專利名稱：丁二酸衍生物酯類化合物治療癡呆癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及旺拉提取物、丁二酸衍生物酯類化合物及其衍生物和藥用鹽在制備治療癡呆，尤其是Alzheimer病、血管性癡呆的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
目前我國人口的平均壽命已超過70歲。國外一項科學(xué)研究預(yù)測到2025年時65歲及65歲以上的老年人將達(dá)到18.8％，這個數(shù)字表明，再過20余年，每5個人中就有1個老年人。早老性癡呆癥(Alzheimer’s Disease)多發(fā)生在50余歲。因腦血管病變引發(fā)的多發(fā)性栓塞性癡呆或老年性癡呆多發(fā)生在60歲以后。可見，由于人口的老齡化，早老性癡呆癥和老年性癡呆癥的發(fā)病率也必將增加。老年人及其特有的神經(jīng)退化性疾病--各種癡呆癥要經(jīng)歷兩種死亡，首先是精神上的死亡，后是肉體上的死亡，苦不堪言，更給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。人口老齡化被認(rèn)為是僅次于戰(zhàn)爭，瘟疫，饑荒，資源能源短缺而影響社會發(fā)展和安定的不利因素。
癡呆(dementia)是由于腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性和持續(xù)性智能障礙綜合癥，智能障礙包括不同程度的記憶、語言、視空間功能、人格異常及認(rèn)知能力降低，癡呆主要包括Alzheimer病、血管性癡呆等。Alzheimer病的病理改變包括老年斑的形成-主要由Aβ(β-淀粉樣蛋白)構(gòu)成、膽堿能神經(jīng)元丟失、Aβ在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的沉積等。血管性癡呆是由腦血管性疾病引起的，主要是缺血。病理改變?yōu)槎喟l(fā)性腔隙性病變或大面積梗死灶及動脈粥樣硬化病變。近年的研究表明，老年性癡呆也有血管因素參與，腦血液灌流量不足是重要的危險因素。
防治衰老和治療老年癡呆的藥物種類繁多。目前臨床上主要應(yīng)用膽堿能藥物或膽堿酯酶抑制劑來治療，輔以改善腦血管循環(huán)、腦保護(hù)劑等，效果往往不甚理想。增強(qiáng)膽堿系統(tǒng)功能的藥物中，Ach前體僅有微弱的治療作用，Ach受體激動劑和膽堿脂酶抑制劑雖有一定效果，但作用較短暫，毒副作用較大。腦血管擴(kuò)張藥，通過改善腦血流量有助于提供能量和改善智能，但真正有價值的腦血管擴(kuò)張藥必須具有高度選擇性，不影響腦代謝，無“竊血”現(xiàn)象，有抗血小板聚集和抗血栓作用。鈣拮抗劑尼莫地平雖符合上述某些條件，但它僅作用于電壓依賴性鈣通道中的L。通道，對N型和T型鈣通道無影響。多種神經(jīng)肽和神經(jīng)生長因子曾被認(rèn)為有治療癡呆癥的希望，但臨床效果不佳，可能主要?dú)w因于這類物質(zhì)難以通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用。2.吡咯烷酮乙酰胺(商品名腦復(fù)康)問世后，在早期文獻(xiàn)中屬沒有爭論的一類新型促智藥，近幾年來國內(nèi)外報道，該藥對各類型的記憶障礙和老年癡呆作用輕微或尚無定論，其為水溶性化合物，血腦屏障通過率低，不易集中到靶點發(fā)揮作用。
蘭科植物凹舌蘭Coeloglossum viride(L.)Hartm.var.bracteatum(Willd.)Richter分布廣泛、主要分布于我國西藏、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、青海等西部地區(qū)。其干燥塊莖即為著名的藏藥旺拉，具有補(bǔ)益氣血、生津止渴、安神增智等功效，在藏、蒙等西部少數(shù)民族具有悠久的應(yīng)用歷史。
通過對該植物進(jìn)行初步的生物活性篩選后，我們發(fā)現(xiàn)其塊莖乙醇提取物具有較好的益智、鎮(zhèn)靜和抗疲勞活性，這與旺拉的藥用功效完全一致。這一發(fā)現(xiàn)，促使本發(fā)明人對該植物進(jìn)行全面系統(tǒng)的化學(xué)成分和生物活性的研究。通過進(jìn)一步的化學(xué)成分和生物活性研究，從中分離得到了丁二酸衍生物酯類酯苷類。凹舌蘭的化學(xué)成分本發(fā)明人已經(jīng)公開(見黃勝陽，石建功，楊永春，胡世林.長苞凹舌蘭的化學(xué)成分研究.藥學(xué)學(xué)報，2002，37(3)199-203.Sheng Yang HUANG，Jian Gong SHI，Yong Chun YANG，Shi Lin HU.Two newisobutyltartrate monoesters from Coeloglossum viride(L.)Hartm.var.bracteatum(Willd.)Richter.Chinese ChemicalLetters，2002，13(6)551-554.)，但是其生物活性方面的研究迄今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種如通式(I)所示的丁二酸衍生物酯類化合物在制備預(yù)防或治療癡呆，尤其是Alzheimer病、血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供藥物組合物，其中包括作為有效成分的如通式(I)所示的丁二酸衍生物酯類化合物，和制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明所述的化合物包括其衍生物、立體異構(gòu)體和藥效學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的目的在于提供一種凹舌蘭(Coeloglossum viride(L.)Hartm.var.bracteatum(Willd.)Richter)提取物在制備預(yù)防或治療癡呆，尤其Alzheimer病、血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供藥物組合物，其中包括作為有效成分的凹舌蘭(Coeloglossum viride(L.)Hartm.var.bracteatum(Willd.)Richter)提取物，和制藥領(lǐng)域中常用的載體。
