專利名稱：治療耳蝸和前庭病癥的方法
本申請依據(jù)35 U.S.C.119(e)，要求2006年10月27日提交的美國臨時申請系列號60/863,144的權(quán)益。以上提到的相關(guān)美國專利申請的完全公開內(nèi)容結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及藥理學(xué)和神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域，并涉及保護哺乳動物內(nèi)耳和聽神經(jīng)細胞(包括耳蝸和前庭系統(tǒng))免受傷害或退化的方法。更具體地講，本發(fā)明提供使用某些氨基甲酸酯化合物治療括耳蝸和前庭紊亂的方法。
相關(guān)領(lǐng)域的描述 聽覺缺失和平衡障礙是影響數(shù)以百萬人群的嚴(yán)重殘疾。聽力損害可歸咎于很多原因，包括感染、機械性損傷、暴露于強聲、老化和損傷外周聽覺系統(tǒng)的神經(jīng)元和/或毛細胞的化學(xué)誘導(dǎo)的耳毒性。
外周聽覺系統(tǒng)由聽覺感受器、螺旋器中的毛細胞、和初級聽覺神經(jīng)元、耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元構(gòu)成。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(“SGN”)是初級傳入聽覺神經(jīng)元，其將來自外周聽覺受體、螺旋器中的毛細胞的信號通過耳蝸神經(jīng)傳遞到大腦。第八腦神經(jīng)將螺旋神經(jīng)節(jié)中的初級聽覺神經(jīng)元連接到腦干上。第八腦神經(jīng)還連接前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(“VGN”)，其是負責(zé)平衡的初級傳入感覺神經(jīng)元，并將來自內(nèi)耳的橢圓囊、球狀囊和壇狀體的信號傳遞給腦，傳遞給腦干。螺旋神經(jīng)節(jié)和毛細胞中的初級傳入神經(jīng)元的破壞一直是聽覺損傷的主要原因。外周聽覺系統(tǒng)的損傷是大多數(shù)聽覺缺失的原因(Dublin，1976；Rybak，1986；Lim，1986；Pryor，1994)。
聽覺缺失或損傷是人殘疾的一種常見原因。沿從外耳道至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的聽覺傳導(dǎo)路無論何處的損傷均可導(dǎo)致聽力喪失和平衡障礙。可將聽覺感受器分為外耳和中耳、內(nèi)耳和聽神經(jīng)及中央聽覺傳導(dǎo)路。雖然物種與物種之間具有某些變化，但所有哺乳動物的通用特征是相同的。聽覺刺激被機械性地通過外耳道、鼓膜和聽骨鏈傳輸?shù)絻?nèi)耳。
中耳和乳突一般充滿空氣。外耳和中耳的疾病通過干擾這種機械性傳導(dǎo)，通常產(chǎn)生傳導(dǎo)性耳聾。傳導(dǎo)性聽覺缺失的常見原因包括外耳道阻塞，可能由于耳道閉鎖或耳垢引起；鼓膜增厚或穿孔，可能由外傷或感染引起；聽骨鏈組件的固定或吸收；以及因鼓管阻塞，導(dǎo)致流體充滿中耳腔。
通過內(nèi)耳中的神經(jīng)上皮細胞(毛細胞)和SGN，將聽覺信息從機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為神經(jīng)性指導(dǎo)的電脈沖。SGN的所有中央纖維在腦橋腦干的耳蝸神經(jīng)核中形成突觸。從耳蝸神經(jīng)核中的聽覺發(fā)射是雙側(cè)性的，其主要核位于下丘、丘腦的內(nèi)側(cè)膝狀體和顳葉的聽覺皮層。涉及聽覺的神經(jīng)元數(shù)目從耳蝸到聽覺腦干和聽覺皮層顯著地增加。所有聽覺信息都通過有限數(shù)目的毛細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，毛細胞是內(nèi)耳的感覺感受器，被稱之為內(nèi)毛細胞，數(shù)目比較少，是十分關(guān)鍵重要的，原因是它們形成具有約90％初級聽覺神經(jīng)元的突觸。
通過比較，在耳蝸神經(jīng)核的水平上，所測定的有關(guān)神經(jīng)單元的數(shù)目數(shù)十萬計。這樣，聽覺末梢中的相對較少的細胞的損傷或疾病即可導(dǎo)致重大的聽力喪失或平衡障礙。因此，感覺神經(jīng)損失的很多原因都歸因于內(nèi)耳的損傷。這種聽力損失和平衡障礙可能是進行性的。另外，由于隨著動物的老化而引起的耳解剖學(xué)的變化，聽力明顯急劇變差。
在胚胎形成過程中，前庭神經(jīng)節(jié)、螺旋神經(jīng)節(jié)和聽囊均源于相同的神經(jīng)元外胚層、聽板。因此，前庭和聽覺系統(tǒng)共有很多特性，包括毛細胞的外周神經(jīng)元神經(jīng)分布和中央突起(central projections)至腦干核。這兩種系統(tǒng)對耳毒素都是敏感的，耳毒素包括治療性藥物、抗腫瘤劑、食物或藥物中的污染物以及環(huán)境和工業(yè)的污染物。毒性藥物包括廣泛使用的化學(xué)治療劑順鉑及其類似物(Fleischman等，1975；Stadnicki等，1975；Nakai等，1982；Berggren等，1990；Dublin，1976；Hood和Berlin，1986)、治療革蘭氏陰性菌引起的感染的通常使用的氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素(Sera等，1987；Hinojosa和Lerner，1987；Bareggi等，1990)、奎寧及其類似物、水楊酸鹽及其類似物和髓袢利尿劑。
這些藥物對聽細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性作用通常是其治療有效性的限制因素。例如，氨基糖苷類抗菌藥，如慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等已知具有嚴(yán)重的毒性，特別是耳毒性和腎毒性，其減少了這些抗菌劑的用途(參見Goodman and Gilman第六版的治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，A.Goodman Gilman等，eds；Macmillan Publishing Co.，Inc.，New York，pp.1169-71(1980)或最新版本)。氨基糖苷類抗菌藥通常被用作廣譜的抗菌藥，其對例如革蘭氏陽性、革蘭氏陰性和抗酸性細菌均有效。
氨基糖苷類抗菌藥主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的感染，并例如與青霉素類聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用。正如由該族通用名稱中所隱含的，所有氨基糖苷類抗生素都在糖苷鍵上包含氨基糖。中耳炎是一種用于描述中耳感染的術(shù)語，其感染非常普遍，尤其是在兒童中。對中耳的感染，一般例如以應(yīng)答性或預(yù)防性方式全身性給予抗生素。全身性給予抗生素對抗中耳感染一般在中耳中導(dǎo)致一種延長的滯后時間達到治療水平，并且為達到這樣的水平需要較高的初始劑量。這些缺點使得其獲得治療水平的能力復(fù)雜化，并可能妨礙一起使用的其它抗生素的用途。
當(dāng)感染到達晚期，全身給藥通常是最有效的，但在該時間點上，可能已經(jīng)造成對中耳和內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的永久損傷。明確地講，耳毒性是抗生素用藥的一種劑量限定型副作用。例如，每日給予2g鏈霉素60-120日的近75％的患者呈現(xiàn)出某些前庭損傷，而每日用藥1g，發(fā)病率則降低到25％。在每日接受1g鏈霉素超過一周的約4-15％患者中，也可發(fā)現(xiàn)聽力損失，發(fā)展成為可測定的聽力缺失。這種聽力損失可進一步發(fā)展，并且如果持續(xù)治療，可導(dǎo)致完全永久的耳聾。
另外，耳毒性也是順鉑的一種嚴(yán)重的劑量限定型副作用，順鉑是一種鉑配位絡(luò)合物，已被證實對多種人癌有效，包括睪丸癌、卵巢癌、膀胱癌和頭頸癌。順鉑損傷聽覺和前庭系統(tǒng)(Fleischman等，1975；Stadnicki等，1975；Nakai等，1982；Carenza等，1986；Sera等，1987；Bareggi等，1990)。水楊酸酯類，如阿司匹林，因其抗炎、鎮(zhèn)痛、退熱和抗凝血作用而成為最常用的治療藥物。不幸的事，它們具有耳毒性副作用。它們通常導(dǎo)致耳鳴(“耳中有響聲”)和短暫性聽力喪失(Myers和Bernstein，1965)。但是，如果長期高劑量使用該藥物，這種聽力損害則可能變成持續(xù)性的且不可逆的，如見臨床報道(Jarvis，1966)。
除耳毒性藥物外，很多種疾病和退行性病癥都不利地影響內(nèi)耳毛細胞和相關(guān)的神經(jīng)元。例如，免疫介導(dǎo)的耳病，如免疫介導(dǎo)的耳蝸或前庭病癥(IMCVD)，對耳鼻喉科專家來講是一種持續(xù)存在的治療挑戰(zhàn)。這些疾病代表一種感覺神經(jīng)性聽力喪失的綜合征，其通常與被確認(rèn)為是由于自身免疫機制的眩暈、耳鳴和耳脹(aural fullness)有關(guān)。IMCVDs的后遺癥包括破壞性殘疾，如深度耳聾和嚴(yán)重的前庭功能障礙。可應(yīng)用免疫抑制性藥物(如環(huán)磷酰胺)和抗風(fēng)濕劑(如甲氨蝶呤)治療IMCVD，但是它們伴隨著功效變化、起效慢和有時存在嚴(yán)重毒性問題(Rahman，MU等Curr.Opin.Rheumatol.，May；13(3)184-9，(2001))。
術(shù)語“免疫介導(dǎo)的耳紊亂”或“免疫介導(dǎo)的耳病”指通過諸如自身免疫或炎癥響應(yīng)的基于免疫的機制引起的耳功能損傷。耳的任何部位都可能受影響，但內(nèi)耳通常是最易受到損傷的。免疫介導(dǎo)的耳病包括但不限于免疫介導(dǎo)的耳蝸或前庭病癥(IMCVD)、免疫介導(dǎo)的梅尼爾氏病、自身免疫性耳病(AIED)、科根綜合征和韋格納氏肉芽腫病。涉及免疫介導(dǎo)的耳病的綜合征包括聽力損害(包括一側(cè)或兩側(cè)耳的全部或部分聽力損失)、眩暈、耳鳴、耳脹、耳痛、耳液溢/慢性中耳炎和TM穿孔。
影響內(nèi)耳的另一種疾病包括梅尼爾氏病(Meniere’s disease)。梅尼爾氏病的典型發(fā)作之前是一只耳脹，聽力波動或耳鳴也可能在該發(fā)作之前出現(xiàn)。其完全發(fā)作通常包括嚴(yán)重眩暈、不平衡、惡心和嘔吐，并可能持續(xù)2-4小時。梅尼爾氏病可引起無警告下突然跌倒，這是由前庭反射突然激活所引起。這種疾病不是致命性的，但可使人極端失去能力，并引起漸進性聽力缺失。梅尼爾氏病相當(dāng)普遍，僅在美國約就有0.2％的人群或600,000人中出現(xiàn)過該病。其原因尚未清楚，但認(rèn)為是由于病毒和/或免疫過程影響內(nèi)耳，但最終的結(jié)果通常是耳蝸和/或前庭系統(tǒng)的退化。
耳鳴是患者聽到的一種清脆鈴聲的、嘶嘶聲的或吼聲的聲音，它并不是由環(huán)境中的任何聲音引起。耳鳴非常普遍，影響約3千6百萬美國人，其中大約6％的一般人群患有嚴(yán)重癥狀。耳鳴是一種癥狀而不是一種特定的疾病，其可能有很多原因，包括因暴露于高噪聲的機械損傷、退行性疾病，包括梅尼爾氏病，但大多數(shù)耳鳴由耳蝸或前庭神經(jīng)損傷所引起。很多種常見藥物也可引起耳鳴，包括阿司匹林、NSAIDS、髓袢利尿劑(如呋塞米(Lasix))、抗生素、奎寧和很多種類的化學(xué)治療劑，如以上所述的順鉑。
因此，目前對預(yù)防、降低或治療內(nèi)耳疾病的發(fā)作和/或嚴(yán)重性以及涉及內(nèi)耳組織(尤其是內(nèi)耳毛細胞)和相關(guān)的聽力神經(jīng)的聽力損傷的方法，存在著需求。特別令人關(guān)注的是作為耳毒性治療藥物的一種不需要的副作用出現(xiàn)的這些病癥，所述藥物包括順鉑及其類似物、氨基糖苷類抗生素、水楊酸酯及其類似物或者髓袢利尿劑，以及涉及內(nèi)耳毛細胞和相關(guān)神經(jīng)元的退行性疾病，包括局部缺血。另外，目前對能允許使用較高且由此更有效的劑量的這些誘發(fā)耳毒性藥物，而同時抑制或降低這些藥物引起的耳毒性的方法，存在著需求。我們所需要的是一種方法，其能為預(yù)防或根治性治療與內(nèi)耳組織損傷、缺失或退化相關(guān)的聽力障礙，尤其是耳毒性誘發(fā)的和涉及內(nèi)耳毛細胞和相關(guān)神經(jīng)元的退行性疾病，提供一種安全、有效且作用延長的方法。
因此，對聽力和平衡障礙以及與毛細胞和/或其支持細胞(包括第八腦神經(jīng))相關(guān)的其它病癥的治療方法一直存在著強烈的需求。本發(fā)明提供保護這些區(qū)域免受毒性藥物和很多種退行性疾病影響的組合物和方法。
對耳蝸或前庭系統(tǒng)或者包括初級聽覺感受器、螺旋器內(nèi)的毛細胞、初級聽覺神經(jīng)元和耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、第八腦神經(jīng)的神經(jīng)元和前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在內(nèi)的聽覺或者前庭神經(jīng)的各種類型的損傷或外傷，可產(chǎn)生深度的且長期的聽力損失或平衡問題或者失去能力的癥狀，如眩暈、惡心和嘔吐。某些這些效應(yīng)通過神經(jīng)元或其它內(nèi)耳的相關(guān)細胞的漸進性死亡，即神經(jīng)退行性變或神經(jīng)元變性所引起。
神經(jīng)元死亡或異常的機制是變化的，并且尚未完全清楚，但是當(dāng)損傷或局部缺血性損傷時，損傷的神經(jīng)元釋放出大量神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，其對周圍神經(jīng)元具有興奮性神經(jīng)毒性(excitotoxic)(Choi等，(1988)，Neuron 1623-634；Rothman等，(1984)，J.Neurosci.41884-1891；Choiend Rothman，(1990)，Ann.Rev.Neurosci.13171-182；David等，(1988)，Exp.Eye Res.46657-662；Drejer等，(1985)，J.Neurosci.45145-151)。谷氨酸是一種帶負電荷的氨基酸，它是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中的一種興奮性突觸遞質(zhì)。雖然在神經(jīng)末梢中谷氨酸濃度可達到毫摩爾范圍，但其細胞外濃度卻保持在較低水平以防止神經(jīng)毒性。已注意到如果谷氨酸以高濃度存在，其可對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性。使用術(shù)語“興奮性神經(jīng)毒性”來描述當(dāng)高濃度應(yīng)用谷氨酸(及其它興奮性氨基酸)時，其可對神經(jīng)元產(chǎn)生細胞毒性作用。
