專利名稱：α-羥基酸在制備癌瘤體內注射治療藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體涉及a -羥基酸在制備癌瘤體內注射治療 藥物中的應用。
背景技術：
原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是惡性程度較高的常見惡性腫瘤之一，以肝細胞癌 (Hepatocellularcarcinoma, HCC)為主。至今肝切除仍是治療肝癌的最佳治療方 法，但由于原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿，發(fā)展快速，確診時能手術切除者僅為10%左 右，即使施行手術，仍有許多病例無法完全切除或腫瘤難以避免術后復發(fā)。對 于晚期肝癌，多因肝功能不全而無法手術。這一部分病人，需通過各種非手術 切除的方法進行治療，或者先行非手術治療，讓腫塊縮小局限，再行手術切除 治療，即二期切除，可使病人獲得較好的益處。肝癌的非手術治療包括腫瘤的 局部治療、化學治療、放射治療、免疫治療和基因治療。由于影像學的發(fā)展， 肝癌的介入治療被認為是目前應用最廣、效果最好的非手術治療，效果明顯好 于全身化療，部分病人尚可獲得二期手術切除的機會。經皮肝癌瘤體內注射治療是肝癌血管外介入治療的常見的一種，主要有以 下幾種治療方法1、無水酒精注射(PEIT)治療小肝癌，即在超聲或CT引導下 經皮肝穿注射無水酒精治療肝癌，其機理是利用無水酒精對癌細胞的蛋白質變 性和脫水作用及癌內小血管的凝固作用，而安全有效地殺滅癌細胞達到治療目 的。國內外學者一致認為對《3cm的肝癌，治療效果可與手術相媲美。其缺 點是患者會出現疼痛、發(fā)熱和一過性轉氨酶升高等副反應，部分患者對酒精過 敏，而且隨著應用研究的不斷深入，發(fā)現酒精滲透能力有限，需較大劑量和多 次多部位注射才能使腫瘤完全壞死，這就不可避免地增加了各種副反應和并發(fā) 癥發(fā)生的可能性。經皮瘤內注射高溫蒸餾水(PHDI)是使用注射器抽取沸騰的蒸 餾水并迅速在30 60秒內均勻注入瘤內，利用高溫效應，使得癌細胞內的蛋白 質合成障礙，從而殺滅癌細胞，蒸餾水的低滲特性引起癌細胞腫脹甚至崩解死 亡，安全性高，本身無刺激性和毒性，適用范圍廣。其適應癥主要是直徑《3 cm的肝癌結節(jié)。效果與PEIT相當，其缺點是滅活癌細胞的可控性和徹底性欠佳以及針道有燙傷的可能。2、釔一90、磷一32、鈥一166等也可用于瘤內注射 治療，其系純(3射線以玻璃微—球形式存在，能均勻地注射到整個瘤體內，局部 滅活瘤細胞可靠，療效突出。但因其屬于放射性核素，該方法要有醫(yī)療保護措 施跟上，加上藥源供給等問題，其臨床應用受到限制。3、經皮乙酸注射(PAI)， 是在超聲或CT導引下經皮穿刺進入肝腫瘤內注射乙酸破壞腫瘤組織以達到局 部滅活的治療目的。(參見文獻OhnishiK， OhyamaN， ho S， et al. Small hepatoeellular carcinoma: treatment with as-guided intratumoral injection of acetic acid. Radiology, 1994， 193: 747)通過乙酸、酒精動物實驗對比研究，從光 鏡、電鏡的病理結果顯示乙酸對肝臟的破壞是非細胞特異性的，主要通過兩個 途徑發(fā)揮損傷效應 一是彌散進入細胞后，利用酸的固有特性，直接引起蛋白 質的凝固；二是直接破壞膜性結構，影響膜的通透性，加速凝固性壞死形成。 PAI的適應證范圍比較廣泛(l)原發(fā)性肝癌、肝轉移瘤的治療， 一般認為病灶 數不超過3個，最大病灶直徑不超過3cm的小肝癌療效最佳，也適合于直徑 >3cm、 〈7cm的中等大小肝癌的治療(參見文獻Ohnishi K， YoshiokaH ， ho S， et al. Treatment of nodular hepatoeellular carcinoma larger than 3cm with ultrasound-gu ided pe rcutaneous aceticacid injection. Hepatology， 1996， 24:1379; 呂國榮，李新豐，王靜意，等.