專利名稱：：重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)、其cDNA基因、含有該cDNA基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的微生物、以及含有該重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病是目前威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，其中因腦卒中引起的死亡率極高，其發(fā)病后的主要表現(xiàn)為①形成腦血腫；②形成腦血栓；③腦缺血；④出現(xiàn)腦水腫。目前認(rèn)為以上幾種病理改變與白細(xì)胞浸潤(rùn)、凝血酶激活和微循環(huán)障礙有關(guān)?，F(xiàn)已知白細(xì)胞抑制因子和水蛭素分別能抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)和凝血酶激活。(MoyleMetal:US5789175;MaddenKetal，InflammRes1997,46(6):216-223;MasaddaT.etal,BrainRes,2000,867(2):173-179.)白細(xì)胞抑制因子(NIF)由257個(gè)氨基酸組成，含有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，基因工程重組去糖基化NIF被證明同樣具有其生物活性。白細(xì)胞抑制因子能有效抑制中性粒細(xì)胞的活性，包括與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、過(guò)氧化氫和超氧化離子的釋放、中性粒細(xì)胞趨化、聚集和吞噬功能等。(MoyleMetal:JBiolchem1994，269(13):10008-10015)鑒于NIF具有以上的功效，應(yīng)用重組NIF在動(dòng)物模型中證明具有臨床應(yīng)用價(jià)值，可防止和治療缺血性的神經(jīng)損傷(大鼠MCAO模型)，具有改善腦損傷的血液供應(yīng)，減輕腦組織損傷面積。(ZhangLetal:stroke.2003,34(7):17M-1795)通過(guò)對(duì)水蛭素的結(jié)構(gòu)與功能的研究，發(fā)現(xiàn)C端的12肽(即5364位)具有水蛭素抗凝血酶活性的全部功能。(NaskiMC.etal:JBiocchem.1990,265(23):13484-13489;MaraganoreJmetal:Biochemistry1990，29(30):7095-7101)在此基礎(chǔ)上人工合成了12肽，命名為水蛭原(Hirugen)，水蛭原被證明能與凝血酶的陰離子結(jié)合區(qū)域結(jié)合，不能與催化位點(diǎn)區(qū)域和纖維蛋白結(jié)合，而凝血酶可與纖維蛋白結(jié)合，所以該水蛭原不能特異地與凝血酶結(jié)合，即缺乏對(duì)凝血酶的靶向性。但水蛭原在體內(nèi)外同樣具有抑制凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白的功能，延長(zhǎng)APTT、PT和TT時(shí)間，起到抗凝作用。根據(jù)以上病理以及NIF和水蛭原的生物活性，中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?31011551)公開(kāi)了一種將白細(xì)胞抑制因子與水蛭原經(jīng)基因工程重組技術(shù)而形成的雙功能嵌合蛋白(NIF-HimdinHybrid,簡(jiǎn)稱NHH)，該嵌合蛋白的結(jié)構(gòu)如下白細(xì)胞抑制因子-(Gly)5-水蛭原。該NHH由274個(gè)氨基酸組成，具有抑制中性粒細(xì)胞的粘附和活化，和抑制凝血酶活性的功能，適用于急性腦血管性疾病的治療。然而，由于上述NHH中的水蛭原不能與催化位點(diǎn)區(qū)域結(jié)合，所以該NHH同水蛭原一樣缺乏對(duì)凝血酶的靶向性，大大抑制了其在治療心腦血管疾病方面的效果。