生理上過量釋放、吸收抑制或者兩者可產(chǎn)生高水平的谷氨酸。正常情況下，通過神經(jīng)元和星細胞維持低濃度的細胞外谷氨酸。神經(jīng)元儲存細胞內(nèi)保存的谷氨酸并且調(diào)節(jié)其釋放。參見Reagan，R.F.，Excitotoxicity and Central Nervous System Trauma，in The Neurobiologyof Central Nervous Trauma，New York，Oxford University Press，1994，pp.173-181(Salzman SK，F(xiàn)aden Al，eds)。星細胞通過特定的轉(zhuǎn)運蛋白吸收細胞外谷氨酸，并將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，然后釋放供神經(jīng)元攝取。參見Robinson，M.B.& Dowd LA，Adv Pharmacol，1997；3769-115。在興奮性神經(jīng)毒性過程中，谷氨酸以自身延續(xù)性(self-perpetuating)方式通過神經(jīng)元釋放，導(dǎo)致過量或延長谷氨酸受體的激活。
這種能量衰竭性神經(jīng)元上過量谷氨酸刺激與神經(jīng)支持性星細胞隔離細胞外谷氨酸的毒性水平的能力降低的結(jié)合，通過壞死和細胞凋亡而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。目前正在考察各種干涉方法來降低與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病相關(guān)的神經(jīng)元死亡。另外，在很多慢性神經(jīng)變性病癥中，炎癥和氧化應(yīng)激是病理學(xué)的關(guān)鍵部分。參見Kermer等的Cell TissueRes 298383-395，1999。這些療法包括谷氨酸釋放抑制劑、谷氨酸受體拮抗劑、Ca2+通道阻斷劑、GABA受體激動劑、神經(jīng)節(jié)苷脂、神經(jīng)營養(yǎng)因子、鈣激活中性蛋白酶抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、自由基清除劑、免疫和細胞代謝調(diào)節(jié)劑。
例如，幾種研究已表明在以下病理學(xué)中涉及谷氨酸1)亨延頓氏舞蹈病(HD)(Coyle和Schwartz，(1976)，Nature 263244-246；2)阿耳茨海默氏病(AD)(Maragos等，(1987)，TINS 1065-68；3)癲癇(Nadler等，(1978)，Nature 271676-677)；4)山黧豆中毒(Spencer等，(1986)，Lancet 2391066-1067；5)肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)和關(guān)島帕金森氏癡呆病(Caine等，(1986)，Lancet 21067-1070)以及與休克、局部缺血和再灌注有關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)(參見Dykens等，(1987)，J.Neurochem.491222-1228)。
因此，神經(jīng)元損傷可由包括谷氨酸和天冬氨酸的興奮性氨基酸通過受體的過度刺激引起(參見Lipton等(1994)New Engl.J.Med.330613 621)?，F(xiàn)的確認(rèn)為谷氨酸受體的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)亞型在正常腦功能中具有很多重要的作用，包括突觸傳遞、學(xué)習(xí)和記憶以及神經(jīng)元發(fā)育(參見Lipston等(1994)同上；Meldrum等(1990)Trends Pharm.Sci.11379-387)。但是，谷氨酸受體的NMDA亞型的過度刺激導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的增加和神經(jīng)元細胞死亡，其可通過抗氧化劑調(diào)節(jié)(參見Herin等(2001)J.Neurochem.781307-1314；Rossato等(2002)Neurosci.Lett.318137-140)。
因此，在耳蝸或前庭系統(tǒng)或者包括初級聽覺感受器、螺旋器內(nèi)的毛細胞、初級聽覺神經(jīng)元和耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、第八腦神經(jīng)的神經(jīng)元和前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在內(nèi)的聽覺或者前庭神經(jīng)中的神經(jīng)元和支持細胞的死亡或異常，可在哺乳動物(包括人)中產(chǎn)生深度且持久的聽力損失和/或前庭障礙。因此，目前需要研制能保護哺乳動物內(nèi)耳的細胞免受這種退化，即具有耳保護性的方法和化合物。
發(fā)明既述 本發(fā)明一般涉及神經(jīng)保護的方法，更具體地講，本發(fā)明涉及預(yù)防由損傷、外傷、毒素或急慢性疾病過程導(dǎo)致的哺乳動物內(nèi)耳的神經(jīng)組織和細胞損傷的方法和化合物，所述細胞源于相同的神經(jīng)原外胚層。
本發(fā)明的部分基礎(chǔ)在于發(fā)現(xiàn)給予氨基甲酸酯化合物家族的一或多個成員能對哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)提供一種普遍的神經(jīng)保護作用，并且這種保護作用還包括源于相同的神經(jīng)原外胚層的哺乳動物內(nèi)耳的組件。這包括但不限于耳蝸或前庭系統(tǒng)或在胚胎形成過程中源于相同的神經(jīng)原外胚層的聽覺或前庭神經(jīng)中的那些神經(jīng)元、支持和相關(guān)細胞、聽板，包括前庭神經(jīng)節(jié)、耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、聽囊、初級聽覺感受器，即螺旋器中的毛細胞，以及初級聽覺神經(jīng)元和第八腦神經(jīng)神經(jīng)元。
本發(fā)明提供的神經(jīng)保護作用包括防護由神經(jīng)損傷或創(chuàng)傷以及由神經(jīng)毒性或耳毒性藥物引起的傷害。因此，本發(fā)明提供的神經(jīng)保護或耳保護作用將可用于治療耳毒性藥物和急慢性退行性疾病帶來的損害，所述退行性疾病包括那些影響包括毛細胞和第八腦神經(jīng)的耳蝸或前庭系統(tǒng)的疾病。
本發(fā)明提供的耳保護作用可對損傷或患病的組織發(fā)揮作用，或者可在預(yù)期發(fā)生損傷的過程中或之前以預(yù)防的方式發(fā)揮作用。
本發(fā)明通過單獨給予患者有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯或者連同藥學(xué)上可接受的賦形劑與另一種藥物聯(lián)合給予，在有需要的患者中提供進行耳保護的方法；抑制細胞退化或細胞死亡的方法；治療或預(yù)防耳退行性疾病的方法；或者改善化合物耳毒性作用的方法，如毒素；或者發(fā)揮耳毒性副作用的治療化合物，如抗生素或化學(xué)治療劑。
在各實施方案中，患者(如人)可能患有內(nèi)耳創(chuàng)傷或損傷；或者可患有選自以下的病癥耳毒性藥物暴露、外傷、耳鳴、梅尼爾氏病，包括免疫介導(dǎo)的梅尼爾氏病，免疫介導(dǎo)的耳蝸或前庭紊亂(IMCVD)、自身免疫性耳病(AIED)、科根綜合征以及影響內(nèi)耳的第八腦神經(jīng)的局部缺血性事件。
因此，本發(fā)明提供進行耳保護的方法，其包括給予有需要的患者治療有效量的組合物，其包含至少一種具有式1或式2的化合物
式1
式2 其中R1、R2、R3和R4獨立是氫或C1-C4烷基；而X1、X2、X3、X4和X5獨立是氫、氟、氯、溴或碘。所述式1或式2的C1-C4烷基可以是取代的或未取代的。在本發(fā)明的一方面，C1-C4烷基被苯基取代。該苯基可以是取代的或未取代的。在某些實施方案中，該苯基是未取代的或者被鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基或氰基取代。
在本發(fā)明中，X1、X2、X3、X4和X5可以是氫、氟、氯、溴或碘。在某些實施方案中，X1、X2、X3、X4和X5獨立是氫或氯。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，X1是氟、氯、溴或碘。在一方面中，X1是氯，X2、X3、X4和X5獨立是氫。在另一優(yōu)選實施方案中，R1、R2、R3和R4獨立是氫。
本發(fā)明提供用于在患者中提供耳保護作用的式1或式2的對映體。在某些實施方案中，式1或式2化合物以其單一對映體形式存在。在其它實施方案中，式1或式2化合物以對映體混合物形式存在，其中一種對映體相對于另一種對映體優(yōu)勢。在一方面中，該對映體占優(yōu)勢的程度達90％或以上或者占優(yōu)勢的程度達98％或以上。
本發(fā)明還提供包括給予患者耳保護作用量的組合物的方法，所述組合物包含至少一種具有式1或式2的化合物，其中R1、R2、R3和R4獨立是氫或C1-C4烷基；而X1、X2、X3、X4和X5獨立是氫、氟、氯、溴或碘。在一實施方案中，在給予患者組合物之前，要做出決定，患者是否患有由例如毒性藥物引起的某種類型的急性或慢性耳退行性或內(nèi)耳損傷。
本發(fā)明還提供方法，該方法包括鑒別處于發(fā)展成為急性或慢性耳退行或內(nèi)耳系統(tǒng)損傷風(fēng)險的患者或者需要用下文定義的耳保護藥物(OPD)治療的患者，以及給予患者包含至少一種具有式1或式2化合物的組合物。
在本發(fā)明的某些實施方案中，提供神經(jīng)保護作用的具有式1或式2的化合物的治療有效量約為0.01mg/Kg/每劑量-150mg/Kg/每劑量。
在某些實施方案中，給予需要用耳保護藥物或OPD治療的受治療者或患者治療有效量的提供耳保護作用的藥用組合物，所述組合物包含一或多種本發(fā)明的對映體或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
可將含有至少一種具有式1或式2化合物的藥用組合物給予有需要的患者。在某些實施方案中，需要用耳保護作用藥物或OPD治療的受治療者或患者可以是已經(jīng)歷某種形式的內(nèi)耳細胞衍生的神經(jīng)急性創(chuàng)傷或損傷的患者，或者是具有某種急性或慢性耳退行性疾病的患者。在一方面，將確定受治療者或患者在給藥時處于發(fā)展為急性或慢性耳退行性疾病的風(fēng)險中，即需要用耳保護性藥物治療的患者。在另一實施方案中，有需要的患者是在給藥時患有對其內(nèi)耳細胞的急性損傷或創(chuàng)傷的患者。
附圖簡述

圖1.Li-Pilo SE之后14天增加試驗化合物劑量對計數(shù)的海馬不同區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目的影響。評價以各關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元細胞體的數(shù)目來表示。
οp＜0.05，·p＜0.01，試驗化合物和對照組大鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別；#p＜0.05，*p＜0.01，試驗化合物和DZP大鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別。
圖2.Li-Pilo SE之后14天增加試驗化合物劑量對計數(shù)的大腦皮層不同區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目的影響。評價以各關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元細胞體的數(shù)目來表示。
οp＜0.05，·p＜0.01，試驗化合物和對照組大鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別；#p＜0.05，*p＜0.01，試驗化合物和DZP大鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別。
縮寫D背部，V腹部。
圖3.Li-Pilo SE之后14天增加試驗化合物劑量對計數(shù)的梨狀(piriform)皮層中神經(jīng)元數(shù)目的可變的神經(jīng)保護作用影響。評價以各關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元細胞體的數(shù)目來表示。
οp＜0.05，·p＜0.01，試驗化合物和對照組大鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別；#p＜0.05，*p＜0.01，試驗化合物和DZP大鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別。
θp＜0.05，∞p＜0.01，通過給定劑量的試驗化合物治療的兩個亞組大鼠(A和B)之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別。
縮寫D背部，V腹部。
圖4.增加試驗化合物劑量對首次SRS(A)的潛伏期以及對內(nèi)嗅(entorhinal)皮質(zhì)(B)的III/IV層中保留的神經(jīng)元數(shù)目的影響。各組和亞組中動物的數(shù)量在各條柱上指明。
在用60、90和120mg/kg試驗化合物治療的各組中，有一個明確的亞類，其大約一半的動物呈現(xiàn)出對癲癇明顯延長的潛伏期，這似乎與內(nèi)嗅皮質(zhì)的III/IV層中的存活的神經(jīng)元數(shù)目有關(guān)。
發(fā)明詳述 患有源于神經(jīng)組織的內(nèi)耳細胞的任何種類的損傷或傷害的患者可能受益于本發(fā)明的這些神經(jīng)保護的方法，所述神經(jīng)組織包括但不限于耳蝸或前庭系統(tǒng)中的那些神經(jīng)元、支持和相關(guān)細胞或者在胚胎形成過程中源于相同的神經(jīng)原外胚層、聽板的聽覺或前庭神經(jīng)，包括前庭神經(jīng)節(jié)、耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、聽囊、初級聽覺感受器，螺旋器中的毛細胞，以及初級聽覺神經(jīng)元和第八腦神經(jīng)神經(jīng)元。這種神經(jīng)系統(tǒng)損傷對這些細胞可采取突然損傷或急性損傷的形式，如急性耳退行性疾病和耳毒性藥物、缺氧-局部缺血或者導(dǎo)致細胞死亡或危害的這些情況的組合。