超聲引導經皮醋酸注射治療肝癌新方法.中華 超聲影像學雜志，1999， 8: 229;周義成，楊華芬，張軍憲，等.肝腫瘤化 學滅活治療的初步報告放射學實踐，2001， 16: 73 ) ; (2)手術前治療，有利 于手術切除，且可減少腫瘤復發(fā)、轉移的可能性；(3)腫瘤切除后的復發(fā)治療。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種對肝腫瘤、肺腫瘤、食管腫瘤等腫瘤細胞都具有 較強抑制作用的新的癌瘤體內注射治療藥物。本發(fā)明提供了 a -羥基酸在制備癌瘤體內注射治療藥物中的應用。 本發(fā)明的a -羥基酸具體指羥基乙酸或a -羥基丙酸。羥基乙酸的分子式是C2H403，是一種水溶性的固體。目前多用于除鐵銹 和水垢的化學清洗；在纖維素織物中用作交聯劑；在羊毛染色中作助染劑；在 鞣革工業(yè)中作為無機酸的代用品制造高級皮革；在皮膚病中對粉刺、老年斑、 疣、消除皺紋的治療；作為護膚品用于去除死皮和汗毛劑及果酸的合成原料；在生產聚乳酸-乙醇酸(PLGA)中是一種重要的生物降解材料；可作為原料合成 乙二醇、乙醛酸等一些重要的化工產品。發(fā)明制備了不同濃度的羥基乙酸水溶液，進行了裸鼠實驗、大鼠實驗和細 胞試驗等藥效試驗，并將其與同濃度的用于肝癌瘤內注射的陽性藥乙酸的藥效 進行了比較。通過裸鼠實驗及大鼠的肝損傷實驗，發(fā)現同濃度下羥基乙酸有跟 乙酸相似甚至比乙酸更好的抗肝腫瘤效果。通過細胞實驗，發(fā)現羥基乙酸用于 瘤內注射對肝腫瘤、肺腫瘤、食管腫瘤等的腫瘤細胞都有強大的抑制作用。乙酸注射作為現在臨床上已經應用的抗癌劑，對肝腫瘤組織比無水酒精具 有更強大的破壞作用，被認為是目前用于肝癌瘤內注射的較好的一種抗癌劑。 但是由于乙酸揮發(fā)刺激性很強，在注射過程中會對病人造成較劇烈的疼痛。而 且乙酸作為一種酸性液體，較難制成可以減少對病人刺激性的制劑。根據Ohnish傳推薦采用50X乙酸，注射劑量采取少量、多次注射，艮卩l(xiāng) 2cm腫瘤， 1 2ml/次，2 3cm腫瘤，2 3ml /次，2—3次/周，每次注射都會給病人 帶來痛苦，但這又是在治療肝癌過程中不可避免的。相比較而言，羥基乙酸就要好一些。首先它的水溶液沒有乙酸那么強的揮 發(fā)刺激性，在裸鼠實驗中通過注射過程中鼠的反應也表明羥基乙酸的刺激性要 小。而且羥基乙酸是一種水溶性的固體，比較容易做成制劑，以其作為功效成 分作成的制劑如水溶液、微球、微囊、包合物等，特別是制成微球后可以起到 進一步緩解病人疼痛的作用，且由于微球的緩釋作用，可以減少注射次數，療 效更持久穩(wěn)定；羥基乙酸是目前廣泛作為可生物降解的微球的囊材聚羥基乙酸 (PGA)在體內的初步降解物，其安全性已經得到了廣泛的證實。a-羥基丙酸即乳酸，分子式為<:311603，經動物實驗證明有與羥基乙酸相 似的抗癌效果。本發(fā)明證明了 a -羥基酸及以a -羥基酸作為功效成分，按常規(guī)方法制成的 制劑可作為一種新的用于癌瘤內注射的抗癌劑。
圖l是注射15。/。羥基乙酸和乙酸的腫瘤生長變化曲線比較圖。 圖2是注射30%羥基乙酸和乙酸的腫瘤生長變化曲線比較圖。 圖3是注射15。/。、 20%、 30%羥基乙酸的腫瘤生長變化曲線比較圖。 圖4是15%的乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。圖5是15%的羥基乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。 圖6是30%的乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。 圖7是30%的羥基乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。 圖8是注射15。/。乙酸(A)和羥基乙酸(B)后瘤組織光鏡檢查結果，其中A:注射乙 酸后仍有瘤組織存在，B:注射羥基乙酸后瘤組織的壞死部分。 圖9是注射30%乙酸后瘤組織光鏡檢査結果，其中A:壞死周邊部示炎性反應，B:壞死周邊部有肉芽組織形成，C:壞死周邊的表皮基本正常，D:壞死周邊的肌 組織。