專利名稱：：用于蛋白質(zhì)、肽和其他分子的改進(jìn)的f-18標(biāo)記的方法和組合物的制作方法用于蛋白質(zhì)、肽和其他分子的改進(jìn)的F-18標(biāo)記的方法和組合物相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2007年1月11日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第60/884,521號(hào)的權(quán)益。領(lǐng)域在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用F-18標(biāo)記肽的簡單方法，其可用于體內(nèi)成像。施用于患者時(shí)，F(xiàn)-18標(biāo)記肽的優(yōu)選比活性將為約1,000至2,000Ci/mmo1。也可使用100至數(shù)萬Ci/mmol范圍內(nèi)的比活性。優(yōu)選地，F(xiàn)-18標(biāo)記的完成不需要純化步驟來分離未標(biāo)記的肽和標(biāo)記的肽。背景正電子成像術(shù)(PET)成像提供了高分辨率和從PET圖像定量。肽或其他小分子可用正電子發(fā)射體(僅舉幾例，18F、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、94mTc、秘Y和^I)標(biāo)記。從同位素的核發(fā)射的正電子根據(jù)使用的同位素而以不同能量噴射。當(dāng)正電子與電子反應(yīng)時(shí)，兩種511keVy射線以相反的方向發(fā)射。噴射的正電子的能量控制正電子在其通過撞擊電子而被湮滅之前飛行的平均距離。噴射能越高，正電子與電子碰撞前飛行得越遠(yuǎn)。希望PET同位素具有低噴射能，以使正電子在其產(chǎn)生被PET照相機(jī)成像的兩種511keVY射線前從靶位點(diǎn)飛行的距離最小。發(fā)射正電子的許多同位素在其衰變鏈中也具有其他發(fā)射，諸如y射線、a粒子或p粒子。希望具有為純的正電子發(fā)射體的PET同位素，以便將任何發(fā)射量測定問題減至最小。同位素的半衰期也是重要的，因?yàn)榘胨テ诒仨氉銐蜷L，以便將同位素連接至靶向分子、分析產(chǎn)物、將其注射于患者、允許產(chǎn)物定位、從非靶組織中清除和然后成像。如果半衰期太長，則比活性可能不夠高到獲得足夠的光子來得到清晰的圖像，而如果半衰期太短，則生產(chǎn)、商業(yè)分配和生物分配(biodistribution)需要的時(shí)間可能不夠。F-18(p+635keV97%，t1/2110分鐘)由于它的低正電子發(fā)射能、無側(cè)向發(fā)射和合適的半衰期，而成為最廣泛使用的PET發(fā)射同位素之一。產(chǎn)生的F-18具有高比活性。如果將F-18連接至具有非常高吸收的分子(諸如2-氟-2-脫氧葡萄糖(FDG))，則比活性就不是那么重要了。不過，如果技術(shù)人員用標(biāo)記肽靶向受體或進(jìn)行免疫PET預(yù)靶向研究，則比活性仍是重要的。肽的常規(guī)F-18標(biāo)記包括標(biāo)記具有高比活性的試劑，然后將F-18標(biāo)記的試劑與肽軛合。一個(gè)實(shí)例是Poethko等人的標(biāo)記方法(/.Wmc/.A/ed2004;45:892-902)，其中首先合成和純化了4-["F]氟苯甲醛(Wilson等人，丄丄flZ)e/WC0附/0Mmfea"(ii^c/,0/^"m7.1990;XXVIII:1189-1199),然后將其與肽輒合。然后通過HPLC純化肽輒合物，以除去用來驅(qū)動(dòng)軛合完成的多余的肽。如果F-18具有長的半衰期，所述兩個(gè)反應(yīng)和純化不會(huì)成問題。但是，F(xiàn)-18的半衰期只有2小時(shí)，因此將F-18連接至肽需要的所有操作是顯著的負(fù)擔(dān)。這些方法進(jìn)行時(shí)間長，并且需要使用特殊設(shè)計(jì)的設(shè)備來產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物，和/或?qū)I(yè)化學(xué)家的努力。這些方法不是可以在臨床環(huán)境中常規(guī)使用的試劑盒制劑。概述氟化物與事實(shí)上所有其他元素結(jié)合，并且這些鍵中的一些相對(duì)穩(wěn)定。已知攜帶金屬結(jié)合配體的肽穩(wěn)定地且以非常高的比活性結(jié)合放射性金屬。本方法采用的途徑是首先使F-18與金屬結(jié)合，然后用肽上的配體螯合F-18金屬絡(luò)合物。那么問題就是選擇哪種金屬(或其他元素，例如硼)。根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)的快速檢索，IllA族的元素(硼、鋁、鎵、銦、鉈)成為首選?？蛇x地，技術(shù)人員可首先將原子連接至肽，然后加入F-18。對(duì)于氟化硼連接，第二個(gè)途徑可能更加有效。已報(bào)道氟化鋁絡(luò)合物在體外穩(wěn)定(Martinez等人，/"wg.C/2e肌1999;38:4765-4660;Antonny等人/編.C/j綴1992;267:6710-6718)。將氟化鋁摻入骨和牙齒的釉質(zhì)，因此所述絡(luò)合物在體內(nèi)也是穩(wěn)定的(Li，CniWev.Ora/說o/.Med2003;14:100-114)。熟練的技術(shù)人員將理解，幾乎任何遞送分子都可用于連接F-18用于成像目的，只要其含有可被修飾而不影響遞送分子與細(xì)胞或組織靶受體之間的配體-受體結(jié)合相互作用的可衍生基團(tuán)。雖然下面的實(shí)施例涉及F-18標(biāo)記的肽部分，但是許多其他類型的遞送分子均可被F-18標(biāo)記并用于成像目的，其他類型的遞送分子諸如寡核苷酸、激素、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫調(diào)諧劑、蛋白質(zhì)、核酸、抗體、抗體片段、藥物、白細(xì)胞介素、干擾素、寡糖、多糖、脂質(zhì)等。相似地，可被成像的疾病或疾患的類型僅受適合乾向與疾病或疾患相關(guān)的細(xì)胞或組織的遞送分子有效性的限制。例如，在成像胂瘤的情況中，與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的任何抗體片段均可被F-18標(biāo)記并用于肺瘤成像。在下面的某些實(shí)施例中，示例性的F-18標(biāo)記的肽可作為使用雙特異性或多特異性抗體或抗體片段的預(yù)靶向方法中的可靶向的構(gòu)建體而用于成像目的。這種情況下，抗體或片段將包含針對(duì)與疾病或疾患相關(guān)的靶的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所述靶諸如肺瘤相關(guān)抗原或由病原生物(諸如病毒、細(xì)菌、真菌或其他微生物)產(chǎn)生或展示的抗原。第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)將特異性結(jié)合可靶向的構(gòu)建體。使用雙特異性或多特異性抗體的預(yù)草巴向方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如美國專利第6,962,702號(hào)，其完整內(nèi)容通過引用并入本文)。相似地，與可靶向的構(gòu)建體結(jié)合的抗體或其片段也是本領(lǐng)域公知的(同上)，諸如與HSG(組胺琥珀酰甘氨酸)結(jié)合的679單克隆抗體。一般而言，在預(yù)靶向方法中，首先施用雙特異性或多特異性抗體，并讓其與細(xì)胞或組織靶抗原結(jié)合。經(jīng)過合適量的時(shí)間讓未結(jié)合的抗體從循環(huán)中清除后，例如F-18標(biāo)記的可靶向的構(gòu)建體被施用于患者并與定位至靶細(xì)胞或組織的抗體結(jié)合，然后例如通過PET掃描拍攝圖像。在示例性實(shí)施方案中，諸如抗壞血酸的非肽受體輩巴向劑可與DOTA軛合，然后用例如與DOTA結(jié)合的F-18金屬絡(luò)合物標(biāo)記。此類非肽受體草巴向劑可包括，例如TA138(整聯(lián)蛋白avp3受體的一種非肽拮抗物)(Liu等人，2003，C/2e附.14:1052-56)。本領(lǐng)域已知的可與DOTA、NOTA或F-18金屬絡(luò)合物的另一螯合劑軛合的相似的非肽靶向劑可用于要求保護(hù)的方法。其他受體靶向劑是本領(lǐng)域已知的，諸如促生長素抑制素受體靶向劑In-DTPA抑生長肽(TYCO)。如下文所述，F(xiàn)-18-銦絡(luò)合物可潛在地使用DTPA螯合并用于成像目的。使用金屬螯合物的受體靶向成像的其他方法是本領(lǐng)域已知的，并可用于要求保護(hù)的方法的實(shí)施(參見，例如Andre等人，2002，《//"org.歷0c/2ew.88:1-6;Pearson等人，1996,J.C/2e附.39:1361-71)。用于通過PET掃描的F-18成像的成像技術(shù)和裝置也是本領(lǐng)域公知的(參見，例如美國專利第6,358,489;6,953,567號(hào)；Page等人，池c/t，她血/"e爿wd21:911-919，1994;Choi等人，C朋ceri^ea/r/，55:5323-5329，1995;Zalutsky等人，丄M/c/e"rA/ed，33:575-582，1992)，并且可使用任何此類已知的PET成像技術(shù)或裝置。附圖簡述包括下列圖以說明本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但其并不意味著限制要求保護(hù)的主題的范圍。圖1.F-18+IMP272+A1C13在110。C加熱15分鐘，然后通過反相HPLC分析。圖2.F-18+過量IMP272+AlCl3在ll(TC加熱15分鐘，然后通過反相HPLC分析。圖3.于室溫下在PBS中磷酸鹽激發(fā)90分鐘。小份F-18+過量IMP272+A1C13在110°C加熱15分鐘，并通過反相HPLC分析。圖4.A1-18FIMP272在H20中的穩(wěn)定性，反相HPLC。就在HLB柱純化后F-18標(biāo)記IMP272。圖5.在25。C下于水中稀釋40分鐘后純化的F-18標(biāo)記IMP272。圖6.A1-18FIMP272粗反應(yīng)混合物，反相HPLC,用于免疫反應(yīng)性研究。圖7.A1-18FIMP272的免疫反應(yīng)性，尺寸排阻HPLC，F(xiàn)-18AlIMP272粗反應(yīng)混合物SEC，79%回收率。