發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的旨在提供一種新的能耙向抑制凝血酶活性的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，從而改善治療心腦血管疾病，如腦卒中的治療效果。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)，其具有如下結(jié)構(gòu)Met-白細(xì)胞抑制因子-交聯(lián)區(qū)l-FPRP-交聯(lián)區(qū)2-水蛭原，其中，交聯(lián)區(qū)1為515個(gè)甘氨酸，優(yōu)選為510個(gè)甘氨酸；交聯(lián)區(qū)2為(GSGG)n，n為l-3。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了該重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的cDNA序列。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了含有上述cDNA的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了含有上述表達(dá)載體的微生物。本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了一種包含本發(fā)明重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明的TNHH的結(jié)構(gòu)為Met-白細(xì)胞抑制因子-交聯(lián)區(qū)l-FPRP-交聯(lián)區(qū)2-水蛭原。優(yōu)選地，TNHH中的交聯(lián)區(qū)1為515的甘氨酸，更優(yōu)選為5個(gè)甘氨酸；交聯(lián)區(qū)2(GSGG)n，n為l3，n更優(yōu)選為l。FPRP中的苯丙氨酸(F)優(yōu)選為L(zhǎng)型；Met為甲硫氨酸。優(yōu)選的嵌合蛋白為Met-NIF(257)-(Gly)5-FPRPGSGG-Hirugen，其中FPRP中的苯丙氨酸(F)為L(zhǎng)型。本發(fā)明的TNHH中的FPRP結(jié)構(gòu)能特異結(jié)合纖維蛋白，從而使TNHH在抑制凝血酶活性和治療心腦血管疾病方面具有靶向性。為了獲得所述的TNHH，本發(fā)明采取了如下步驟①以GenBank中的NIF的cDNA以及根據(jù)水蛭原的12肽推測(cè)的密碼子序列為依據(jù)，結(jié)合大腸桿菌或酵母或CHO表達(dá)的偏愛(ài)密碼子原則，設(shè)計(jì)了NHH相對(duì)應(yīng)的用于人工合成的cDNA序列；②根據(jù)上述設(shè)計(jì)的cDNA堿基序列，設(shè)計(jì)若干對(duì)互補(bǔ)重疊引物，用遞歸PCR方法擴(kuò)增所設(shè)計(jì)的堿基序列，插入pUC57測(cè)序質(zhì)粒，由全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABI)測(cè)序確定人工合成的cDNA片斷的堿基序列與所設(shè)計(jì)一致；③以含有②中所設(shè)計(jì)的堿基序列的pUC57為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增TNHH基因，擴(kuò)增后的基因首尾分別含有酶切位點(diǎn)，且在尾部的酶切位點(diǎn)前含有終止子，優(yōu)選含有TAATGA的終止子，以方便插入表達(dá)載體中，以及表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。其中優(yōu)選首尾分別插入^^/和5""〃/，以便插入原核表達(dá)載體中;^^;④由于擴(kuò)增后的TNHH首尾分別含有酶切位點(diǎn)，用含有相同酶切位點(diǎn)的測(cè)序質(zhì)粒來(lái)檢驗(yàn)擴(kuò)增的TNHH基因與設(shè)計(jì)的完全一致后，酶切TNHH基因正確序列的測(cè)序質(zhì)粒以及表達(dá)載體，從而使表達(dá)載體與TNHH基因連接，得到含有TNHH基因的表達(dá)載體；⑤將所得的含有TNHH基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞經(jīng)測(cè)序分析，目的基因正確地嵌入載體中，并且目的基因序列與所設(shè)計(jì)的相同。使TNHH蛋白在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)。最后從菌體中提取純化得到TNHH蛋白。本發(fā)明所提供的表達(dá)TNHH的cDNA優(yōu)選為SEQIDNO.2。本發(fā)明所提供的含有所述cDNA的表達(dá)載體優(yōu)選為pET-3c。本發(fā)明所提供的含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、酵母細(xì)胞和CHO細(xì)胞等，優(yōu)選為大腸桿菌。本發(fā)明的藥物組合物可為任何常規(guī)劑型，如注射劑型，其包括注射液和凍干粉等形式。