專利名稱：：異喹啉生物堿類作為組織因子抑制劑的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一類異喹啉生物堿作為組織因子(TF)抑制劑的醫(yī)藥用途。
發(fā)明內(nèi)容組織因子(tissuefactor,TF),即凝血因子III，又稱為促凝血激酶或凝血致活酶(CD142)，為263個(gè)氨基酸組成的單鏈跨膜糖蛋白，屬于細(xì)胞因子超家族成員。TF既是凝血因子VD在細(xì)胞表面的受體，又是FVn或激活的因子VE(FVIIa)的輔因子，是唯一存在于正常人血漿以外的細(xì)胞和組織中的凝血因子?，F(xiàn)代研究表明，TF和FWa復(fù)合物是凝血的最重要的啟動(dòng)因子，該復(fù)合物啟動(dòng)了凝血級聯(lián)反應(yīng)當(dāng)血管受損后，血液暴露于能表達(dá)TF的細(xì)胞表面，隨后TF與其配體FVII或FVIIa形成復(fù)合物，進(jìn)而激活凝血因子X和凝血因子IX，同時(shí)啟動(dòng)外源性和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)；激活的FXa和FlXa進(jìn)一步激活凝血酶原(FII)成為FlIa，F(xiàn)IIa又使纖維蛋白原變成纖維蛋白，進(jìn)而與激、活的血小豐及形成凝塊(SemeraroN，ColucciM.Tissuefactorinhealthanddisease.ThrombHa函st.1997;78:759~64)。在病理狀態(tài)下，例如動(dòng)脈粥樣硬化或微血管移植、血管造形術(shù)、部署植入裝置(例如移植模、導(dǎo)管或動(dòng)靜脈分流器)或動(dòng)脈內(nèi)切開術(shù)的類侵入性外科程序后，TF引起的凝血可能引發(fā)血栓形成而導(dǎo)致各種心血管疾病諸如心臟病發(fā)作、中風(fēng)、不穩(wěn)定性心絞痛、移植片衰竭或其他冠狀動(dòng)脈疾病。血栓形成同時(shí)亦可能并發(fā)各種血栓栓塞障礙及凝塞，分別例如肺栓塞(例如心房纖維顫動(dòng)及栓塞、深度靜脈血栓形成等)及擴(kuò)散性血管內(nèi)凝血。體液操作亦可能引起不良性血栓，特別是在輸血或體液抽樣及涉及體外循環(huán)(例如心腫迂回補(bǔ)助外科手術(shù))及透析過程中。而目前，心血管疾病是現(xiàn)代社會(huì)最普遍的致死因素，因而尋找抗凝、抗血栓藥物將會(huì)對上述心血管疾病的預(yù)防和治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義并具有很好的應(yīng)用前景。有些抗凝血?jiǎng)┍挥靡詼p輕或避免與血栓形成有關(guān)的血凝塊的形成。它包含使用一種或多種香豆素衍生物(如華發(fā)令(warfm)及二香豆醇)或帶電聚合物(如肝磷脂，水蛭素或水蛭素類(himlog))。有些具有抗血小板活性的抗體亦可用以減輕各種血栓形成。然而，使用先前的這些抗凝劑經(jīng)常會(huì)并發(fā)一些副作用例如出血、血栓形成復(fù)發(fā)、[白血塊]癥候群、過敏、新生兒缺陷、血小板減少及肝功能障礙。特別是長期給予抗凝劑可能提高患致命性疾病的危險(xiǎn)性。蛋白質(zhì)藥劑在本質(zhì)上較為安全，但一般限于用在急性癥狀的處理上，且給藥常限于非腸道，此類藥劑一般認(rèn)為較不適合用于慢性疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化，即心臟病發(fā)作的主因)的長期治療。因此急需新式抗凝血藥劑，特別是可長期給藥以治療慢性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化的新式抗凝血藥劑。最近的研究表明，TF和FVI]a復(fù)合物的抑制劑能有效的抗凝，同時(shí)和其他抗凝藥相比又減少了出血的危險(xiǎn)(SuleymanovOD等人，PharmacologicalInterruptionofAcuteThrombusFormationwithMinimalHemorrhagicComplicationsbyaSmallMoleculeTissueFactor/FactorVilaInhibitor:ComparisontoFactorXaandThrombinInhibitioninaNonhumanPrimateThrombosisModel.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003;306:1115-21)，因此，TF或TF/F訓(xùn)(a)復(fù)合物的抑制劑已經(jīng)成為抗凝、抗血栓藥物發(fā)展的一個(gè)新靶點(diǎn)！TF或TF/FVH(a)復(fù)合物的抑制劑也有望成為新式的抗凝血藥劑，用于病理性血栓的預(yù)防和治療。同時(shí)，隨著對TF作用的了解加深，除了其在凝血過程中的作用，TF還承擔(dān)了信號受體和其他非凝血功能。這使得它在系統(tǒng)性炎癥、凝血紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤的血管發(fā)生及轉(zhuǎn)移，糖尿病等疾病中起重要作用。