具體講，本發(fā)明一方面涉及如通式(I)所示的化合物
其中R1、R4分別選自-OCH3、-OH、-O-Glu、 R2、R3分別選自H、-OH、-O-Glu、 R5選自C1-6的支鏈或支鏈的烷基，優(yōu)選甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、新丁基、異丁基、叔丁基，更優(yōu)選異丙基、新丁基、異丁基；2、3位手性中心C上的構(gòu)型分別是2R3S、2R3R、2S3S、2S3R。
為完成本發(fā)明的目的，優(yōu)選的化合物包括但不限定于 2，3-二羥基-2-異丁基-丁二酸-1-(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W1)
2，3-二羥基-2-異丁基-丁二酸-1-(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W2) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-3-羥基-2-異丁基-丁二酸-1-(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W3) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-3-羥基-2-異丁基-丁二酸-4-(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W4) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-3-羥基-2-異丁基-丁二酸(W5)
2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-3-羥基-2-異丁基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W6) 2，3-二羥基-2-異丁基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W7) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-3-羥基-2-異丁基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W8) 3-羥基-2-異丁基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W9)
2-羥基-2-新丁基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W10) 2-羥基-2-異丙基-丁二酸-1-甲氧基-4-(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W11) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-2-異丙基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W12) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-2-異丁基-丁二酸-1-(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W13) 2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-2-異丁基-丁二酸-1，4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖氧基)芐酯(W14)在模仿乙酰膽堿分泌不足的東莨菪堿致癡呆模型中，跳臺實驗結(jié)果顯示本發(fā)明的提取物和化合物均可以明顯延長動物第一次跳下平臺的潛伏期，同時減少錯誤次數(shù)，最小有效劑量很低。說明本發(fā)明的提取物和化合物能夠有效改善抗膽堿藥東莨菪堿導(dǎo)致的學(xué)習(xí)和記憶獲得障礙，提高小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。
在Aβ致癡呆模型中，通過跳臺法檢測發(fā)現(xiàn)，服用本發(fā)明的提取物或化合物的小鼠和大鼠與模型組相比，第一次跳下平臺的潛伏期顯著延長，受電擊的次數(shù)明顯減少；通過水迷路法檢測發(fā)現(xiàn)，服用本發(fā)明的提取物或化合物的小鼠與模型組相比，從起步區(qū)游到目標(biāo)區(qū)所需時間明顯縮短，進(jìn)入盲端的次數(shù)顯著減少。說明本發(fā)明的提取物和化合物能有效地改善腦室或海馬內(nèi)注射Aβ導(dǎo)致的小鼠和大鼠記憶和空間定向障礙，提高Aβ致癡呆模型動物學(xué)習(xí)記憶能力。
