專利名稱：環(huán)烯醚萜類化合物在制備促進神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)烯醚萜類化合物在制備促進神經(jīng)細(xì)胞增殖和/或分 化的藥物中的用途以及所制備的藥物組合物。本發(fā)明也涉及用所述化疾病或病癥的方法,襪術(shù)背景神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSC)是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有 自我更新能力并且能夠分化產(chǎn)生成熟腦細(xì)胞(包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì) 胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)的多潛能細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新能力、 高增殖潛能以及多分化潛能，可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形 膠質(zhì)細(xì)胞等，神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生的子代細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、維 持以及實施細(xì)胞替代治療具有重要作用。NSC的發(fā)現(xiàn)和體外培養(yǎng)成功， 為中樞神經(jīng)系統(tǒng)病的細(xì)胞替代療法拓寬了道路。如治療神經(jīng)系統(tǒng)退行 性疾病，如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)和亨廷頓病(HD)，可 以明顯改善癥狀.同時，大量體外和在體實驗已經(jīng)證實成年腦中確實 存在NSC，只是發(fā)育成熟后喪失了活性因子的刺激作用。這些細(xì)胞在 一定的條件下，如腦組織損傷、缺血、生長因子刺激等，可以進行增 殖、遷移和分化，新生的神經(jīng)元可替代丟失的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮一定的功 能。因此，研究有效的促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖和/或分化的方法有重要的環(huán)烯醚雜類化合物(Iridoids)是一類特殊的單萜化合物，其母核 都為環(huán)狀，具有烯鍵和醚鍵。1925年由伊蟻的防衛(wèi)分泌物中首次分得 伊蟻內(nèi)酯，1958年0. Halpern和H. Schmid對plumieride結(jié)構(gòu)的研究確定了環(huán)烯醚祥的基本骨架。植物界中的環(huán)烯醚辟類化合物是由焦磷酸香葉酯(GPP)經(jīng)生物合成途徑生成臭蟻二醛(iridodial)，再縮醛衍 生而成的，其基本骨架如下面結(jié)構(gòu)式。<formula>formula see original document page 4</formula>
simple secoiridoidi.環(huán)烯瞇辟的基本骨架環(huán)烯醚薛分子中，CH)H很活潑，易與糖結(jié)合，天然存在的環(huán)烯瞇 辟多為苷，且多為D-葡萄糖苷。包含但不僅有(1) 普通環(huán)烯醚萜苷①C-8環(huán)烯瞇萜苷。②C-9環(huán)烯瞇萜苷(第9 個C接在C-4上)，③C-9環(huán)烯酸萜苷(笫9個C接在C-8上)。④C-10 環(huán)烯瞇萜苷.如6，-乙酰車葉草苷、莫諾苷、馬錢素、梔子苷、梓醇、 黃蜂花素、黃蟬花定、車葉草苷、桃葉珊瑚苷、梓苷、去氣番木鱉苷、 京尼平、雞蛋花素、馬鞭萆苷、金吉苷。(2) 裂環(huán)環(huán)烯醚碎苷如龍膽苦苷、龍膽苦酯苷，開聯(lián)番木鱉苷、 獐芽茱苦素等。(3) Valeriana型環(huán)烯醚薛，如7， 10， 2， -3乙酰敗醬甙、和10-乙酕敗醬戒，(4) Plumeria型環(huán)烯醚辟如枸桔苷A。(5) 3，10位間形成氣橋的環(huán)烯鍵辟，如3，10位間形成氧橋的環(huán)烯 瞇萜苷新月苷B.(6) 荊芥內(nèi)酯相關(guān)類型環(huán)烯醚硨，有紫苷。(7) 變形的類環(huán)烯酸辟，例如新月苷A， B、 8位有三元氧螺環(huán)結(jié)構(gòu) 的枸桔苷B。(8) 由幾個環(huán)烯醚薛直接經(jīng)酯鍵或由薛類、酚類連接而成。如纈草 瞇酯、去乙酰車葉草苷酸甲酯等。本發(fā)明發(fā)明人通過對馬錢素和莫諾苷的研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚碎類對 神經(jīng)干細(xì)胞有良好的促增殖和/或促分化作用，因而完成了本發(fā)明。