圖8.F-18AlIMP272粗反應(yīng)混合物SEC+hMN-14x73481%回收率圖9.F-18AlIMP272粗反應(yīng)混合物SEC+hMN-14x67978%回收率圖10.用與其他金屬結(jié)合的F-18標(biāo)記IMP272，反相HPLC。使用冷銦的IMP272的F-18標(biāo)記。圖11.使用冷鎵的IMP272的F-18標(biāo)記。圖12.使用冷鋯的IMP272的F-18標(biāo)記。圖13.使用冷镥的IMP272的F-18標(biāo)記。圖14.使用冷4乙的IMP272的F-18標(biāo)記。圖15.A1-18FIMP375在水中的穩(wěn)定性，反相HPLC。在水中的F-18IMP375，4且標(biāo)記的肽(97.5%)。圖16.在水中的F-18IMP375,在25。C下5小時(shí)后(95.4%)圖17.A1-18FIMP375在人血清(25°C)中的穩(wěn)定性，反相HPLC。在人血清中的F-18IMP375，4.5分鐘(83.5%)。圖18.在人血清中的F-18IMP375，1.5小時(shí)(0%)圖19A-19D.F-18標(biāo)記的IMP449在人血清中孵育零時(shí)(A)和1小時(shí)(B)、2小時(shí)(C)和4小時(shí)(D)后的穩(wěn)定性。詳述在下面的描述中，使用了大量術(shù)語，提供以下定義以便于理解本文的公開內(nèi)容。未明確定義的術(shù)語根據(jù)其明顯的和普通含義使用。如本文所用，"一個(gè)(a)"或"一種(an)"可指一個(gè)或多于一個(gè)的條目。如本文所用，術(shù)語"和"和"或"可用于指合取的或析取的。即除非另外聲明，兩個(gè)術(shù)語均應(yīng)理解為等同于"和/或"。如本文所用，"約，，指數(shù)字的加或減10%的范圍內(nèi)。例如，"約100"將指90和110之間的任何數(shù)字。如本文所用，"肽"指長度介于2個(gè)和100個(gè)氨基酸殘基之間、更優(yōu)選地長度介于2個(gè)和10個(gè)氨基酸之間、更優(yōu)選地長度介于2個(gè)和6個(gè)氨基酸之間的天然存在或非天然存在的氨基酸的任何序列。"氨基酸，，可以是L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸類似物、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物。如本文所用，術(shù)語"病原體"包括但不限于真菌、病毒(例如，人免疫缺陷病毒(HIV)、皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、貓白血病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細(xì)小才羊病毒(humanserumparvo-likevims)、猿f吳病毒40、呼吸道合l包病毒、小鼠乳癌病毒、水痘帶狀皰滲病毒、登革病毒、風(fēng)滲病毒、麻滲病毒、腺病毒、人T細(xì)胞白血病病毒、埃巴病毒、鼠白血病病毒、膽、腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、疣病毒和藍(lán)舌病毒)、寄生蟲和細(xì)菌(例如，無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophilia)、化膿性鏈多求菌(Streptococcuspyogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae),腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis),肺炎3求菌(Pneumococcus)、乙型流感嗜血桿菌(HemophilisinfluenzaeB)、梅毒螺旋體(Treponemapallidum)、萊姆病螺旋體(Lymediseasespirochetes)、銅綠，1單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriumleprae)、流產(chǎn)布魯氏菌(Brucellaabortus)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和破傷風(fēng)4發(fā)菌(Chlostridiumtetani))?？砂严虻臉?gòu)建體肽在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)-18標(biāo)記的部分可包含肽或其他可靶向的構(gòu)建體。此類可乾向的構(gòu)建體可以是多種結(jié)構(gòu)，并被選擇為不僅要引起充分的免疫應(yīng)答而且當(dāng)用于預(yù)靶向方法和雙特異性抗體(bsAb)或多特異性抗體時(shí)還要快速在體內(nèi)清除。疏水劑在引起強(qiáng)免疫應(yīng)答方面最好，而親水劑是快速體內(nèi)清除所優(yōu)選的。因此，建立了疏水和親水特性之間的平衡。這可部分地通過使用親水螯合劑以抵消許多有機(jī)部分固有的疏水性來實(shí)現(xiàn)。另外，可選擇具有相反溶解性質(zhì)的可靶向構(gòu)建體的亞基，例如，含有其中一些為疏水的和其中一些為親水的氨基酸的肽。除了肽之外，還可使用碳水化合物?？墒褂镁哂猩僦羶蓚€(gè)氨基酸殘基的肽，優(yōu)選地為2至10個(gè)殘基，也可將肽與諸如螯合劑的其他部分偶聯(lián)。連接體應(yīng)是低分子量軛合物，優(yōu)選地具有低于50,000道爾頓的分子量，并且有利地低于約20,000道爾頓、10,000道爾頓或5,000道爾頓的分子量(包括螯合物中的金屬離子)。更常見地，抗原性肽將具有四個(gè)或更多殘基，諸如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO:1),其中DOTA是1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸，而HSG是組胺琥珀酰甘氨?；鶊F(tuán)?？蛇x地，DOTA可被NOTA(1,4,7-三氮雜-環(huán)壬烷-N,N',N"-三乙酸)或TETA(對(duì)-溴乙酰氨基-千基-四乙胺四乙酸)部分取代?？砂邢虻臉?gòu)建體還可在主鏈結(jié)構(gòu)中包含非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)以增加肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性。在可選的實(shí)施方案中，其他主鏈結(jié)構(gòu)，諸如從非天然氨基酸和擬肽構(gòu)建的那些。使用固相支持體和重復(fù)正交脫保護(hù)和偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在自動(dòng)肽合成儀上方便地合成用作免疫原的肽。肽中以后用于螯合物軛合的游離氨基用標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基團(tuán)(諸如Boc基團(tuán))有利地封閉，而N-末端殘基可被乙?；栽黾友宸€(wěn)定性。此類保護(hù)基團(tuán)是熟練的技術(shù)人員已知的。參iGreene和WutsProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán))，1999(JohnWileyandSons,N.Y.)。當(dāng)肽準(zhǔn)備以后用于bsAb系統(tǒng)時(shí)，它們被有利地從樹脂解離，以產(chǎn)生相應(yīng)的C-末端酰胺，以便抑制體內(nèi)羧肽酶的活性。免疫原的半抗原包含免疫原識(shí)別部分，例如化學(xué)半抗原。使用化學(xué)半抗原，優(yōu)選地HSG半抗原，連接體顯示對(duì)抗體的高特異性。出現(xiàn)這種情況的原因是針對(duì)HSG半抗原產(chǎn)生的抗體是已知的，并可輕松地?fù)饺脒m當(dāng)?shù)碾p特異性抗體。因此，連接體與連接的半抗原的結(jié)合是抗體或抗體片段高度特異的。螯合部分在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)-18標(biāo)記的分子可包含一個(gè)或多個(gè)親水螯合部分，其可結(jié)合金屬離子并且還有助于確?？焖俚捏w內(nèi)清除。螯合劑可根據(jù)其特定的金屬結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行選擇，并且可容易地被交換。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-千基-DTPA和其單甲基和環(huán)己基類似物。諸如NOTA(1,4,7-三氮雜-環(huán)壬烷-N,N',N"-三乙酸)、DOTA和TETA(對(duì)-溴乙酰tt-千基-四乙胺四乙酸)的大環(huán)螯合劑也可與可潛在地用作F-18軛合配體的多種金屬一起使用。其中配體包括硬堿螯合功能諸如羧酸或胺基的DTPA和DOTA-型螯合劑對(duì)于螯合硬酸陽離子、尤其是IIa族和IIIa族金屬陽離子最為有效。通過調(diào)整感興趣的金屬的環(huán)的大小，可使此類金屬-螯合物絡(luò)合物非常穩(wěn)定。諸如大環(huán)聚醚的其他環(huán)型螯合劑由于穩(wěn)定結(jié)合核素而受到關(guān)注。吟啉螯合劑可與許多金屬絡(luò)合物一起使用?？蓪⒉恢挂环N類型的螯合劑與載體軛合以結(jié)合多種金屬離子。諸如美國專利第5,753,206號(hào)中公開的那些螯合劑，尤其是縮氨基硫脲基乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和縮氨基硫脲基乙酰半胱氨酸(thiosemicarbazinyl-acetylcysteine,Tsca-Cys)螯合劑有利;l也用于結(jié)合Tc、Re、Bi和其他過渡金屬元素、鑭系元素和鋼系元素的軟酸陽離子，所述軟酸陽離子緊密地結(jié)合軟堿配體。將不止一種類型的螯合劑與肽連接是有用的。由于雙-DTPA半抗原的抗體是已知的(Barbet等人，美國專利第5,256,395號(hào))并且容易偶聯(lián)至靶向抗體形成bsAb,因此，在預(yù)靶向?qū)嶒?yàn)方案中使用帶有冷雙DTPA螯合劑和用于結(jié)合F-18絡(luò)合物的另一螯合劑的肽半抗原是可能的。