制備注射劑型時(shí)，可將本發(fā)明TNHH加入一定量的無(wú)機(jī)鹽或氨基酸緩沖，如磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸，其中鹽主要指鈉鹽，其離子強(qiáng)度為5—100mmol/L之間。藥物組合物的酸堿值維持在5.0-9.0之間。該組合物中還可加入蛋白保護(hù)劑如白蛋白、明膠、多糖、淀粉、甘油等。其中多糖優(yōu)選為甘露醇、蔗糖、海藻糖中的一種或多種，其比例(g/ml)為2.0—6.0%。本發(fā)明提供的含有所述重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的藥物組合物能夠治療心腦血管疾病，尤其是腦卒中。圖l:PCR擴(kuò)增的各DNA片段，其中M.100bpDNALadderMarker;1.Hirulog基因(70bp);2.NIF基因(810bp);3.TN朋基因(870bp)圖2:擴(kuò)增后的TNHH的測(cè)序結(jié)果，其中，圖2a為擴(kuò)增后的TNHH的測(cè)序結(jié)果(正向測(cè)序)；圖2b擴(kuò)增后的TNHH的測(cè)序結(jié)果(反向測(cè)序)圖3:pLEX-TNHH、pLEX和pET3c質(zhì)粒的酶切鑒定，其中Ml.XDNA///zwdIII+￡coRIAgeW;1.pLEX-TNHH/7W/eI十SamHI;2.pLEX/廁eI十B謂HI;3.pET3c/腸I十B函HI;M2.訓(xùn)bpDNALadderMarker圖4:表達(dá)重組質(zhì)粒pET3-TNHH的構(gòu)建圖5:重組質(zhì)粒pET3-TNHH的鑒定，其中M.XDNA/歷"dIII+￡coRI消化；1.pET3c/iVdeI+J5amHI;2-3.pET3-TNHH/AWeI十BawHI;4.TNHH基因PCR片段圖6:pET3-TNHH中TNHH基因的測(cè)序結(jié)果，其中圖6a為pET3-TNHH中TNHH基因的測(cè)序結(jié)果(正向測(cè)序)，圖6b為pET3-TNHH中TNHH基因的測(cè)序結(jié)果(反向測(cè)序)圖7:TNHH的免疫印跡鑒定，其中M.蛋白質(zhì)中分子量Marker;1.純化的TNHH;2.Hirudin;l，.TNHH的免疫印跡；2，.Hirudin的免疫印跡圖8:TNHH的N端及C端氨基酸測(cè)序結(jié)果，其中，圖8a為T(mén)NHH的N端及C端氨基酸測(cè)序結(jié)果(N端測(cè)序)，圖8bTNHH的N端及C端氨基酸測(cè)序結(jié)果(C端測(cè)序)圖9:正常對(duì)照組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞層次清晰，胞核深染，胞體皺縮或消失圖10:模型組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞層次紊亂，胞核深染，胞體皺縮或消失圖11:NIF組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞層次欠規(guī)則，部分胞核深染，部分胞體皺縮或消失圖12:NHH組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞層次欠規(guī)則，部分胞核深染，部分胞體皺縮或消失圖13:TNHH組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞層次較規(guī)則，可見(jiàn)部分胞核深染，可見(jiàn)部分胞體皺縮或消失(HE10X10)圖14:TNHH組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次較規(guī)則，可見(jiàn)部分核深染，可見(jiàn)部分胞體皺縮或消失(HE40X10)具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于實(shí)施例。實(shí)施例1NHH基因的獲得委托上海生物工程有限公司全基因人工合成，其設(shè)計(jì)方案為根據(jù)NHH設(shè)計(jì)的全基因序列(SeqIDNo.l)合成14個(gè)寡核苷酸片段，長(zhǎng)度為80130bp之間。其中l(wèi)、3、5、7、9、11、13片段為正向片段，2、4、6、8、10、12、14為反向片段。在相鄰二個(gè)片段之間設(shè)計(jì)20個(gè)左右堿基序列的互補(bǔ)區(qū)。合成以上片段并純化后，按等量混合作為遞歸PCR的底物，進(jìn)行PCR反應(yīng)后獲得822bp的NHH基因cDNA。NHH基因序列前端加Kex2位點(diǎn)，該位點(diǎn)開(kāi)始六堿基為屈oI位點(diǎn)；NHH后跟兩個(gè)終止密碼子；終止密碼子后跟I6"I位點(diǎn)。