專(zhuān)利名稱(chēng)：：使用反向序列hiv-tat多肽的運(yùn)輸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含多肽的新型運(yùn)輸分子(transportmolecule)，其中所述的多肽具有排列于這樣的序列中的氨基酸殘基，所述的序列為HIV-TAT蛋白質(zhì)的堿性部分的反向序列。所述的新型運(yùn)輸分子可用于貨物分子的跨膜或細(xì)胞內(nèi)遞送，所述貨物分子的非限定性實(shí)例包括多肽和核酸。所述的新型運(yùn)輸分子可以與貨物分子以共價(jià)方式或非共價(jià)方式結(jié)合。本發(fā)明優(yōu)選的運(yùn)輸分子的減小的尺寸還使對(duì)貨物分子的生物學(xué)活性的干擾達(dá)到最小。
背景技術(shù)：
：診斷或治療試劑的跨膜或細(xì)胞內(nèi)遞送通常由于該試劑不能到達(dá)所關(guān)注的組織或細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)處而變得棘手。這種復(fù)雜的情況可能部分方式。例如，考慮人類(lèi)皮膚的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，人類(lèi)皮膚保護(hù)身體器官免受外界環(huán)境的威脅，并且起到恒溫器的作用，從而保持身體溫度。皮膚由多個(gè)不同的層構(gòu)成，每層都具有特定的功能。主要的層包括皮下組織、真皮和表皮。皮下組織為皮膚的最深層。其既作為絕緣體以用于身體熱量的保持，又作為震動(dòng)吸收器以用于器官的保護(hù)(Inlander,Skin,NewYork,N.Y.:People'sMedicalSociety,1—7(1998))。此夕卜，皮下組織還儲(chǔ)存了脂肪以用于儲(chǔ)能。皮膚的pH通常為5至6。這種酸性情況是由于存在皮脂腺所分泌的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸。術(shù)語(yǔ)"酸性外膜(acidmantle)"是指在皮膚的大部分區(qū)域中存在的水溶性物質(zhì)。皮膚的緩沖能力部分是由于在皮膚的角質(zhì)層中儲(chǔ)存的這些分泌物。真皮，其位于皮下組織以上，為l.5至4毫米厚。真皮是皮膚的三個(gè)層中最厚的。此外，真皮還具有大部分的皮膚結(jié)構(gòu)物，包括汗腺和脂腺(其通過(guò)皮膚中被稱(chēng)為毛孔或粉刺的孔分泌物質(zhì))、毛嚢、神經(jīng)末梢、血液和淋巴管(Inlander,Skin,NewYork,N.Y.:People'sMedicalSociety,1-7(1998))。然而，真皮的主要成分為結(jié)締組織，例如膠原和彈性蛋白。表皮為表皮細(xì)胞的層疊的層，其位于真皮上面并且為皮膚的最外層。表皮只有0.1至1.5毫米厚(Inlander,Skin,NewYork,N.Y.:People'sMedicalSociety,1-7(1998))，其由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成，并且根據(jù)其分化狀態(tài)而被分成多個(gè)層。表皮可以被進(jìn)一步分為角質(zhì)層和有活力的表皮，其由granularmelphigian和基細(xì)胞構(gòu)成。通過(guò)局部或透皮施加生理學(xué)活性試劑的一個(gè)顯著的問(wèn)題在于皮膚是滲透的有效屏障。角質(zhì)層的油性及其細(xì)胞的緊密的構(gòu)造提供了針對(duì)單獨(dú)使用的或者處于水或油狀溶液中的氣體、固體或液體化學(xué)試劑的有效屏障。因此，角質(zhì)層阻撓了將治療、化妝或診斷試劑以局部方式施加到身體的局部區(qū)域的努力。由于許多生理學(xué)活性試劑理想地應(yīng)該以局部方式施加到局部化的區(qū)域中、以使該試劑的局部濃度足夠高從而具有治療益處而不會(huì)導(dǎo)致全身性過(guò)量，因此上述情況是成問(wèn)題的。此外，治療或診斷試劑通過(guò)胃腸道的吸收通常是不希望的，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致該試劑通過(guò)正常的新陳代謝過(guò)程而發(fā)生不想要的化學(xué)變化。除了諸如皮膚之類(lèi)的宏觀結(jié)構(gòu)以外，細(xì)胞通常對(duì)許多治療或診斷試劑是不可滲透的或者幾乎不可滲透的，特別是如果所述的試劑為諸如蛋白質(zhì)或核酸之類(lèi)的大分子則更是如此。此外，一些小分子以極低的速率進(jìn)入活細(xì)胞中。缺少在體內(nèi)將大分子遞送至細(xì)胞中的手段已經(jīng)成為具有細(xì)胞內(nèi)作用位點(diǎn)的、潛在大量的治療和診斷試劑(例如蛋白質(zhì)和核酸)的治療、預(yù)防和診斷用途的障礙。已經(jīng)研發(fā)出多種在體外將大分子遞送至細(xì)胞中的方法。一系列這樣的方法包括電穿孔、與脂質(zhì)體的膜融合、用包被有DNA的微粒進(jìn)行的高速轟擊、與磷酸鈣-DNA沉淀物的溫育、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、用經(jīng)修飾的病毒核酸進(jìn)行的感染、以及直接微注射到單個(gè)細(xì)胞中。這些體外方法通常將核酸分子遞送至總體細(xì)胞群的僅一部分中，并且這些方法往往破壞了大量的細(xì)胞。在體內(nèi)將大分子試驗(yàn)性地遞送至細(xì)胞中已采用刮擦負(fù)載、磷酸鉤沉淀和脂質(zhì)體來(lái)完成。但是，到目前為止，這些技術(shù)對(duì)于體內(nèi)細(xì)胞遞送而言顯示出有限的用途。此外，即使就體外細(xì)胞而言，這些方法對(duì)于遞送蛋白質(zhì)而言也具有特別有限的用途。需要用于在體外和體內(nèi)有效地將生物活性蛋白質(zhì)遞送至完整細(xì)胞中的一般方法(L.A.Ster謂n，"ObstaclestoPolypeptideDelivery",Ann.N.Y.Acad.Sci,57，pp.19-21(1987))。化學(xué)添力口月旨狀(P.Hoffmannetal.,"StimulationofHumanandMurineAdherentCellsbyBacterialLipoproteinandSyntheticLipopeptideAnalogues",Iramunobiol.，177，pp.158-70(1988))或者諸如聚賴(lài)氨酸或聚精氨酸之類(lèi)的堿性聚合物(W.-C.Chenetal.，"ConjugationofPoly—L-LysineAlbuminandHorseradishPeroxidase:ANovelMethodofEnhancingtheCellularUptakeofProteins",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75，pp.1872-76(1978))不能證明是高度可靠的或者通常有用的。已經(jīng)將葉酸用作運(yùn)輸部分(C.P.LeamonandLow,DeliveryofMacromoleculesintoLivingCelIs:AMethodThatExploitsFolateReceptorEndocytosis"，Proc.Natl.Acad.SciUSA,88，pp.5572-76(1991))。已有證據(jù)表明葉酸綴合體的內(nèi)化，但無(wú)細(xì)胞質(zhì)遞送的證據(jù)。即使在體內(nèi)存在高水平的循環(huán)的葉酸，但是該系統(tǒng)的用途還沒(méi)有完全被證明。此外，假單胞菌的外毒素也已經(jīng)被用作運(yùn)輸部分(T.I.Prioretal.，"BarnaseToxin:ANewChimericToxinComposedofPseudomonasExotoxinAand6Barnase"，Cell,64，pp.1017-23(1991))。但是，該系統(tǒng)用于細(xì)胞內(nèi)遞送生物學(xué)活性貨物分子的效率和一般適用性在已經(jīng)出版的著作中還不清晰。