在永久性結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈致癡呆模型中，通過跳臺法檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的提取物和化合物能明顯延長小鼠第一次跳下平臺的潛伏期，有效的減少小鼠受電擊的次數(shù)；通過水迷路法檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提取物和化合物能有效的縮短動物游出迷宮所需時間，減少動物進(jìn)入盲端的次數(shù)。說明本發(fā)明的提取物和化合物對永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈導(dǎo)致的小鼠記憶和空間定向障礙有明顯的改善作用，提高該模型動物學(xué)習(xí)記憶能力。
在蛋白合成抑制劑環(huán)己烯亞胺致癡呆模型中，跳臺實驗結(jié)果顯示本發(fā)明的提取物和化合物均可以明顯延長動物第一次跳下平臺的潛伏期，同時減少動物錯誤次數(shù)。說明本發(fā)明提取物和化合物均能夠有效改善蛋白合成抑制劑環(huán)己烯亞胺導(dǎo)致的小鼠記憶鞏固障礙，提高小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。
在考察本發(fā)明提取物對正常動物記憶力的影響中，水迷路法檢測發(fā)現(xiàn)連續(xù)灌胃給藥三天后小鼠游出迷宮所用的時間明顯縮短，進(jìn)入盲端的次數(shù)減少。提示本發(fā)明提取物對正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有增強(qiáng)作用。
在檢測乙酰膽堿酯酶活性實驗中，實驗結(jié)果顯示一次或多次灌胃給本發(fā)明的提取物和化合物對大、小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性均沒有明顯影響。說明本發(fā)明的提取物和化合物改善擬癡呆動物學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制不是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性。
在小鼠急性毒性實驗中大劑量服用本發(fā)明的提取物和化合物的小鼠無任何特異反應(yīng)，并且兩周內(nèi)體重增加。說明本發(fā)明化合物對小鼠的毒性很小或者幾乎沒有毒性。
藥理實驗表明了本發(fā)明的提取物和化合物對癡呆，尤其Alzheimer病、血管性癡呆具有較好的治療作用，另外，對屬于癡呆早期表現(xiàn)的輕度認(rèn)知損害、記憶力減退和健忘等也具有相同的治療作用。另外，本發(fā)明的提取物和化合物毒性低，安全性高，對乙酰膽堿酯酶的活性無抑制作用。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明的提取物或化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的本發(fā)明提取物或化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明的提取物或化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明提取物或化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等，優(yōu)選口服。
本發(fā)明提取物或化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射和皮內(nèi)注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明提取物或化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明提取物或化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明提取物或化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明提取物或化合物、藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍本發(fā)明的提取物或化合物的用量為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.01-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為0.01-60mg/Kg體重，最優(yōu)選為0.1-10mg/Kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的提取物、化合物、組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。
本發(fā)明的化合物存在于凹舌蘭屬(Coeloglossum)、山珊瑚屬(Galeola)、天麻屬(Gastrodia)、Loroglossum屬、紅門蘭屬(Orchis)和萬代蘭屬(Vanda)等6屬植物中(見下表)。
蘭科植物中的本發(fā)明化合物


aCoeloglossum viride；bGaleola faberi；cGaleolaseptentrionalis；dGastrodia elata；eLoroglossum hircinum；fOrchis latifolia；gOrchismilitaris；hOrchis papilionacea.