此類肽的一個(gè)實(shí)例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO:2)。其他硬酸螯合劑(諸如DOTA、TETA和類似硬酸螯合劑)可取代DTPA和/或Tscg-Cys基團(tuán)，并且可使用與用來產(chǎn)生抗-雙-DTPAMab的技術(shù)類似的技術(shù)來生產(chǎn)特異于這些硬酸螯合劑的Mab。另一種有用的螯合劑可包含NOTA-型部分，例如，如Chong等人(Rationaldesignandgenerationofabimodalbifunctionalligandforantibody-targetedradiationcancertherapy(用于4元體革巴向的》文射癌癥療法的雙模態(tài)雙功能配體的合理設(shè)計(jì)和產(chǎn)生，J.AfedC/je肌，電子出版于12-7-07,通過？I用并入本文)中所公開的。Chong等人公開了基于NOTA結(jié)構(gòu)的雙功能C-NETA配體的生產(chǎn)和用途，所述配體在與177Lu或2Q5/2Q6Bi絡(luò)合時(shí)顯示在血清中高達(dá)14天的穩(wěn)定性。應(yīng)理解，可將兩種不同的硬酸或軟酸螯合劑(例如具有不同的螯合環(huán)大小)摻入可靶向的構(gòu)建體，以優(yōu)先結(jié)合兩種不同的硬酸或軟酸陽離子(根據(jù)陽離子的不同大小、螯合環(huán)的幾何學(xué)和陽離子的優(yōu)選絡(luò)合物離子結(jié)構(gòu))。這將允許兩種不同的金屬(其中一種或兩種可與F-18連接)摻入可靶向的構(gòu)建體，以被預(yù)靶向的bsAb最終捕獲。施用方法在不同的實(shí)施方案中，雙特異性抗體和可靶向的構(gòu)建體可用于成像正常或病態(tài)組織和器官(,A，例如美國專利第6,126,916;6,077,499;6,010,680;5,776,095;5,776,094;5,776,093;5,772,981;5,753,206;5,746,996;5,697,902;5,328,679;5,128,119;5,101,827;和4,735,210號(hào))。bsAb和F-18標(biāo)記的可耙向構(gòu)建體的施用可通過在施用可耙向的構(gòu)建體之前某一時(shí)間施用bsAb來執(zhí)行。試劑的劑量和施用時(shí)間可由熟練的技術(shù)人員容易地設(shè)計(jì)，并依賴于所用試劑的具體性質(zhì)。如果首先施予bsAb-F(ab')2衍生物，則施用可靶向構(gòu)建體之前24-72小時(shí)的等待時(shí)間將是適當(dāng)?shù)摹Ｈ绻鸌gG-Fab'bsAb軛合物是最初的靶向載體，則施用可靶向的構(gòu)建體之前將需要3-10天范圍內(nèi)的更長的等待時(shí)間。經(jīng)過充分的時(shí)間讓bsAb耙向病態(tài)組織之后，施用F-18標(biāo)記的可把向的構(gòu)建體。施用可耙向的構(gòu)建體之后，即可進(jìn)行成像。某些實(shí)施方案涉及具有至少三個(gè)不同的靶結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)靶結(jié)合蛋白質(zhì)的使用，如序號(hào)為60/220,782的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)所述。已通過經(jīng)由化學(xué)連接體交聯(lián)幾個(gè)Fab-樣片段制備了多價(jià)靶結(jié)合蛋白質(zhì)。參A美國專利第5,262,524;5,091,542號(hào)和Landsdorp等人，</./ww朋o/.，16:679-83(1986)。也已通過共價(jià)連接幾個(gè)單鏈Fv分子(scFv)以形成單個(gè)多肽制備了多價(jià)靶結(jié)合蛋白質(zhì)。參！美國專利第5,892,020號(hào)。基本上是scFv分子的聚集體的多價(jià)靶結(jié)合蛋白質(zhì)已公開于美國專利第6,025,165和5,837,242號(hào)。包含三個(gè)scFv分子的三價(jià)靶結(jié)合蛋白質(zhì)已公開于Krott等人尸ra^"五"g/"固力g,10(4):423-433(1997)。可使用可在bsAb和可靶向構(gòu)建體的給藥之間施予的清除劑。可使用具有新機(jī)制作用的清除劑，即被靶向bsAb的疾病靶向臂的糖基化的抗獨(dú)特型Fab'片段。在一個(gè)實(shí)例中，施予抗CEA(MN14Ab)x抗肽bsAb，并允許其最大程度地附著于疾病靶。為了清除殘留的bsAb,施予MN-14的抗獨(dú)特型Ab(稱為WI2)，優(yōu)選地作為糖基化的Fab'片段。清除劑以單價(jià)方式與bsAb結(jié)合，而其附著的糖殘基將整個(gè)復(fù)合物引向肝臟，在肝臟中發(fā)生快速的代謝。然后將F-18標(biāo)記的可耙向構(gòu)建體施予受治療者。bsAb的MN-14臂的WI2Ab具有高親和力，并且其清除機(jī)制不同于其他公開的機(jī)制(#jSGoodwin等人，同上)，原因是其不涉及交聯(lián)，因?yàn)閃I2-Fab是單價(jià)部分。產(chǎn)生抗體的方法肽主鏈的Ab可通過公知的Ab生產(chǎn)方法產(chǎn)生。例如，向免疫活性動(dòng)物中注射于完全弗氏佐劑中的免疫原，諸如(肽)n-KLH(其中KLH是匙孔威血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin)，并且n=l-30),接下來再兩次注射懸于不完全弗氏佐劑中的同一免疫原，i.v.抗原加強(qiáng)后三天后收獲脾細(xì)胞。然后將收獲的脾細(xì)胞與Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞融合，并使用直接結(jié)合ELISA分析得到的克隆的培養(yǎng)上清液的抗肽反應(yīng)性。產(chǎn)生的Ab的特異性可通過使用原始免疫原的肽片段進(jìn)行分析。這些片段可使用自動(dòng)肽合成儀容易地制備。對(duì)于Ab生產(chǎn)，分離酶缺陷的雜交瘤以便能夠選擇融合的細(xì)胞系。此技術(shù)也可用于產(chǎn)生針對(duì)包含可耙向構(gòu)建體的一種或多種螯合物(例如，In(III)-DTPA螯合物)的抗體。In(III)-雙-DTPA的單克隆小鼠抗體是已知的(Barbet'395，見上)。使用的靶向抗體可以對(duì)作為標(biāo)志物質(zhì)的多種細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)肺瘤相關(guān)抗原具有特異性。這些標(biāo)志物可以是腫瘤產(chǎn)生的物質(zhì)，或可以是在腫瘤部位、在腫瘤細(xì)胞表面上或在腫瘤細(xì)胞內(nèi)(無論是在細(xì)胞質(zhì)、核還是在各種細(xì)胞器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中)積累的物質(zhì)。此類肺瘤相關(guān)標(biāo)志物包括由Herberman，"ImmunodiagnosisofCancer"(癌癥的免疫診斷)，F(xiàn)leisher編，"TheClinicalBiochemistryofCancer"(癌癥的臨床生物化學(xué))，第347頁(AmericanAssociationofClinicalChemists，1979)和在美國專利第4,150,149;4,361,544;和4,444,744號(hào)中公開的那些。Herberman(見上)已將肺瘤相關(guān)標(biāo)志物分為許多類別，包括胎瘤抗原、胎盤抗原、致癌或腫瘤病毒相關(guān)抗原、組織相關(guān)抗原、器官相關(guān)抗原、異位激素和正?？乖蚱渥凅w。有時(shí)，肺瘤相關(guān)標(biāo)志物的亞基有利地用于產(chǎn)生具有更高腫瘤特異性的抗體，例如，人絨毛膜促性腺激素(HCG)的P亞基或癌胚抗原(cea)的y區(qū)，其刺激對(duì)非肺瘤物質(zhì)具有大大降低的交叉反應(yīng)性的抗體的產(chǎn)生，如美國專利第4,361,644和4,444,744號(hào)所^Hf。感興趣的另一種標(biāo)志物是跨膜激活劑及CAML-相互作用分子。參JE，Yu等人Ato./附ww"o/.，1:252-256(2000)。簡單地說，TACI是B細(xì)胞惡性腫瘤(例如，淋巴瘤)的標(biāo)志物。進(jìn)一步，已知TACI和B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)被腫瘤壞死因子同系物(一種增殖誘導(dǎo)配體(APRIL))結(jié)合。APRIL刺激原B細(xì)胞和T細(xì)胞的體外增殖，并由于B細(xì)胞在體內(nèi)的積累而增加脾的重量。APRIL還與TALL-I(也稱為BLyS或BAFF)竟?fàn)幨荏w的結(jié)合?？扇苄訠CMA和TACI特異性防止APRIL的結(jié)合，并阻止APRIL-刺激的原B細(xì)胞的增殖。BCMA-Fc還抑制小鼠中針對(duì)匙孔威血藍(lán)蛋白和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗體的產(chǎn)生，表明經(jīng)由BCMA和/或TACI的APRIL和/或TALL-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是產(chǎn)生體液免疫必需的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACT形成參與B細(xì)胞和T細(xì)胞功能刺激的雙配體-雙受體途徑。用于成像各種疾病或疾患(諸如惡性疾病、心血管疾病、傳染病、炎性疾病自身免疫病或神經(jīng)疾病)的示例性靶抗原可包括結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD80、HLA-DR、Ta、Ii、而C1、而C2、固C3、MUC4、NCA、EGFR、HER2/觀、TAG國72、EGP-l、EGP誦2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、生腱蛋白、葉酸受體、VEGFR、P1GF、ILGF-1、壞死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或這些抗原的組合。