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面提供了環(huán)烯瞇萜類化合物例如馬錢素和/或莫諾苷 在制備促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖和/或分化的藥物中的用途。本發(fā)明另一方 面也提供了含有環(huán)烯瞇辟類化合物的藥物組合物以及用所述化合物或 組合物治療與神經(jīng)細(xì)胞增殖和/或分化有關(guān)疾病的方法。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速更新進步，人類將有可能研制出對已經(jīng) 發(fā)育完善的成體神經(jīng)細(xì)胞的增殖與分化技術(shù)?；诃h(huán)烯瞇萜類化合物對 神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖與分化作用，環(huán)烯瞇薛類化合物對成體神經(jīng)細(xì)胞也 可能有促增殖與分化作用，進而治療各種原因?qū)е碌囊陨窠?jīng)元缺失為特 征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。環(huán)烯瞇轉(zhuǎn)類化合物的以上所述方法和用途可以是單獨應(yīng)用促使 神經(jīng)疾病患者神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)尚存的干細(xì)胞增殖和分化，或者是對外源性 干細(xì)胞移植到神經(jīng)疾病患者神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)進行增殖和分化達(dá)到治療或預(yù) 防神經(jīng)系統(tǒng)疾病目的。本發(fā)明所述莫諾苷、馬錢素，均具有環(huán)烯醚萜的基本骨架，可以 從山茱萸按照已知方法提取，或從市售中得到。馬錢素(loganin) 莫諾苷(morroniside )本發(fā)明的化合物也可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以合成。 本發(fā)明除了上列化合物以外，還打算涵蓋這類化合物的同系物和 類似物。在這種情況下，同系物是具有上述化合物的實質(zhì)性結(jié)構(gòu)相似 性的分子，類似物是具有與結(jié)構(gòu)相似性無關(guān)的實質(zhì)性生物相似性的分 子。本發(fā)明還涵蓋藥物組合物，所述組合物包括環(huán)烯瞇辟類化合物與 有機和無機酸的藥學(xué)上可接受的鹽，例如酸加成鹽，酸例如可以是鹽 酸、疏酸、甲橫酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、 檸檬酸、酒石酸、碳酸、砩酸等。藥學(xué)上可接受的鹽還可以借助無機 堿和有機堿的處理而制備，無機堿例如鈉、鐘、銨、鉤或鐵的氬氣化物，有機堿例如異丙胺、三曱胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因 等.本發(fā)明還涵蓋藥物組合物，所述組合物包括環(huán)烯醚薛類化合物的 水合物。術(shù)語"水合物"包括但不限于半水合物、 一水合物、二水合物、三7jC合物等o本發(fā)明還涵蓋藥物組合物，所述組合物包括環(huán)烯醚萜類化合物的 任意固體或液體物理形式，例如，環(huán)烯醚萜類化合物可以是結(jié)晶形式、 無定形，并且具有任意的粒徑，環(huán)烯^萜類化合物粒子可以被微粉化， 或者可以是聚結(jié)的微粒狀顆粒、粉末、油、油懸液或任意其他固體或 液體物理形式。藥物組合物本發(fā)明化合物及其衍生物、片段、類似物、同系物、藥學(xué)上可接 受的鹽或水合物可以與藥學(xué)上可接受的栽體或賦形劑一起制成適合于 口服給藥的藥物組合物，這類組合物通常包含治療有效量的任意上迷 化合物和藥學(xué)上可接受的栽體。優(yōu)選地，有效量是有效地促進神經(jīng)細(xì) 胞増殖和/或分化的量并且小于導(dǎo)致患者毒性的量。在本發(fā)明制劑中可以使用任意普遍用作栽體或稀釋劑的惰性賦形 劑，例如樹膠、淀粉、糖、纖維素材料、丙烯酸酯或其混合物。優(yōu)選 的稀幹刑是微晶纖維素，組合物可以進一步包含崩解劑(例如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)和潤滑劑(例如硬脂酸鎂)，另外可以包含一種或多 種添加劑，選自粘合刑、緩沖劑、蛋白酶抑制劑、表面活性劑、增溶 劑、增塑劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、粘度增加劑、甜味劑、成膜劑或其任 意組合。