損傷包括但不限于可由選自以下病癥引起的對內(nèi)耳的創(chuàng)傷或損傷耳毒性藥物暴露、外傷、耳鳴、梅尼爾氏病，包括免疫介導(dǎo)的梅尼爾氏病，免疫介導(dǎo)的耳蝸或前庭紊亂(IMCVD)、自身免疫性耳病(AIED)、科根綜合征以及影響內(nèi)耳或第八腦神經(jīng)局部缺血性事件、鈍性或穿透性腦外傷。另外，剝奪氧氣或血液供給一般可引起急性損傷，如低氧和/或局部缺血下，包括但不限于聽神經(jīng)或相關(guān)結(jié)構(gòu)的局部缺血或梗塞。
在一優(yōu)選實施方案中，可將本發(fā)明化合物用于在涉及對內(nèi)耳的神經(jīng)元和神經(jīng)元衍生的細胞造成外傷和漸進性損傷的疾病中提供耳保護作用，所述疾病由服用包括但不限于抗生素和化學(xué)治療劑的耳毒性藥物所引起。
因此，本發(fā)明所用術(shù)語“耳保護作用”或“耳保護的”應(yīng)指抑制、預(yù)防、緩解或減輕以下細胞的功能障礙、退化或死亡的嚴(yán)重性神經(jīng)細胞；軸突或其支持性或相關(guān)細胞，包括源自胚胎形成過程中源于相同神經(jīng)原性外胚層、聽板的細胞，所述聽板包括哺乳動物(包括人)的第八或聽覺神經(jīng)元，耳蝸；前庭系統(tǒng)，前庭神經(jīng)；初級聽覺感受器，螺旋器中的毛細胞；初級聽覺神經(jīng)元；耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元“SGN”以及前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(“VGN”)。這包括治療或預(yù)防外傷、退行性疾病以及防止藥物或毒素(例如抗生素和化學(xué)治療劑或者其它毒素)的耳毒性作用。
因此，本文所用術(shù)語“需要用耳保護的藥物(OPD)治療的患者”指目前患有或可能發(fā)展為任何上述綜合征或疾病的任何患者，或者需要或者已經(jīng)服用耳毒性藥物的患者，或者患有其中患者出現(xiàn)的臨床癥狀或預(yù)后將得益于提供耳保護作用的任何疾病的患者，所述耳保護作用是預(yù)防所治療的任何疾病或病癥的發(fā)展、延長、惡化或抗藥性增加，其中所述任何疾病或病癥涉及哺乳動物(包括人)的第八腦神經(jīng)的神經(jīng)元、耳蝸、前庭系統(tǒng)、初級聽覺感受器、螺旋器中的毛細胞、初級聽覺神經(jīng)元、耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元“SGN”以及前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(“VGN”)。
本發(fā)明所用術(shù)語“治療”或“處置”指在預(yù)防或緩解損傷、病變或病癥中任何成功的標(biāo)志，包括任何客觀或主觀的參數(shù)，如減輕、緩和、減小癥狀，或者使得患者更能耐受損傷、病變或病癥；減慢惡化或衰退的速率；使得退化終點衰弱降低；或者改善患者的身心健康。癥狀的治療或緩解可取決于客觀或主觀參數(shù)；包括身體檢查和/或神經(jīng)系統(tǒng)檢查的結(jié)果。因此，術(shù)語“治療”或“處置”包括給予本發(fā)明化合物或藥物提供耳保護作用。
本文所用術(shù)語“治療作用”指對預(yù)防或降低患者內(nèi)耳細胞的死亡或損害或功能障礙有效提供的耳保護作用。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“治療有效量”指在需要這種耳保護作用治療的受治療者或患者中，產(chǎn)生如上定義的治療作用的一或多種本發(fā)明化合物的充足量。
本發(fā)明所用術(shù)語“受治療者”或“患者”可交互使用，并如本文所用的指任何哺乳動物，包括但不限于人，包括可給予本發(fā)明組合物的人類患者或受治療者。術(shù)語哺乳動物包括人患者或非-人靈長類，和諸如家兔、大鼠和小鼠的實驗動物以及其它動物。
在某些實施方案中，本發(fā)明方法有利地用于治療尚未患有或已知患有本領(lǐng)域已知用氨基甲酸酯化合物可有效治療的病癥的患者。在這些情況下，以確定患者是否是以上定義的術(shù)語“需要用耳保護的藥物(OPD)治療的患者”為基礎(chǔ)，做出使用本發(fā)明方法和化合物的決定。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供耳保護的方法。在某些實施方案中，這些方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的氨基甲酸酯化合物，所述患者尚未有明顯的內(nèi)耳細胞損傷或損害的臨床征兆或癥狀，但由于疾病、損傷或外傷、或者由于需要給予耳毒性藥物、或者由于某些已知的生化性或遺傳性的誘病因素或者發(fā)現(xiàn)一或多種這些疾病的證實的生物標(biāo)記，患者可能為面臨產(chǎn)生這種損傷的高危人群。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物直接針對面臨發(fā)展成為內(nèi)耳損傷但尚未有臨床跡象的患者的耳保護作用。該患者可能只是處于“較大的風(fēng)險”之中，這是根據(jù)對患者的任何因素的識別、或其家族病史、身體檢查或測定，表明其形成內(nèi)耳損傷的風(fēng)險大于平均值而確定的。因此，可使用通過任何現(xiàn)有途徑確定患者可能處于“較大風(fēng)險”的方法決定患者是否應(yīng)該用本發(fā)明的方法治療。
因此，在一示例性實施方案中，可采用已公認(rèn)的確定內(nèi)耳損傷風(fēng)險因素的篩選方法，來鑒定可受益于通過本發(fā)明方法和化合物治療的患者。這些篩選方法包括例如常規(guī)確定風(fēng)險因素的步驟以及用耳毒性藥物的治療。
可根據(jù)多種“代用標(biāo)記物”或“生物標(biāo)記物”來確定在尚未有臨床體征或癥狀的患者中，可受益于用OPD治療的患者。
本發(fā)明所用術(shù)語“代用標(biāo)記物”和“生物標(biāo)記物”可交互使用，指可與現(xiàn)存或?qū)硇纬傻纳窠?jīng)或內(nèi)耳損傷確切相關(guān)的任何解剖學(xué)的、生物化學(xué)的、結(jié)構(gòu)的、電的、基因的或化學(xué)的指示劑或標(biāo)記物。在某些情況下，可使用腦顯像技術(shù)，如計算機X線層掃描術(shù)(CT)、核磁共振影像(MRI)或者正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)確定患者是否面臨神經(jīng)元損傷的危險。
預(yù)期將來將研制出更多的利用多種檢測技術(shù)的這類生物標(biāo)記物。預(yù)期任何這類現(xiàn)存的或可能將來形成的神經(jīng)損傷的標(biāo)記物或指示劑，如本發(fā)明中所用的后一術(shù)語，都可用于本發(fā)明方法中，用以測定用本發(fā)明化合物和方法治療的需要。
受治療者患有或可能面臨發(fā)展成為內(nèi)耳損傷的風(fēng)險的確定法還包括例如醫(yī)學(xué)評價，其包括完整的病史、身體檢查和一系列的有關(guān)血液測試。其還可包括腦電圖(EEG)、CT、MRI或PET掃描。
本發(fā)明的氨基甲酸酯化合物 本發(fā)明提供在有需要的患者中使用2-苯基-1，2-乙二醇單氨基甲酸酯和二氨基甲酸酯提供耳保護作用的方法。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講，用于本發(fā)明方法中的合成和純化氨基甲酸酯化合物(包括氨基甲酸酯對映體)的適合的方法是熟知的。例如2-苯基-1，2-乙二醇單氨基甲酸酯和二氨基甲酸酯的純對映體形式和對映體混合物在美國專利號5,854,283、5,698,588和6,103,759中有描述，其公開內(nèi)容全文結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
本發(fā)明代表性的氨基甲酸酯化合物包括那些具有式1或式2的化合物
式1
式2 其中R1、R2、R3和R4獨立是氫或C1-C4烷基，X1、X2、X3、X4和X5獨立是氫、氟、氯、溴或碘。
本文所用“C1-C4烷基”指取代或未取代的具有1-4個碳原子的脂肪族烴。具體地講，包括在“烷基”定義中的是那些任選取代的脂肪族烴。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，C1-C4烷基或者是未取代的或者被苯基取代。
本文中所用術(shù)語“苯基”無論單獨或作為另一基團的部分使用時，被定義為取代或未取代的帶有6個碳原子的芳烴。具體地講，包括在“苯基”定義中的是那些任選取代的苯基。例如，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，“苯基”或者是未取代的或者被鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基取代。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，X1是氟、氯、溴或碘，而X2、X3、X4和X5是氫。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，X1、X2、X3、X4和X5獨立是氯或氫。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，R1、R2、R3和R4都是氫。
應(yīng)清楚的是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可選擇本發(fā)明化合物上的取代基和取代模式，以提供化學(xué)上穩(wěn)定的并且易于通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)以及本文提供的方法合成的化合物。
代表性的2-苯基-1，2-乙二醇單氨基甲酸酯和二氨基甲酸酯包括下列化合物
式3
式4
式5
式6
式7
式8 本發(fā)明包括使用分離的式1或式2的對映體。在一優(yōu)選的實施方案中，可使用包含分離的式1的S-對映體的藥用組合物在患者中提供神經(jīng)保護作用。在另一優(yōu)選的實施方案中，可使用包含分離的式2的R-對映體的藥用組合物在患者中提供神經(jīng)保護作用。在另一實施方案中，可使用包含分離的式1的S-對映體和分離的式2的R-對映體的藥用組合物在患者中提供神經(jīng)保護作用。
本發(fā)明還包括使用式1或式2的對映體的混合物。在本發(fā)明的一方面中，一種對映體將占優(yōu)勢。在混合物中占優(yōu)勢的對映體為在混合物中存在的量比在混合物中存在任一其它對映體的量大的對映體，例如其量大于50％。在一方面中，一種對映體占優(yōu)勢的程度達90％或91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％或以上的程度。在一優(yōu)選實施方案中，在包含式1化合物的組合物中占優(yōu)勢的對映體是式1的S-對映體。在另一優(yōu)選實施方案中，在包含式2化合物的組合物中占優(yōu)勢的對映體是式2的R-對映體。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，以單一對映體或者以本發(fā)明組合物中占優(yōu)勢的對映體存在的對映體由式3或式5代表，其中X1、X2、X3、X4、X5、R1、R2、R3和R4定義同上，或者由式7或式8代表。

式3
式5
式7
式8 本發(fā)明提供使用式1和式2代表的化合物的對映體和對映體混合物的方法。式1或式2的氨基甲酸酯對映體在芐基位置含有不對稱手性碳，其是與苯環(huán)鄰近的脂肪族碳。
所分離的對映體是基本上不含對應(yīng)的對映體的對映體。因此，所分離的對映體指通過拆分技術(shù)分離的或者制備的不含對應(yīng)的對映體的化合物。此處所用術(shù)語“基本上不含”指該化合物由比例非常大的一種對映體組成。在優(yōu)選實施方案中，所述化合物包括重量比至少為約90％的優(yōu)選對映體。在本發(fā)明的其它實施方案中，該化合物包括重量比至少為約99％的優(yōu)選對映體。優(yōu)選的對映體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，由外消旋混合物中分離，包括高效液相色譜法(HPLC)和手性鹽的形成和結(jié)晶法，或者可通過本發(fā)明所述的方法制備優(yōu)選的對映體。
制備優(yōu)選對映體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并在以下文獻中有描述，例如Jacques等的Enantiomers，外消旋體和拆分(Wiley Interscience，New York，1981)；Wilen，S.H.等的Tetrahedron332725(1977)；Eliel，E.L.，碳化合物的立體化學(xué)(McGraw-Hill，NY，1962)；以及Wilen，S.H.拆分劑表和光學(xué)拆分(Tables of ResolvingAgents and Optical Resolutions)p.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.of NotreDame Press，Notre Dame，IN 1972)。
另外，本發(fā)明化合物可按美國專利號3,265,728(其公開內(nèi)容全文通過引用結(jié)合到本發(fā)明中作為參考)、3,313,692(其公開內(nèi)容全文通過引用結(jié)合到本發(fā)明中作為參考)以及先前參考的美國專利號5,854,283、5,698,588和6,103,759(其公開內(nèi)容全文通過引用結(jié)合到本發(fā)明中作為參考)中所述制備。
作為藥物的氨基甲酸酯化合物 本發(fā)明提供作為藥物的式1和/或式2的對映體混合物和分離的對映體。可將所述氨基甲酸酯化合物配制為在患者中提供神經(jīng)保護作用的藥物。
一般來講，可通過本領(lǐng)域任何已知的給予治療藥物方法，將本發(fā)明的氨基甲酸酯化合物作為藥用組合物給藥，包括口服、頰下、局部、全身(如經(jīng)皮、鼻內(nèi)或通過栓劑)或非腸道(如肌內(nèi)、皮下或靜脈注射)。直接將化合物給予神經(jīng)系統(tǒng)可包括例如給予大腦內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、椎管內(nèi)或通過傳遞給予脊柱周圍的途徑，其通過帶有或不帶有泵裝置的顱內(nèi)或脊椎內(nèi)注射針或?qū)Ч苓M行。