尤其是，抗原可包括癌胚抗原(CEA)、生腱蛋白、表皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、成纖維細(xì)胞生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子受體、神經(jīng)節(jié)普脂、HER/2neu受體和這些抗原的組合。最初產(chǎn)生針對(duì)免疫原的抗體后，可對(duì)抗體進(jìn)行測序，并隨后通過重組技術(shù)制備。鼠抗體和抗體片段的人源化和嵌合是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，通過以下制備人源化單克隆抗體將來自小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變鏈的小鼠互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)移到人可變區(qū)，然后在框架區(qū)內(nèi)用鼠對(duì)應(yīng)殘基置換人殘基。使用衍生自人源化單克隆抗體的抗體組分消除了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問題?？寺∈竺庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)的一般技術(shù)描述于例如以下出版物Orlandi等人，Prac.Ato7〔/M,86:3833(1989)，其通過引用整體并入本文。生產(chǎn)人源化Mab的技術(shù)描述于例如Jones等人，Atowe，321:522(1986)，Riechmann等人，M^re,332:323(1988),Verhoeyen等人，Science,239:1534(1988),Carter等人，細(xì)c.淑7爿a7dWX4，89:4285(1992),Sandhu，Wev.說Wec/.,12:437(1992)和Singer等人，J./柳/77朋.，150:2844(1993)，其每個(gè)通過引用整體并入本文?？蛇x地，完全人抗體可從轉(zhuǎn)基因非人的動(dòng)物獲得。參JE，例如，Mendez等人，AtoweGew幼"，15:146-156(1997);美國專利第5,633,425號(hào)。例如，可從具有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中回收人抗體。小鼠體液免疫系統(tǒng)通過滅活內(nèi)源免疫球蛋白基因并引入人免疫球蛋白基因座而被人源化。人免疫球蛋白基因座極其復(fù)雜，并包含總共占人類基因組近0.2%的大量離散區(qū)段。為了確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生足夠的抗體諉，必須將人重鏈和輕鏈基因座的大部分引入小鼠基因組。這是以逐步過程實(shí)現(xiàn)的，開始于形成含有胚系構(gòu)型的人重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的酵母人工染色體(YAC)。由于每個(gè)插入物的大小是大約1Mb，YAC的構(gòu)建要求免疫球蛋白基因座的重疊片段的同源重組。經(jīng)由含有YAC的酵母球芽與小鼠胚胎干細(xì)胞的融合，將兩個(gè)YAC(—個(gè)含有重鏈基因座而一個(gè)含有輕鏈基因座)分別引入小鼠。然后將胚胎千細(xì)胞克隆微注射于小鼠胚泡。得到的嵌合雄性小鼠根據(jù)其通過其種系傳遞YAC的能力進(jìn)行篩選，并將其與具有鼠抗體產(chǎn)生缺陷的小鼠雜交。繁殖兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系(一個(gè)含有人重鏈基因座而另一個(gè)含有人輕鏈基因座)產(chǎn)生響應(yīng)于免疫接種而產(chǎn)生人抗體的子代。未重排的人免疫球蛋白基因也可經(jīng)由微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移(MMCT)被引入小鼠胚胎干細(xì)胞。參J^，例如，Tomizuka等人，AtoweGew"/",16:133(1997)。在此方法中，含有人染色體的微細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞融合。轉(zhuǎn)移的染色體被穩(wěn)定地保持，并且成年嵌合體顯示適當(dāng)?shù)慕M織特異性表達(dá)。作為替代方案，抗體或抗體片段可從分離自組合免疫球蛋白文庫的人抗體片段衍生。參jS,例如，Barbas等人，METHODS:ACompaniontoMethodsinEnzymology2(方法與酶學(xué)方法的比4交)119(1991)，和Winter等人，爿朋.Aev./附w朋o/,12:433(1994)，其通過引用并入本文。與通過B細(xì)胞永生產(chǎn)生單克隆抗體相關(guān)的許多困難可通過使用噬菌體展示在大腸桿菌中改造和表達(dá)抗體片段來克服?？刹捎孟嗨频牟呗垣@得高親和力scFv。參A，例如，Vaughn等人，Ato,傷Wec/wo/,14:309-314(1996)。通過使用對(duì)應(yīng)于所有已知VH、Vk和Vso基因家族的PCR引物從未免疫的人供體分離V基因，可構(gòu)建廣譜的scFv文庫。擴(kuò)增之后，Vk和V入庫被合并形成一個(gè)庫。將這些片段連接入噬菌粒載體。然后將scFv連接體(Gly4,Ser)3連接于噬菌粒中Vl片段的上游。擴(kuò)增Vh和迷接體-Vl片段并在Jh區(qū)上裝配。將得到的Vh-連接體-Vl片段連接于噬菌粒載體。可使用如上所述的過濾器或使用免疫管(NUNC⑧；MAXISORP⑧)淘選噬菌粒文庫。相似的結(jié)果可通過從免疫的兔的淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞構(gòu)建組合免疫球蛋白文庫和通過在巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中表達(dá)scFv構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn)。#X，例如，Ridder等人，5/otec/mo/ogy，13:255-260(1995)。另外，分離適當(dāng)?shù)膕cFv后，具有更高的結(jié)合親和力和更慢的解離速率的抗體片段可通過親和力成熟過程(諸如CDR3誘變和鏈改組)獲得。#jS，例如，Jackson等人，ik/.O"cen78:181-188(1998);Osbourn等人，/附mw"Cec/wo/ogy,2:181-196(1996)?？贵w片段的另一形式是編碼單個(gè)CDR的肽。CDR狀("最小識(shí)別單位")可通過構(gòu)建編碼感興趣抗體的CDR的基因來獲得。此類基因例如通過使用聚合酶鏈反應(yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)來制備。《A，例:i口、Larrick等人，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology(方法與酶學(xué)方法的比較)2:106(1991);Courtenay-Luck,"GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies"(單克隆抗體的遺傳操作)，選自單克隆抗體產(chǎn)生、改造和臨床應(yīng)用(MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION),Ritter等人(編)，第166-179頁(CambridgeUniversityPress1995);和Ward等人，"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies"(抗體的遺傳操作和表達(dá))，選自MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS(單克隆抗體原理和應(yīng)用)，Birch等人(編)，第137-185頁(Wiley-Liss,Inc.1995)。bsAb可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備，例如，抗CEA紳瘤Ab和抗肽Ab二者分別用胃蛋白酶消化為它們各自的F(ab')2片段。用半胱氨酸還原抗CEA-Ab-F(ab')2以產(chǎn)生Fab'單體單元，其進(jìn)一步與交聯(lián)劑雙(馬來酰亞胺基)己烷反應(yīng)以產(chǎn)生Fab'-馬來酰亞胺部分。用半胱氨酸還原抗肽Ab-F(ab')2，并且純化的、回收的抗肽Fab'-SH與抗CEA-Fab'-馬來酰亞胺反應(yīng)以產(chǎn)生Fab'xFab'雙特異性Ab。可選地，抗肽Fab'-SH片段可與抗CEAF(ab')2偶聯(lián)以產(chǎn)生F(ab')2xFab'構(gòu)建體，或與抗CEAIgG偶聯(lián)以產(chǎn)生IgGxFab'雙特異性構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgGxFab'構(gòu)建體可通過以下以位點(diǎn)特異性的方式制備將抗肽Fab'巰基與已用高碘酸鹽氧化的抗CEAIgG重鏈碳水化合物連接，然后通過與可商業(yè)獲得的酰肼-馬來酰亞胺交聯(lián)劑反應(yīng)而活化。使用的組分Ab可通過已知技術(shù)被嵌合或人源化。嵌合抗體是含有來自嚙齒類動(dòng)物抗體的可變區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的重組蛋白，而抗體分子的剩余部分衍生自人抗體。人源化抗體是其中單克隆抗體的鼠互補(bǔ)決定區(qū)被從鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變鏈轉(zhuǎn)移至人可變區(qū)的重組蛋白。嵌合Ab是通過連接編碼小鼠輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的cDNA片段與編碼人抗體C結(jié)構(gòu)域的片段而構(gòu)建的。由于C結(jié)構(gòu)域不參與抗原結(jié)合，因此嵌合抗體將保留與原始小鼠Ab相同的抗原特異性，但在序列上將更接近人抗體。不過，嵌合Ab仍含有一些小鼠序列，并且仍可以是免疫原性的。人源化Ab僅含有識(shí)別抗原必需的那些小鼠氨基酸。