用于細(xì)胞內(nèi)遞送某類(lèi)治療試劑的一種之前報(bào)道的方法涉及使用運(yùn)輸試劑，該運(yùn)輸試劑含有用于細(xì)胞內(nèi)遞送某類(lèi)化合物的HIV-TAT蛋白質(zhì)的堿性區(qū)域。例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,652,122;5，670，617;5,674,980;5,747,641;5，804，604;和6，316，003。此外，已經(jīng)報(bào)道經(jīng)純化的人類(lèi)免疫缺陷病毒l型("HIV")TAT蛋白質(zhì)由在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的人類(lèi)細(xì)胞從周?chē)囵B(yǎng)基中攝取(A.D.FrankelandC.0.Pabo，"CellularUptakeoftheTATProteinfromHumanImmunodeficiencyVirus",Cell,55，pp.1189-93(1988))。通常，TAT蛋白質(zhì)反式激活某些HIV基因，并且是病毒復(fù)制所必須的。全長(zhǎng)HIV-1TAT蛋白質(zhì)具有86個(gè)氨基酸殘基。HIVTAT基因具有兩個(gè)外顯子。TAT氨基酸1-72由外顯子1編碼，而氨基酸73-86由外顯子2編碼。全長(zhǎng)TAT蛋白質(zhì)可以表征為包含2個(gè)賴(lài)氨酸和6個(gè)精氨酸的堿性區(qū)域(氨基酸49-57)、以及含有7個(gè)半胱氨酸殘基的半胱氛酸富集區(qū)域(氨基酸22-37)。特別地，認(rèn)為所述的堿性區(qū)域(即，氨基酸49-57)對(duì)于核定位是重要的(Ruben，S.etal.，J.Virol.63:1-8(1989);Hauber，J.etal.，J.Virol.631181-1187(1989))。發(fā)明概述盡管HIV-TAT的堿性區(qū)域之前已經(jīng)被用于增加某類(lèi)分子的細(xì)胞內(nèi)遞送，但是本發(fā)明是以意想不到的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，所述的發(fā)現(xiàn)如本文所述，即，HIV-TAT的堿性區(qū)域的反向序列可以用于增加貨物分子的跨膜或細(xì)胞內(nèi)遞送。作為上述發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，本發(fā)明提供能夠增加貨物分子的跨膜或細(xì)胞內(nèi)滲透的新型運(yùn)輸分子。因此，本發(fā)明的運(yùn)輸分子可以用于在體外或體內(nèi)將貨物分子遞送穿過(guò)膜(例如透皮方式)或者通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入到真核細(xì)胞(例如進(jìn)入到細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì))中。本發(fā)明進(jìn)一^^力a^乂》工te^4A4MJt^《AJLA&A"^A此外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的新型運(yùn)輸分子來(lái)增加貨物分子的跨膜或細(xì)胞內(nèi)滲透的方法。該方法特別適用于這樣的貨物分子，該貨物分子(l)不能天然地進(jìn)入靶細(xì)胞、細(xì)胞核或膜，或者(2)不能天然地以有用的速率進(jìn)入到靶細(xì)胞、細(xì)胞核或膜。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的運(yùn)輸分子可用于將蛋白質(zhì)或肽(例如調(diào)節(jié)因子、酶、抗體、藥物或毒素)、以及DNA或RNA遞送至細(xì)胞核或者穿過(guò)膜。特別優(yōu)選的貨物分子包括毒素，其非限定性實(shí)例包括肉毒桿菌毒素、waglerin毒素和破傷風(fēng)毒素。根據(jù)本發(fā)明的貨物分子的細(xì)胞內(nèi)遞送是通過(guò)對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞施用新型運(yùn)輸分子與貨物分子的綴合體來(lái)完成的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)向所關(guān)注的膜施用運(yùn)輸分子/貨物分子綴合體來(lái)遞送貨物分子穿過(guò)膜的方法。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述的運(yùn)輸分子/貨物分子綴合體進(jìn)行局部施用，從而提高所關(guān)注的貨物分子的透皮滲透。圖1:在人皮膚中，使用K15RT2的1251-相關(guān)放射性在體外的經(jīng)皮滲透情況，其中所述的K15RT2為具有與SEQIDNO1相對(duì)應(yīng)的、通過(guò)G間隔體與任一末端連接的多肽的十五(15)個(gè)賴(lài)氨酸。發(fā)明詳述運(yùn)輸分子的形成本發(fā)明優(yōu)選的運(yùn)輸分子的特征在于存在這樣的多肽，該多肽具有與HIV-TAT堿性區(qū)域氨基酸序列(天然存在的HIV-TAT蛋白質(zhì)的氨基酸49-57)的反向序列相應(yīng)的序列。HIV-TAT堿性區(qū)域的反向序列(其為RRRQRRKKR(SEQIDNO.1))在下文中被稱(chēng)為"反向序列多肽"，并且可以與所關(guān)注的貨物分子以共價(jià)方式或非共價(jià)方式連接，從而形成綴合體。在某些實(shí)施方案中，有利地將一個(gè)或多個(gè)反向序列多肽以直接方式或者通過(guò)肽或聚合物連接體而與所關(guān)注的貨物分子共價(jià)連接。例如，如本文所述，反向序列多肽可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或者通過(guò)基因融合而與貨物分子有利地連接。本發(fā)明還預(yù)期了反向序列多肽的變體。通常，可以用作運(yùn)輸分子來(lái)改善貨物分子的透皮或跨膜滲透的反向序列多肽的任何變體被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。例如，在一些實(shí)施方案中，反向序列多肽的變體是通過(guò)刪除和/或取代存在于反向序列多肽中的至少一個(gè)氨基酸、從而產(chǎn)生經(jīng)修飾的反向序列多肽來(lái)形成的。因此，可以制備這樣的經(jīng)修飾的反向序列多肽，其具有與所述的反向序列多肽基本相似、但不相同的氨基酸序列。優(yōu)選的經(jīng)修飾的反向序列多肽包括功能等價(jià)的那些多肽或其功能等價(jià)的肽片段。這些功能等價(jià)物或功能等價(jià)的片段具有與天然存在的反向序列多肽基本相似的跨膜或細(xì)胞內(nèi)滲透能力。反向序列多肽或其變體可以采用多種方法獲得，所述方法包括基因工程技術(shù)或化學(xué)合成。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)取代，從而調(diào)控反向序列多肽的滲透能力，以使得所得的運(yùn)輸分子趨向于定位在某些區(qū)域(例如靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì))中。相似的行為已經(jīng)在天然存在的HIV-TAT的堿性區(qū)域中觀察到，并且已經(jīng)用于將HIV-TAT片段定位或部分定位于細(xì)胞質(zhì)中(例如參見(jiàn)Dang，C.V.andLee，W.M.F.，J.Biol.Chem.264:18019-18023(1989);Hauber，J.etal.，J.Virol.63:1181-1187(1989);Ruben,S.A.etal.，J.Virol.63:1-8(1989))。備選地，可以將用于結(jié)合細(xì)胞質(zhì)成分的序列與所述的反向序列多肽連接，從而將反向序列多肽和貨物分子保留在細(xì)胞質(zhì)中，或者調(diào)節(jié)貨物分子的核吸收。在其他實(shí)施方案中，可以將膽固醇或其他脂質(zhì)衍生物加入到反向序列多肽或其變體中，從而增加運(yùn)輸分子的膜溶解性。