合成的NHH全基因序列如下(SEQIDNO.1):XhoIKex2AACGGTACTGAAATGCCAGGTTTCAACGACTCCATCAGAGCTTTGGGTCACATCTCCATCACTGAAGAATCCGAATCCGACGACGACGACGACTTCGGTTTCTTGCCAGACTTCGCTCCAAGAGCTTCCAAGATGAGATACTTGGAATACGACTGTGAAGCTGAAAAGTCCGCTTACATGTCCGCTAGAAACTGTTCCGACTCCTCCTCCCCACCAGAAGGTTACGACGAAAACAAGTACATCTTCGAAAACTCCAACAACATCTCCGAAGCTGCTTTGAAGGCTATGATCTCCTGGGCTAAGGAAGCTTTCAACTTGAACAAGACTAAGGAAGGTGAAGGTGTTTTGTACAGATCCAACCACGACATCTCCAACTTCGCTAACTTGGCTTGGGACGCTAGAGAAAAGTTCGGTTGTGCTGTTGTTAACTGTCCATTGGGTGAAATCGACGACGAAACTAACCACGACGGTGAAACTTACGCTACTACTATCCACGTTGTTTGTCACTACCCAAAGATCAACAAGACTGAAGGTCAACCAATCTACAAGGTTGGTACTCCATGTGACGACTGTTCCGAATACACTAAGAAGGCTGACAACACTACTTCCGCTGACCCAGTTTGTATCGACTCCAAGGAGTTCTACAGATTCAGAGAATTGGGCGGTGGCGGTGGCAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCAGAAGAATACTTG[TAATGA|rC7^04終止子X(jué)6a/合成基因嵌入pUC57質(zhì)粒且命名為pUC57-NHH。該NHH基因用于與pPIC9K構(gòu)建重組質(zhì)粒、線性化后重組入宿主菌畢節(jié)酵母(戶/c/nh內(nèi)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，制備重組NHH作為本品動(dòng)物模型對(duì)照篩選蛋白。實(shí)施例2TNHH基因的獲得在本實(shí)施例中，所設(shè)計(jì)的TNHH具有Met-NIF-GGGGG-FPRPGSGG-水蛭原結(jié)構(gòu)，其對(duì)應(yīng)的cDNA序列如下(SEQIDNO.2):AACGAACACAACTTGAGATGTCCACAAAACGGTACTGAAATGCACAACGGTTACAGATCCAAGTTGGCTTTGGGTCACATCTCCATCACTGAAGAATCCGAATCCGACGACGACGACGACTTCGGTTTCTTGCCAGACTTCGCTCCAAGAGCTTCCAAGATGAGATACTTGGAATACGACTGTGAAGCTGAAAAGTCCGCTTACATGTCCGCTAGAAACTGTTCCGACTCCTCCTCCCCACCAGAAGGTTACGACGAAAACAAGTACATCTTCGAAAACTCCAACAACATCTCCGAAGCTGCTTTGAAGGCTATGATCTCCTGGGCTAAGGAAGCTTTCAACTTGAACAAGACTAAGGAAGGTGAAGGTGTTTTGTACAGATCCAACCACGACATCTCCAACTTCGCTAACTTGGCTTGGGACGCTAGAGAAAAGTTCGAAACTAACCACGACGGTGAAACTTACGCTACTACTATCCACGTTGTTTGTCACTACCCAAAGATCAACAAGACTGAAGGTCAACCAATCTACAAGGTTGGTACTCCATGTGACGACTGTTCCGAATACACTAAGAAGGCTGACAACACTACTTCCGCTGACCCAGTTTGTATCCCAGACGACGGTGTTTGTTTCATCGGTTCCAAGGCTGACTACGACTCCAAGGAGTTCTACAGATTCAGAGAATTGGGCGGTGGCGGTGGCTTCCCAAGACCAGGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCAGAATNHH基因通過(guò)如下步驟獲得合成4條引物P1、P2、P3禾t!P4，以重組質(zhì)粒pUC57-NHH為模板，用引物P1、P2擴(kuò)增NIF基因(尾部帶有編碼FPRP的堿基序列)，用引物P3、P4擴(kuò)增Himlog基因(首部帶有編碼FPRP的堿基序列)；再用NIF基因及Himlog基因?yàn)槟０?，用引物P3、P4擴(kuò)增TNHH基因。擴(kuò)增的TNHH基因首尾分別加入NdeI和BamHI位點(diǎn)，方便插入原核表達(dá)載體pET-3c。