圖10是注射30%羥基乙酸后瘤組織光鏡檢查結果，其中A:壞死邊緣也見明顯壞死，B:壞死明顯伴鈣化，C:壞死周邊有大量的炎細胞伴鈣化，D:壞死組織 僅見細胞輪廓。圖11是乙酸對肝腫瘤細胞株7721的抑制曲線圖。 圖12是羥基乙酸對肝腫瘤細胞株7721的抑制曲線圖。圖13是15%的乳酸注射后第2天(A)與15%的羥基乙酸注射后第2天(B)的裸鼠 比較照片。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。羥基乙酸與乙酸同濃度的換算由于羥基乙酸為固體，而乙酸為液體。所 以為了進行同濃度的比較，我們用mol/L作為濃度單位。 實施例1裸鼠實驗選用裸鼠人肝癌組織模型(SMMC—LTNM ， 255代，由上海市嘉定區(qū)中 心醫(yī)院提供)以及4一6周齡，體重18 20 g的雄性BALB / C裸鼠。將SMMC^LTNM的背部皮下移植瘤的新鮮無壞死的組織塊剪成勻漿狀， 用16號針頭吸人注射器0.2ml，將瘤組織注入另一只裸鼠背部皮下，形成皮下 移植。約2-3周待其緩慢吸收又開始長出時每天按規(guī)定時間測量腫瘤體積大小， 瘤體測量用游標卡尺測量瘤體最長徑(A)與最短徑(B)。腫瘤體積為V(mm3 )=11 AXB2 /6，以腫瘤體積為0.6士0.05cm為成瘤入選標準。分別選了15%、 20%、 30%三個濃度的羥基乙酸(羥基乙酸固體購自北京偶 合科技有限公司)對裸鼠瘤體進行注射。15%、 20%組分別于第1天注射第一針 O.lml，第5天注射第二針0.1ml。 30W組第l天注射第一針0.1ml，由于注射后大6部分瘤體可見變黑結痂，所以在第5天只注射了0.05ml。同時作了15%、 30%的 乙酸與其作陽性對照，分別于第l天注射第一針0.1ml，第5天注射第二針0.1ml。 每天用精密卡尺測量瘤體最長徑和和最短徑.由腫瘤體積公式計算瘤體體積。 羥基乙酸組與乙酸組裸鼠都于第10天處死，所有裸鼠均做系統(tǒng)剖檢，取腫瘤、 心肺肝腎組織作病理檢查，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察細胞和組織結構 的變化。結果15%與30%下注射羥基乙酸和乙酸的腫瘤生長變化曲線比較圖分別 見圖1和圖2。 15%、 20%、 30%三個濃度下的羥基乙酸的腫瘤生長變化曲線比 較圖見圖3。裸鼠處死后瘤組織的光鏡檢查見圖4、 5、 6。羥基乙酸組與乙酸組的裸鼠均生長良好。由15%與30%下羥基乙酸組與乙 酸組的裸鼠注射后，乙酸組裸鼠比起羥基乙酸組裸鼠有更明顯的劇烈掙扎的反 應。注射后羥基乙酸組比乙酸組的腫瘤變黑范圍大顏色深且局部結痂明顯，通 過腫瘤生長變化曲線比較圖可以看出羥基乙酸比乙酸的斜率更大，腫瘤縮小明 顯。15%羥基乙酸與乙酸腫瘤的縱切片的光鏡結果顯示各組裸鼠的心肺肝腎 組織切片均未見異常。乙酸組的整個腫瘤組織中有60%壞死，而羥基乙酸則完 全壞死，壞死組織僅見細胞輪廓。30%羥基乙酸與乙酸腫瘤的縱切片的光鏡結 果顯示乙酸組的整個腫瘤組織僅有部分壞死，可見壞死周邊部有肉芽組織形 成及可以看到肌組織。而羥基乙酸組則完全壞死，且壞死明顯伴鈣化，壞死邊 緣也見明顯壞死，周邊有大量的炎細胞伴鈣化。由以上的結果可知，同濃度下 羥基乙酸比乙酸的對腫瘤的治療效果好。對于15%、 20%、 30%三個濃度下羥基乙酸對腫瘤的治療效果的比較，發(fā) 現隨著濃度的增加，裸鼠的腫瘤變黑更大，腫瘤縮小也更明顯。又根據光鏡 觀察結果，15%組與30%組的羥基乙酸注射后的腫瘤雖都完全壞死，但30%組 的羥基乙酸的光鏡下可以看到壞死明顯伴鈣化，可知30%組的羥基乙酸比15% 組的羥基乙酸使腫瘤的壞死程度更大。綜上可以得出隨著濃度的增加，羥基 乙酸對腫瘤的治療效果增強。 實施例2大鼠實驗將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，劍突下作一小切口，入腹腔后即可見 大鼠肝臟.向肝內直接注入15。/o的羥基乙酸50ul，然后關腹。另用15%的乙酸 50ul注入鼠肝，作為陽性對照組。于注射后第4天將鼠處死，從大體標本上形 成壞死灶的直徑，進行比較。