當(dāng)然，可以在將給定的貨物分子遞送至細(xì)胞質(zhì)中后，將同一貨物分子進(jìn)一步遞送至細(xì)胞核中。核遞送必需涉及穿越細(xì)胞質(zhì)的某些部分。雖然反向序列多肽可以用于貨物分子的跨膜或細(xì)胞內(nèi)遞送，但是本發(fā)明所預(yù)期的運(yùn)輸分子還可以包含HIV-TAT天然蛋白質(zhì)的、增強(qiáng)跨膜或細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)娜魏纹渌糠帧＠?，如果需要的?huà)，運(yùn)輸分子還可以包含全部HIV-TAT多肽的所有86個(gè)殘基，其中所述的多肽具有天9然HIV-TAT蛋白質(zhì)的局部序列，這些序列增多了已經(jīng)被證明能夠增大吸收活性的任何部分的序列，所述序列的非限定實(shí)例包括殘基1-58，37-72，或49-57。但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，運(yùn)輸分子不包含HIV-TAT的半胱氨酸富集區(qū)域，該區(qū)域相應(yīng)于天然HIV-TAT序列的氨基酸22-37,并且這16個(gè)氨基酸中有7個(gè)氨基酸為半胱氨酸。這些半胱氨酸殘基能夠互相形成二硫鍵，與可能存在的其他HIV-TAT蛋白質(zhì)分子或其片段的半胱氨酸富集區(qū)域中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，和與構(gòu)成所關(guān)注貨物分子的蛋白質(zhì)或多肽中可能存在的半胱氨酸殘基形成二硫鍵。這種二硫鍵的形成可能導(dǎo)致貨物分子的生物學(xué)活性喪失。此外，即使不可能與貨物分子形成二硫鍵(例如，當(dāng)治療試劑為不具有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì))，運(yùn)輸分子之間形成的二硫鍵也會(huì)導(dǎo)致運(yùn)輸分子、運(yùn)輸分子-貨物分子綴合體或者這二者的積聚和不溶。因此，天然HIV-TAT蛋白質(zhì)的半胱氨酸富集區(qū)域在HIV-TAT相關(guān)蛋白質(zhì)用于遞送治療或診斷試劑的用途中成為潛在的、嚴(yán)重問(wèn)題的來(lái)源。通過(guò)缺失HIV-TAT蛋白質(zhì)中存在的半胱氨酸富集區(qū)域，本發(fā)明優(yōu)選的運(yùn)輸分子避免了二硫鍵積聚的問(wèn)題，其中所述的二硫鍵積聚可以導(dǎo)致運(yùn)輸多肽/治療試劑的共價(jià)或非共價(jià)綴合體的生物學(xué)活性的喪失或不溶，或者兩者。此外，本發(fā)明優(yōu)選的運(yùn)輸分子的減小的尺寸還有利地使對(duì)治療或診斷試劑的生物學(xué)活性的干擾達(dá)到最小。在涉及每個(gè)貨物分子連接多個(gè)反向序列多肽的實(shí)施方案中，減小的運(yùn)輸分子尺寸的其他優(yōu)點(diǎn)為增大吸收效率。此外，本發(fā)明還預(yù)期了這樣的運(yùn)輸分子，其包含一個(gè)或多個(gè)與得自其他病毒的TAT蛋白質(zhì)組合的反向序列多肽，其中所述病毒的非限定實(shí)例包括HIV-2(M.Guyaderetal.，"GenomeOrganizationandTransactivationoftheHumanImmunodeficiencyVirusType2"，Nature,326，pp.662-669(1987)),馬傳染性貧血病毒(R.Carrolletal.，"IdentificationofLentivirus7^7FunctionalDomainsThroughGenerationofEquineInfectiousAnemiaVirus/HumanImmunodeficiencyVirusType1rj71GeneChimeras",J.Virol.，65，pp.3460-67(1991))以及猿免疫缺陷病毒(L.Chakrabartietal.，"SequenceofSimianImmunodeficiencyVirusfromMacaqueandItsRelationshiptoOtherHumanandSimianRetroviruses",Nature,328，pp.543-47(1987);S.LAryaetal.，"NewHumanandSimianHIV-RelatedRetrovirusesPossessFunctionalTra雄ctivatorGene"，Nature,328，pp.548-550(1987))。應(yīng)該理解的是，包括由這些其他TAT蛋白質(zhì)衍生得到的任何多肽和反向序列多肽的運(yùn)輸分子都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括特征在于存在TAT堿性區(qū)域且缺乏TAT半胱氨酸富集區(qū)域的那些。當(dāng)本發(fā)明的運(yùn)輸分子為多肽時(shí)，該運(yùn)輸分子可以是化學(xué)合成的，或者是通過(guò)重組DNA方法制備的。具有已知氨基酸序列的多肽的化學(xué)合成或重組DNA制備方法是公知的。用于多肽或DNA合成的自動(dòng)化設(shè)備是市售可得的。用于制備多肽運(yùn)輸分子的宿主細(xì)胞、克隆栽體、DM表達(dá)控制序列以及寡核苷酸連接體也是市售可得的。根據(jù)本發(fā)明，貨物分子以共價(jià)或非共價(jià)的方式與運(yùn)輸分子結(jié)合，從而形成綴合體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所預(yù)期的貨物分子包括具有預(yù)防、治療或診斷用途的任何物質(zhì)。而且，本發(fā)明還預(yù)期了任何生物學(xué)活性試劑，包括可能對(duì)接受者具有不利作用的貨物分子，例如用于對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死的毒素。在用于實(shí)施本發(fā)明的貨物分子的選取中存在廣泛的自由。本發(fā)明所預(yù)期的貨物分子的非限定性實(shí)例包括藥物、診斷試劑、酶、蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、抗原和毒素。本發(fā)明所預(yù)期的貨物分子可以采用已知的技術(shù)(例如化學(xué)合成、基因工程方法或者由其天然存在的來(lái)源中分離)來(lái)獲得或制備。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的貨物分子為由肉毒桿菌毒素血清型衍生得到的毒素分子。特別優(yōu)選的是由肉毒桿菌血清型A，B，C,D，E，F(xiàn)，和G直接分離得到的毒素，而且這些肉毒桿菌血清型的修飾形式也清楚地被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。所述的修飾形式包括但不限于其中含有氨基酸殘基的加入或刪除的毒素分子，前體條件是所述的這些加入或刪除基本上不改變毒素分子的生物學(xué)作用。在其他的實(shí)施方案中，所述的貨物分子為抗原，并且與運(yùn)輸分子綴合是為了制備疫苗。例如，所述的貨物分子可以為得自疫苗所免疫針對(duì)的細(xì)菌、病毒或其他感染試劑的抗原(例如HIV的gpl20)。倘若所述的抗原進(jìn)入到了細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)可以使細(xì)胞對(duì)所述的分子進(jìn)行處理，并將其表達(dá)在細(xì)胞表面上?？乖诩?xì)胞表面的表達(dá)將引發(fā)殺傷T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，由此誘導(dǎo)免疫。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的貨物分子為蛋白質(zhì)，例如期望遞送至細(xì)胞內(nèi)、特別是遞送至細(xì)胞核內(nèi)的酶、抗體、毒素或調(diào)節(jié)因子(例如轉(zhuǎn)錄因子)。