組合物可采用片劑、丸劑、膠囊、半固體、散劑、緩釋制劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、酏劑、氣霧劑或者任何其它適合的組合物形式；并可含有至少一種本發(fā)明的化合物與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合。適合的賦形劑對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講是是熟知的，并且它們以及制備所述組合物的方法可在此類標(biāo)準(zhǔn)參考書中發(fā)現(xiàn)，例如Alfonso ARRemington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton PA，1985，其公開內(nèi)容全文通過引用結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。適合的液體載體，尤其是注射溶液，包括水、鹽水溶液、葡萄糖水溶液和二醇等。
可將氨基甲酸酯化合物作為含水混懸液提供。本發(fā)明的含水混懸液可含有氨基甲酸酯化合物并混有適合制備含水混懸液的賦形劑。這些賦形劑可包括例如懸浮劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠，以及分散劑或著濕劑，如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物(例如十七碳亞乙基氧基鯨蠟醇(heptadecaethylene oxycetanol))、環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)或環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物(如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯)。
水性混懸劑也可包含一種或多種防腐劑，諸如對-羥基苯甲酸乙酯或正-丙酯、一種或多種著色劑、一種或多種矯味劑和一種或多種甜味劑，諸如蔗糖、阿司帕坦或糖精。可調(diào)節(jié)制劑的等滲性。
可通過將氨基甲酸酯化合物混懸于植物油，諸如落花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或于礦物油，諸如液體石蠟中；或以上這些的混合物中，配制用于本方法的油性混懸劑。油性混懸劑可包含增稠劑，諸如蜂蠟、固體石蠟或正十六醇?？杉尤胩鹞秳┮蕴峁┛煽诘目诜苿T如丙三醇、山梨醇或蔗糖。這些制劑可通過加入抗氧化劑，諸如抗壞血酸進行防腐?？勺⑸涞挠托悦浇槲锏膶嵗?，參見Minto，J.Pharmacol.Exp.Ther.28193-102，1997。本發(fā)明的藥用制劑也可呈現(xiàn)水包油乳劑的形式。油相可為如上描述的植物油或礦物油或這些的混合物。
適宜的乳化劑包括天然產(chǎn)生的樹膠，諸如阿拉伯樹膠和西黃蓍膠、天然產(chǎn)生的磷脂，諸如大豆卵磷脂、源自脂肪酸與己糖醇酐的酯或偏酯，諸如山梨聚糖單-油酸酯以及這些偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，諸如聚氧乙烯山梨聚糖單-油酸酯。如在糖漿劑和酏劑的制劑中的那樣，乳劑也可包含甜味劑和矯味劑。這樣的制劑也可包含緩和劑、防腐劑或著色劑。
可任選化合物單獨或與其它適宜的成分被制成氣霧制劑(即，可使它們成“噴霧狀”)經(jīng)由吸入給藥?？蓪忪F制劑置于加壓的可接受的拋射劑，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等。
本發(fā)明的適宜用于胃腸外，例如，通過關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑給藥的制劑，可包括水性和非-水性等滲滅菌注射溶液劑，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與意欲接受者的血液等滲的溶質(zhì)，以及可包含助懸劑、助溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非-水性滅菌混懸劑?？墒褂玫目山邮艿拿浇槲锖腿軇樗土指袷?Ringer′s)溶液、等滲氯化鈉。另外，滅菌固定油可常規(guī)用作溶劑或混懸介質(zhì)。為此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的單-或雙甘油酯類。另外，脂肪酸類，諸如油酸可同樣地用于可注射的制劑中。這些溶液劑為滅菌的且一般沒有不合乎需要的物質(zhì)。
當(dāng)化合物充分溶解時，可將它們直接溶解于生理鹽水中，使用或不用適宜的有機溶劑，諸如丙二醇或聚乙二醇。細粉碎的化合物的分散可在淀粉或羧基甲基纖維素鈉水溶液中或在適宜的油，諸如落花生油中完成。這些制劑可經(jīng)常規(guī)的、熟悉的消毒技術(shù)消毒。需要時，該制劑可包含藥學(xué)上可接受的接近生理條件的輔助物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑，如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。
在這些制劑中的氨基甲酸酯化合物的濃度可變化很大，并且將主要基于液體的體積、粘度、體重等，依據(jù)選擇的特定給藥模式和患者的需要進行選擇。對于IV給藥，制劑可為滅菌的可注射制劑，諸如滅菌的可注射水性或油性混懸劑。可依據(jù)已知技藝使用那些適宜的分散劑或濕潤劑和助懸劑配制該混懸劑。滅菌的可注射制劑也可為在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，諸如1，3-丁烷二醇溶液中的滅菌的可注射溶液或混懸劑。所推薦的制劑可以單位-劑量或多-劑量密封容器，諸如安瓿和小瓶呈現(xiàn)。可自之前描述的各種滅菌的散劑、顆粒劑和片劑，制備注射溶液劑和混懸劑。
適用于本發(fā)明實踐的氨基甲酸酯化合物可以并優(yōu)選通過口服給予。組合物中本發(fā)明化合物的量可根據(jù)組合物的類型、單位劑量的大小、賦形劑的種類以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其它因素在很大范圍內(nèi)變化。最終的組合物一般可含有例如重量比為1.0％(％w)-95％w的氨基甲酸酯化合物，優(yōu)選10.0％w-90％w，其余的為賦形劑。
可使用本領(lǐng)域熟悉的藥學(xué)上可接受的載體、以適宜口服給藥的劑量，配制適于口服給藥的藥用制劑。這樣的載體能夠使藥用制劑配制成適于患者消化的單位劑型，如片劑、丸劑、散劑、糖衣丸、膠囊劑、液體劑、菱形錠劑、凝膠劑、糖漿劑、漿狀劑(slurries)、混懸劑等。
適于口服給藥的制劑可包括(a)液體溶液，如有效量的藥物制劑，其混懸于稀釋劑，如水、鹽水或PEG 400中，或者(b)膠囊劑、囊劑或片劑，其各自含有預(yù)定量的活性成分，作為液體、固體、顆?；蚰z；(c)在適當(dāng)液體中的混懸劑；以及(d)適合的乳劑。
可通過將本發(fā)明化合物與固體賦形劑組合，任選碾磨得到的混合物和加工顆粒的混合物，加入適宜的另外的化合物后，如果需要，得到片劑或糖衣丸的核心，獲得用于口服的藥用制劑。適宜的固體賦形劑為碳水化合物或蛋白質(zhì)填充劑，并且包括、但不限于糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；得自玉米、小麥、稻米、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素，諸如甲基纖維素、羥基甲基纖維素、羥基丙基甲基-纖維素或羧基甲基纖維素鈉；和樹膠，包括阿拉伯樹膠和西黃蓍膠；以及蛋白質(zhì)類，諸如明膠和膠原質(zhì)。如果需要，可加入崩解劑或助溶劑，諸如交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、褐藻酸或其鹽，諸如藻酸鈉。片劑形式可包括一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠態(tài)二氧化硅、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸和其它賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑、矯味劑、染料、崩解劑和藥學(xué)上相容的載體。菱形錠劑形式可包含在矯味劑，如蔗糖中的活性成分，以及包含在惰性基質(zhì)，諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中的活性成分的錠劑，以及除了活性成分外，還包含本領(lǐng)域已知載體的乳劑、凝膠劑等。
本發(fā)明化合物也可以栓劑形式直腸給藥?？赏ㄟ^使藥物與適宜的非刺激性賦形劑混合制備這些制劑，所述賦形劑在常溫下是固體而在直腸溫度下是液體，并且因此將在直腸融化以釋放藥物。這樣的材料為可可脂和聚乙二醇。
本發(fā)明化合物也可經(jīng)鼻腔內(nèi)、眼內(nèi)、陰道內(nèi)和直腸內(nèi)途徑給藥，包括栓劑、吸入劑、粉劑和氣霧制劑(例如，類固醇吸入劑，參見，Rohatagi，J.Clin.Pharmacol.351187-1193，1995；Tjwa，Ann.AllergyAsthma Immunol.75107-111，1995)。
本發(fā)明化合物可經(jīng)局部途徑、透皮傳遞，配制為如敷藥棒、溶液劑、混懸劑、乳劑、凝膠劑、乳膏劑、油膏劑、糊劑、果醬、涂料、散劑和氣霧劑。
封裝材料也可與本發(fā)明化合物一起使用，且術(shù)語“組合物”可包括與作為配方的封裝材料組合的活性成分，加或不加其它載體。例如，本發(fā)明化合物也可作為微球傳遞用于在體內(nèi)緩慢釋放。在一個實施方案中，微球可經(jīng)由藥物的透皮注射劑給藥(如，含米非司酮的微球，其在皮下緩慢釋放(參見Rao，J.Biomater Sci.Polym.Ed.7623-645，1995；如生物可降解的和可注射的凝膠制劑(見，如，Gao，Pharm.Res.12857-863，1995)；或作為用于口服給藥的微球(參見，如，Eyles，J.Pharm.Pharmacol.49669-674，1997)。透皮和皮內(nèi)途徑均提供數(shù)周或數(shù)月的持續(xù)的傳遞。扁囊劑也可用于傳遞本發(fā)明化合物。
在另一實施方案中，可將本發(fā)明化合物通過使用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)運，質(zhì)脂體與細胞膜融合或者被細胞內(nèi)吞，即使用配基連接質(zhì)脂體，后者與細胞的表面膜蛋白受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞內(nèi)吞作用。通過使用質(zhì)脂體，尤其是當(dāng)質(zhì)脂體表面帶有對靶細胞特異性的載體，或者另外優(yōu)先指向特定組織時，可集中將氨基甲酸酯化合物轉(zhuǎn)運到體內(nèi)的靶細胞上(參見例如Al-Muhammed，J.Microencapsul.13293-306，1996；Chonn，Curr.Opin.Biotechnol.6698-708，1995；Ostro，Am.J.Hosp.Pharm.461576-1587，1989)。
可將本發(fā)明的藥物制劑以鹽的形式提供，并且可用很多酸形成，所述酸包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、琥珀酸等。鹽在水性或其它質(zhì)子溶劑中更易溶解，在其中它們是對應(yīng)的游離堿形式。在其它情況下，優(yōu)選的制劑可為凍干粉劑，其可包含，例如，任何或所有下列組分1mM-50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇，pH范圍為4.5-5.5，使用前與緩沖液混合。
藥學(xué)上可接受的鹽和酯指為藥學(xué)上可接受的并具有所需藥理特性的鹽和酯。這樣的鹽包括當(dāng)化合物中存在酸性質(zhì)子時能與無機或有機堿反應(yīng)而可形成的鹽。適宜的無機鹽包括與堿金屬，如鈉和鉀、鎂、鈣以及鋁形成的鹽。適宜的有機鹽包括與有機堿，諸如胺堿，如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等形成的鹽。
藥學(xué)上可接受的鹽也可包括由母體化合物中的胺部分與無機酸(如鹽酸和氫溴酸)和有機酸(如乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸和烷烴-和芳烴-磺酸，諸如甲烷磺酸和苯磺酸)反應(yīng)形成的酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的酯包括由存在于化合物中的羧基、磺?；趸挽⒒趸?phosphonoxy)形成的酯。當(dāng)存在兩個酸性基團時，則藥學(xué)上可接受的鹽或酯可為單-酸-單-鹽或酯或二-鹽或酯；并且類似地，當(dāng)存在多于兩個酸性基團時，這樣的基團中的某些或全部可被鹽化或酯化。
在本發(fā)明中命名的化合物可以未鹽化或未酯化的形式，或者以鹽化和/或酯化的形式存在，并且這樣的化合物的命名意欲均包括原型(未鹽化和未酯化的)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽和酯。本發(fā)明包括式1和式2的藥學(xué)上可接受的鹽和酯的形式?？纱嬖谝环N以上的式1或式2的對映體的結(jié)晶形式，并且這些也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明的藥用組合物除包含氨基甲酸酯化合物外，可任選包含至少一種用于治療與提供神經(jīng)保護作用相關(guān)的疾病或病癥的其它治療藥物。
配制藥用組合物的方法已在數(shù)個出版物，諸如藥用劑型片劑(Pharmaceutical Dosage FormsTablets).第二版，修訂和增訂。第1-3卷，Lieberman等編著；藥用劑型胃腸外藥物(Pharmaceutical DosageFormsParenteral Medications).第1-2卷，Avis等編著；和藥用劑型分散系統(tǒng)(Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems).第1-2卷，Lieberman等編著；Marcel Dekker，Inc出版中描述，這些文獻的公開內(nèi)容，通過引用全文結(jié)合于本文中并且用于所有目的。
通常將藥用組合物配制成滅菌的、充分等滲的，并且完全依從美國食品與藥品管理局的藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(Good ManufacturingPractice(GMP))規(guī)則。