圖1 旺拉提取分離流程圖。
圖2 小鼠各天的到達(dá)目標(biāo)區(qū)所需時間。
圖3 小鼠各天的錯誤次數(shù)。
具體實施例方式
下面的實施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
CE為從旺拉中提取的有效部位；W6、W7、W8、W9為從CE中分離到的化合物制備例本發(fā)明提取物和化合物的制備凹舌蘭塊莖粗粉5Kg，用8倍量95％EtOH加熱回流提取3次，過濾，合并濾液，減壓濃縮后得到EtOH浸膏220g。將浸膏加水稀釋，用EtOAC萃取，水相濃縮、過濾，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，依次用水和20％、40％、60％、80％EtOH洗脫。20％和40％EtOH洗脫液回收溶劑得提取物CE，用水溶解，分別進(jìn)行Rp-18反相硅膠柱層析，以MeOH-H2O(MeOH，0→60％)梯度洗脫，得到的各流份經(jīng)薄層檢查，組分相同者合并，再利用重結(jié)晶、硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、反相制備柱HPLC等多種方法進(jìn)行純化，分別得到化合物W1(70mg)、W2(95mg)、W3(85mg)、W4(173mg)、W5(65mg)、W6(4.2g)、W7(4.8g)、W8(3.4g)、W9(1.2g)。見附圖1。
藥理實驗實施例1.本發(fā)明提取物和化合物提高東莨菪堿致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力實驗?zāi)康睦夏晷园V呆以基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失最為嚴(yán)重，造成乙酰膽堿分泌不足。東莨菪堿為M膽堿受體阻斷劑，能抑制乙酰膽堿對M受體的激動作用，因此可模仿乙酰膽堿分泌不足的結(jié)果，是研究老年性癡呆的動物模型之一。
實驗方法跳臺法雄性ICR小鼠，隨機(jī)分組，每組20只，設(shè)正常對照組、模型組(東莨菪堿組)及多個給藥組。給小鼠灌胃受試藥物二次后腹腔注射東莨菪堿(1mg/kg)，30分鐘后將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)的平臺上，反應(yīng)箱的底部為銅柵，通以36伏交流電，反應(yīng)箱內(nèi)一角為一平臺，無電，動物跳下平臺即受到電擊，跳回平臺可躲避傷害性刺激，訓(xùn)練5分鐘，24小時后重做試驗，此即記憶獲得和保持測試，記錄小鼠受電擊的動物數(shù)、第一次跳下平臺潛伏期及5分鐘內(nèi)的錯誤次數(shù)。
實驗結(jié)果與正常對照組相比，東莨菪堿組小鼠第一次跳下平臺的潛伏期明顯縮短，受電擊的次數(shù)明顯增多，提示東莨菪堿能顯著破壞動物的記憶獲得。與模型組比較，CE、W6、W7、W8和W9均可以明顯延長動物第一次跳下平臺的潛伏期，同時減少錯誤次數(shù)，提示本發(fā)明提取物和化合物能夠有效改善抗膽堿藥東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠的記憶獲得障礙。
表1.CE等對東莨菪堿致記憶獲得障礙小鼠跳臺實驗結(jié)果的影響

表中潛伏期和錯誤次數(shù)的數(shù)據(jù)表示為Mean±SEM，n＝20，#p＜0.05，##p＜0.01，與正常對照組比較.*p＜0.05，**p＜0.01，與模型組比較。
實施例2.本發(fā)明提取物和化合物改善環(huán)己烯亞胺(cycloheximide，CHX)致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力實驗?zāi)康沫h(huán)己烯亞胺是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，可造成動物記憶鞏固障礙，是研究促智藥的常用動物模型之一。
實驗方法雄性ICR小鼠，隨機(jī)分組，每組20只，設(shè)正常對照組、模型組(CHX)、多個給藥組。給小鼠灌胃受試藥物二次后，除正常對照組外，其余組小鼠均腹腔注射CHX(120mg/kg)，30分鐘后將小鼠放進(jìn)跳臺箱中先適應(yīng)環(huán)境3分鐘，然后給定電壓36V，5分鐘，使小鼠學(xué)會逃避電擊。24h后進(jìn)行記憶測試，記錄小鼠第一次跳下平臺的潛伏期及分鐘內(nèi)跳下平臺的次數(shù)(或稱錯誤次數(shù))。
實驗結(jié)果CE和W6可以明顯延長動物第一次跳下平臺的潛伏期，同時減少5min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)。提示本發(fā)明提取物和化合物均能夠有效改善蛋白合成抑制劑環(huán)己烯亞胺導(dǎo)致的小鼠記憶鞏固障礙，提高小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。
表2.對環(huán)己烯亞胺致記憶鞏固障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響


表中數(shù)據(jù)為Mean±SEM，##p＜0.01，###p＜0.001，與正常對照組比較；*p＜0.05，**p＜0.01，與模型組比較。