例如，一些病毒致癌基因通過(guò)與細(xì)胞基因的啟動(dòng)子結(jié)合而不適當(dāng)?shù)亻_(kāi)啟細(xì)胞基因的表達(dá)。通過(guò)在細(xì)胞核內(nèi)提供竟?fàn)幮越Y(jié)合蛋白質(zhì)，病毒致癌基因的活性可以被抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的貨物分子為用作診斷工具(或者探針)或者用作治療試劑的核苷酸序列，例如與靶細(xì)胞內(nèi)基因或基因區(qū)域互補(bǔ)并且能夠通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)基因或基因區(qū)域雜交來(lái)抑制這些基因或基因區(qū)域的活性的寡核苷酸序列?？梢允褂帽景l(fā)明的運(yùn)輸分子來(lái)有利地提高單鏈和雙鏈核酸體外和體內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速率。例如，多肽與核酸的化學(xué)交聯(lián)方法是本領(lǐng)域公知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的貨物分子為單鏈反義核酸。反義核酸可用于抑制與其互補(bǔ)的序列的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的貨物分子為包含由與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈核酸。所述的與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)的實(shí)例為病毒反式、激活子(trans-activator)。所關(guān)注的貨物分子還可以為藥物，例如肽類(lèi)似物或小分子酶抑制劑，其特異性且可靠性地到細(xì)胞核內(nèi)的導(dǎo)入是期望的本發(fā)明的貨物分子還可以為這樣的診斷試劑，該診斷試劑在體外或體內(nèi)提供了關(guān)于所述貨物分子所存在的局部環(huán)境的信息。在選擇診斷試劑中所考慮的因素包括但不限于所尋求的試驗(yàn)信息的類(lèi)型、診斷或成像的條件、給藥的途徑、非毒性、檢測(cè)的方便性、檢測(cè)的可定量性、以及實(shí)用性。許多此類(lèi)的診斷試劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。合適的診斷試劑的非限定性實(shí)例包括放射不可透過(guò)性造影劑、12順磁性造影劑、超順磁性造影劑、CT造影劑和其他造影劑。例如，放射不可透過(guò)性造影劑(用于X射線(xiàn)成像)包括無(wú)機(jī)和有機(jī)碘化合物(例如泛影酸)、放射不可透過(guò)性金屬及其鹽(例如銀，金，賴(lài)等)和其他放射不可透過(guò)性化合物(例如鉤鹽、鋇鹽，如硫酸鋇、鉭和氧化鉭)。合適的順磁性造影劑(用于MR成像)包括二乙烯三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)及其衍生物；以及其他的釓、錳、鐵、鏑、銅、銪、鉺、鉻、鎳和鈷的絡(luò)合物，包括與以下物質(zhì)形成的絡(luò)合物，所述的物質(zhì)為1，4，7，lO-四氮雜環(huán)十二烷-N，Jf，N"，N"-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，-N'，N"-三乙酸(DO3A)、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，『，N"-三乙酸(NOTA)、1，4，8，10-四氮雜十四烷-N，『，N"，N"'-四乙酸(TETA)、羥基千基乙烯-二胺二乙酸(HBED)等。合適的超順磁性造影劑(用于MR成像)包括磁鐵礦、超順磁鐵氧化物、單晶鐵氧化物、特別是上文所述各種試劑的絡(luò)合形式，如本文所述，這些試劑可以與反向序列多肽或者與包含反向序列多肽的正電荷主鏈以共價(jià)或非共價(jià)方式連接。其他合適的成像試劑為CT造影劑(包括碘酸鹽的和非碘酸鹽的CT造影劑、以及離子和非離子的CT造影劑)以及諸如自旋標(biāo)記物或其他可有效診斷的試劑之類(lèi)的造影劑。診斷試劑的其他實(shí)例包括編碼蛋白質(zhì)的標(biāo)志物基因，當(dāng)該基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，所述的蛋白質(zhì)可以容易地檢測(cè)，所述的蛋白質(zhì)包括但不限于p-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白質(zhì)、藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)、熒光素酶等。還可以使用多種標(biāo)記物，例如放射性核素、氟石、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、配體(特別是半抗原)等。其他有用的物質(zhì)為用放射性同位素或成分標(biāo)記的那些(例如"raTc葡庚糖酸鹽)。連接的任何手;來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述的i接足夠穩(wěn)定以耐受所采用的條件，，并且不改變?nèi)魏谓M分的功能。所述的兩種組分之間的連接可以是非共價(jià)的或共價(jià)的。例如，可以采用重組技術(shù)通過(guò)以下過(guò)程來(lái)以共價(jià)方式將作為多肽的運(yùn)輸分子與基于蛋白質(zhì)/多肽的貨物分子連接，其中所述的過(guò)程為將編碼貨物分子的基因與編碼多肽運(yùn)輸分子的基因連接，然后將所得的基因構(gòu)建體引入能夠表達(dá)該綴合體的細(xì)胞中。備選地，可以采用已知的技術(shù)，在細(xì)胞中表達(dá)兩種分開(kāi)的核普酸序列，或者可以以化學(xué)方式合成所迷的核苷酸序列然后順次共價(jià)連接。此外，基于成為一條氨基酸序列(;卩，其中兩種組分均存在二二條氨基酸序歹^)，由此不需要連接。多種化學(xué)交聯(lián)方法是已知的，并且可潛在地用于將本發(fā)明的運(yùn)輸多肽與作為大分子的貨物分子綴合。許多已知的化學(xué)交聯(lián)方法是非特異性的，即，這些方法不會(huì)將偶聯(lián)點(diǎn)指定于運(yùn)輸多肽或貨物大分子上的任何特定位點(diǎn)。結(jié)果，非特異性交聯(lián)試劑的使用可以攻擊功能位點(diǎn)或者在空間上阻斷活性位點(diǎn)，從而使綴合的蛋白質(zhì)發(fā)生生物學(xué)失活。用于增加本發(fā)明實(shí)施過(guò)程中的偶聯(lián)特異性的優(yōu)選方法將化學(xué)偶聯(lián)定向于在待交聯(lián)的一種或兩種多肽中僅發(fā)現(xiàn)一次或少數(shù)幾次的官能團(tuán)。例如，在許多蛋白質(zhì)中，作為唯一含有巰基的蛋白質(zhì)氨基酸的半胱氨酸僅出現(xiàn)少數(shù)幾次。此外，例如，如果多肽不含賴(lài)氨酸殘基，則對(duì)伯胺具有特異性的交聯(lián)反應(yīng)劑對(duì)該多肽的氨基末端是具有選擇性的。成功地采用所述的方法來(lái)增加偶聯(lián)特異性需要所述的多肽在可以反應(yīng)性殘基。當(dāng)半胱氨酸殘基存在于多肽序列的部分中且這些半胱氨酸參與交聯(lián)反應(yīng)可能會(huì)干擾生物學(xué)活性時(shí)，可以替換所述的半胱氨酸殘基。當(dāng)半胱氨酸殘基被替換時(shí)，通常期望的是使在多肽折疊中所產(chǎn)生的變化最小。當(dāng)所述的替換物與半胱氨酸在化學(xué)和空間上相似時(shí)，多肽折疊中的變化最小。就上述原因而言，絲氨酸優(yōu)選地作為半胱氨酸的替換物?？梢詫腚装彼釟埢氲蕉嚯牡陌被嵝蛄兄?，以用于交聯(lián)。當(dāng)引入半胱氨酸殘基時(shí)，引入到氨基或羧基的末端處或者附近是優(yōu)選的。無(wú)論所關(guān)注的多肽是通過(guò)化學(xué)合成制備的，還是通過(guò)重組DNA的表達(dá)制備的，傳統(tǒng)的方法都可以用于此類(lèi)氨基酸序列的修飾。