此產(chǎn)物是通過將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸構(gòu)于人抗體框架構(gòu)建的。產(chǎn)生bsAb的其他最近方法包括具有額外的半胱氨酸殘基以便它們比更普通的免疫球蛋白同種型更強(qiáng)地交聯(lián)的改造的重組Ab。#見，例如，F(xiàn)itzGerald等人，戶驗(yàn),"五"g.,10:1221-1225,1997。另一途徑是改造重組融合蛋白質(zhì)，連接具有需要的雙特異性的兩個(gè)或多個(gè)不同的單鏈抗體或抗體片段區(qū)段。參見，例如，Coloma等人，A^we說^ec/.,5:159-163,1997。使用分子工程可產(chǎn)生多種雙特異性融合蛋白質(zhì)。在一種形式中，雙特異性融合蛋白質(zhì)是單價(jià)的，由例如具有一個(gè)抗原的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的scFv和具有第二個(gè)抗原的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段組成。在另一種形式中，雙特異性融合蛋白質(zhì)是二價(jià)的，由例如具有一個(gè)抗原的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的IgG和具有第二個(gè)抗原的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)scFv組成。功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)(也稱為雙抗體)可使用重組方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。參1，例如，Mack等人，Ato/.爿cad92:7021-7025,1995。優(yōu)選的雙特異性抗體是包括MAbMu9的Fv和MAb679的Fv、或MAbMN14的Fv和MAb679的Fv及其人、嵌合化或人源化對(duì)應(yīng)物的那些抗體。MN14以及其嵌合化和人源化對(duì)應(yīng)物公開于美國專利第5,874,540號(hào)。另外優(yōu)選的是包括Mu9或679的一個(gè)或多個(gè)CDR的雙特異性抗體?？贵w還可以是包括III類抗CEA抗體和679的Fv的融合蛋白質(zhì)或雙特異性抗體。包括III類抗CEA的III類抗體在美國專利第4,818,709號(hào)中詳細(xì)討論。在某些實(shí)施方案中，上面討論的bsAbF-18標(biāo)記的可耙向的構(gòu)建體可用于手術(shù)中、血管內(nèi)和內(nèi)窺鏡腫瘤以及損傷檢測、活組織檢查和治療，如美國專利第6,096,289號(hào)所述。實(shí)施例實(shí)施例1.肽IMP272的F-18標(biāo)記使用的第一個(gè)肽是IMP272:DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2畫+1512乙酸鹽緩沖溶液-乙酸1.509g于160mL水中稀釋，并通過力口入lMNaOH調(diào)節(jié)pH然后稀釋至250mL以獲得pH4.03的0.1M溶液。乙酸鋁緩沖溶液-鋁溶液通過將0.1028g的AlCl3六水合物溶解于42.6mLDI水中來制備。4mL小份的鋁溶液與16mL的0.1MNaOAc溶液(pH4)混合，以提供2mMAl貝i液。IMP272乙酸鹽緩沖溶液-肽0.0011g(7.28xl(T7molIMP272)溶解于364的0.1MpH4的乙酸鹽緩沖溶液，以獲得肽的2mM的貯液。F-18標(biāo)記IMP272-3小份的鋁^液置于REACTI-VIAIJM并與50F-18(原始樣品)和3的IMP272溶液混合。溶液在加熱器中于110°C加熱15分鐘，并通過反相HPLC分析。HPLC譜圖(圖1)顯示93%的游離F-18和7%與肽結(jié)合的F-18。向所述反應(yīng)中加入另外10的IMP272溶液，并再次加熱和通過反相HPLC分析(圖2)。HPLC譜圖顯示8%的F-18處于空隙體積，而92%的活性連接至肽。剩余的肽溶液在室溫下與150PBS孵育1小時(shí)，然后通過反相HPLC分析。HPLC(圖3)顯示58%的F-18未結(jié)合，而42%的F-18仍連接至肽。數(shù)據(jù)表明F-18-AL-DTPA絡(luò)合物在與磷酸鹽混合時(shí)可能不穩(wěn)定。反相HPLC-反相HPLC分析在下列條件下進(jìn)行柱WATERSXTERRAMSC185,，4.6x250mm流速1mL/分4中梯度緩沖液緩沖液C，于DI水中的0.1%NH40Ac，緩沖液D，90%乙腈、10%水和0.1%NH4OAc梯度00%緩沖液C至100%緩沖液D,使用30分鐘的線性梯度。運(yùn)行時(shí)間30分鐘尺寸排阻HPLC-尺寸排阻HPLC在下列條件下進(jìn)行柱BIORADBIO-SILTMSEC250,300x7.8mm梯度等度洗脫緩沖液0.2M磷酸鹽pH6.8流速lmL/分鐘運(yùn)4亍時(shí)間30分4中本文附圖中顯示的所有譜圖都是使用PERKINELMER610Tr監(jiān)測F-18的發(fā)射的放射語圖。表1-3分別以表格呈現(xiàn)了圖卜3中顯示的數(shù)據(jù)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>標(biāo)記的肽通過以下純化將標(biāo)記的肽溶液應(yīng)用到1CC(30mg)WATERSHLB柱(部件#186001879)并用300nL水洗滌以除去未結(jié)合的F-18。通過用2x100mL1:1MeOH/H20洗滌柱來洗脫肽。純化的肽在水中于25。C孵育并通過反相HPLC分析(圖4、圖5)。HPLC分析顯示F-18標(biāo)記的IMP272在水中不穩(wěn)定(圖4、圖5)。圖4和圖5的比較顯示在水中孵育40分鐘后約17%的F-18從所述肽釋放。實(shí)施例2.F-18IMP272的免疫反應(yīng)性肽(16piL2mMIMP272，48將)用F-18標(biāo)記并通過尺寸排阻HPLC分析抗體結(jié)合(放射譜圖，圖6至圖9)。尺寸排阻HPLC顯示所述肽結(jié)合hMN-14x679，但不與無關(guān)的雙特異性抗體hMN-14x734結(jié)合(圖8對(duì)比圖9)。實(shí)施例3.用其他金屬的IMP272的F-18標(biāo)記3小份的金屬貯液(6x10—9mol)置于聚丙烯錐形管，并與75F-18(原始樣品)混合，在室溫下孵育2分鐘，然后與20的于0.1MNaOAcpH4緩沖液中的2mM(4xl(T8mol)IMP272溶液混合。溶液在加熱器中于100。C加熱15分鐘，并通過反相HPLC分析。顯示了用銦(圖10)、鎵(圖11)、鋯(圖12)、镥(圖13)和釔(圖14)標(biāo)記IMP272的結(jié)果。實(shí)施例4.用于篩選A1-18F結(jié)合的其他肽的標(biāo)準(zhǔn)F-18肽標(biāo)記條件3nL小份的2mM鋁貯液置于聚丙烯錐形管，并與50^LF-18(原始樣品)混合，在室溫下孵育2分鐘，然后與16^L至20nL的于O.lMNaOAcpH4緩沖液中的2mM肽溶液混合。溶液在加熱器中于IO(TC加熱15分鐘，并通過反相HPLC(PHENOMENEX,GEMINI,5(x,C-18，HOA，250x4.6mmHPLC柱)分析。的肽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>IMP326DTPA-ITC陽NH-NH-Phe-CO-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1477<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>IMP337Ac-D-Ser(P03H2)-D-Ser(P03H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1291IMP338Ac-D-Ser(P03H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1126IMP345DTPA-D-Ser(P03H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH1459IMP349DTPA-D-Cys((H203P)2-CH-CH2-S)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1583IMP361DTPA-Dpr(BrCH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1498IMP366DTPA-Dpr(Ph-S-CH2CO->D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1528IMP368Sym-DTPA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1292IMP369Sym-DTPA-NH-CH(2-Br-Phc-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1517IMP370Sym-DTPA-NH-CH(2-02N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)隱D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1484IMP371DTPA-NH-CH(2-02N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1484IMP372DTPA-Dpr(Ser)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1465IMP373DTPA-Dpr(Sym-DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MFT1753IMP374DTPA-Dpr(Cl-CH2CO-Cys(Et)-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1585D-AIa-D-Lys(HSG)D-Ala-D-Lys(HSG)-NH231IMP375DTPA-Dpr(2-Br-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+廳<