實施例3.本發(fā)明提取物和化合物提高Aβ致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力實驗?zāi)康睦夏晷园V呆(AD)的特征性病理變化是大腦出現(xiàn)老年斑，而β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是構(gòu)成老年斑的核心。有研究表明，Aβ對神經(jīng)細(xì)胞具有毒性。本實驗的目的是觀察CE和W6對Aβ致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
實驗方法①雄性ICR小鼠，每組12只，模型組和給藥組小鼠雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ(1-42)，10微克/只，假手術(shù)組小鼠注射相同體積的生理鹽水，一周后給藥組小鼠開始灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組小鼠灌胃給生理鹽水，給藥二周后用跳臺法和水迷路法檢測所有動物的學(xué)習(xí)記憶情況。
水迷路法在水迷宮裝置內(nèi)加入水，在目標(biāo)區(qū)有一爬梯，動物可爬出水面而獲得休息。首先訓(xùn)練動物三天，每天逐漸延長動物起步區(qū)至目標(biāo)區(qū)的游泳路徑，同時增加盲端區(qū)，第四天記錄小鼠從起步區(qū)游泳到達(dá)目標(biāo)區(qū)所需時間和進(jìn)入盲端的次數(shù)，觀察時間為2分鐘。該方法可檢測動物空間定向和學(xué)習(xí)記憶的能力。
②雄性Wistar大鼠，模型組和給藥組大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射Aβ(1-42)，10微克/側(cè)，假手術(shù)組大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)各注射相同體積的生理鹽水，給藥組連續(xù)灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃給生理鹽水，三周后用跳臺法檢測所有動物學(xué)習(xí)和記憶情況，每組10只動物。
實驗結(jié)果在跳臺實驗中，腦室或海馬內(nèi)注射Aβ組與假手術(shù)組相比，動物第一次跳下平臺的潛伏期明顯縮短，受電擊的次數(shù)明顯增多，提示腦室或海馬內(nèi)注射Aβ(1-42)可造成動物學(xué)習(xí)記憶障礙；給藥組與模型組相比，2個受試藥均能有效的減少小鼠受電擊的次數(shù)，明顯延長小鼠第一次跳下平臺的潛伏期。在水迷路實驗中，腦室注射Aβ組與假手術(shù)組相比，從起步區(qū)到達(dá)目標(biāo)區(qū)所需時間明顯延長，其間動物進(jìn)入盲端的次數(shù)明顯增多；給藥組與模型組相比，2個受試藥均能有效的縮短動物游出迷宮的時間，減少動物進(jìn)入盲端的次數(shù)。提示本發(fā)明提取物和化合物可以有效地改善腦室或海馬內(nèi)注射Aβ(1-42)導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間定向障礙。
表3.CE等對Aβ致癡呆模型小鼠跳臺實驗結(jié)果的影響

表4.CE等對Aβ致癡呆模型小鼠水迷宮實驗結(jié)果的影響

表5.CE等對Aβ致癡呆模型大鼠跳臺實驗結(jié)果的影響

表中數(shù)據(jù)為Mean±SEM，#p＜0.05，與正常對照組比較；*p＜0.05，與模型組比較。
實施例4.本發(fā)明提取物和化合物提高永久性結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力實驗?zāi)康难苄园V呆是由腦血管疾病所致的認(rèn)知功能障礙，主要原因是腦缺血。近年的研究表明，老年性癡呆也有血管因素參與，腦血液灌流量不足是重要的危險因素。本實驗的目的是觀察CE和W6對永久性結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。
實驗方法永久性結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈，一周后給藥組小鼠開始灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組小鼠灌胃給生理鹽水，在手術(shù)后第四周用跳臺法和小鼠水迷路法檢測動物學(xué)習(xí)記憶情況。
實驗結(jié)果結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈4周后，在跳臺實驗中，模型組與假手術(shù)組相比，動物第一次跳下平臺的潛伏期明顯縮短，受電擊的次數(shù)明顯增多；提示模型組動物有學(xué)習(xí)記憶障礙；給藥組與模型組相比，2個受試藥均能有效的減少小鼠受電擊的次數(shù)，明顯延長小鼠第一次跳下平臺的潛伏期。在水迷路實驗中，模型組與假手術(shù)組相比，動物進(jìn)入盲端的次數(shù)明顯增多，游出迷宮所需時間明顯延長；提示模型組動物在空間定向和記憶方面有障礙；給藥組與模型組相比，2個受試藥均能有效的縮短動物游出迷宮所需時間，減少動物進(jìn)入盲端的次數(shù)。提示本發(fā)明提取物和化合物對永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈導(dǎo)致的小鼠記憶和空間定向障礙有明顯的改善作用。