兩種組分的偶聯(lián)可以通過(guò)偶聯(lián)或綴合試劑來(lái)完成。目前具有多種可以4吏用的分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)劑(例如參見(jiàn)Means，G.E.andFeeney，R.E.，ChemicalModificationofProteins,Holden-Day，1974，pp.39-43)。在這些反應(yīng)劑中，例如有J-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸鹽(SPDP)或N，『-(1，3-亞苯基)雙馬來(lái)酰亞胺(這二者對(duì)巰基均具有高度的特異性并且形成了不可逆的連接)；N，N'-乙烯基-雙-(碘乙酰胺)或者其他具有6-11個(gè)碳亞曱基橋的此類(lèi)反應(yīng)劑(其對(duì)巰基具有相對(duì)的特異性)；以及1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其與氨基和酪氨酸基團(tuán)形成了不可逆的連接)?？捎糜谏鲜瞿康牡钠渌宦?lián)反應(yīng)劑包括p，p'-二氟-m，m'-二硝基二苯基砜(其與氨基和苯酚基團(tuán)形成了不可逆的交聯(lián))；二亞胺代己二酸二甲酯(其對(duì)氨基具有特異性)；苯酚-l，4-二磺酰氯(其主要與氨基發(fā)生反應(yīng))；六亞曱基二異氰酸酯或二異硫代氰酸酯，或者苯偶氮基-p-二異氰酸酯(其主要與氨基發(fā)生反應(yīng))；戊二醛(其與多種不同的側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng))以及disdiazobenzidine(其主要與酪氨酸和組氨酸發(fā)生反應(yīng))。交聯(lián)反應(yīng)劑可以為同雙功能的，即，具有可以發(fā)生相同反應(yīng)的2個(gè)官能團(tuán)。優(yōu)選的同雙功能交聯(lián)反應(yīng)劑為雙馬來(lái)酰亞胺己烷("BMH")。BMH含有2個(gè)馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)，該官能團(tuán)在溫和的條件(pH6.5-7.7)下特異性地與含有巰基的化合物發(fā)生反應(yīng)。所述的2個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)通過(guò)經(jīng)鏈連接。因此，BMH可用于含有半胱氨酸殘基的多肽的不可逆的交聯(lián)。交聯(lián)反應(yīng)劑還可以為異雙功能的。異雙功能交聯(lián)試劑具有2個(gè)不同的官能團(tuán)，例如胺反應(yīng)性基團(tuán)和硫醇反應(yīng)性基團(tuán)，這兩個(gè)基團(tuán)分別交聯(lián)胺反應(yīng)性基團(tuán)和硫醇反應(yīng)性基團(tuán)。異雙功能交聯(lián)試劑的實(shí)例為琥珀酰亞胺4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯("SMCC")、m-馬來(lái)酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯("MBS")、琥珀酰亞胺4-(p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸酯("SMPB")、以及MBS的延伸鏈類(lèi)似物。這些交聯(lián)劑的琥珀酰亞胺基團(tuán)與伯胺發(fā)生反應(yīng)，并且碌u醇反應(yīng)性馬來(lái)酰亞胺與半胱氨酸殘基的巰基形成了共價(jià)鍵。交聯(lián)反應(yīng)劑在水中通常具有低的溶解度?？梢詫⒅T如磺?；?lèi)15的親水性部分加入到所述的交聯(lián)反應(yīng)劑中，從而提高其水溶性?；腔?MBS和磺基-SMCC為針對(duì)水溶性進(jìn)行修飾的交聯(lián)反應(yīng)劑的實(shí)例。許多交聯(lián)反應(yīng)劑形成了在細(xì)胞內(nèi)條件下基本不可裂解的綴合體。然而，某些交聯(lián)反應(yīng)劑包含在細(xì)胞內(nèi)條件下可以裂解的共價(jià)鍵，例如二石?；铩＠?，二辟u(mài)代雙(琥珀酰亞胺丙酸酯)("DSP")、Traut，s反應(yīng)劑和N-琥珀酰亞胺3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯("SPDP")是公知的可裂解的交聯(lián)劑?？闪呀獾慕宦?lián)反應(yīng)劑的使用可以使貨物部分在被遞送至靶細(xì)胞中后與運(yùn)輸多肽分離。直接的二硫鍵也是可以使用的。一些諸如n-y-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基-琥珀酰亞胺酯("gmbs")和磺基-GMBS之類(lèi)的新型交聯(lián)反應(yīng)劑具有降低的免疫原性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，這種降低的免疫原性是有利的。包括上文所述的那些在內(nèi)的多種交聯(lián)反應(yīng)劑是市售可得的。詳細(xì)的使用說(shuō)明書(shū)可以容易地得自售貨供應(yīng)商。關(guān)于蛋白質(zhì)交聯(lián)和綴合體的制備的普通參考文獻(xiàn)為S.S.Wong,ChemistryofProteinConjugationandCross—Linking,CRCPress(1991)?；瘜W(xué)交聯(lián)可以包括間隔臂的使用。間隔臂提供了分子內(nèi)撓性，或者調(diào)節(jié)了綴合部分之間的分子內(nèi)距離，并由此可以幫助保持生物學(xué)活性。間隔臂可以為包含間隔氨基酸的多肽部分的形式。例如，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的間隔連接體由一個(gè)或多個(gè)甘氨酸單元(例如GG二聚體)構(gòu)成。備選地，間隔臂可以為交聯(lián)反應(yīng)劑的一部分，例如"長(zhǎng)鏈SPDP"(PierceChem.Co.，Rockford，111.,cat.No.21651H)中的一部分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，當(dāng)運(yùn)輸多肽與貨物部分基因融合時(shí)，加入氨基末端甲硫氨酸是有利的，但是在某些實(shí)施方案中不必加入間隔氨基酸(例如CysGlyGly或GlyGlyCys)。獨(dú)特的末端半胱氨酸殘基為化學(xué)交聯(lián)的優(yōu)選手段。根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案，反向序列多肽的羧基末端與含有多肽或蛋白質(zhì)的貨物分子的氨基末端基因融合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的反向序列多肽本身為這樣的運(yùn)輸分子，該運(yùn)輸分子以非共價(jià)方式與貨物分子結(jié)合，從而形成可以增強(qiáng)所述貨物分子的遞送的非共價(jià)綴合體。備選地，所述的反向序列多肽并非以共價(jià)方式與貨物分子連接，而是以共價(jià)方式與主鏈分子連接(直接地或者通過(guò)連接體)，從而形成了運(yùn)輸分子，其又與貨物分子以非共價(jià)方式結(jié)合從而形成綴合體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述或多個(gè)拷貝。任選地，天然HIV-TAT或得自其他病毒的TAT蛋白質(zhì)的其他運(yùn)輸增強(qiáng)性片段也可以與正電荷主鏈連接。正電荷主鏈通常為原子的線(xiàn)性鏈，在該鏈中，或者具有在生理學(xué)pH下帶正電荷的基團(tuán)，或者具有與從主鏈延伸的側(cè)鏈相連接的、帶正電荷的基團(tuán)。所述的線(xiàn)性主鏈為烴主鏈，在某些實(shí)施方案中，該烴主鏈被選自氮、氧、硫、硅和磷中的雜原子所中斷。大部分的主鏈原子通常為碳。