給藥方案 本發(fā)明提供在哺乳動物中使用氨基甲酸酯化合物提供神經(jīng)保護的方法。需要提供神經(jīng)保護作用的氨基甲酸酯化合物的量被定義為是治療上或藥學(xué)上有效的劑量。所述劑量日程表和該用途的有效量，即劑量或給藥方案將取決于多種因素，包括疾病的階段、患者的身體狀況、年齡等。在計算患者的給藥方案中，也要考慮給藥的方式。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在不進行過多試驗下，根據(jù)其技能和本發(fā)明公開內(nèi)容，將能夠確定實施本發(fā)明的特定取代的氨基甲酸酯化合物的治療有效劑量(參見如Lieberman，藥物劑型(Vols.1-3，1992)；Lloyd，1999，The art，藥物混合的科學(xué)技術(shù)(Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)；和Pickar，1999，Dosage Calculations)。治療有效劑量也是其中在臨床意義上講，治療上有益的作用優(yōu)于活性藥物的任何毒性或有害副作用的量。進一步指出的是對于每一特定的患者，其特定的給藥方案應(yīng)在一段時間內(nèi)，根據(jù)個體需要和給予或監(jiān)督該化合物用藥的人員的專業(yè)判斷進行評估和調(diào)整。
為治療目的，可將本發(fā)明所公開的組合物或化合物以單次快速推注傳遞的方式，通過在一延長的時間期間或者以重復(fù)給藥的方案給予患者(例如通過每小時、每日或每周，重復(fù)給藥的方案)。可將本發(fā)明的藥用制劑以例如每日一或多次、每周三次或每周一次給予。在本發(fā)明的一實施方案中，可將本發(fā)明的藥用制劑每日一或二次口服給予。
使用本發(fā)明化合物的治療方案可以在例如患者患有損害性損傷或其它最初的傷害之后，但在患者被診斷為內(nèi)耳疾病或其它明顯損傷之前開始實施。在一實施方案中，被鑒定為正處于發(fā)展為內(nèi)耳損傷高風(fēng)險下的患者或者患有與形成內(nèi)耳損傷風(fēng)險有關(guān)的疾病(如耳鳴、梅尼爾氏病或耳毒性藥物暴露)的患者可開始采用本發(fā)明的氨基甲酸酯化合物的治療方案。
在上下文中，所述生理活性劑的治療有效劑量可包括在延長的治療方案內(nèi)的重復(fù)劑量，所述治療方案將對提供神經(jīng)保護作用產(chǎn)生明顯臨床效果。上下文中有效劑量的確定一般根據(jù)動物模型研究以及隨后的人體臨床試驗，并通過確定的有效劑量和給藥方案指導(dǎo)，所述有效劑量和給藥方案能明顯降低患者中定向暴露的病癥或癥狀的出現(xiàn)或嚴(yán)重性。有關(guān)的合適模型包括例如小鼠、大鼠、豬、貓、非人靈長類動物。本領(lǐng)域已知的其它可接受的動物模型患者。另外，有效劑量可使用體外模型確定(例如免疫學(xué)和組織病理學(xué)測定)。使用這些模型，一般僅需普通的計算和調(diào)整來確定給予治療有效量的所述生理活性劑的適當(dāng)?shù)臐舛群蛣┝?例如為引起所需反應(yīng)的鼻內(nèi)給藥有效量、經(jīng)皮給藥有效量、靜脈給藥有效量或者肌內(nèi)給藥有效量)。
在本發(fā)明的示例性實施方案中，可按標(biāo)準(zhǔn)給藥方案，制備所述化合物的單位劑量形式。在該方法中，在主治醫(yī)生指導(dǎo)下，很容易將組合物細分成較小的劑量。例如，可將單位劑量制成包裝的粉末、小瓶或安瓿中，并優(yōu)選制成膠囊或片劑形式。
以組合物的這些單位劑量形式呈現(xiàn)的活性化合物，其呈現(xiàn)的量為例如約10mg-1g或更多，根據(jù)患者的具體需要，以單劑量或多劑量每日給予。通過用大約1g的最小日劑量的治療方案開始，可用氨基甲酸酯化合物的血液水平確定更大或更小的劑量是否為適應(yīng)的。
例如可以以口服或非腸道給藥量約每劑量0.1mg/kg至約50mg/kg的量，將本發(fā)明的氨基甲酸酯化合物的有效給藥。優(yōu)選給藥量為約每劑量1.0/mg/kg至約25mg/kg，更優(yōu)選每劑量約2.0-40mg/kg。因此，對于具有例如平均體重為70kg的患者來講，本發(fā)明所述的每劑量單位所含有的活性組分的治療有效量可以是例如約每日140mg-2800mg。
本發(fā)明方法還提供供神經(jīng)保護作用使用的試劑盒。當(dāng)在適當(dāng)?shù)妮d體中將含有一或多種本發(fā)明的氨基甲酸酯化合物與可能加入的一或多種具有治療益處的其它化合物的藥用組合物制成制劑后，可將其置于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，并標(biāo)記提供神經(jīng)保護作用的標(biāo)簽。另外，也可將另一種包含至少一種用于提供神經(jīng)保護作用、治療致癲癇的、癲癇或與神經(jīng)損傷有關(guān)的其它病癥或疾病的治療劑的藥物置于容器內(nèi)，并標(biāo)記治療所述指定疾病的標(biāo)簽。這些標(biāo)簽可包括例如有關(guān)各藥物的給藥量、給藥頻率和給藥方法。
雖然為清楚了解的目的，已通過實例詳述了上述發(fā)明，但技術(shù)人員應(yīng)明了該公開內(nèi)容包含某些改變和修飾，并且所述改變和修飾在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)不進行過多試驗下即可實施，其僅供非限制性例證說明。提供下列實施例以舉例說明本發(fā)明的特定方面，但并不意味著構(gòu)成限定。
實施例 提出下列實施例幫助理解本發(fā)明，但并不意味著且不應(yīng)該以任何方式構(gòu)成對隨后權(quán)利要求書中提出的本發(fā)明的限定。用于提供神經(jīng)保護作用的式(I)和式(II)化合物的活性在下列實驗實施例中評價。在以下所有實施例中，即實施例1、2、3和4中，式1的分離的S-對映體(該化合物如以上式7中所示，并將在以下實施例中被稱為試驗化合物(或TC或tc)的活性，在誘發(fā)癲癇大鼠模型中評價，以確定化合物神經(jīng)保護的功效，以及在大鼠的鋰和毛果蕓香堿誘發(fā)的顳葉性癲癇的模型中治療癲癇發(fā)生的效能(實施例1和2)。另外，實施例3和4表明在大鼠的去血清模型和短暫性腦缺血模型中相同試驗化合物提供神經(jīng)保護的效能。這些實施例表明試驗化合物保護神經(jīng)元組織免受各種損傷事件的能力。這些實施例是一種通過示例性說明本發(fā)明的各實施方案的方式，并不以任何方式限定本發(fā)明。
試驗化合物的結(jié)構(gòu)如下
實施例1 顳葉性癲癇的鋰-毛果蕓香堿模型 通過與鋰締合(associated)的毛果蕓香堿(Li-Pilo)誘發(fā)的大鼠模型再現(xiàn)人顳葉性癲癇的大多數(shù)臨床和神經(jīng)生理學(xué)特征(Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci 1633-37)。在成年大鼠中，全身給予毛果云香堿導(dǎo)致癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)。第一日內(nèi)，致死率達到30-50％。在存活的動物中，神經(jīng)元損傷主要出現(xiàn)在海馬結(jié)構(gòu)、梨狀和內(nèi)嗅皮質(zhì)、丘腦、杏仁體、新皮質(zhì)和黑質(zhì)之內(nèi)。這種急性發(fā)作期后接著是一段“安靜”不發(fā)作期，平均持續(xù)時間14-25日，然后所有動物以通常每周2-5次的頻率，顯示出自發(fā)的再發(fā)性抽搐發(fā)作(Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci1633-37；Dube等，2001，Exp Neurol 167227-241)。
鋰-毛果蕓香堿和試驗化合物的治療 將Janvier培育中心(Le Genest-St-lste，法國)提供的體重225-250g的雄性Wistar大鼠于控制的標(biāo)準(zhǔn)條件下(明/暗循環(huán)，7.00a.m.-7.00p.m.燈照)飼養(yǎng)，任意提供食物和飲水。所有動物的實驗均遵從1986年11月24日歐洲公眾理事會導(dǎo)則(86/609/EEC)和法國農(nóng)業(yè)部(許可證N°67-97)的規(guī)定。對于電極的植入，通過腹腔注射2.5mg/kg地西泮(DZP，Valium，Roche，法國)和1mg/kg鹽酸氯胺酮(ketamine chlorhydrate)(Imalgene 1000，Rhone Merrieux，法國)，將大鼠麻醉。將4個單觸點記錄電極置于兩側(cè)頂葉皮層之上的顱骨上，每側(cè)2個。
癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導(dǎo) 試驗化合物的治療和自發(fā)性再發(fā)作(SRS)的出現(xiàn) 給所有大鼠服用氯化鋰(3meq/kg，i.p.，Sigma，St Louis，Mo，美國)；約20小時后，將動物置于樹脂玻璃箱中，目的是記錄基礎(chǔ)皮層EEG。給予甲基東莨菪堿溴化物(1mg/kg，s.c，Sigma)來限制該驚厥劑的末梢作用。給予甲基東莨菪堿之后30分鐘，通過注射鹽酸毛果蕓香堿(25mg/kg，s.c，Sigma)誘發(fā)SE。記錄整個SE期間雙側(cè)EEG皮層活性，并注意行為的變化。
研究增加試驗化合物劑量對3組大鼠的影響。第一組動物在SE發(fā)作后1小時腹膜內(nèi)接受10mg/kg的試驗化合物(pilo-試驗10組)，而第二組和第三組動物分別接受30和60mg/kg試驗化合物(pilo-試驗30組和pilo-試驗60組)。
另一組在SE發(fā)作后1小時注射2mg/kg地西泮(DZP，i.m.)，這是SE后改善動物存活率的標(biāo)準(zhǔn)治療方法(pilo-DZP組)。對照組接受鹽水，用以代替毛果蕓香堿和試驗化合物(鹽水-鹽水組)。然后給pilo-試驗化合物SE存活的大鼠在第一次注射試驗化合物后約10小時，第二次腹腔注射相同劑量的試驗化合物，并保持每日2次用試驗化合物治療，再進行6日。在第一次注射后約10小時，在SE日中，Pilo-DZP接受第二次注射1mg/kg DZP。然后，Pilo-DZP組和鹽水-鹽水組大鼠每日2次接受等體積的鹽水。
通過每日10小時影像記錄動物并且每周2次8小時記錄動物電圖活性，研究試驗化合物對EEG和對SRS出現(xiàn)潛伏期的影響。
細胞密度的定量 SE后6日，對8只pilo-DZP、8只pilo-試驗10、7只pilo-試驗30、7只pilo-試驗60和6只鹽水-鹽水大鼠進行細胞密度定量。SE后14日，將動物用1.8g/kg戊巴比妥(

Vetoquinol，Lure，法國)深度麻醉。然后取出大腦，冷凍。用恒冷切片機切成一系列20μm的薄片，空氣干燥數(shù)日，然后用亞氨嗪(thionine)染色。
根據(jù)大鼠腦立體定位坐標(biāo)圖譜(Paxinos and Watson，1986，The Ratbrain in Stereotaxic Coordinates，2nd ed.Academic Press，San Diego)，用一個10x 10盒子1cm2精微網(wǎng)格對冠狀縫切片進行細胞密度定量。細胞計數(shù)以盲法進行2次，并且它是從各個體動物的2個相鄰切片中的至少三個值的平均值。僅對大于10μm的細胞計數(shù)，小的則認(rèn)為是膠質(zhì)細胞。
Timm染色 自發(fā)性復(fù)發(fā)癲癇發(fā)作開始后2個月，對長期接受試驗化合物或DZP的大鼠或者3只鹽水-鹽水組大鼠檢查萌發(fā)的苔狀纖維。將動物深度麻醉，經(jīng)頸動脈灌注鹽水、接著是100ml的1.15％(w/v)Na2S的0.1M磷酸鹽緩沖液溶液，以及100ml的4％(v/v)甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液溶液。從顱骨中取出大腦，后固定于4％甲醛中3-5小時，隨后在滑行振動切片機上切成40μm切片，然后在明膠涂布的載玻片上制作標(biāo)本。
次日，在暗處，將切片在26℃下的50％(w/v)阿拉伯樹膠(160ml)、檸檬酸鈉緩沖液(30ml)、5.7％(w/v)氫醌(80ml)和10％(w/v)硝酸銀(2.5ml)的溶液中顯色40-45分鐘。然后將切片用40℃下的自來水漂洗至少45min，用蒸餾水快速漂洗，接著干燥。將它們在乙醇中脫水并蓋上蓋玻片。
根據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)，在背海馬中評價苔狀纖維的萌發(fā)(Cavazos等，1991，J Neurosci 112795-2803.)，如下評價0-在DG的頂端和嵴之間無顆粒；1-在DG的頂端和嵴之間細胞上顆粒(supragranular)區(qū)域以斑片狀分布的稀疏顆粒；2-在DG的頂端和嵴之間連續(xù)分布的更多顆粒；3-在頂端和嵴之間連續(xù)式樣的凸出顆粒，并在頂端和嵴之間偶有融合顆粒的斑；4-在頂端和嵴之間形成融合的密集疊片狀環(huán)帶的凸出顆粒；以及5-延伸到內(nèi)分子層的顆粒的融合密集的疊片狀環(huán)帶。
數(shù)據(jù)分析 采用非成對Student′s t-檢驗，比較pilo-鹽水組和pilo-試驗化合物組動物中SE的特征。通過卡方檢驗進行兩組中發(fā)作大鼠數(shù)目之間的比較。對于神經(jīng)元損傷，各組之間的統(tǒng)計學(xué)分析先后采用ANOVA和Fisher′s檢驗，使用Statview軟件進行多重比較(Fisher RA，1946a，Statistical Methods for Research Workers(第10版)Oliver & Boyd，Edinburgh；Fisher RA，1946b，The Design of Experiments(第4版)Oliver& Boyd，Edinburgh)。
鋰-毛果蕓香堿癲癇持續(xù)狀態(tài)的行為和EEG特征 將重約250-330g的總量的Sprague-Dawley大鼠經(jīng)歷Li-pilo誘發(fā)的SE。pilo-鹽水和pilo-試驗化合物組中SE的行為和特征相同。注射毛果蕓香堿5min后，大鼠出現(xiàn)腹瀉、豎毛和其它膽堿能刺激的征象。在隨后15-20min期間，大鼠呈現(xiàn)頭上下?lián)u動、搔抓、咀嚼和探索行為。給予毛果蕓香堿大約15-20min后，開始再發(fā)作癲癇。給予毛果蕓香堿大約35-40min后，伴隨用后腿站起和跌倒有關(guān)的頭和左右前肢肌陣攣的發(fā)作的這些癲癇發(fā)作發(fā)展成為SE，如前所述(Turski等，1983，Behav Brain Res 9315-335.)。
SE期間EEG模式 在SE的第一個小時期間，在不用藥物治療下，EEG的幅度漸進性增加，同時頻率降低。在注射毛果蕓香堿后的5min內(nèi)，皮層中正常本底的EEG活性被低電壓快速活性所代替，同時θ節(jié)律(5-7Hz)出現(xiàn)在海馬區(qū)。經(jīng)過15-20min，高電壓快速活性重疊在海馬的θ節(jié)律上，并僅在海馬區(qū)記錄到分離的高壓棘波，同時皮層的活性基本上無變化。