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>IMP376DTPA-Cys(H03S-S)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH11558IMP379DTPA-Dpr(2-H2N-Phc-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1497IMP382DTPA-Dpr(H)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH11378IMP383DTPA-Dpr(Gla-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)"NH2MH+1507IMP384DTPA-Dpr(2-HO-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1541>-Ala-D-Lys(HSG)"D-Ala-D-Lys(HSG>-NH2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>IMP385DTPA-Dpr(Dpr)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MIT1464IMP38601八-01(2"比咬基曙(:152-(:朋112-(:0->0^1&-0-1^8080)-0-人1&-0-Lys(HSG)-NH2MH+1526IMP387DTPA-Dpr(D-9-蒽基丙氨酸)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1625IMP389DTPA-Dpr(2-羧基p底漆基)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1490i-Ala-D"Lys(HSG)"D-Ala-D-Lys(HSG)-NH肽標(biāo)記篩選研究的結(jié)果大多數(shù)DTPA衍生物顯示與IMP272的標(biāo)記相當(dāng)?shù)臉?biāo)記。例外的是，在半胱氨酸側(cè)鏈上攜帶雙膦酸鹽基團(tuán)的IMP349標(biāo)記非常差。DOTA配體未結(jié)合A1-18F。IMP326的ITCDTPA配體未結(jié)合A1-18F以及DTPA。IMP331的NTA配體未結(jié)合A1-18F。IMP332的EDTA配體結(jié)合A1-18F但不如DTPA。對(duì)稱DTPA配體未結(jié)合A1-18F。測試的膦酸鹽和磷酸鹽基團(tuán)在測試的條件下與A1-18F結(jié)合的不好。篩選確實(shí)顯示連接于DTPA附近的基團(tuán)可影響A1-18F-DTPA絡(luò)合物的穩(wěn)定性。篩選顯示IMP375標(biāo)記得更好并形成比IMP272顯著更加穩(wěn)定的絡(luò)合物。IMP375標(biāo)記得良好并且在水中穩(wěn)定(圖15、圖16),但是血清穩(wěn)定性應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)，以用于體內(nèi)用途(圖17、圖18)。肽標(biāo)記篩選研究僅考察了A1-18F的結(jié)合。一些用A1，F(xiàn)標(biāo)記得不好的肽可用另一種結(jié)合F-18的金屬更好地標(biāo)記。肽合成通過使用Fmoc策略的固相肽合成來合成肽。通過使用Fmoc/Aloc保護(hù)基團(tuán)以允許差異的脫保護(hù)而將基團(tuán)加至二氨基氨基酸的側(cè)鏈。通過Dangles等人(J.CAew.1987，52:4984曙4993)的方法除去Aloe基團(tuán)，不同的是哌啶以1:1的比例加入使用的乙酸。不對(duì)稱四叔丁基DTPA的制備如McBride等人所述(美國專利申請(qǐng)公布第US2005/0002945Al號(hào)，申請(qǐng)第10/776,470號(hào)，公布日期2005年1月6日)。三叔丁基DOTA、對(duì)稱四叔丁基DTPA和ITC-千基DTPA獲自MACROCYCLICS。Aloc/Fmoc賴氨酸和Dap(二氨基丙酸衍生物(也稱為Dpr))獲自CREOSALUS⑧或BACHEM⑧。Sieber酰胺樹脂獲自NOVABIOCHEM。其余的Fmoc氨基酸獲自CREOSALUS、BACHEM、PEPTECH⑧或NOVABIOCHEM。IMP272根據(jù)描述合成(McBride等人，美國專利申請(qǐng)公布第20040241158Al號(hào)，申請(qǐng)第10/768,707號(hào)，2004年12月2日)。IMP288根據(jù)描述制備(McBride等人，丄他c/Md,2006，47:1678-1688)。IMP326肼肽(IMP319)使用Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(OBut)-OH、Fmoc畫D-Lys(Aloc)國OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和4-(Boc-NH-NH-)C6H4-C02H以所述順序在Sieber酰胺樹脂上制備。4-(Boc-NH-NH-)C6H4-C02H通過將Boc二碳酸鹽加入于二噁烷氫氧化鈉溶液中的4-肼基苯曱酸來制備。添加Boc-酰肼后，除去側(cè)鏈Aloe基團(tuán)，并將三苯曱基-HSG-OH基團(tuán)加到賴氨酸的側(cè)鏈上。然后用TFA從樹脂解離肽，并通過HPLC純化，以獲得需要的肼二-HSG肽IMP319(Mtf1201)。然后將酰肼肽(0.0914g)與于3mL0.1M磷酸鈉pH8.2中的0.0650gITC-千基DTPA混合。用1MNaOH調(diào)節(jié)所述溶液的pH，以使pH保持在pH8.2。肽和ITC-千基DTPA之間的反應(yīng)完成后，通過HPLC純化肽軛合物。IMP329通過將1.0422g的去鐵胺曱磺酸酯(1.59xl(T3mol)和于10mL1:1曱醇/水中的0.2835g(1.59xl(T3mol)的硫羰基二咪唑混合來制備去鐵胺異硫氰酸酯。加入三乙胺0.23mL，2.5小時(shí)后通過反相HPLC純化反應(yīng)，以獲得去鐵胺異硫氰酸酯MNa+625。肼肽IMP319(0.0533g、4.4xl(T5mol，Mtf1201)與于磷酸鈉緩沖液pH8.1中的0.0291g去鐵胺異^ifu氰酸酯混合兩小時(shí)，然后通過HPLC純化以獲得需要的產(chǎn)物MH+1804。IMP331下列氨基酸以所示順序連接至Sieber酰胺樹脂(0.58mmol/g)Sieber酰胺樹脂F(xiàn)moc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH。除去Aloc基團(tuán)，并將Trt-HSG-OH加至賴氨酸的側(cè)鏈。除去Fmoc，然后以所述順序添加Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Asp-OBut(0.5g樹月旨)。除去Fmoc,并用3mL叔丁基溴乙酸酯和3.6mL二異丙基乙胺在3.4mLNMP中使Asp的氮烷基化過夜。用TFA從樹脂解離肽，并通過反相HPLC純化，以獲得需要的肽MH"1240。IMP332肽在3gSieber酰胺樹脂(0.58mmol/g)上制備。下列氨基酸以所示順序添加至樹脂F(xiàn)moc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Dpr(Fmoc)畫OH。樹脂分成幾部分以用于后續(xù)合成。取出一克樹脂，并除去二氨基丙酸上的Fmoc基團(tuán)。用3mL叔丁基溴乙酸酯、3.6mL二異丙基乙胺和3.4mLNMP使肽烷基化過夜。然后除去側(cè)鏈Aloc基團(tuán)并添加Trt-HSG-OH基團(tuán)。然后將肽從樹脂解離，并通過HPLC純化以獲得產(chǎn)物MH1"1327。IMP333肽使用1g與用于制備IMP332相同的樹脂制備。將DTPA四叔丁基酯(美國專利公布第20050002945號(hào))添加至Dpr基團(tuán)的兩個(gè)胺上。然后除去Aloc基團(tuán)，并添加Trt-HSG-OH。然后將肽解離，并通過HPLC純化以獲得需要的產(chǎn)物MIT1845。IMP334肽在1gRink酰胺樹脂(0.7mmol/g)上制備，并以所示順序添力口下歹'J氨基酸Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D匿Glu(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Ser(But)-OH。除去Aloc基團(tuán)，并添加三苯曱基-HSG-OH。用TFA從樹脂解離肽。通過從醚中沉淀收集粗肽并干燥。高碘酸鈉0.33g溶于15mL水。粗肽溶于1mL0.5M磷酸鈉pH7.6、3mL水和1mL高碘酸鹽溶液。在2小時(shí)內(nèi)以一毫升的增量另外添加3mL高碘酸鹽。然后通過反相HPLC純化所述混合物，并凍干以獲得醛IMP289HC0-C0-D-Lys(HSG)-D-Glu國D畫Lys(HSG)-麗2MfT959。阿倫膦酸鈉(Alendronate,0,0295g，CALBIOCHEM⑧)溶于150pL0.1MNaOAcpH4。肽IMP289(0.0500g)溶于100pL13%于水中的異丙醇。添加氰基硼氫化鈉，并通過HPLC純化所述混合物以獲得需要的產(chǎn)物Mtf1192。IMP337&IMP338肽在Sieber酰胺樹脂上制備，使用以所示順序添加的下列氨基酸Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)誦OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Ac20。除去Aloc基團(tuán)，并向賴氨酸的側(cè)鏈添加Trt-HSG-OH基團(tuán)。將肽從樹脂解離，并通過HPLC純化以獲得需要的產(chǎn)物IMP3371291和IMP338Mlf1126。IMP345肽在Sieber酰胺樹脂上制備，使用以所示順序添加的下列氨基酸Fmoc國D-Lys(Aloc)隱OH、Fmoc隱D隱Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D誦Ser(PO(OBzl)OH)-OH和四叔丁基DTPA。除去Aloe基團(tuán)，并向賴氨酸的側(cè)鏈添加Trt-HSG-OH基團(tuán)。將肽從樹脂解離，并通過HPLC純化以獲得需要的產(chǎn)物IMP345Mffl459。