此外，所述的主鏈通常為重復(fù)單元的聚合物(例如氨基酸、聚(氧乙蹄)、聚(丙烯胺)(poly(propyleneamine))等)。在一組實(shí)施方案中，正電荷主鏈為聚丙烯胺，其中大量的胺的氮原子以帶有正電荷的銨基(四取代的)形式存在。在另一組實(shí)施方案中，所述的主鏈與多個(gè)包含正電荷基團(tuán)(例如銨基、吡咬基、膦基、4?；?、胍基或脒基(amidiniumgroup))的側(cè)鏈部分連接。在這組實(shí)施方案中，所述的側(cè)鏈部分可以沿著所述主鏈以多種間距放置，所述的間距在分離方面是一致的，或者是可變化的。此外，所述側(cè)鏈的長(zhǎng)度可以相同或不同。例如，在一組實(shí)施方案中，所述的側(cè)鏈可以為線(xiàn)性或支化的烴鏈，其具有1至20個(gè)碳原子，并且以上文所述的正電荷基團(tuán)之一在遠(yuǎn)端(遠(yuǎn)離主鏈)終結(jié)。在一組實(shí)施方案中，所述的正電荷主鏈為具有多個(gè)正電荷側(cè)鏈基團(tuán)(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、高精氨酸等)的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，當(dāng)將氨基酸用于本發(fā)明的該部分中時(shí)，所述的側(cè)鏈在連接的中心處可以具有D-或L-(R或S構(gòu)型)形式。備選地，所述的主鏈可以為諸如類(lèi)肽之類(lèi)的多肽的類(lèi)似物。例如，參見(jiàn)Kessler，Angew.Chera.Int.Ed.Engl.32:543(1993);Zuckermannetal.Chemtracts-Macromol.Chem.4:80(1992);和Siraonetal.Proc.Nat".Acad.Sci.USA89:9367(1992)。簡(jiǎn)而言之，類(lèi)肽為這樣的聚甘氨酸，其中側(cè)鏈與主鏈氮原子連接，而并非與ot-碳原子連接。同上，所述側(cè)鏈的一部分通常以正電荷基團(tuán)處終結(jié)，從而提供了正電荷主鏈成分。類(lèi)肽的合成在(例如)美國(guó)專(zhuān)利No.5,877,278中有所描述。如本文所用的術(shù)語(yǔ)，具有類(lèi)肽主鏈構(gòu)造的正電荷主鏈被認(rèn)為為"非肽類(lèi)"，這是因?yàn)檫@種主鏈并非由在a-碳位置處具有天然存在的側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)成。可以使用多種其他的主鏈，例如多肽的空間或電子模擬物，其中肽的酰胺鍵可以用替代物替換，所述的替代物例如酯鍵，硫代酰胺(--CSNH--)，反向的硫代酰胺(一NHCS—)，氨基亞曱基(一NHCH2—)或者反向的亞甲基氨基(一CH2NH—)，酮-亞甲基(一C0CH2--)，亞膦酸酯(一P02RCH2--),亞膦酰胺(phosphonamidate)和亞膦酰胺的酯(—PO廁--),反向肽(--NHCO—)，反式-烯烴(一CR=CH—),氟代烯烴(一CF-CH--)，二亞甲基(一CH2CH廠(chǎng)-)，硫醚(一CH2S—),羥基亞乙基(--CH(OH)CH廣-)，亞曱基氧(一CH20—)，四唑(CN4),磺酰胺(—S02NH—),亞曱基磺酰胺(一CHRS02NH—)，反向磺酰胺(一NHSO廣-)，以及具有丙二酸酯和/或偕-二氨基-烷基亞單元的主鏈，例如如Fletcheretal.((1998)Chem.Rev.98:763)所綜述以及其中引用的文獻(xiàn)所詳述的那樣。許多之前的取代得到與由a-氨基酸形成的主鏈大致相當(dāng)?shù)碾娮拥扰诺木酆衔镏麈?。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的主鏈部分為聚賴(lài)氨酸，并且所述的反向序列多肽連接至賴(lài)氨酸側(cè)鏈的氨基基團(tuán)上。在這種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中使用的聚賴(lài)氨酸可以為任何市售可得的聚賴(lài)氨酸(SigmaChemicalCompany,St.Louis，Mo.，USA),例如MW〉70，000的聚賴(lài)氨酸，MW為70，000至150，000的聚賴(lài)氨酸，MW為150，000至300，000的聚賴(lài)氨酸，以及MW〉300，000的聚賴(lài)氨酸。對(duì)聚賴(lài)氨酸的適當(dāng)?shù)倪x擇取決于組合物的其余成分，并且將足以向所述的組合物提供整體凈正電荷。運(yùn)輸分子/貨物分子綴合體的遞送本發(fā)明總體而言適用于小分子和大分子(例如蛋白質(zhì)、核酸和多糖)的治療、預(yù)防或診斷的細(xì)胞內(nèi)或跨膜遞送，其中所述的小分子和大分子不能固有地以有用的速率進(jìn)入到靶細(xì)胞中或者滲透過(guò)生物學(xué)膜。本發(fā)明的方法和組合物可以適用于任何有機(jī)體，包括人。本發(fā)明的方法和組合物還適用于子宮里的動(dòng)物和人。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在將運(yùn)輸分子-貨物綴合體引入到活的人體或動(dòng)物中、或者活的人體或動(dòng)物上之后，將貨物分子遞送至各種器官和組織的細(xì)胞中。例如，可以將貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體與期望引入貨物分子的細(xì)胞接觸。結(jié)果，所述的綴合體進(jìn)入到細(xì)胞中，從而穿越進(jìn)入核中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體施用到膜的表面上，從而使貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體發(fā)生跨膜滲透。例如，可以將貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體局部施用到將受益于貨物分子的治療作用的區(qū)域上。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的貨物分子為肉毒桿菌毒素血清的皮膚區(qū)域中，從而減少皺紋或褶皺的出現(xiàn)。備選地，所述的貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體可以通過(guò)所制備的并被移植到個(gè)體中的細(xì)胞來(lái)在體內(nèi)進(jìn)行遞送。所述的細(xì)胞被基因工程改造，這樣它們可以連續(xù)地在體內(nèi)表達(dá)貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體。備選地，本發(fā)明可以用于在體外遞送貨物分子。例如，在其中貨物分子被遞送至培養(yǎng)物的細(xì)胞中的體外應(yīng)用中，可以將貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體簡(jiǎn)單地加入到培養(yǎng)基中。這可以用作(例如)遞送其對(duì)細(xì)胞功能的影響待被估計(jì)的物質(zhì)至核中的手段。例如，可以測(cè)定經(jīng)純化的轉(zhuǎn)錄因子的活性，或者可以在將貨物分子用于體內(nèi)治療之前，將體外測(cè)定用于提供對(duì)該貨物分子活性的重要的測(cè)試。還可以通過(guò)制備能夠在體外合成所需的貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體的細(xì)胞，或者通過(guò)在合適的條件下將得自個(gè)體的樣品(例如血液、骨髓)與貨物分子/運(yùn)輸綴合體結(jié)合，來(lái)在體外進(jìn)行遞送。例如，可以將關(guān)注的貨物分子-TAT蛋白質(zhì)綴合體或與TAT蛋白質(zhì)結(jié)合的所選貨物分子，與得自個(gè)體的樣品(例如血液、骨髓)結(jié)合，從而將所關(guān)注的19分子引入到該樣品中存在的細(xì)胞中，并且在以這種方式進(jìn)行處理后，將所得的樣品返回至個(gè)體中。以上述方式進(jìn)行的一系列處理可以用于阻止或抑制感染試劑的作用。