結果發(fā)現羥基乙酸會導致鼠肝注射局部發(fā)生凝固性壞死，提示其可以用于 局部注射治療肝癌。而且通過乙酸和羥基乙酸對大鼠肝臟形成的壞死灶可以看 出，羥基乙酸有著與乙酸相似的效果。 實施例3肝腫瘤細胞的體外抑制作用細胞培養(yǎng)肝腫瘤細胞株7721 (購自中科院細胞庫)，以含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100嗎/ml和鏈霉素100嗎/ml)在37°C ， 5%C02 細胞培養(yǎng)箱中孵育，取對數生長期的細胞進行實驗。腫瘤細胞的體外抑制作用7721細胞用胰酶消化，吹散，調整細胞濃度 為5xl04/mL，加于96孔培養(yǎng)板，每孔100pL。置37°C、 5%C02、飽和濕度 條件培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng)基，加入120(iL新鮮培養(yǎng)基，然后再分別加入不同濃 度的藥物乙酸和羥基乙酸各30pL，空白孔和對照孔加入等量的培養(yǎng)基，置37 °C、 5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。加入濃度為5mg/ml的MTT， 15|iL/ 孔，37"、5%<:02、飽和濕度條件孵育4h。棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) IOOiiL/孔，振蕩10min左右。置酶標儀測定吸收度(A)值，波長為570nm， 參照波長630nm。所得數據計算IC50。細胞生長抑制率=(l-試驗組平均A值 /對照組平均A值)X100°/。。實驗重復3次。結果不同濃度的乙酸和羥基乙酸作用于肝腫瘤細胞株7721 48 h后，隨 著濃度增加，細胞存活率顯著下降，對腫瘤細胞生長抑制率顯著上升(附圖12、 13)。從低濃度開始作乙酸和羥基乙酸對細胞的抑制作用與空白對照的統(tǒng)計分 析(t檢驗)，發(fā)現當濃度增加到25mM時，二者的差異具有顯著性(p<0.05)， 而此時二者對細胞的抑制作用之間沒有顯著差異。由此可知乙酸和羥基乙酸對 肝腫瘤細胞株7721的最低抑制濃度相同，且二者的抑制程度相同。同濃度下 對乙酸與羥基乙酸對細胞的抑制作用之間作統(tǒng)計分析(t檢驗)，結果在各濃 度下二者均沒有顯著性差異。肝腫瘤細胞株7721的半數細胞抑制量(IC50值) 乙酸和羥基乙酸都為26mM。 實施例4肺腫瘤細胞的體外抑制作用以含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素，100嗎/ml和鏈霉素 100嗎/ml)在37°C， 5XC02細胞培養(yǎng)箱中孵育，取對數生長期的細胞進行實 驗。肺腫瘤細胞A549 (購自中科院細胞庫)用胰酶消化，吹散，調整細胞濃 度為5xl04/mL，加于96孔培養(yǎng)板，每孔100pL。置37°C、 5%C02、飽和濕 度條件培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng) 基，加入120ul新鮮培養(yǎng)基，然后再分別加入不同濃度的藥物羥基乙酸30pL，空白孔和對照孔加入等量的培養(yǎng)基，置37°C、 5 %C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。加入濃度為5mg/ml的MTT， 15pL/孔，37 °C、 5%C02、飽和濕度條件孵育4h。棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) 100pL/孔，振蕩10min左右。置酶標儀測定吸收度(A)值，波長為570nm， 參照波長630nm。實驗重復'3次。結果表明羥基乙酸對肺腫瘤細胞有明顯的體 外抑制作用。提示其可用于肺癌瘤內注射。 實施例5食管腫瘤細胞的體外抑制作用使用與上述實施例4中相同的方法，但用食管腫瘤細胞Eca-109 (購自中科 院細胞庫)替換肺腫瘤細胞。結果表明羥基乙酸對食管腫瘤細胞有明顯的體外 抑制作用。提示其可用于食管癌瘤內注射。 