此外，本發(fā)明組合物可以是控釋制劑或即時釋放制劑的形式。 一種實施方式是口服給藥用藥物組合物，包含環(huán)烯醚薛類化合物 或其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和硬脂酸鎂，另一種實施方式包含50 - 70重量％的環(huán)烯醚萜類化合物 或其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物、20 - 40重量％的微晶纖維素、5-15 重量％的交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和0. 1 - 5重量％的硬脂酸鎂。另 一種實施 方式包含約50 - 200mg的環(huán)烯醚萜類化合物。在一種實施方式中，藥物組合物是口服給藥的，因而被配制成適 合于口服給藥的形式，也就是固體或液體制備物。適合的固體口服制 劑包括片刑、膠囊刑、丸劑、顆粒劑、小丸等。適合的液體口服制刑 包括溶液、懸液、分散體、乳劑、油劑等。在一種本發(fā)明實施方式中， 組合物被配制成膠嚢劑。按照這種實施方式，本發(fā)明組合物除了環(huán)烯 酸萜類化合物活性化合物和惰性載體或稀釋劑以外，還包含硬明膠膠 囊。本文所用的"藥學(xué)上可接受的栽體"打算包括任意和所有的溶劑、 分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌與抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，它們 與藥學(xué)給藥是可相容的，例如無菌無熱原的水。適合的栽體描述在最 新版Remington's Pharmaceutical Sciences中,它是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn) 參考書，結(jié)合在此作為參考。這類栽體或稀釋劑的優(yōu)選實例包括但不 限于水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。還可以 ^t用脂質(zhì)體和非水性栽體，例如固定油。這類介質(zhì)和試刑應(yīng)用于藥學(xué) 活性物質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物是 不可相容的，其在組合物中的用途都涵蓋在內(nèi)。還可以向組合物摻入 補充性活性化合物，固體栽體/稀釋刑包括但不限于樹膠、淀粉(例如玉米淀粉、預(yù)膠 凝淀粉)、糖(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖)、纖維素材料2 (例如微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸酯)、碳酸鉀、 氧化鎂、滑石或其混合物。就液體制刑而言，藥學(xué)上可接受的栽體可以是水性或非水性溶液、 懸液、乳劑或油。非水性溶劑的實例有丙二醇、聚乙二醇和可注射的 有機酯，例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液， 包括鹽水和經(jīng)過緩沖的介質(zhì)。油的實例有石油、動物、植物或合成來 源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花油和魚肝油。溶液或懸液還可以包括下列組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水 溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑， 例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸 氬鈉；螯合刑，例如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖劑，例如乙酸鹽、檸 檬酸鹽或褲酸鹽；和調(diào)節(jié)張性的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH可以 用酸或堿來調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。