經(jīng)過注射毛果蕓香堿后35-40min，動物發(fā)展成為典型的腦電圖癲癇發(fā)作，伴有在海馬區(qū)和皮層中都存在高壓快速活性，在癲癇發(fā)作前首先出現(xiàn)的是活性爆發(fā)，接著是連續(xù)序列的高壓棘波和多棘波，一直持續(xù)到給予DZP或試驗化合物為止。在SE約3-4h，海馬區(qū)EEG的特征為在pilo-DZP和pilo-10組的海馬區(qū)和皮層中周期性的腦電圖放電(PEDs，約1次/秒)。EEG本底活度的幅度在pilo-試驗60動物中較低。在SE約6-7h，在DZP-和試驗10-處理的大鼠中，棘波活性仍存在于皮層和海馬區(qū)中，而在試驗30大鼠的海馬區(qū)和在試驗60處理的大鼠的兩個結(jié)構(gòu)中，EEG的幅度降低并回到本底水平。在試驗10、試驗30和試驗60組之間沒有差別。SE后9h，在試驗化合物處理的大鼠的海馬以及偶爾在皮層中仍能記錄到分離的棘波。在兩個結(jié)構(gòu)中，本底活性在實驗時幅度非常低。
SE誘發(fā)的死亡率 在SE后的首個48小時期間，在pilo-DZP大鼠(23％，5/22)、pilo-試驗10大鼠(26％，6/23)和pilo-試驗30大鼠(20％，5/25)中，死亡率的程度是類似的。在pilo-試驗60大鼠中，死亡率大大降低，僅達到4％(1/23)。這種差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
靜止期EEG特征和自發(fā)性復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作的出現(xiàn) 靜止期期間的EEG受治療者與pilo-DZP和pilo-試驗10、30或60組的大鼠類似。SE后24和48h，基線EEG的特征仍存在PEDs，其中大波或棘波可能重疊。在注射試驗化合物或注射媒介物之后1-8h之間，pilo-DZP或pilo-試驗10組無變化。在試驗30和試驗60大鼠中，注射10分鐘后，PEDs的頻率和幅度即降低，并被試驗30組中較大振幅的棘波和試驗60組中較低振幅的棘波代替。注射后4h，EEG返回到后兩組中的基線水平。SE后6日，EEG仍處于比注射毛果蕓香堿之前更低的幅度，并且在大多數(shù)組中仍可記錄到棘波，偶爾也出現(xiàn)在pilo-DZP、-試驗10和-試驗30大鼠中。在pilo-試驗60大鼠中，大振幅棘波的頻率比所有其它組中的高。注射試驗化合物或媒介物之后，在pilo-DZP和pilo-試驗10組中，EEG記錄不受注射的影響。在pilo-試驗30大鼠中，注射誘導(dǎo)海馬和皮層的EEG上的慢波出現(xiàn)，而在pilo-試驗60大鼠中棘波頻率降低。
研究用DZP、試驗10和試驗30處理的全部大鼠，直至慢性期發(fā)展成為具有相似潛伏期的SRS。pilo-DZP大鼠潛伏期為18.2±6.9日(n＝9)，pilo-試驗10大鼠為15.4±5.1日(n＝7)，pilo-試驗30大鼠為18.9±9.0日(n＝10)。在接受試驗60處理的大鼠組中，一個亞組的大鼠變?yōu)榘d癇的潛伏期與其它組類似，即17.6±8.7日(n＝7)，而另一組大鼠變?yōu)榘d癇延遲的時間較長，在SE后109-191日(149.8±36.0日，n＝4)，并且一只大鼠在SE后9個月尚未變?yōu)榘d癇。pilo-DZP、pilo-試驗10、pilo-試驗30與pilo-TPM60大鼠的第一亞組之間對SRS的潛伏期沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差別。鹽水-鹽水組大鼠(n＝5)沒有一只發(fā)展為SRS。
為計算接觸毛果蕓香堿的大鼠中SRS的頻率，可將癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度和明顯的III期(面肌和前肢的陣攣性發(fā)作)和IV-V期發(fā)作(用后腿站起和墜落)考慮在內(nèi)。pilo-DZP和pilo-試驗化合物組的大鼠每周III期SRS的頻率在各組之間是變化的。在前3周期間，pilo-DZP和pilo-試驗60(帶有早期SRS發(fā)作)組中頻率是低的，恒定的，在第4周期間，pilo-DZP組中已消失。III期SRS的頻率在pilo-試驗10組中較高，其中在3和4周期間比pilo-DZP組的值明顯增加。更嚴(yán)重的IV-V期SRS頻率在大多數(shù)組的第一周中都是最高的，除晚期癲癇發(fā)作的pilo-試驗30和試驗60組之外，其中在試驗30組的整個4周中以及pilo-試驗60組的前兩周，SRS頻率不變，pilo-試驗60組具有沒有IV-V期癲癇發(fā)作的晚期SRS發(fā)作，其中第二周后沒記錄到癲癇發(fā)作。在第一周中，與pilo-DZP組(每周11.3次SRS)相比，試驗10、試驗30和試驗60(帶有早期SRS發(fā)作)組(每周2.3-6.1次SRS)的IV-V期SRS頻率明顯降低。在第2-4周中，與第一周每周達到2-6次癲癇發(fā)作的值相比，所有組的IV-V期SRS頻率都降低，除具有早期SRS發(fā)作的pilo-試驗60組之外，其中與其SRS頻率在3.3-5.5范圍的pilo-DZP組別比較，其每周癲癇發(fā)作頻率明顯降低到0.6-0.9次。
海馬、丘腦和皮層中的細胞密度 與鹽水-鹽水組大鼠比較，在pilo-DZP大鼠中，海馬CA1區(qū)內(nèi)細胞數(shù)量顯著降低(在錐體細胞層70％細胞損失)，而CAS區(qū)降低較小(CA3a內(nèi)為54％細胞損失，CA3b內(nèi)為31％)。在齒狀回中，pilo-DZP大鼠門中細胞損失較大(73％)，而粒細胞層沒有顯示明顯的損失。在腹面海馬中發(fā)現(xiàn)類似的損傷，但在該區(qū)未進行細胞計數(shù)。在丘腦核側(cè)面也記錄到廣泛的損傷(91％細胞損失)，而丘腦核側(cè)部損傷較為適度(56％)。在梨狀皮質(zhì)中，細胞損傷在III-IV層完全不再可見，pilo-DZP組大鼠中II層中達到53％。在背側(cè)的內(nèi)嗅皮質(zhì)，II層和III-IV層損傷較小(分別為9和15％)。背側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的II層完全被保護起來，而III-IV層細胞損傷為44％。
在pilo-試驗化合物動物的海馬中，與pilo-DZP大鼠相比，CA1錐體細胞層中細胞損失降低，其中pilo-DZP組中細胞損失達到75％，pilo-試驗30或pilo-試驗60動物中細胞損失分別為35和16％。兩個試驗化合物劑量的差異在統(tǒng)計學(xué)上是明顯的。在CAS錐體細胞層中，試驗化合物在CA3a區(qū)域中沒有提供任何保護作用，而60mg/kg的試驗化合物的劑量在CA3b中具有明顯的神經(jīng)保護作用。在齒狀回中，門中細胞損失在pilo-試驗化合物(69-72％)和pilo-DZP動物(73％)中類似。在兩側(cè)丘腦核中，60mg/kg劑量也有降低神經(jīng)損傷的保護作用，在側(cè)面和內(nèi)側(cè)背核分別降低65和42％。在大腦皮層中，與DZP相比，僅在高劑量60mg/kg下，用試驗化合物治療提供神經(jīng)保護作用。在兩個最低劑量10和30mg/kg下，pilo-DZP大鼠和pilo-試驗化合物大鼠中，在梨狀皮質(zhì)的III-IV層中觀察到的總細胞損失和組織破壞相同，但在任何組中并未進行任何計數(shù)。在梨狀皮質(zhì)的II和III-IV層中，試驗60治療組在pilo-DZP大鼠中記錄的降低神經(jīng)損害分別為41和44％。在腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)，給予試驗60可在III-IV層中引發(fā)神經(jīng)保護作用，與pilo-DZP大鼠相比，達到31％。在內(nèi)嗅皮層中，與pilo-DZP大鼠的背側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的III-IV層(28％以上損傷)以及腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的III-IV層(35％以上損傷)相比，pilo-試驗10大鼠細胞損傷稍重。在試驗化合物的其它劑量下，內(nèi)嗅皮層中的細胞損傷與pilo-DZP大鼠中記錄的類似。
海馬中苔狀纖維的萌生 pilo-DZP和pilo-TPM組中呈現(xiàn)SRS的所有大鼠都在齒狀回的內(nèi)分子層中表現(xiàn)出類似的Timm染色強度(評分為2-4)。在齒狀回的上下片都顯示出Timm染色。上片中Timm評分的平均值在pilo-DZP大鼠(n＝9)達到2.8±0.8，pilo-試驗10(n＝7)大鼠達到1.5±0.6，pilo-試驗30大鼠(n＝10)達到2.6±1.0，pilo-試驗60大鼠的所有組(n＝11)中達到1.5±0.7。當(dāng)根據(jù)SRS潛伏期將pilo-試驗60組細分時，伴有早期SRS發(fā)作的亞組表示的Timm分值為1.8±0.6(n＝6)，而伴有遲發(fā)或不出現(xiàn)SRS的亞組的Timm分值為1.2±0.6(n＝5)。pilo-DZP大鼠中記錄的值與pilo-試驗10(p＝0.032)和具有遲發(fā)或無癲癇發(fā)作的pilo-試驗60亞組(p＝0.016)中的值具有統(tǒng)計學(xué)上的明顯差異。
討論和結(jié)論 該研究結(jié)果表明在SE發(fā)作后1小時起用試驗化合物的7-日療法能保護大腦的某些區(qū)域免受神經(jīng)元損傷，例如在CA1和CA3b區(qū)域的錐體細胞層、丘腦的背中部、梨狀皮質(zhì)的II和I1MV層以及腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的III-IV層，但是僅出現(xiàn)在試驗化合物的最高劑量，即60mg/kg時。試驗化合物的后一劑量也能延遲SRS的出現(xiàn)，至少在比其它組動物具有長約9倍的平均延遲期的癲癇發(fā)作的亞組動物中，但有一只動物在SE后9個月的延遲期內(nèi)也未有癲癇發(fā)作。
這些結(jié)果表明具有抗發(fā)作性質(zhì)的化合物，這是大多數(shù)市售的抗癲癇藥物的典型的特性，也能延遲癲癇發(fā)作，即具有抗癲癇作用。本研究數(shù)據(jù)還表明無論使用何種劑量的試驗化合物治療都能降低癲癇的嚴(yán)重程度，原因是它降低IV-V期癲癇發(fā)作的次數(shù)，主要是在發(fā)作的第一周期間，以及在用試驗60治療的整個4周的觀察期間。另外，在試驗10組中，存在嚴(yán)重性較弱的III期發(fā)作出現(xiàn)增加的變化，其比pilo-DZP組發(fā)作次數(shù)更多。
實施例2 鋰-毛果蕓香堿誘發(fā)大鼠癲癇模型中增加試驗化合物劑量對神經(jīng)保護作用和抗癲癇作用的可能影響 本項目的目的是繼續(xù)進行對顳葉性癲癇的鋰-毛果蕓香堿(Li-Pilo)模型中試驗化合物對潛在的神經(jīng)保護作用和抗癲癇作用的研究。本研究接著第一個實驗進行(以上實施例1)，其中已表明試驗化合物能夠保護海馬的CA1和CA3區(qū)域、梨狀皮質(zhì)和腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)免受Li-Pilo癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。大多數(shù)這些神經(jīng)保護特性都出現(xiàn)在所研究的最高劑量60mg/kg時，并且這種治療能延遲36％大鼠(11只中4只)出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作。在本研究中，我們計劃研究試驗化合物對神經(jīng)元損傷、癲癇發(fā)作、神經(jīng)元興奮性和行為的治療效果。
顳葉性癲癇的鋰-毛果蕓香堿模型 通過與鋰締合的毛果蕓香堿(Li-Pilo)誘發(fā)的大鼠模型再現(xiàn)人顳葉性癲癇的大多數(shù)臨床和神經(jīng)生理學(xué)特征(Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci 1633-37)。在成年大鼠中，全身性給予毛果云香堿導(dǎo)致可持續(xù)長達24小時的SE。第一日內(nèi)，致死率達到30-50％。在存活的動物中，神經(jīng)元損傷主要出現(xiàn)在海馬結(jié)構(gòu)、梨狀和內(nèi)嗅皮質(zhì)、丘腦、杏仁體、新皮質(zhì)和黑質(zhì)之內(nèi)。這種急性發(fā)作期后接著是一段“安靜”的不發(fā)作期，平均持續(xù)時間14-25日，然后所有動物以通常每周2-5次的頻率，顯示出自發(fā)的再發(fā)性抽搐發(fā)作(見Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci1633-37；Dubé等，2001，Exp Neurol 167227-241)。目前的抗癲癇藥物不能阻止該癲癇發(fā)生，并且僅對復(fù)發(fā)性發(fā)作具有短暫性效果。
在我們的前期研究中，我們研究在單一療法中增加所給予的試驗化合物的劑量對神經(jīng)保護作用和抗癲癇發(fā)作作用的可能影響，并與大多數(shù)約定的抑制高死亡率的標(biāo)準(zhǔn)地西泮療法相比較。這些數(shù)據(jù)表明在SE發(fā)作后1小時開始用10、30或60mg/kg(RWJ10、RWJ 30、RWJ 60)劑量的試驗化合物的7-日療法能保護大腦的某些區(qū)域免受神經(jīng)元損傷。這些作用在CA1和CA3b區(qū)域的錐體細胞層、丘腦的背中部、梨狀皮質(zhì)的II和III-IV層以及腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的III-IV層中具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，但是僅在試驗化合物的最高劑量下，即60mg/kg(RWJ60)有意義。另外，結(jié)果顯示試驗化合物的最大劑量也是唯一能延遲自發(fā)性復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作(SRS)的出現(xiàn)的劑量，至少在比其它組動物具有長約9倍的平均延遲期的癲癇發(fā)作的亞組動物中，但有一只動物在SE后9個月的延遲期內(nèi)也未癲癇發(fā)作。
在本研究中，我們使用與前期研究相同的實驗設(shè)計，測試了各種不同劑量試驗化合物的作用，即30、60、90和120mg/kg(在此稱為RWJ30、RWJ60、RWJ90和RWJ120)。治療在癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)發(fā)作后1小時開始，經(jīng)第二次注射相同劑量的藥物來處理動物。SE的這種早期治療接著為6日試驗化合物的治療。該報告涉及四個不同劑量的試驗化合物對海馬和海馬回皮層中神經(jīng)元損傷的影響。有關(guān)癲癇發(fā)作的潛伏期的研究尚不完善，但我們?nèi)哉宫F(xiàn)出我們目前對有限組動物進行的試驗所得到的數(shù)據(jù)。相同大鼠中自發(fā)性癲癇發(fā)作的潛伏期與發(fā)作周期中涉及的區(qū)域內(nèi)保留的神經(jīng)元數(shù)目相關(guān)。