IMP349肽IMP347DTPA-D-Cys-D-Ala-D-Lys(HSG)誦D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2在Sieber酰胺樹脂上制備，使用以所示順序添加的下列氨基酸Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt隱HSG誦OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D誦Lys(Fmoc)隱OH、Trt畫HSG-OH,切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和四叔丁基DTPA。將肽從樹脂解離，并通過HPLC純化以獲得需要的產(chǎn)物IMP347Mtfl395。肽IMP3470.0446g(3.2xl(T5mol)與于3mL水中的0.4605g(2.4xl(T3mol)亞乙烯基雙(膦酸)(Degenhardt等人，《/Og.1986，51:3488-3490)混合，并用逐滴添加的1MNaOH將所迷溶液調(diào)節(jié)至pH6.5。反應(yīng)攪拌過夜，并通過添加過量的亞乙烯基雙(膦酸)將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)至pH1.49?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜，然后通過HPLC純化以獲得需要的肽IMP349MH+1583。IMP361肽在Sieber酰胺樹脂上制備，使用以所示順序添加的下列氨基酸Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D隱Ala-OH、Aloc曙D-Lys(Fmoc)-OH、Trt畫HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Dap(Aloc)-OH和四叔丁基DTPA。除去Dap側(cè)鏈上的Aloc,并用溴乙酸酐添加溴乙酰基。粗產(chǎn)物通過HPLC純化以獲得需要的肽IMP361(Mlf1498)。IMP366肽通過與IMP361相同的方法制備，最后添加笨硫乙酸。粗產(chǎn)物通過HPLC純化以獲得產(chǎn)物IMP366MH^1528。IMP368肽的制備參見IMP349，除了未添加半胱氨酸殘基，并且使用對(duì)稱四叔丁基DTPA(MACROCYCLICS⑧)替代非對(duì)稱DTPA，以在純化后獲得需要的產(chǎn)物IMP368MH+1292。IMP369肽的制備參見IMP349,但是添加Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸替代D-Cys和添加對(duì)稱四叔丁基DTPA替代DTPA四叔丁基酯的非對(duì)稱形式。純化粗肽以獲得需要的產(chǎn)物MH"1517。IMP370肽的制備參見IMP369,除了使用？1110011-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸替代溴。通過HPLC純化后獲得需要的產(chǎn)物Mtf1484。IMP371肽的制備參見IMP370，除了使用非對(duì)稱四叔丁基DTPA替代對(duì)稱形式。通過HPLC純化后獲得需要的產(chǎn)物MH"1484。IMP372肽的制備參見IMP361,但是使用Fmoc-Ser(But)-OH將Ser連接至Dap側(cè)鏈。除去Fmoc,將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MH"1465。IMP373肽的制備參見IMP361，但是使用對(duì)稱四叔丁基酯DTPA將Sym-DTPA連接至Dap側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物Mlf1753。IMP374肽的制備參見IMP361,但是將Fmoc-S-乙基半胱氨酸添加至Dap側(cè)鏈，然后經(jīng)由氯乙酸酐添加氯乙?；?于半胱氨酸氮上)。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MHM585。IMP375肽的制備參見IMP361，但是將Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸添加至Dap側(cè)鏈，然后切割Fmoc基團(tuán)。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物Mtf1603。IMP376肽的制備參見IMP361，但是在第二個(gè)丙氨酸后添加Fmoc-D-Tyr(But)-OH,然后是Fmoc-Cys(S03H)和四叔丁基DTPA。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MH""1558。IMP379肽的制備參見IMP361，但是將Boc-2-Abz-OH添加至Dap的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MH"1497。IMP382肽的制備參見IMP361，但是從Dap的側(cè)鏈除去Aloc。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MfTl378。IMP383肽的制備參見IMP361，但是將Fmoc-Gla(OBut)2-OH添加至Dap的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物Mlf-C021507。IMP肽的制備參見IMP361,但是將Fmoc-Boc-S3-氨基^-0鞋基苯基)丙酸添加至Dap的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MlT1541。IMP385肽的制備參見IMP361，但是將Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH添加至D叩的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物Mtf1464。IMP386肽的制備參見IMP361，但是將Boc-D-2-吡^t基丙氨酸-OH添加至Dap的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物Mlf1526。IMP387肽的制備參見IMP361，但是將Fmoc-D-9-蒽基丙氨酸-OH添加至Dap的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MH+1625。IMP389肽的制備參見IMP361,但是將雙-Boc-哌"秦-2-羧酸鹽添加至Dap的側(cè)鏈。將肽從樹脂解離，并純化以獲得需要的產(chǎn)物MPf1664。實(shí)施例5.體內(nèi)研究向攜帶GW-39人結(jié)腸異種移植肺瘤(100-500mg)的棵鼠注射雙特異性抗體hMN-14xm679(1.5x10-1°mol)。在注射F-18標(biāo)記的肽(8.8^Ci，1.5x10-Umol)之前，允許抗體清除24小時(shí)。在注射后3、24和48小時(shí)對(duì)所述動(dòng)物成像。異種移植腫瘤通過PET掃描檢測與雙特異性hMN-14xm679結(jié)合的F-18標(biāo)記的肽而纟皮清晰成像，雙特異性hMN-14xm679通過hMN-14與腫瘤抗原的結(jié)合而定位于肺瘤。實(shí)施例6.血清穩(wěn)定的F-18標(biāo)記肽的制備和用途IMP449NOTA誦ITC千基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D隱Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH^1459肽IMP448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH"1009在Sieber酰胺樹脂上制備，通過以所示的順序向樹脂添加下列氨基酸Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt誦HSG誦OH、切割A(yù)loc、Fmoc-D誦Tyr(But)-OH、Aloc匿D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、切割A(yù)loc、Fmoc-D陽Ala誦OH，最后切割Fmoc以制備需要的肽。然后將肽從樹脂解離，并通過HPLC純化以制備IMP448，其然后與ITC-千基NOTA偶聯(lián)。肽IMP4480.0757g(7.5xl(T5mol)與0.0509g(9.09xl(T5mol)ITC千基NOTA混合，并溶于imL水。然后向攪拌的肽/NOTA溶液緩慢加入無水碳酸鉀0.2171g。在加入所有碳酸鹽后反應(yīng)溶液為pH10.6。允許反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^夜。14小時(shí)后用1MHC1小心猝滅反應(yīng)，并通過HPLC純化以獲得48mg需要的產(chǎn)物IMP449。-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2IMP449的F-18標(biāo)記肽0.002g(1.37x10"6mol)溶于686(2mM肽溶液)0.1MNaOAcpH4.02。三微升于pH4乙酸鹽緩沖液中的2mMAl溶液與15pL、1.3mCi的F-18混合。所述溶液然后與20的2mMIMP449;容液混合，并在105。C加熱15分鐘。反相HPLC分析顯示35%(RT~10分鐘)的活性連接至肽，而65%的活性在柱的空隙體積洗脫(3.1分鐘)，表明活性與所述肽無關(guān)。粗標(biāo)記的混合物(5^L)與收集的人血清混合，并在37。C孵育。15分鐘后取出小份并通過HPLC分析。HPLC顯示9.8%的活性仍連接至肽(從35%下降)。1小時(shí)后取出另一小份并通過HPLC分析。HPLC顯示7.6%的活性仍連接至肽(從35%下降)，這基本上與15分鐘的譜圖相同。高劑量F-18標(biāo)記使用純化的IMP449的進(jìn)一步研究證明，F(xiàn)-18標(biāo)記的肽在人血清中于37。C下至少一小時(shí)內(nèi)是高度穩(wěn)定的(91%，圖19B),并且在人血清中于37。C下至少四小時(shí)內(nèi)是部分穩(wěn)定的(76%,圖19D)。