例如，可以從感染有HIV或其他病毒的個(gè)體，或者從具有基因缺陷的個(gè)體取出血液。然后，在適于綴合體進(jìn)入細(xì)胞以及所述樣品被保持在其可以被返回至個(gè)體中的狀態(tài)中的條件下，將所述的血液與貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體結(jié)合，其中所關(guān)注的貨物分子為能夠使所述病毒滅活的藥物，或者是能夠與所選病毒序列雜交并使其滅活的寡核苷酸序列，或者是補(bǔ)充缺失或缺陷蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。處理后，將所得的血液返回至個(gè)體中。嫁厶汰^.ji$jl咖-斤；末絲酌合體用于診斷、預(yù)防或治療目的的個(gè)體中來(lái)進(jìn)行遞送。所述的靶細(xì)胞可以為體內(nèi)細(xì)胞，即，構(gòu)成活的動(dòng)物或人的器官或組織的細(xì)胞、或者在活的動(dòng)物或人中發(fā)現(xiàn)的^:生物。在一些實(shí)施方案中，將運(yùn)輸分子/貨物分子綴合體與增加穩(wěn)定性和滲透能力的試劑結(jié)合。例如，與HIV-TAT蛋白質(zhì)結(jié)合并增加其穩(wěn)定性和滲透能力的金屬離子可以用于上述目的。備選地，在細(xì)胞外，將向溶酶體試劑與運(yùn)輸分子和貨物分子聯(lián)合提供，從而增加細(xì)胞的吸收。所述的向溶酶體試劑可以單獨(dú)使用或者與穩(wěn)定劑聯(lián)合使用。例如，諸如氯喹、莫能星、金剛烷胺和甲胺之類(lèi)的向溶酶體試劑可以用于上述目的，其中所述的試劑已經(jīng)顯示出在某些細(xì)胞中增加天然存在的HIV-TAT的吸收達(dá)幾百倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞外，將堿性肽與運(yùn)輸分子和貨物分子一起提供，從而增加貨物分子的吸收，其中所述的堿性肽例如與殘基38-58、HIV-TAT或精蛋白相應(yīng)的肽序列。此外，所述的堿性肽可以單獨(dú)使用，或者與穩(wěn)定試劑或向溶酶體試劑組合使用。本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療、預(yù)防或it斷用途，并且可以為多種形式。這些形式包括(例如)固體、半固體和液體劑型，例如片劑、丸劑、粉末、液體溶液或懸浮液、氣霧劑、脂質(zhì)體、栓劑、可注射和可注入的溶液、以及緩釋劑型。優(yōu)選的劑型取決于所計(jì)劃的給藥方式，以及治療、預(yù)防或診斷用途。根據(jù)本發(fā)明，所選的貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體可以通過(guò)常規(guī)的給藥途徑施用，例如腸胃外途徑、皮下途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、病灶內(nèi)途徑、胸骨內(nèi)途徑、顱骨內(nèi)途徑和氣霧劑途徑。此外，還可以采用局部給藥途徑，即，在合適的情況下，將所述的組合物局部施加到身體的特定部分(例如皮膚、下消化道、陰道、直腸)。所述的組合物還優(yōu)選地包含本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的、常規(guī)的藥學(xué)可接受的載體和佐劑。通常，可以采用與藥學(xué)上重要的多肽(例如a-干擾素)所采用的方法和組合物相似的方法和組合物來(lái)配制和施用本發(fā)明的藥物組合物。應(yīng)該理解的是，常規(guī)劑量將根據(jù)具體涉及的貨物分子以及患者的健康情況、重量、年齡、性別、病況或疾病和所需的給藥模式而變化。本發(fā)明的藥物組合物包括藥學(xué)上適當(dāng)?shù)妮d體、佐劑和媒介物。通常，所述的載體包括水性或者酒精/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物可以包括氯化鈉溶液、Ringer，s右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸鹽的Ringer，s或不揮發(fā)性油。此外，靜脈內(nèi)媒介物可以包括流動(dòng)性和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如基于Ringer，s右旋糖的那些。此外，還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如殺菌劑、抗IU匕劑、整合劑和'隋'I"生氣體。通常參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,16thEd.，Mack,ed.1980。然而，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的替代實(shí)施方案不限于臨床應(yīng)用。本發(fā)明可以有利地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究。在本發(fā)明的研究應(yīng)用中，所述的貨物分子可以為藥物或診斷試劑。本發(fā)明的運(yùn)輸分子可以單獨(dú)地用作實(shí)驗(yàn)室研究反應(yīng)劑，或者可以用作運(yùn)輸分子綴合試劑盒的一部分。盡管我們已經(jīng)描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，但是顯而易見(jiàn)的是可以改變我們的基礎(chǔ)構(gòu)造，從而提供利用本發(fā)明的方法和產(chǎn)物的其他實(shí)施方案。因此，應(yīng)該理解的是本發(fā)明的范圍是由所附的權(quán)利要求書(shū)定義的，而不是由以舉例方式列出的具體實(shí)施方案定義的。實(shí)施例1本研究的目的是評(píng)價(jià)使用流通式擴(kuò)散槽(flow-throughdiffusioncell)來(lái)在體外將大型貨物分子(肉毒桿菌毒素A型)遞送至人類(lèi)皮膚的可能性。由于所述的毒素具有相當(dāng)大的尺寸，所以預(yù)期未使用任何運(yùn)輸分子的真皮吸收為可忽略的那樣低。因此，加入不同毒素/載體比例的載體溶液，以試圖增大/促進(jìn)通過(guò)角質(zhì)層的真皮吸收。除了在各時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)受體流體中存在的量以外，在24小時(shí)以后評(píng)價(jià)各種皮膚層中的分布情況。完整的Neuronox⑧產(chǎn)品(即，毒素/白蛋白復(fù)合物，包括輔助蛋白質(zhì))用1251進(jìn)行放射性標(biāo)記。1.1測(cè)試系統(tǒng)皮膚膜的制備由冷凍的皮膚樣品制備人皮膚膜(在腹部手術(shù)后直接得到的單一供體)。在解凍后，使用Dermatome25mm(NouvagGmbH，Germany)將所述的皮膚用皮刀處理為大約400jam的記錄厚度。流通式擴(kuò)散槽將所述的皮膚膜放置在9fflm流通式自動(dòng)化擴(kuò)散槽(PermeGearInc.,Riegelsvi1le，PA，USA)中。在環(huán)境濕度下，將皮膚表面的溫度保持在大約32°C。以大約1.6mlh-l的速度泵入受體流體，該受體流體由含有D.0ly。疊氮化鈉(w/v)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)構(gòu)成。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法測(cè)試物質(zhì)的1251_標(biāo)記在100jnL50mMkh2p0^緩沖劑(pH7.2)中重構(gòu)裝有Neuronox產(chǎn)物的小瓶中的內(nèi)容物。在碘化過(guò)程中，將37MBqNa1251(10，20m1溶于水中的大約100，000倍稀釋的過(guò)氧化氫溶液(30%(v/v)強(qiáng)雙氧水)和20jal乳過(guò)氧化物酶(4jjg.IO(liL-I7jc)力口入到裝有Neuronox⑧產(chǎn)物的小弁瓦中。