TF的非凝血功能中，與腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系甚為引人注目，它在惡性黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)均異常增高，近年來國外臨床觀察及體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)FVIla/TF復(fù)合物具有促進(jìn)腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。另外，有研究報(bào)道，TF是在人朗格罕胰島中表達(dá)的，在大部分的胰島內(nèi)分泌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TF("胰島產(chǎn)生TF")，這一發(fā)現(xiàn)表明TF的分泌和胰島素的分泌存在著一定的聯(lián)系。這種TF很有可能與II型糖尿病或其前期患者患動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的高發(fā)病率有關(guān)。因此，抑制TF的活性或合成的抑制劑可以用來預(yù)防這些患者患心血管疾病的危險(xiǎn)。TF的生物學(xué)作用多樣性已經(jīng)得到證實(shí)，TF的異常表達(dá)可能影響多種疾病的病理過程，干預(yù)TF的表達(dá)可能為多種疾病的治療、預(yù)防提供新的策略。因此，TF或TF/FVH(a)復(fù)合物抑制劑將成為抗凝、抗血栓、抗腫瘤等藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)很有吸引力的新耙點(diǎn)，已成為當(dāng)前倍受國內(nèi)外關(guān)注的研究熱點(diǎn)(SteffelJ，ThomasF，F(xiàn)elixC.TissueFactorinCardiovascularDiseases:MolecularMechanismsandClinicalImplications.Circulation.2006;113:722-31)。中醫(yī)、中藥是中華民族幾千年來與疾病作斗爭的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，中藥有效成分是中草藥發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。我國中藥資源豐富，中藥有效成分眾多，很多成分都具有很好的生物活性，并己廣泛用于臨床，例如青蒿素、石杉堿甲等。利用中草藥活性成分尋找新藥是我國新藥研發(fā)的特色和公認(rèn)的捷徑之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一類異喹啉生物堿用作TF抑制劑的用途，其可用于制備治療或預(yù)防與組織因子相關(guān)的疾病的藥物。發(fā)明人從天然化合物中篩選出活性強(qiáng)的異喹啉生物堿類的TF抑制劑，這些天然化合物多數(shù)IC5C〈O.lpM，為心血管疾病和腫瘤疾病的治療提供新的治療策略和候選的先導(dǎo)化合物或可能的治療藥物。本發(fā)明所述的異喹啉生物堿優(yōu)選下列結(jié)構(gòu)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R!、R2、R3或R4各自獨(dú)立地代表OCH3、OH或-0-CH2-0。更優(yōu)選下列化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>紫堇達(dá)明(R,S):R尸RfOCFb，R3=OCH3，fL^OH;四氫小檗堿R「RfO-CH2-0，R3=OCH3,R4=OCH3;延胡索乙素(dl-四氫巴馬汀)RfR2=R3=R4=OCH3;羅通定(l-四氫巴馬汀)R產(chǎn)R2=R3=R4=OCH3藥根堿R產(chǎn)OCH3，R2=OH,R3=R4=OCH3;小檗堿R產(chǎn)R2=0-CH2-0，R3=OCH3，R4=OCH:小檗紅堿R尸R^OCH3，R3=OH，R4=OCH3;巴馬汀R尸R2=R3=R4=OCH3氯仿小檗堿Ri，R2=0-CH2-0,R3=OCH3，R4=OCH3'R=CC13丙酮小檗堿Ri，R2=0-CH2-0,R3=OCH3,R4=OCH3，R=CH2COCH3本發(fā)明以組織因子為靶點(diǎn)，從天然或合成的化合物中篩選有效的TF抑制劑。采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)及人外周血單核細(xì)胞，經(jīng)炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)或細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激表達(dá)TF,加入一定劑量的天然化合物與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時(shí)間后，采用發(fā)色底物法，考察這些化合物對TF促凝活性的影響。