實施例6乳酸作為抗癌劑的裸鼠實驗選用4一6周齡，體重18 20g的雄性BALB/C裸鼠人肝癌組織模型，形成 皮下移植。約2-3周待其緩慢吸收又開始長出時每天按規(guī)定時間測量腫瘤體積 大小，瘤體測量用游標卡尺測量瘤體最長徑(A)與最短徑(B)。腫瘤體積為 V(mm3)=nAXB2 / 6，以腫瘤體積為0.6士0.05cm為成瘤入選標準。選用15%濃度的乳酸(乳酸購自無錫福菱制藥有限公司)對裸鼠瘤體進行注 射。于第l天注射第一針0.1ml，第5天注射第二針0.1ml。每天用精密卡尺測量 瘤體最長徑和和最短徑.由腫瘤體積公式計算瘤體體積。于第10天處死裸鼠并 做系統(tǒng)剖檢，取腫瘤、心肺肝腎組織作病理檢查，石蠟包埋，HE染色，光鏡 下觀察細胞和組織結構的變化。結果注射乳酸后裸鼠生長良好，腫瘤變黑且局部結痂明顯，各組裸鼠的 心肺肝腎組織切片均未見異常。與同濃度的羥基乙酸相比，與其有相似的抗癌 效果(見圖13)。實施例7乳酸作為抗癌劑對肝腫瘤細胞的體外抑制作用以含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素10(^g/ml和鏈霉素 100|ig/ml)在37。C， 5XC02細胞培養(yǎng)箱中孵育，取對數生長期的細胞進行實 驗。肝腫瘤細胞7721 (購自中科院細胞庫)用胰酶消化，吹散，調整細胞濃 度為5xl04/mL，加于96孔培養(yǎng)板，每孔100|iL。置37°C、 5%C02、飽和濕 度條件培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng)基，加入120|iL新鮮培養(yǎng)基，然后再分別加入不同 濃度的藥物乳酸30pL，空白孔和對照孔加入等量的培養(yǎng)基，置37"C、 5%C02、 飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。加入濃度為5mg/ml的MTT， 15jiL/孔，37°C、 5%C02、飽和濕度條件孵育4h。棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) 100|iL/ 孔，振蕩10min左右。置酶標儀測定吸收度(A)值，波長為570nm，參照波 長630nm。實驗重復3次。結果表明乳酸對肝腫瘤細胞有明顯的體外抑制作用。 提示其可用于癌瘤內注射。
權利要求
1、α-羥基酸在制備癌瘤體內注射治療藥物中的應用，其中的α-羥基酸是羥基乙酸或α-羥基丙酸。
2、 根據權利要求1所述的a -羥基酸在制備癌瘤體內注射治療藥物中的應用， 其中的癌瘤是肝腫瘤、肺腫瘤或食管腫瘤。
3、 根據權利要求l所述的a -羥基酸在制備癌瘤體內注射治療藥物中的應用， 該藥物是含a-羥基酸的水溶液、微球、微囊或包合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體指α-羥基酸在制備癌瘤體內注射治療藥物中的應用。本發(fā)明的α-羥基酸指羥基乙酸或α-羥基丙酸。本發(fā)明制備了不同濃度的羥基乙酸水溶液，進行了裸鼠實驗、大鼠實驗和細胞試驗等藥效試驗，并將其與同濃度的用于肝癌瘤內注射的陽性藥乙酸的藥效進行了比較。通過裸鼠實驗及大鼠的肝損傷實驗，發(fā)現同濃度下羥基乙酸有跟乙酸相似甚至比乙酸更好的抗肝腫瘤效果。通過細胞實驗，發(fā)現羥基乙酸用于瘤內注射對肝腫瘤、肺腫瘤、食管腫瘤等的腫瘤細胞都有強大的抑制作用。本發(fā)明也證明了α-羥基丙酸(乳酸)具有與羥基乙酸相似的抗癌效果。本發(fā)明提供了對肝腫瘤、肺腫瘤、食管腫瘤等腫瘤細胞都具有較強抑制作用的新的癌瘤體內注射治療藥物。
文檔編號A61K31/185GK101214234SQ20081003252
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權日2008年1月10日
發(fā)明者俊 嚴, 吳忠斌, 靖 孫, 悅 張, 揚 張, 瑩 李, 胡育新, 莉 鄧, 丹 郭, 陳建明 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學