在大約60秒后，通過(guò)加入溶于磷酸緩沖劑中的50jiL酪氨酸溶液(lmgmL-l)來(lái)停止碘化，從而除去尚未與可利用的蛋白質(zhì)(毒素、白蛋白等)發(fā)生反應(yīng)的過(guò)量的1251。l分鐘后，通過(guò)使用用含有O.5%(w/v)BSA的測(cè)定緩沖劑平衡的、大約10ml體積的SephadexG25細(xì)粒柱，來(lái)從放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)中分離出1251(與L-酪氨酸結(jié)合)。收集大約250nL的級(jí)份。取出一部分級(jí)份以用于反射性活性的測(cè)定。將其他級(jí)份儲(chǔ)存在2-10。C下，直到進(jìn)一步使用。試驗(yàn)設(shè)計(jì)針對(duì)其在K15RT2載體溶液中滲透皮膚的能力來(lái)評(píng)價(jià)Neuronox⑧產(chǎn)品。在施加所述的測(cè)試化合物之前，通過(guò)測(cè)定氖標(biāo)記的水的滲透系數(shù)(Kp)來(lái)估測(cè)皮膚的完整性。試驗(yàn)設(shè)置如下所示組別n載體/毒素比測(cè)試物質(zhì)A4對(duì)照(無(wú)載體)單獨(dú)的NNXB51.1:1K15TR2+NNX回收方法在24小時(shí)后，使用溫和的肥皂溶液(3%陰離子去垢劑(Teepol)，溶于水中)和棉簽，從施加位點(diǎn)除去未被吸收的測(cè)試物質(zhì)(可除去的劑量(dislodgeabledose))。在清洗之后，用干棉簽使皮膚的表面干燥。將受體室和供體室用水漂洗(2次，每次lmL)。隨后，使用D-squame(Monaderm，Monaco)帶狀剝離各皮膚膜(每塊膜10次)。在表皮破裂的情況下，帶狀剝離是不連續(xù)的。將包含(多塊)表皮的帶狀剝離物與皮膚膜(表皮)集中在一起。最后，使用刮刀和鑷子將表皮和真皮機(jī)械分離。通過(guò)Y-輻射計(jì)數(shù)，測(cè)定所有級(jí)份中的放射性。1.3分析放射性的測(cè)定在WallacPharmaciaS1414型閃爍計(jì)數(shù)器上，使用D0T-DPMTM(使用光譜庫(kù)和外標(biāo)光語(yǔ)的數(shù)字疊加技術(shù))進(jìn)行淬滅校正，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)(LSC)來(lái)測(cè)定整體測(cè)試樣品中的放射性。在測(cè)試工具上建立針對(duì)所述儀器的校準(zhǔn)方法。劑量配制物將在劑量給藥之前和之后立即得到的劑量配制物的等分直接加入到液體閃爍儀(UltimaGold)中，并通過(guò)LSC進(jìn)行測(cè)量。將受體液體樣品直接加入到液體閃爍儀(UltimaGoldTM)中，并通過(guò)LSC進(jìn)行測(cè)量。使用Y計(jì)數(shù)儀(PerkinElmer)測(cè)定使用1251-標(biāo)記的測(cè)試化合物的吸收測(cè)試的樣品中的放射性。1.4計(jì)算總體吸收被定義為在受體液體、受體室清洗液和皮膚(不包括帶狀剝離物)中存在的化合物相關(guān)放射性的量。232.結(jié)果測(cè)試項(xiàng)目的經(jīng)皮吸收在人的皮膚膜上評(píng)價(jià)「I]Neuronox⑧的經(jīng)皮吸收。暴露時(shí)間為24小時(shí)。(組織)分布列于表l中。表l:人皮膚中mI-相關(guān)放射性在體外的經(jīng)皮滲透情況的總表(以施加的劑量的百分比表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>圖l示出了在人皮膚中，使用K15RT2的1251-相關(guān)放射性在體外的經(jīng)皮滲透情況。所得數(shù)據(jù)清楚地表明，與單獨(dú)的肉毒桿菌毒素相比，在使用肉毒桿菌毒素和K15RT2的情況下，1251-相關(guān)放射性在體外的經(jīng)皮滲透更高得多。權(quán)利要求1.一種用于遞送貨物分子的運(yùn)輸分子，其中所述的運(yùn)輸分子包含反向序列多肽，該反向序列多肽具有根據(jù)SEQIDNO1所示的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)輸分子，其中所述的反向序列多肽與所述的貨物分子以共價(jià)方式連接。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)輸分子，其中所述的反向序列多肽與正電荷主鏈以共價(jià)方式結(jié)合，并且所述的主鏈與所述的貨物分子以非共價(jià)方式連接。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的運(yùn)輸分子，其中所述的反向序列多肽與正電荷主鏈以共價(jià)方式結(jié)合，并且所述的主鏈與所述的貨物分子以非共價(jià)方式結(jié)合。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)輸分子，其中所述的運(yùn)輸分子增加了所述貨物分子穿過(guò)生物學(xué)膜的滲透。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的運(yùn)輸分子，其中所述的生物學(xué)膜見(jiàn)于皮膚中。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)輸分子，其中所述的運(yùn)輸分子增加了所述貨物分子的細(xì)胞內(nèi)滲透。8.—種用于遞送貨物分子的綴合體，其中所述的綴合體包含包含反向序列多肽的運(yùn)輸分子，所述的反向序列多肽具有在SEQIDNO.l中列出的氨基酸序列；以及貨物分子。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的綴合體，其中所述的運(yùn)輸分子與所述的貨物分子以共價(jià)方式連接。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的綴合體，其中所述的運(yùn)輸分子與所述的貨物分子以非共價(jià)方式連接。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的綴合體，其中所述的貨物分子為治療試劑。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合體，其中所述的治療試劑選自肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、酶和抗原。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合體，其中所述的治療試劑由肉毒桿菌毒素血清型或其片段衍生得到。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的綴合體，其中所述的診斷試劑選自放射不可透過(guò)性造影劑、順磁性造影劑、超順磁性造影劑和CT造影劑。15.—種用于治療疾病的方法，其中所述的方法包括選擇貨物分子；選擇運(yùn)輸分子；Zs工t;6ff;A、J^物合，從而形成貨物分子/運(yùn)輸分子綴合體；以及將所述的綴合體施用至耙細(xì)胞或膜，從而引起所述的貨物分子的細(xì)胞內(nèi)或跨膜遞送。全文摘要本發(fā)明涉及包含多肽的新型運(yùn)輸分子，其中所述的多肽具有排列于這樣的序列中的氨基酸殘基，所述的序列為HIV-TAT蛋白質(zhì)的堿性部分的反向序列。所述的新型運(yùn)輸多肽可用于貨物分子的跨膜或細(xì)胞內(nèi)遞送，所述貨物分子的非限定性實(shí)例包括多肽和核酸。所述的新型運(yùn)輸多肽可以與貨物分子以共價(jià)方式或非共價(jià)方式結(jié)合。文檔編號(hào)A61K31/70GK101583274SQ200780048363公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2007年12月12日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者J·H·李,J·M·沃申請(qǐng)人:雷文斯治療公司