表6.CE等對結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈致癡呆模型小鼠跳臺實驗結(jié)果的影響

表7.CE等對結(jié)扎頸總動脈致癡呆模型小鼠水迷路實驗結(jié)果的影響

表中數(shù)據(jù)為Mean±SEM，#p＜0.05，##p＜0.01，與正常對照組比較。*p＜0.05，***p＜0.001，與模型組比較。
實施例5.本發(fā)明提取物對正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的作用實驗?zāi)康牟捎盟月贩ㄓ^察CE是否有增強(qiáng)正常小鼠記憶的作用。
實驗方法雄性ICR小鼠，隨機(jī)分組，每組20只，設(shè)正常對照組、和2個給藥組。給小鼠灌胃受試藥物三天后，在水迷路中訓(xùn)練動物三天，每天逐漸延長動物起步區(qū)至目標(biāo)區(qū)的游泳路徑，同時增加盲端區(qū)，從第四天記錄小鼠從起步區(qū)游泳到達(dá)目標(biāo)區(qū)所需時間和進(jìn)入盲端的次數(shù)，觀察時間為2分鐘。該方法可檢測動物空間定向和學(xué)習(xí)記憶的能力。見附圖2和3。
實驗結(jié)果連續(xù)灌胃給CE(1.25和5mg/kg)能有效縮短小鼠游出迷宮的時間，減少進(jìn)入盲端的次數(shù)。提示本發(fā)明提取物對正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有增強(qiáng)作用。
實施例6本發(fā)明提取物和化合物的小鼠急性毒性實驗實驗方法小鼠一次性腹腔注射或口服5g/kg的CE或0.5g/kg劑量的化合物W6、W7、W8和W9后，觀察兩周內(nèi)對小鼠的影響。
實驗結(jié)果給藥后小鼠無任何特異反應(yīng)，并且兩周內(nèi)體重增加。說明化合物W6、W7、W8和W9對小鼠的毒性很小或者幾乎沒有毒性。小鼠急性毒性實驗顯示本發(fā)明提取物和化合物的毒性很小或者幾乎沒有毒性。
實施例7本發(fā)明提取物和化合物對乙酰膽堿酯酶活性的影響實驗?zāi)康囊阴Ｄ憠A是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，膽堿能神經(jīng)的退變最終導(dǎo)致乙酰膽堿濃度降低，因此目前許多老年性癡呆的治療措施是以使用膽堿酯酶抑制劑來增加乙酰膽堿的濃度為基礎(chǔ)的。本試驗的目的是初步探索本發(fā)明化合物的作用機(jī)理，了解本發(fā)明提取物和化合物對動物腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性是否有影響。
實驗方法Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組，每組6只正常對照組、陽性藥對照組(石杉堿甲)、CE組(5mg/kg)、W6組(5mg/kg)和W6組(20mg/kg)。動物禁食12小時后灌胃給藥一次，1小時后斷頭處死動物，在冰浴條件下迅速取出前腦，加入生理鹽水用超聲粉碎器制成10％腦勻漿，低溫下離心20分鐘(6000rpm)，取上清。按照乙酰膽堿酯酶測定試劑盒說明書進(jìn)行操作(購自南京建成生物工程研究所)。
實驗結(jié)果CE和W6對大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性均沒有明顯影響。表明本發(fā)明提取物和化合物改善癡呆動物學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制不是通過抑制乙酰膽堿酯酶活性從而提高中樞乙酰膽堿濃度這一途徑。
表8.對大鼠腦內(nèi)ACHE的影響

權(quán)利要求
1.凹舌蘭(Coeloglossum viride(L.)Hartm.var.bracteatum(Willd.)Richter)提取物在制備預(yù)防或治療癡呆的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的癡呆包括Alzheimer病、血管性癡呆、學(xué)習(xí)記憶障礙。
3.一種藥物組合物，其特征在于，含有藥物有效劑量的如權(quán)利要求1所述的提取物，及藥用載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物可以是片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及旺拉提取物、丁二酸衍生物酯類化合物及其衍生物和藥用鹽在制備治療癡呆，尤其是Alzheimer病、血管性癡呆的藥物中的用途。經(jīng)動物實驗證實，丁二酸衍生物酯類化合物能夠提高東莨菪堿和環(huán)己烯亞胺致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高β－淀粉樣蛋白致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)正常動物的記憶力，具有活性高、毒性小、對乙酰膽堿酯酶無抑制作用的特點。
文檔編號A61K31/7028GK101015648SQ200710084699
公開日2007年8月15日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者張建軍, 石建功, 王亞芳, 張丹, 高梅, 楊永春, 黃勝陽 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所