這些結(jié)果證明，本文公開的F-18標(biāo)記的肽在接近體內(nèi)的條件下顯示充分的穩(wěn)定性以用于F-18成像研究。于~400nL水中的F-1821mCi與于0.1MpH4NaOAc中的92mMA1C13混合。加入肽IMP44960(0.01M，6xl(T7mol，于0.5NaOH中，pH4.13)，并將溶液加熱至ll(TC，15分鐘。然后通過以下純化粗標(biāo)記的肽將反應(yīng)溶液置于1ccWatersHLB柱的桶中，并用水洗脫以除去未結(jié)合的F-18，然后用1:1EtOH/H20以洗脫F-18標(biāo)記的肽。粗反應(yīng)溶液通過所述柱進(jìn)入廢液瓶，并用三個(gè)1毫升水的級(jí)分(18.97mCi)洗滌柱。然后將HLB柱置于新瓶上，并用2x2001:1EtOH/H20洗脫來收集標(biāo)記的肽(1.83mCi)。在所有的洗脫完成后柱保留0.1mCi的活性。小份的純化的F-18標(biāo)記肽(20pL)與200pL收集的人血清混合，并在37。C加熱。小份通過反相HPLC分析(如上所述)。結(jié)果顯示在37。C下在人血清中孵育零時(shí)(圖19A)、1小時(shí)(圖19B，91%標(biāo)記的肽)、2小時(shí)(圖19C,77%標(biāo)記的肽)和4小時(shí)(圖19D，76%標(biāo)記的肽)的F-18標(biāo)記的純4匕IMP449的相對(duì)穩(wěn)定性。還觀察到F-18標(biāo)記的IMP449在TFA溶液中穩(wěn)定，其有時(shí)用于反相HPLC色謙。觀察到的本文所述示例性F-18標(biāo)記的分子在TFA中的穩(wěn)定性與在人血清中的穩(wěn)定性之間顯示廣義相關(guān)性。權(quán)利要求1.一種用F-18標(biāo)記分子的方法，其包括a)通過添加金屬形成F-18金屬絡(luò)合物來活化所述F-18；b)將所述F-18金屬絡(luò)合物連接至分子。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述絡(luò)合物連接至所迷分子上的螯合基團(tuán)。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述分子是蛋白質(zhì)或肽。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述金屬選自由鋁、鎵、銦、镥或鉈組成的組。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述F-18標(biāo)記的分子在水溶液中穩(wěn)定。6.—種用F-18標(biāo)記分子的方法，其包括a)通過添加硼形成F-18硼絡(luò)合物來活化所述F-18;b)將所述F-18硼絡(luò)合物連接至分子。7.—種F-18標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽，其包含連接至所述蛋白質(zhì)或肽的F-18金屬絡(luò)合物或F-18硼絡(luò)合物。8.—種通過正電子成像術(shù)(PET)的F-18成像方法，其包括a)通過添加IIIA族元素形成F-18IIIA族元素絡(luò)合物來活化F-18;b)將所述絡(luò)合物連接至分子以形成F-18標(biāo)記的分子；c)在其中所述標(biāo)記的分子被定位至一種或多種細(xì)胞、組織或器官的條件下，將所述分子施用于受治療者；和d)通過PET掃描對(duì)所述F-18標(biāo)記的分子的分布進(jìn)行成像。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述F-18標(biāo)記的分子被施用于所述受治療者而無需從未標(biāo)記的分子中純化所述F-18標(biāo)記的分子。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中將所述絡(luò)合物連接至所迷分子而無需從未絡(luò)合的F-18中純化含有F-18的絡(luò)合物。11.一種用F-18標(biāo)記分子的方法，其包括在允許所述F-18與硼結(jié)合的條件下將F-18添加至硼標(biāo)記的分子。12.—種用F-18標(biāo)記分子的方法，其包括在允許所述F-18與金屬結(jié)合的條件下將F-18添加至所述金屬標(biāo)記的分子。13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述F-18標(biāo)記的分子用于成像受體。14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述F-18標(biāo)記的分子用于成像腫瘤。15.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使用抗體、抗體片段或抗體構(gòu)建體將所述F-18標(biāo)記的分子耙向感興趣的部位。16.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使用雙特異性抗體將所述F-18標(biāo)記的分子靶向感興趣的部位。17.如^f又利要求16所述的方法，其進(jìn)一步包^^:i)將雙特異性抗體施用于受治療者，所述雙特異性抗體具有至少一個(gè)針對(duì)可靶向構(gòu)建體的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)針對(duì)被靶向抗原的結(jié)合位點(diǎn)，其中所述^^皮靶向抗原的存在指示疾病或疾患；ii)允許足量的時(shí)間，以使未與被靶向抗原結(jié)合的雙特異性抗體從循環(huán)中清除；和iii)將F-18標(biāo)記的可靶向的構(gòu)建體施用于所述受治療者。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述被靶向的抗原是腫瘤相關(guān)抗原。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述被靶向的抗原存在于病原生物上。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述病原體是病毒、細(xì)菌、真菌、酵母或微生物。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述病毒選自由以下組成的組人免疫缺陷病毒(mv)、皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、貓白血病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細(xì)小樣病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳癌病毒、水痘帶狀皰滲病毒、登革病毒、風(fēng)滲病毒、麻滲病毒、腺病毒、人T細(xì)胞白血病病毒、埃巴病毒、鼠白血病病毒、膃腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、疣病毒和藍(lán)舌病毒；或所述細(xì)菌選自由以下組成的組無乳鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血桿菌、梅毒螺旋體、菜姆病螺旋體、銅綠假單胞菌、麻風(fēng)桿菌、流產(chǎn)布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌和破傷風(fēng)梭菌。22.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述被耙向的抗原選自由以下組成的組結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD80、HLA-DR、Ia、Ii、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA、EGFR、HER2/neu受體、TAG-72、EGP隱1、EGP畫2、A3、KS-1、Le(y)、SIOO、PSMA、PSA、生腱蛋白、葉酸受體、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、P1GF、ILGF-1、壞死抗原、IL-2、IL-6、TlOl、MAGE或這些抗原的組合。23.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述螯合劑是NOTA(1,4,7-三氮雜-環(huán)壬烷-N,N',N"-三乙酸)基團(tuán)。24.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述肽是IMP449(NOTA-ITC千基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。全文摘要本申請(qǐng)公開了用于例如PET成像技術(shù)的F-18標(biāo)記分子的組合物和合成方法以及用途。在特定的實(shí)施方案中，標(biāo)記的分子可以是肽或蛋白質(zhì)，雖然其他類型的分子(包括但不限于適體、寡核苷酸和核酸)可被標(biāo)記并用于此類成像研究。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)-18標(biāo)記可通過形成金屬絡(luò)合物并將F-18-金屬絡(luò)合物結(jié)合至螯合部分(諸如DOTA、NOTA、DTPA、TETA或NETA)而與靶向分子軛合。在其他的實(shí)施方案中，金屬可首先與螯合基團(tuán)軛合，隨后F-18結(jié)合至金屬。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)-18標(biāo)記的部分可包含可靶向的軛合物，其可與雙特異性或多特異性抗體聯(lián)合使用，以將F-18靶向到與疾病、醫(yī)療狀況或病原體相關(guān)的細(xì)胞或組織上表達(dá)的抗原。示例性結(jié)果顯示F-18標(biāo)記的可靶向軛合物肽于37℃下在人血清中穩(wěn)定數(shù)小時(shí)，有足夠的時(shí)間進(jìn)行PET成像分析。文檔編號(hào)A61K49/00GK101568352SQ200780048376公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日發(fā)明者大衛(wèi)·M·高德寶,威廉·J·麥克布萊德申請(qǐng)人:免疫醫(yī)學(xué)股份有限公司