本發(fā)明優(yōu)選的化合物可用于預(yù)防和治療人類由組織因子影響的疾病，包括心腦血管疾病、凝血障礙、敗血癥、侵入性醫(yī)療程序相關(guān)的再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移及糖尿病及其相關(guān)心血管并發(fā)癥。下面是藥理試驗(yàn)及結(jié)果1.人外周血單核細(xì)胞的分離及培養(yǎng)根據(jù)文獻(xiàn)t艮道(AnnuK,KonaWS.Inductionofmonocytetissuefactorexpressionbyhomo-cysteine:apossiblemechanismforthrombosis.Blood.2000;%(3):966-70)，采用FicolI-Hypaque分離液(密度l.077)，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。2.細(xì)胞株ECV304細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。ECV304細(xì)胞復(fù)蘇、傳代后，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，以含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成1.5xl05個(gè).ml:每孔100pl接種于96孔培養(yǎng)板中，在37t:，5。/。C02條件下培養(yǎng)24h，成融合狀態(tài)。3.刺激表達(dá)組織因子(TF)實(shí)驗(yàn)分為三組①空白對照組加入90W的0.1Q/。DMSO溶液(溶媒)及10nlPBS或培養(yǎng)基；②模型組加入90pl的0.iy。DMSO溶液(溶媒)及10(J脂多糖LPS(終濃度為100ng/ml)或腫瘤壞死因子TNF-a(終濃度為20ng/ml)孵育5小時(shí)，以刺激TF的表達(dá)；③給藥組先加入90pl不同濃度藥物(溶媒為0.1%DMS0)作用1小時(shí)，再加入10^1LPS(100ng/ml)或TNFa(20ng/ml)，共同孵育5小時(shí)。各種待測藥物先溶于純DMSO中，配成濃度為lOOmmol.L—i的高濃度母液，然后在臨用前以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，DMSO的最終體積分?jǐn)?shù)均為0.1%。4.TF活性的測定本發(fā)明設(shè)計(jì)采用發(fā)色底物法(即采用商品化的人凝血酶原復(fù)合物，作為因子VE、X的來源)進(jìn)行組織因子抑制劑的篩選。其原理是根據(jù)TF-FVEa復(fù)合物活化的FXa可以使發(fā)色底物(chromogenicsubstrate)分解為多肽和對硝基苯胺(pNA)，后者在405歸處有吸收高峰，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測定405nm處的OD值，該值能反映TF的活性水平。該方法靈敏、簡單、快速，是國際上公認(rèn)的測定TF活性的方法。而改進(jìn)的發(fā)色底物法(即采用商品化的人凝血酶原復(fù)合物，作為因子W、X的來源)，降低了成本，簡化了步驟，更適于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高通量篩選。藥物先與細(xì)胞輕育l小時(shí)，然后加入LPS或TNF與細(xì)胞共孵育5小時(shí)后，將細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)基吸去，用無血清培養(yǎng)基洗l次，再在每孔中加入無血清培養(yǎng)基100Kil(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，一7(TC至室溫反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，將裂解液吹打均勻，吸取45pl細(xì)胞裂解液(每孔可吸兩次)接種于另一塊新的96孔板中，37'C溫育5min，每孔加入5pl新鮮配制的人凝血酶原復(fù)合物溶液(PPSB，華蘭生物工程股份公司，中國，含100mM的CaCU)，37'C溫育15min，再加入50pl新鮮配制的凝血因子Xa的發(fā)色底物溶液(Sigma，USA)(含IOOmMEDTA)，溫育3min，用酶標(biāo)儀以405nm測定吸光度。5.統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對各組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，？<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并計(jì)算有效化合物的ICso值。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果6.1部分異喹啉類生物堿對脂多糖誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞TF表達(dá)的影響脂多糖LPS(終濃度為100ng/ml)作用于人外周血單核細(xì)胞5h，能顯著增加TF的表達(dá);小檗堿、藥根堿、紫堇達(dá)明、延胡索乙素、四氫小檗堿、氯仿小檗堿，丙酮小檗堿等在一定濃度范圍內(nèi)能劑量依賴的抑制LPS誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞TF表達(dá)，結(jié)果見表1。