另外，組合物可以進一步包含粘合劑(例如阿拉伯膠、玉米淀粉、 明膠、卡波姆、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖 維素、聚維酮)、崩解劑(例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸、二氧 化硅、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、瓜爾膠、淀粉羥乙酸鈉、 Primogel)、不同pH和離子強度的緩沖劑(例如Tris-HC1、乙酸鹽、 礴酸鹽)、防止表面吸收的添加劑(例如白蛋白或明膠)、洗滌劑(例 如吐溫20、吐溫80、 PluronicF68、膽汁酸鹽)、蛋白酶抑制劑、表 面活性劑(例如月桂基硫酸鈉)、滲透增強劑、增溶劑(例如甘油、 聚乙烯甘油)、助流劑(例如膠體二氧化硅)、抗氧化劑(例如抗壞 血酸、偏亞硫酸氬鈉、丁基化羥基茴香醚)、穩(wěn)定劑(例如羥丙基纖 維素、羥丙基甲基纖維素)、增粘劑(例如卡波姆、膠體二氧化硅、 乙基纖維素、瓜爾膠)、甜味劑(例如蔗糖、阿斯巴甜、檸檬酸)、 矯味劑(例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)料)、防腐劑(例如硫汞撒、 苯曱醇、對羥基苯甲酸酯)、潤滑劑(例如硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、月桂基硫酸鈉)、流動助劑(例如膠體二氧化硅)、增塑劑(例 如鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)、乳化劑(例如卡波姆、羥丙基纖維素、月桂基疏酸鈉)、聚合物包衣(例如泊洛沙姆或poloxamine)、包衣與成膜劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基 丙烯酸酯)和/或助劑。在一種實施方式中，與活性化合物一起配制的載體將保護化合物 防止從機體迅速消除，例如控釋制劑，包括植入物和微囊包封的遞送 系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物可相容的聚合物，例如乙烯乙酸 乙烯酯、聚肝、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這類制劑的制 備方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。材料還可以在商業(yè)上 從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc獲得。還可以 使用脂質(zhì)體懸液(包括定向于感染細(xì)胞的脂質(zhì)體和病毒抗原的單克隆 抗體)作為藥學(xué)上可接受的栽體。這些可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的方法加以制備，例如美國專利No. 4，522，811所述。配制劑量單元形式的口服組合物尤其有利于輕松給藥和劑量一致 性。本文所用的劑量單元形式表示物理上離散的單元，適合作為受治 療者的單位刑量；每一單元含有與所需藥物栽體締合的預(yù)定量活性化 合物，根據(jù)計算產(chǎn)生所需的治療效果。本發(fā)明劑量單元形式的規(guī)格取 決于并且直接依賴于活性化合物的獨特特征和所要達(dá)到的特定治療效 果，以及本領(lǐng)域圍繞這樣一種活性化合物就個體治療而言所固有的限 制。藥物組合物可以與給藥指導(dǎo)一起包括在容器、包裝或配藥器中。 本發(fā)明化合物或組合物可以連續(xù)地重復(fù)每日給藥達(dá)數(shù)天至數(shù)年。 口服治療可以持續(xù)一周至患者壽命。優(yōu)選地，給藥達(dá)連續(xù)五天，然后 可以評價患者以確定是否需要進一步的給藥。給藥可以是連續(xù)的或間 歇的，也就是連續(xù)幾天治療繼之以休息期。含有活性成分的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域熟知的，例如混合、 造?；驂浩^程。經(jīng)常將活性治療成分與藥學(xué)上可接受的并且可與活 性成分相容的賦形劑混合.就口服給藥而言，將活性試劑與慣用于此 目的的添加劑混合，例如栽體、穩(wěn)定劑或惰性稀釋劑，再借助慣用方 法轉(zhuǎn)化為適合于給藥的刑型，例如片劑、包衣片、硬或軟明膠膠囊劑、水、醉或油溶液等，如上所述。本發(fā)明化合物口服給藥的總每日劑量在25至4000mg/n^之間，例 如約25至1000mg、 50 - 1000mg、 100mg、 200mg、 300mg、 400mg、 600mg、 800mg、 1000mg等。通常，當(dāng)對患者給藥至多400mg時，將化合物作 為單一劑量給藥。就更高的總劑量而言(也就是大于400mg)，將總 量分為多個劑量，例如每日兩次、每日三次等，優(yōu)選地在當(dāng)天內(nèi)間隔 相等的時間，例如，可以間隔12小時給以兩劑，例如各500mg， 一天 的總劑量達(dá)到1000mg。在一種當(dāng)前優(yōu)選的實施方式中，環(huán)烯醚辟類化合物對患者給藥的 每日總劑量為200mg。在另一種當(dāng)前優(yōu)選的實施方式中，環(huán)烯醚萜類 化合物對患者給藥的每日總劑量為400mg。