將Janvier培育中心(Janvier Breeding Center)(Le Genest-St-Iste，法國)提供的成年雄性Sprague-Dawley大鼠飼養(yǎng)于控制的、不擁擠的20-22℃標(biāo)準(zhǔn)條件下(明/暗循環(huán)，7.00a.m.-7.00p.m.燈照)，任意提供食物和飲水。所有動物實驗均遵從1986年11月24日歐洲共同體理事會導(dǎo)則(86/609/EEC)和法國農(nóng)業(yè)部(許可證N°67-97)的規(guī)定。
癲癇持續(xù)狀態(tài)的誘發(fā)、試驗化合物治療以及SRS發(fā)作 給所有大鼠服用氯化鋰(3meq/kg，i.p.，Sigma，St Louis，Mo，美國)，約20小時后，再給予所有動物甲基東莨菪堿溴化物(1mg/kg，s.c，Sigma)來限制該驚厥劑的末梢作用。給予甲基東莨菪堿之后30分鐘，通過注射鹽酸毛果蕓香堿(25mg/kg，s.c，Sigma)誘發(fā)SE。研究增加試驗化合物(RWJ)劑量對5組大鼠的影響。在SE發(fā)作后1小時，動物或者接受肌內(nèi)注射2.5mg/kg地西泮(DZP)，或者腹膜內(nèi)接受30、60、90或120mg/kg試驗化合物(RWJ30、RWJ60、RWJ90、RWJ120)。對照組接受介質(zhì)，用以代替毛果蕓香堿和試驗化合物。然后給SE存活的大鼠在第一次注射試驗化合物后10小時，對DZP組第二次腹腔注射1.25mg/kg DZP或與試驗化合物相同劑量(在早晨)，并每日2次用試驗化合物維持治療，再進行6日(s.c.)，同時DZP大鼠接受溶媒注射。通過每日10小時影像記錄動物，研究4種劑量的試驗化合物對自發(fā)性復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作(SRS)出現(xiàn)的潛伏期的影響。
細胞密度的定量 細胞密度的定量在SE后兩個時間進行第一組在SE后14日研究，其由7DZP、8RWJ30、11RWJ60、10RWJ90、8RWJ 120和8只未經(jīng)歷SE的對照大鼠組成。將在第一次SRS后8周或者在延遲期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)SRS的5個月，將用于進行對SRS延遲期研究的第二組大鼠處死，其由7DZP、2RWJ30、3RWJ60、3RWJ90、4RWJ 120大鼠組成。將動物用1.8g/kg戊巴比妥(

Vétoquinol，Lure，法國)深度麻醉。然后取出大腦，冷凍。用恒冷切片機切成一系列20μm的薄片，空氣干燥數(shù)日，然后用亞氨嗪染色。根據(jù)大鼠腦立體定位坐標(biāo)圖譜(Paxinos and Watson，1986，The Rat brain in StereotaxicCoordinates，2nd ed.Academic Press，San Diego)，用一個10x 10盒子1cm2精微網(wǎng)格對冠狀縫切片進行細胞密度定量。將計數(shù)的網(wǎng)格置于所涉及的大腦結(jié)構(gòu)的明確的區(qū)域內(nèi)，然后用確定的200-或400-倍放大顯微鏡對各單個的大腦結(jié)構(gòu)進行計數(shù)。由一名不知道所述動物治療法的觀察者對每個區(qū)域的三個鄰近切片的各側(cè)進行計數(shù)2次。將各大腦結(jié)構(gòu)中12個計數(shù)區(qū)域內(nèi)得到的細胞數(shù)進行平均。用該程序?qū)⒂呻p倍計數(shù)可導(dǎo)致過高評價細胞數(shù)的的可能誤差降到最小。不計接觸到網(wǎng)格下方及右緣的神經(jīng)元。僅對大于10μm的細胞體神經(jīng)元計數(shù)。小細胞體細胞被認(rèn)為是膠質(zhì)細胞而不計數(shù)。
數(shù)據(jù)分析 對于神經(jīng)元損傷，通過單向方差分析法，接著使用Statview軟件的Scheffe′s檢驗，對各組之間進行統(tǒng)計分析。
結(jié)果 鋰-毛果蕓香堿癲癇持續(xù)狀態(tài)的行為特征 將總數(shù)101只體重為250-330g的Sprague-Dawley大鼠經(jīng)歷鋰-毛果蕓香堿(Li-pilo)-誘發(fā)的SE。在該總數(shù)中，2只未發(fā)展為SE，而99只大鼠發(fā)生全特征的Li-pilo SE。lipilo-DZP和lipilo-RWJ兩組中的SE行為特征相同。注射毛果蕓香堿后5min內(nèi)，大鼠出現(xiàn)腹瀉、豎毛和其它類膽堿能藥物刺激的體征。在隨后15-20min期間，大鼠呈現(xiàn)頭上下?lián)u動、擦傷、咀嚼和探索行為。給予毛果蕓香堿大約15-20min后，開始復(fù)發(fā)癲癇。給予毛果蕓香堿大約35-40min后，伴隨用后腿站起和跌倒有關(guān)的頭和左右前肢肌陣攣的發(fā)作的這些癲癇發(fā)作發(fā)展成為SE，如前所述(參見Turski等，1989；Synapse 3154-171；Dubé等，2001，Exp Neurol 167227-241和André等，2003，Epilepsia 44893-903)。
在進行早期細胞計數(shù)的動物組中，SE后首個48小時期間，死亡率的程度在各治療組間是變化的DZP大鼠死亡47％(7/15)、RWJ30大鼠死亡43％(6/14)、RWJ60大鼠死亡0％(0/11)，RWJ90大鼠死亡0％(0/10)和RWJ120大鼠死亡47％(7/15)。在DZP組中，在首個24小時，4/7大鼠死亡，24-48小時期間，3只死亡。在RWJ30大鼠組中，在首個24小時，4/6大鼠死亡，24-48小時期間，2只死亡。在RWJ120大鼠組中，在首個24小時，6/7大鼠死亡，24-48小時期間，1只死亡。遭受SE且接受鋰和鹽水的對照組由10只大鼠組成。
在進行SRS潛伏期和最后細胞計數(shù)的研究的動物組中，死亡率的程度如下DZP大鼠30％(3/10)、RWJ30大鼠50％(2/4)、RWJ60大鼠0％(0/3)、RWJ90大鼠0％(0/3)和RWJ120大鼠0％(0/4)死亡。在DZP大鼠組別中，在首個24h內(nèi)3/3大鼠死亡。在RWJ30組別中，在首個24h內(nèi)1/2大鼠死亡，24-48h期間1只大鼠死亡。
早期海馬和皮質(zhì)中的細胞密度(SE后14日) 在將DZP大鼠與對照大鼠的比較中，海馬CA1區(qū)內(nèi)細胞數(shù)量大量降低(在錐體細胞層85％細胞損失)，而CA3區(qū)降低較小(CA3中細胞損失40％)(參見表1和圖1)。在齒狀回中，DZP大鼠門中細胞損失較大(66％)，而粒細胞層通常沒有顯示明顯的損失。在腹面海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)類似的損傷，但在該區(qū)未進行細胞計數(shù)。在DZP大鼠的梨狀皮質(zhì)中，細胞損傷在幾乎都在III層中(94％)，其實際不再可見，在背部和腹側(cè)II層中分別達到66和89％。在背側(cè)的內(nèi)嗅皮質(zhì)，II層和III-IV層損傷較小(分別為18和24％)，而在腹部II和III/IV層中，損傷分別達到22和74％(表1和圖2)。
在RWJ動物的海馬中，與DZP大鼠相比，RWJ30、60或90大鼠中的CA1錐體細胞層中細胞損失有些降低(36-57％細胞損失)，在RWJ120中明顯降低(13％細胞損失)。所有RWJ劑量存在統(tǒng)計學(xué)上的明顯差異(表1和圖1)。在CAS錐體細胞層中，RWJ僅在120mg/kg劑量下具有誘導(dǎo)輕微神經(jīng)保護的作用，但與DZP組沒有顯著差別。在齒狀回中，門中細胞損失在DZP和RWJ30、60以及90組中類似(62-66％損傷)，與DZP動物(66％細胞損傷)相比，RWJ120組顯示輕微降低損傷的趨勢(54％損傷)。這些差別不具統(tǒng)計學(xué)意義。
在大腦皮層中，與DZP治療組相比，用試驗化合物治療能保護幾乎所有的皮質(zhì)區(qū)域。在梨狀皮質(zhì)中，RWJ30劑量沒有保護任何層。相反地，60-120mg/kg劑量的試驗化合物能在III層中提供某些神經(jīng)保護作用(在兩個較低劑量細胞損傷53-64％，而在120mg/kg RWJ細胞中損傷為21％)。僅在最高劑量下具有統(tǒng)計學(xué)上的明顯差異。在背側(cè)層II中，與DZP-臺療的大鼠相比(66％損傷)，60-120mg/kg誘發(fā)統(tǒng)計學(xué)上明顯的神經(jīng)保護作用(4-21％損傷)。在腹側(cè)II層中，與DZP大鼠(89％損傷)相比，60和120mg/kg RWJ劑量稍具保護作用(分別為56和45％損傷)，而120mg/kg能大部分保護梨狀皮質(zhì)的這一層(9％損傷)。在所有的背側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)中，所研究的試驗化合物的兩個最低劑量30和60mg/kg并未提供任何神經(jīng)保護作用。所試驗的試驗化合物的兩個最高劑量90和120mg/kg保護背側(cè)和腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的II和III/IV層，與DZP組的18-24％損傷相比，背側(cè)II和III/IV層和腹側(cè)II層中保留4-14％損傷，與DZP組74％細胞損失相比，腹側(cè)III/IV層細胞損失為18-21％。但是，這種差別僅在內(nèi)嗅皮質(zhì)的腹側(cè)部具有統(tǒng)計學(xué)意義。
早期梨狀皮質(zhì)中的細胞密度(SE后14日) 在經(jīng)受SE并用DZP或30mg/kg試驗化合物治療的大鼠中，所研究的不同區(qū)域內(nèi)的細胞群處于所有動物中的相同范圍。相反地，在試驗化合物的三個最高劑量下，根據(jù)梨狀皮質(zhì)中存活的神經(jīng)元數(shù)目，一個亞組幾乎完全被保護，而另一亞組如DZP組一樣被廣泛損傷，可將兩個亞組大鼠區(qū)別開來。在60和90mg/kg試驗化合物劑量下的腹側(cè)梨狀皮質(zhì)的II層，以及在60、90和120mg/kg試驗化合物的三組下的相同皮質(zhì)的III層，兩個亞組中神經(jīng)元數(shù)目之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。內(nèi)嗅皮質(zhì)中存在類似的趨勢，但并不明顯，可能是因為該皮質(zhì)中損傷并不廣泛，差別未達到顯著意義(未顯示數(shù)據(jù))。
復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作的潛伏期 在這個試驗中我們有的唯一數(shù)據(jù)就是其中我們開始研究癲癇發(fā)作的各亞組中的潛伏期。DZP組(7只大鼠)中，自發(fā)性癲癇發(fā)作的潛伏期達到平均值為18±8日，而30mg/kg(RWJ30)試驗化合物組的兩只大鼠的值為8和9日。在DZP的三個其它劑量下，存在小的分類，即潛伏期類似于DZP和RWJ30的亞組群和具有比首次SRS延長的潛伏期的亞組群。在RWJ60組中，2/3大鼠分別在SE的7和8日之后出現(xiàn)首次自發(fā)性癲癇發(fā)作，而一只大鼠在SE的38日之后出現(xiàn)其首次癲癇發(fā)作。在90mg/kg試驗化合物的劑量下，2/3大鼠分別在SE的9和10日之后出現(xiàn)其首次自發(fā)性癲癇發(fā)作，而一只大鼠在SE的51日之后出現(xiàn)其首次癲癇發(fā)作。最后，在120mg/kg試驗化合物的劑量下，2/4大鼠具有延長的潛伏期，分別在44和79日之后出現(xiàn)其首次自發(fā)性癲癇發(fā)作。而其它兩只大鼠在SE后記錄的5個月中未發(fā)生任何癲癇發(fā)作(圖4A)。
復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作潛伏期和基底皮質(zhì)中存活的神經(jīng)元數(shù)目之間的關(guān)系 當(dāng)將已在各種潛伏期后變成癲癇病或尚未變成癲癇病的動物皮質(zhì)區(qū)內(nèi)存活的神經(jīng)元數(shù)根據(jù)首次SRS潛伏期作圖時，似乎看來潛伏期的持續(xù)時間與這些區(qū)域內(nèi)存活的神經(jīng)元數(shù)相關(guān)。這在圖4B的腹側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的III/IV層中顯示，但在背側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的III/IV層和梨狀皮質(zhì)的II層情況也似乎如此。但是，此時各組中大鼠的數(shù)目還很低，以至于不能使我們得出腹側(cè)皮質(zhì)中試驗化合物治療后SE存活的神經(jīng)元百分?jǐn)?shù)與所述藥物抗癲癇作用之間直接相關(guān)的結(jié)論。
結(jié)果與討論 本研究結(jié)果表明在海馬的CA1錐體細胞層以及在梨狀皮質(zhì)和腹側(cè)和背側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)的所有層中，Li-pilo-誘導(dǎo)SE發(fā)作后1小時開始用試驗化合物的治療法具有神經(jīng)保護特性。但是，在該模型中，試驗化合物在30mg/kg劑量下不具保護性，從60mg/kg劑量下開始呈現(xiàn)神經(jīng)保護性質(zhì)。在較后的劑量以及在兩個較高劑量90和120mg/kg下，所述藥物也能延遲首次自發(fā)性癲癇發(fā)作的出現(xiàn)的潛伏期，但僅在各劑量的亞組動物中。另外，這種癲癇出現(xiàn)的延遲似乎與相同動物基部皮質(zhì)中SE存活的神經(jīng)元數(shù)目相關(guān)。但是，在該研究部分中，動物的數(shù)量仍不足以斷然作出相關(guān)的結(jié)論。
本研究中得到的數(shù)據(jù)與我們組前期研究結(jié)果一致，前期研究報告60mg/kg劑量的試驗化合物保護海馬和基底皮質(zhì)免受神經(jīng)元損傷，并能延遲再發(fā)性癲癇發(fā)作的出現(xiàn)(見以上實施例1)。他們還確證基底皮質(zhì)的保護似乎是在癲癇的鋰-毛果蕓香堿模型中誘導(dǎo)疾病改善作用的關(guān)鍵因素，在120mg/kg劑量下，其或者延長潛伏的無癲癇發(fā)作期甚或其抑制期。在鋰-毛果蕓香堿模型組中，我們先前已證明了作為癲癇過程啟動劑的基部皮質(zhì)的關(guān)鍵作用(參見André等的2003，Epilepsia 44893-903，Roch等的2002，Epilepsia 43325-335和Epilepsia 431129-1136)。
