(biāo)記后作探針。
4，應(yīng)用酚-氯仿法提取最小弧菌染色體DNA。選擇適當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶利用局部消化法處理基因組DNA，凝膠電泳分離，作Southernblotting，轉(zhuǎn)印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)。切取與陽(yáng)性反應(yīng)條帶位置相應(yīng)的凝膠條，用DNA回收試劑盒回收目的DNA片段。
克隆載體質(zhì)粒酶切后，與回收的目的DNA片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)16-18小時(shí)后，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用最小弧菌外毒素基因探針檢測(cè)，確認(rèn)重組質(zhì)粒中插入片段為含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5，外毒素基因與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析等生化方法對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行外毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的提純。用濃度為0.2％的福爾馬林對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行滅活處理，得到的滅活疫苗為基因工程疫苗。
權(quán)利要求
1.一種抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗，其特征在于本疫苗由權(quán)利要求2中所述的為最小弧菌外毒素基因的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)福爾馬林滅活后制備，產(chǎn)生菌種為最小弧菌。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病基因工程疫苗方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)、最小弧菌活化后接種普通海水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基后，30℃、200rpm搖床培養(yǎng)18-20小時(shí)；(2)、采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素層析及Sephadex-G100層析方法對(duì)培養(yǎng)物上清外毒素進(jìn)行分離、純化；(3)、對(duì)已提純的外毒素進(jìn)行氨基酸測(cè)序，根據(jù)氨基酸序列反推出外毒素基因編碼區(qū)可能的核酸序列，據(jù)此用DNA合成儀體外合成寡核苷酸片段，用DIG標(biāo)記后作探針，用以篩選及檢測(cè)外毒素基因；(4)、外毒素基因與表達(dá)載體質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行外毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的提純，用濃度為0.2％的福爾馬林對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行滅活處理，得到的滅活疫苗為抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病基因工程疫苗。
3.一種權(quán)利要求1中所述抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗的用途，其特征在于該疫苗適用于免疫多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，并具有提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的基因工程疫苗及制法用途。目前只有鰻弧菌菌體疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用，對(duì)其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用較差，此外，傳統(tǒng)的細(xì)菌疫苗的生產(chǎn)工序在最后環(huán)節(jié)加入滅活用藥物，殘留于疫苗中，導(dǎo)致副作用。本發(fā)明所述疫苗為最小弧菌外毒素基因的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)福爾馬林滅活后制成，純化后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)福爾馬林滅活制成疫苗。這種基因工程疫苗能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)性，其免疫保護(hù)率可達(dá)84％。該疫苗適用于免疫多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，并具有提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的效果。
文檔編號(hào)A61K39/02GK1706496SQ20051003466
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者吳后波, 李濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所