在另一種當(dāng)前優(yōu)選的實施 方式中，環(huán)烯醚萜類化合物對患者給藥的每日總劑量為600叫，化合物對患者給藥的量小于將對患者導(dǎo)致毒性的量。在某些實施 方式中，化合物對患者給藥的量小于導(dǎo)致化合物在患者血漿中的濃度 等于或超過化合物毒性水平的量。優(yōu)選地，化合物在患者血漿中的濃 度維持在約lOnM.在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度 維持在約25nM。在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度維 持在約50nM。在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度維持 在約100nM。在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度維持 在約500nM。在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度維持 在約lOOOnM。在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度維持 在約2500nM,在另一種實施方式中，化合物在患者血漿中的濃度維持 在約5000nM,在本發(fā)明的實施中，化合物應(yīng)當(dāng)對患者給藥的最佳量將 依賴于所使用的特定化合物和所治療病癥的類型。在當(dāng)前優(yōu)選的本發(fā)明實施方式中，藥物組合物包含普通環(huán)烯醚萜 苷；微晶纖維素作為栽體或稀釋劑；交聯(lián)羧曱基纖維素鈉作為崩解劑； 和硬脂酸鎂作為潤滑劑。在特別優(yōu)選的實施方式中，環(huán)烯瞇碎類化合 物是莫諾苷或馬錢素?；钚猿煞峙c各種賦形劑在制劑中的百分比可以各不相同。例如，組合物可以包舍20至90重量％、優(yōu)選50 - 70重量H的普通環(huán)烯醚薛苷。 此外，組合物可以包含10至70重量％、優(yōu)選20 - 40重量％的微晶纖維 素作為栽體或稀釋刑，此外，組合物可以包含1至30重量％、優(yōu)選5 -15重重％的交聯(lián)羧甲基纖維素鈉作為崩解刑。此外，組合物可以包 含0. 1 - 5重量％的硬脂酸鎂作為潤滑劑。在另一種優(yōu)選的實施方式中， 組合物包含約50 - 200mg的環(huán)烯醚轉(zhuǎn)類化合物(例如50mg、 100mg和 200mg的環(huán)烯醚薛類化合物)。在特別優(yōu)選的實施方式中，組合物是 片刑或明膠膠囊劑的形式。當(dāng)前優(yōu)選的本發(fā)明實施方式是環(huán)烯醚辟類化合物與微晶纖維素 NF (Avicel Ph 101)、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉NF (AC-Di-Sol)和硬脂酸 鎂NF的固體制劑，包含在明膠膠嚢中。進一步優(yōu)選的實施方式是200邁g 固體SAHA與89. 5mg微晶纖維素、9mg交聯(lián)羧曱基纖維素鈉和1. 5mg 硬脂酸鎂，包含在明膠膠囊中。本發(fā)明葯物組合物不僅可用于促進神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化，而且 對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，這些組合物可用于治療多 種已經(jīng)發(fā)現(xiàn)環(huán)蜂瞇薛類化合物有用的疾病。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚辟類化合物，可用于治療各種原因?qū)е碌?出現(xiàn)神經(jīng)元缺失的疾病，包括中樞神經(jīng)損傷，包含但不僅于缺血性、 外傷性、以及酒精性腦或脊號損傷；影響神經(jīng)系統(tǒng)的系統(tǒng)性萎縮病、 基底節(jié)退行性疾病、肌張力陣礙、原發(fā)性的錐體外系疾??；以及神經(jīng) 系統(tǒng)變性疾病。缺血性損傷，包括腦缺血(例如作為創(chuàng)傷、癲癇、出 血或中風(fēng)結(jié)果的腦損傷，它們均可以引起神經(jīng)變性)；肌萎縮性側(cè)索 硬化(ALS);多發(fā)性硬化；肌病，例如肌肉蛋白代謝病。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚薛類化合物可用于治療多種神經(jīng)變性疾病， 其非窮舉性列表有I. 以沒有其他突出的神經(jīng)病學(xué)病征存在的進行性癡呆為特征的陣礙，例如阿爾茨海默氏病；阿爾茨海默型老年癡呆；和皮克氏病(腦葉萎縮).II. 