因此，試驗化合物在該模型中顯示出非常有希望的抗癲癇和神經(jīng)保護作用，且據(jù)我們所知，第一種分子能夠展現(xiàn)這些性質(zhì)。見下表1 表1.增加試驗化合物劑量對經(jīng)歷Li-Pilo SE大鼠的海馬和大腦皮質(zhì)中神經(jīng)元細胞體數(shù)目的影響。RWJ30＝30mg/kg試驗化合物，RWJ60＝60mg/kg試驗化合物，RWJ90＝90mg/kg試驗化合物和RWJ120＝120mg/kg試驗化合物。
表示為各研究區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元細胞體數(shù)目的值代表平均值±括弧內(nèi)動物數(shù)的S.E.M. *p＜0.05，**p＜0.01表示與對照組具有統(tǒng)計學(xué)上明顯差異 °p＜0.05，°°p＜0.01表示與DZP組具有統(tǒng)計學(xué)上明顯差異， 實施例3 PC12細胞去血清模型 去血清是一種細胞毒性環(huán)境攻擊，其導(dǎo)致培養(yǎng)的細胞系中以及各種組織起源的初級細胞(包括神經(jīng)細胞)中的細胞死亡。尤其是，嗜鉻細胞瘤(PC)12細胞已被廣泛用作各種神經(jīng)變性和細胞死亡相關(guān)疾病的體外神經(jīng)元細胞模型(Muriel等，神經(jīng)酰胺依賴性細胞死亡過程中神經(jīng)元分化的PC12細胞中線粒體的游離鈣水平(Rhod-2熒光)和超微結(jié)構(gòu)的改變(Mitochondrial free calcium levels(Rhod-2 fluorescence)andultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells duringceramide-dependent cell death)，J.Comp.Neurol.，2000，426(2)，297-315；Dermitzaki等，短期去血清后阿片短暫性抑制細胞凋亡機制的激活(Opioids transiently prevent activation of apoptotic mechanisms followingshort periods of serum withdrawal)，J.Neurochem.，2000，74(3)，960-969；Carlile等，去神經(jīng)生長因子和血清后細胞凋亡的降低四聚體甘油醛-3-磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w(Reduced apoptosis after nerve growthfactor and serum withdrawalconversion of tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to a dimmer)，Mol Pharmacol.，2000，57(1)，2-12)。
將PC12細胞培養(yǎng)于補充有10％熱滅活馬血清和5％胎牛血清(FBS)的無菌培養(yǎng)基(RPMI 1640)中。該培養(yǎng)基還包含抗生素青霉素-鏈霉素-新霉素(分別為50.mu.g、50.mu.g、100.mu.g)。每隔一日更換培養(yǎng)基，細胞通過對數(shù)期接近融合。
將對照細胞培養(yǎng)于無任何處理的常規(guī)培養(yǎng)基中。將式7或式8的對映體(10.mu.M)在培養(yǎng)基中充分混合，然后施加于細胞中。對于2日的試驗，僅在去血清時立即將式7或式8的對映體(10.mu.M)施加于細胞中。對于7日的試驗，在去血清時和每48小時用新鮮新的無血清培養(yǎng)基更換細胞時，將式7或式8的對映體(10.mu.M)施加于細胞中。在去血清組中，將細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不另外加入式7或式8的對映體。在去血清后2或7日，通過3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓內(nèi)鹽(MTS)測定法測定細胞存活率。
在實驗結(jié)束時，將細胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌，并在潮濕37℃下5％CO2培養(yǎng)箱中與MTS溶液一起培養(yǎng)1.5小時。培養(yǎng)期之后，用Softmax程序(Molecular Devices)，立即對細胞進行分析。MTS測定法是一種測定給定試驗環(huán)境下活細胞數(shù)的量熱法。該測定法的基礎(chǔ)是四唑鎓鹽MTS的細胞轉(zhuǎn)化為甲

(formazan)，將甲

溶解于組織培養(yǎng)基中，在96孔測定板中在490nm處直接測定。吸光度與培養(yǎng)物中活細胞數(shù)直接成比例。將對照細胞中讀取的隨機吸光度表示為100％存活率。表2列出表明在PC12細胞去血清模型中口服給予式7和式8對映體對細胞存活率影響的數(shù)據(jù)(.sup.1p值-0.01；.sup.2p值-＜0.01)。
表2(％細胞存活率) 實施例4 大鼠暫時性腦缺血模型 使用雄性Wistar大鼠，運用短暫腦缺血中腦動脈閉塞(MCAO)大鼠模型(見Nagasawa H和Kogure K.，Stroke，1989，20，1037；和ZeaLonga E.，Weinstein P.R.，Carlson S和Cummins R.，Stroke，1989，20，84中所述)，研究10和100mg/kg(i.v.)式7的對映體。采用MK 801(馬來酸地佐環(huán)平；CAS登記號77086-22-7，市售獲得的神經(jīng)保護化合物)作為陽性對照(3mg/kg，i.p.)。
將大鼠(n＝12)隨機分配為四個試驗組之一中，然后麻醉。通過該操作阻斷血液從頸內(nèi)動脈、大腦前動脈和大腦后動脈流向大腦中動脈。阻斷1小時后，在一小時內(nèi)，將動物用介質(zhì)(在1小時內(nèi)靜脈注射給予)、對照藥物(在該1小時期間開始時一次性腹腔注射給予)和2個劑量的式7的對映體(在該1小時內(nèi)靜脈注射給予)處理。阻斷2小時后，進行再灌注。
將動物處死，制備20mm厚的各腦的冠狀縫切片。用將從前至枕葉皮質(zhì)每40個切片(即每800nM)的一個來定量大腦損傷的程度。使用甲酚紫染色(根據(jù)Nissl程序)的切片制備載玻片，然后在光顯微鏡下檢查。
根據(jù)出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)變化的細胞確定各個大鼠冠狀縫切片中局部缺血的表面積。測定神經(jīng)元損傷或梗塞的面積，然后相加。計算各動物皮層和紋狀體體積(總?cè)毖娣e乘以0.8mm(厚度))。
MCAO模型分析 先后采用單向ANOVA(單向ANOVA是一種比較三個或三個以上不匹配組別的統(tǒng)計方法)和Dunnett′s t-檢驗(兩種方法均裝載于Statview 512+軟件中，BahnPower，Calabasas，Calif.，USA)，比較隨機安排的四個實驗組的各動物的平均體積(.+-.S.E.M.)。
如下表3中所示，當(dāng)與介質(zhì)組比較，p值＜0.05(1p＜0.01；2p＜0.05)時，認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
表3
參考文獻 本發(fā)明所引用的所有參考文獻均全文結(jié)合到本發(fā)明中作為參考，且如同各個申請或?qū)＠驅(qū)＠暾埜髯蕴貏e地且分別被指明通過引用全文結(jié)合到本發(fā)明中作為參考的程度一樣。
本文中參考文獻的討論意指僅僅概述其作者所作出的主張，并未對任何參考文獻構(gòu)成的現(xiàn)有技術(shù)做出認(rèn)可。申請人保留對所引用的參考文獻的準(zhǔn)確性和適合性質(zhì)疑的權(quán)力。
本發(fā)明并不受本申請中所述的具體實施方案的限定，這些實施方案僅是對本發(fā)明各方面的簡單說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，在不背離本發(fā)明精神和范圍下，可對本發(fā)明作出很多修飾和改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員從以上說明書和附圖中將清楚，除本文所列舉的之外，功能上等同的方法和儀器也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這些修飾和改變意欲落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。本發(fā)明僅受限于所附的權(quán)利要求書，以及該權(quán)利要求書所要求的等同物的全部范圍。
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權(quán)利要求
1.一種提供耳保護的方法，其包括給予需要用耳保護藥物(OPD)治療的患者治療有效量的選自式(I)和式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，
其中
苯基在X上被1-5個選自氟、氯、溴和碘的鹵原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任選被苯基取代(其中苯基任選被獨立選自下列的取代基取代鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中X是取代在苯環(huán)鄰位上的氯，且其中R1、R2、R3、R4、R5和R6選自氫。
3.一種提供耳保護的方法，其包括給予需要用耳保護藥物(OPD)治療的患者治療有效量的選自式(I)和式(II)的對映體或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯或?qū)τ丑w混合物，其中選自式(I)和式(II)的一種對映體占優(yōu)勢
其中
苯基在X上被1-5個選自氟、氯、溴和碘的鹵原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任選被苯基取代(其中苯基任選被獨立選自下列的取代基取代鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中X是取代在苯環(huán)鄰位上的氯，且其中R1、R2、R3、R4、R5和R6選自氫。
5.權(quán)利要求3的方法，其中選自式(I)和式(II)的一種對映體占優(yōu)勢的程度達到約90％或以上。
6.權(quán)利要求3的方法，其中選自式(I)和式(II)的對映體是選自式(Ia)和式(IIa)的對映體
其中苯基在X上被1-5個選自氟、氯、溴和碘的鹵原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任選被苯基取代(其中苯基任選被獨立選自下列的取代基取代鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中X是取代在苯環(huán)鄰位上的氯，且其中R1、R2、R3、R4、R5和R6選自氫。
8.權(quán)利要求6的方法，其中選自式(Ia)和式(IIa)的一種對映體占優(yōu)勢的程度達到約90％或以上。
9.權(quán)利要求3的方法，其中選自式(I)和式(II)的對映體是選自式(Ib)和式(IIb)的對映體
10.權(quán)利要求9的方法，其中選自式(Ib)和式(IIb)的一種對映體占優(yōu)勢的程度達到約90％或以上。
11.權(quán)利要求1或3要求的方法，其中在需要耳保護的患者中表現(xiàn)的耳損傷的可能原因選自以下病癥耳毒性藥物暴露；外傷；耳鳴；梅尼爾氏病，包括免疫介導(dǎo)的梅尼爾氏病、免疫介導(dǎo)的耳蝸或前庭紊亂(IMCVD)；自身免疫性耳病(AIED)；科根綜合征；影響內(nèi)耳或第八腦神經(jīng)的局部缺血性事件以及鈍性或穿透性腦外傷。
12.權(quán)利要求11的方法，其中在需要耳保護的患者中表現(xiàn)的誘病因素選自耳鳴、梅尼爾氏病和耳毒性藥物暴露。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述誘病因素是耳鳴。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述誘病因素是耳毒性藥物暴露。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述耳毒性藥物是抗生素。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述耳毒性藥物是化學(xué)治療劑。
17.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述化合物(或?qū)τ丑w)或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯與一或多種其它化合物或治療劑聯(lián)合給予。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述一或多種其它化合物或治療劑選自抗生素和化學(xué)治療藥物；以便抑制患者的耳毒性。
19.一種提供耳保護作用的藥用組合物，其包含藥用有效量的選自式(Ib)和式(IIb)的對映體，或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，或其對映體混合物，其中一種對映體選自式(Ib)和式(IIb)
20.權(quán)利要求1或3的方法，其中治療有效量約為每劑量0.1mg/kg-50mg/kg。
21.權(quán)利要求1或3的方法，其中治療有效量約為每劑量1.0mg/kg-25mg/kg。
22.權(quán)利要求1或3的方法，其中治療有效量約為每劑量2.0mg/kg-40mg/kg。
23.權(quán)利要求1或3的方法，其中對于平均體重為70kg的患者，治療有效量約為140mg/天-2800mg/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供耳保護的方法，該方法包括給予有需要的患者治療有效量的選自式(I)和式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中苯基在X上被1-5個選自氟、氯、溴和碘的鹵原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任選被苯基取代(其中苯基任選被獨立選自下列的取代基取代鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
文檔編號A61P27/00GK101568335SQ200780048306
公開日2009年10月28日 申請日期2007年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
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