6.2部分異喹啉類生物堿對腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞TF表達(dá)的影響腫瘤壞死因子TNF-a(終濃度為20ng/ml)作用于人外周血單核細(xì)胞5h，能顯著增加TF的表達(dá)；羅通定(左旋四氫巴馬汀)、小檗紅堿或巴馬汀在一定濃度范圍內(nèi)能劑量依賴的抑制TNF誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞TF表達(dá)，結(jié)果見表l。6.3部分異喹啉類生物堿對腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)TF表達(dá)的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNF—a(終濃度為20ng/ml)作用于ECV304內(nèi)皮細(xì)胞株5個(gè)小時(shí)后，能顯著增加TF的表達(dá)；小檗堿、藥根堿、紫堇達(dá)明、延胡索乙素在一定濃度范圍內(nèi)也能劑量依賴性的抑制TNF誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞TF的表達(dá)，結(jié)果見表3。表1:異喹啉生物堿類化合物對LPS誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞TF表達(dá)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2:部分生物堿類化合物對TNF誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞TF表達(dá)的影響(x±SD,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>##尸<0.01vs空白對照組；*P<0.05,**尸<0.01vs模型組綜上所述，本發(fā)明從一些中藥有效成分中篩選到小檗堿(IC5()=0.025pM)、藥根堿(IC5o=0.027nM)、紫堇達(dá)明(ICs『0.032nM)、延胡索乙素(IC50=0.197pM)、羅通定(IC5()=3.75X10M)、小檗紅堿((IC5()=0.60pM)、巴馬汀(IC5『3.86Xl(r3pM)、氯仿小檗堿(IC50=4X10—3pM)、丙酮小檗堿(IC5Q=4.6x10—SnM)等異喹啉類生物堿具有較強(qiáng)的抑制TF表達(dá)的活性，權(quán)利要求1、異喹啉生物堿用于制備治療或預(yù)防與組織因子相關(guān)疾病的藥物的用途。2、權(quán)利要求1的用途，其中異喹啉生物堿是具有式(1)、式(II)或式(III)任一結(jié)構(gòu)的化合物其中R卜R2、R3或R4各自獨(dú)立地代表OCH3、OH或-0-CH2-0。3、權(quán)利要求2的用途，其中異喹啉生物堿是紫堇達(dá)明、四氫小檗堿、延胡索乙素或羅通定。4、權(quán)利要求2的用途，其中異喹啉生物堿是藥根堿、小檗堿、小檗紅堿或巴馬汀。5、權(quán)利要求2的用途，其中異喹啉生物堿是氯仿小檗堿或丙酮小檗堿。6、權(quán)利要求1的用途，其中與組織因子相關(guān)疾病是心腦血管疾病、凝血障礙、敗血癥、侵入性醫(yī)療程序、腫瘤轉(zhuǎn)移、糖尿病或其相關(guān)心血管疾病并發(fā)癥。7、權(quán)利要求6的用途，其中心腦血管疾病是心臟病發(fā)作、心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、肺栓塞、深度靜脈血栓形成或冠狀動(dòng)脈疾病。8、權(quán)利要求6中的疾病，其中所述的侵入性醫(yī)療程序?yàn)檠艹尚涡g(shù)、動(dòng)脈內(nèi)切開術(shù)、應(yīng)用移植模、導(dǎo)管的使用、移植片的植入或動(dòng)靜脈分流器的使用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
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，具體涉及異喹啉生物堿的醫(yī)藥用途，其可用于制備治療或預(yù)防與組織因子相關(guān)的疾病的藥物，用于預(yù)防和治療人類由組織因子影響的疾病，包括心腦血管疾病、凝血障礙、敗血癥、侵入性醫(yī)療程序相關(guān)的再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移及糖尿病及其相關(guān)心血管并發(fā)癥。文檔編號A61P7/00GK101327214SQ20081002209公開日2008年12月24日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日發(fā)明者余伯陽,盧燈翠,寇俊萍,劍張,蔣文雯申請人:中國藥科大學(xué)