合并有進行性癡呆與其他突出的神經(jīng)病學(xué)異常的綜合征，例如A)主要見于成人的綜合征(例如亨廷頓氏病、合并有癡呆與共濟失 調(diào)的多系統(tǒng)萎縮和/或帕金森氏病的表現(xiàn)、進行性核上性麻瘠 (Steel-Richardson-01szewski)、 擴散性利維小體病和 corticodentatonigral變性)；和B)主要見于兒童或青年的綜合征(例 如哈-斯二氏病和進行性家族性肌陣車性癲癇)。III. 體位與運動漸進性異常的綜合征，例如震顫麻瘠(帕金森氏 病)、striatonigral變性、進行性核上性麻痹、扭轉(zhuǎn)張力障礙(扭 轉(zhuǎn)痙享；變形性肌張力陣礙)、痙享性斜頸與其他運動障礙、家族性 震顏和困雷特氏綜合征。IV. 進行性共濟失調(diào)的綜合征，例如小腦變性(例如小腦皮質(zhì)變 性和橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA))和脊髄小腦變性(弗里德希氏共濟 失調(diào)和相關(guān)陣礙)，V. 中樞自主神經(jīng)系統(tǒng)表竭的綜合征(Shy-Drager綜合征)。VI. 沒有感覺改變的肌肉虛弱和消瘦的綜合征(運動神經(jīng)元疾病， 例如肌萎饗性側(cè)索硬化、脊柱肌肉蔞縮(例如嬰兒脊柱肌肉姿縮 (Werdnig-Hoffman)、 青少年脊柱肌肉萎縮 (Wohlfart-Kugelberg-Welander)和其他形式的家族性脊柱肌肉萎 縮)、原發(fā)性側(cè)索硬化和遺傳性痙車性截癱。VII. 合并有肌肉虛弱和消瘦與感覺改變的綜合征(進行性神經(jīng)肌 肉萎縮；慢性家族性多神經(jīng)病)，例如A.腓肌肉萎縮 (Charcot-Marie-Tooth) ， B.肥大性間質(zhì)性多神經(jīng)病 (Dejerine-Sottas)，和C.各種形式的慢性進行性神經(jīng)病。VIII. 進行性視覺喪失的綜合征，例如色素性視網(wǎng)膜變性(色素 性視網(wǎng)膜炎)和遣傳性視神經(jīng)蔞縮(利伯氏病)。下列實驗細(xì)節(jié)部分中的實施例進一步闡述本發(fā)明。該部分有助于 理解發(fā)明，但是不打算、也不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制如下權(quán)利 要求書所限定的發(fā)明，


圖1.環(huán)蜂醚薛類化合物馬錢素和莫諾苷對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。A.對照組用不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)6天，絕大部 分細(xì)胞死亡(x 200 ) ; B.不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中添加馬 錢素50[Ag/ml，培養(yǎng)6天，神經(jīng)干細(xì)胞球體積增大(x 200 ) ; C.不 加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入馬錢素25Pg/ml，培養(yǎng)14天， 神經(jīng)干細(xì)Jffe體積進一步增大(x 200 ) ; D.不加生長因子的DMEM/F12 培養(yǎng)液中添加莫諾苷25fig/ml，培養(yǎng)6天，可見神經(jīng)干細(xì)胞球體積增 大(x 200 ) ; E.不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中添加莫諾苷 25Hg/ml，培養(yǎng)14天，神經(jīng)干細(xì)胞體積進一步增大(x 200 )。圖2.環(huán)蜂醚待類化合物馬錢素和莫諾苷促進神經(jīng)干細(xì)胞分化作用。A對照組用含1 %胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)神經(jīng)干 細(xì)胞分化7天，單細(xì)胞從細(xì)胞球周緣遷出，遷出細(xì)胞的形態(tài)大致可分為 兩種①小部分細(xì)胞胞體形態(tài)接近橢圓形，有2~3個細(xì)長的突起，類 似于神經(jīng)元的形態(tài)；②大部分細(xì)胞的形狀不規(guī)則，突起較多，經(jīng)免疫細(xì) 胞化學(xué)實驗結(jié)果分析，分別是神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞(x 200)。 B用舍馬錢素50ug/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液(無FBS)誘導(dǎo)分化7 天，細(xì)胞球幾乎完全貼壁，分化較好，遷出的細(xì)胞非均勻的輻射狀排列， 而是細(xì)胞之間互相連接成網(wǎng)狀(x 200 ) 。 C用含莫諾苷50ug/ml的 DMEM/F12培養(yǎng)液(無FBS)誘導(dǎo)分化7天，細(xì)胞球幾乎完全貼壁，分化較 好，遷出的細(xì)胞的突起首尾相連成"串珠狀"(x 200 )。圖3.環(huán)烯醚辟類藥物組合物促進腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用。 A正常大鼠海馬齒狀回有散在分布的Brdu陽性神經(jīng)干細(xì)胞，陽性細(xì) 胞胞核著色，多數(shù)呈卵圃形；B正常大鼠腦室下層有散在分布的Brdu 陽性神經(jīng)干細(xì)胞，陽性細(xì)胞胞核著色，多數(shù)呈卵圓形；C.腦缺血模型組 大鼠海馬齒狀回的Brdu陽性神經(jīng)干細(xì)胞較正常組顯著增加；D.腦缺血 模型組大鼠腦室下層的Brdu陽性神經(jīng)干細(xì)胞較正常組顯著增加；E給環(huán)烯瞇薛類藥物組合物(馬錢素莫諾苷組合物=1:1)后的腦缺血模型 組大鼠海馬齒狀回Brdu陽性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目較正常組和模型組顯著增 加；F給環(huán)烯醚薛類藥物組合物(馬錢素莫諾苷組合物=1:1)后的 腦缺血模型組大鼠室管膜Brdu陽性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目較正常組和模型組 顯著增加。實施例1馬錢素和莫諾苷促進神經(jīng)千細(xì)胞存活增殖作用一、 實驗?zāi)康挠^察馬錢素和莫諾苷對神經(jīng)干細(xì)胞存活增殖作用的影響。二、 實驗方法取新生1天的SD大鼠，無菌條件下取腦，分離海馬，置于盛有少 量高糖DMBM/F12的培養(yǎng)皿中；剝除腦膜及血管組織，將組織盡量剪碎， 加細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml，用火焰拋光的Pasteur吸管輕輕吹打制成細(xì)胞懸 液，400目篩網(wǎng)過濾，胎盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞的比例，細(xì)胞計數(shù)后以2 ><106個細(xì)胞/011的密度接種到25ml的培養(yǎng)瓶。釆用基礎(chǔ)培養(yǎng)液 DMEM/F12(1:1)和B27(2 0，并分別加入終濃度分別為10、 50、 100、 200、 400 ng/ml的馬錢素和莫諾苷，將培養(yǎng)板移入371C、 5%C02、 95%空氣平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，微 尺測量細(xì)胞球直徑。神經(jīng)干細(xì)胞鑒定，取上述細(xì)胞球，去除含有生長因子EGF和bFGF 的培養(yǎng)液，加含10%FBS的DMEM/F12，種于鋪有多聚賴氨酸的24孔 培養(yǎng)板中，于16小時時行nestin和doublecortin (DCX)免疫細(xì)胞 化學(xué)染色，細(xì)胞幾乎均為nestin和doublecortin陽性，說明培養(yǎng)的 細(xì)胞球是神經(jīng)千/祖細(xì)胞。三、 實驗結(jié)果從困l可以看出，用不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)6天，絕大部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞呈彌散狀態(tài)。不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng) 液中添加馬錢素25~ 200ug/ml，培養(yǎng)6天，神經(jīng)干細(xì)胞球體積增大， 為促干細(xì)胞存活增殖的有效范圍，以50~ 100ug/ml最佳；莫諾苷25 ~ 100ug/ml，神經(jīng)干細(xì)胞球體積增大，為促細(xì)胞存活增殖的有效范圍， 以25~50ug/ml最佳。說明馬錢素和莫諾苷可有效促進神經(jīng)干細(xì)胞存 活增殖。實施例2馬錢素和莫諾苷促進神經(jīng)干細(xì)胞分化作用一、 實驗?zāi)康挠^察馬錢素和莫諾苷對神經(jīng)干細(xì)胞分化作用的影響二、 實驗方法取笫二代神經(jīng)干細(xì)胞球，去除培養(yǎng)瓶內(nèi)含有生長因子的培養(yǎng)液， 細(xì)胞球被隨機分為2組，①胎牛血清(FBS )對照組培養(yǎng)液為DMEM/F12 + 10%FBS;②藥物處理組無FBS培養(yǎng)液DMEM/F12中分別加入終濃 度為10、 50、 100 ng/ml的馬錢素或莫諾苷，上述兩組細(xì)胞種于鋪有 多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，7天后行免疫熒光染色，觀察拍照。三、 實驗結(jié)果胎牛血清對照組細(xì)胞球完全貼壁，單細(xì)胞從細(xì)胞球周緣遷出，遷 出細(xì)胞的形態(tài)大致可分為兩種①小部分細(xì)胞胞體形態(tài)接近橢圃形， 有2 3個細(xì)長的突起；②大部分細(xì)胞的胞體較大，形狀不規(guī)則，突起 較多，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)實驗結(jié)果分析，分別是神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和星 形膠質(zhì)細(xì)胞。無FBS培養(yǎng)液DMEM/F12中分別加入馬錢素與莫諾苷的細(xì)胞培養(yǎng)板 中，10、 50ng/ml兩組細(xì)胞球幾乎完全貼壁，分化較好，遷出細(xì)胞的 細(xì)胞的輻射狀排列，而是細(xì)胞之間互相連接成網(wǎng)狀，或幾個細(xì)胞的突 起首尾相連成"串珠狀"；100ng/ml組的結(jié)果基本相同。結(jié)果表明， 馬錢素與莫諾苷對神經(jīng)干細(xì)胞有良好的促分化作用(圖2)。實施例3馬錢素與莫諾苷的組合物促進腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用一、 實驗?zāi)康挠^察馬錢素與莫諾苷組合物對腦卒中大鼠模型神經(jīng)發(fā)生的影響二、 實驗方法SD大鼠，灌胃給予馬錢素與莫諾苷組合物(1:1)(大劑量 論g/kg，中劑量60mg/kg，小劑量20mg/kg)7天后用線栓法制作局灶 性腦缺血大鼠模型，造模后4~7天內(nèi)連續(xù)腹腔注射給予Brdu (10mg/ml， 50mg/kg/次，2次/d )標(biāo)記內(nèi)源性增殖的細(xì)胞，第8天灌 注，固定、取腦，連續(xù)冰凍切片，片厚30 40um，行免疫熒光染色。三、 實驗結(jié)果正常大鼠海馬齒狀回(DG )和腦室下層(SVZ )有散在分布的Brdu 陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞胞核著色，多數(shù)呈卵圓形；模型組大鼠DG和SVZ 的陽性細(xì)胞較正常組顯著增加；馬錢素與莫諾苷組合物大劑量組大鼠 的陽性細(xì)胞較正常組和模型組增加，說明馬錢素與莫諾苷組合物可以 促進腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖(圖3)。
權(quán)利要求
1. 環(huán)烯醚萜類化合物在制備促進神經(jīng)細(xì)胞增殖和/或分化的藥物中的用途。
2. 按照權(quán)利要求i的用途，其中所述環(huán)烯醚辟類化合物為普通環(huán) 烯瞇辟苷.
3. 按照權(quán)利要求2的用途，其中所述環(huán)烯醚辟苷為莫諾苷或其同 系物或類似物。
4. 按照權(quán)利要求2的用途，其中所述環(huán)烯瞇辟苷為馬錢素或其同 系物或類似物。
5. 按照權(quán)利要求1-4任一項的用途，其中所述促進神經(jīng)細(xì)胞增殖 和/或分化是用于治療各種原因?qū)е碌某霈F(xiàn)神經(jīng)元缺失的疾病。
6. 按照權(quán)利要求l-4任一項的用途，其中所述促進神經(jīng)細(xì)胞增殖 和/或分化是用于治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。
7. 按照權(quán)利要求5或6的用途，其中所述疾病為帕金森病、阿爾 茨海默病、亨廷頓病、肌養(yǎng)縮側(cè)索硬化、運動失調(diào)病、脊號源性肌肉荽 縮與相關(guān)疾病、影響神經(jīng)系統(tǒng)的系統(tǒng)性萎縮病、基底節(jié)退行性疾病、肌 張力陣礙、原發(fā)性的錐體外系疾病或多發(fā)性硬化。
8. 按照權(quán)利要求l-4任一項的用途，其中所述促進神經(jīng)細(xì)胞增殖 和/或分化是用于治療中樞神經(jīng)損傷。
9. 按照權(quán)利要求8的用途，其中所述中樞神經(jīng)損傷為缺血性、外 傷性、以及酒精性腦或脊髄損傷。
10. 按照權(quán)利要求9的用途，其中所述中樞神經(jīng)損傷為外傷性腦損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了環(huán)烯醚萜類化合物在制備促進神經(jīng)細(xì)胞增殖和/或分化的藥物中的用途以及用其治療與神經(jīng)細(xì)胞增殖和/或分化相關(guān)疾病的方法。
文檔編號A61P21/00GK101254185SQ20071008443
公開日2008年9月3日 申請日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日
發(fā)明者姚瑞芹, 張如意, 林 李, 李小黎, 文 王, 魏海峰 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院