引物序列如下Pl(正向)5'-CGC4r爿rGAACGAACACAACTTGAGATGTCCA-3，P2(反向)5'-ACC^TGGTCTTGGGA^GCCACCGCCACCGCCCAATTCTCTGAA-3'P3(正向)5，-GGC[lTCCCAAGACCA|GGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTC-3'P4(反向)5，_TG7TCTTACAAGTATTCTTCTGGGATTTC-3，C4L4rC:Mfcl位點(diǎn)；TTC:5amHl位點(diǎn)；方框內(nèi)堿基編碼氨基酸序列FPRP;下劃線堿基編碼氨基酸序列GGGGG或GSGG。重疊延伸PCR方法擴(kuò)增TNHH目的基因的反應(yīng)體系如下各PCR的反應(yīng)體系均用PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa，大連)按商家的說(shuō)明書(shū)設(shè)置(表l)。以重組質(zhì)粒pUC57-NHH為模板，以P1、P2作引物，擴(kuò)增810bp的NIF基因(圖1泳道2)。以重組質(zhì)粒pUC57-NHH為模板，以P3、P4作引物，擴(kuò)增70bp的水蛭原基因(圖1泳道1)。以凝膠回收的NIF基因和水蛭原基因作模板，以P1、P4作引物，最終擴(kuò)增870bp的TNHH基因(圖1泳道3)。表1PCR反應(yīng)體系模板1nl上游引物(25pmol/L)2|xl下游引物(25pmol/L)2pldNTPs(每種堿基分別為2.58plmmol/L)10xPCR緩沖液10plMgCl2(25mmol/L)10pi7b《DNA聚合酶1piddH20_66^總體積100^將反應(yīng)體系振蕩混勻，離心處理后，加入40nl石蠟油。反應(yīng)參數(shù)如下94°C預(yù)變性3分鐘，94。C55°C72°C72°C1分鐘1分鐘1.5分鐘10分鐘,35循環(huán)反應(yīng)完畢后取3反應(yīng)產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR效果(圖1)PCR結(jié)果顯示，各步PCR成功擴(kuò)增出目的DNA片段，TNHH基因初步獲得，序列是否正確通過(guò)如下鑒定將TNHH基因及載體pLEX(Invitrogen)用MfeI和BawHI雙酶切后，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接起來(lái)形成重組質(zhì)粒pLEX-TNHH，經(jīng)DNA測(cè)序(TaKaRa，大連)后表明，擴(kuò)增的TNHH基因與設(shè)計(jì)的完全一致，參見(jiàn)圖2。實(shí)施例3重組質(zhì)粒構(gòu)建1.主要材料宿主菌￡.co"BL21(DE3)pLysS、￡.co/ZDH5a、質(zhì)粒pET3c(Novagen)，DNA抽提純化試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，ADNA////^/IH+五coRIMarker(華美)，工具酶7W/eI、5amHI、歷"dIII、DNALadderMarker、DNARecoveryKit和DNALigationKitVer.2.1(TaKaRa，大連)，抗生素Ampicillin、Streptomycin、Tetracycline,Kanamycin(AMRESCO)。2.方法pLEX-TNHH經(jīng)兩個(gè)限制性內(nèi)切酶I、5a/wHI雙酶切后回收目的片段，TNHH基因與7W/el、5訓(xùn)HI雙酶切的pET3c質(zhì)粒大片段用DNALigationKit連接。采用CaCl2法制備感受態(tài)轉(zhuǎn)化DH5a，均勻涂抹于含100mg/L氨卡青霉素的LB平板，在37"C培養(yǎng)箱中孵育12h生長(zhǎng)出乳白色半透明單菌落，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落在含100mg/LAmpicillin的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用I、加仿HI雙酶切篩選出已嵌合860bp片段的表達(dá)質(zhì)粒pET3-TNHH。①質(zhì)粒提取按DNA抽提純化試劑盒操作手冊(cè)方法進(jìn)行。②酶切分別進(jìn)行pLEX-TNHH質(zhì)粒和pET3c質(zhì)粒的酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系為0.5嗎的質(zhì)粒DNA、5amHI1.0單位、iV^feI1.0單位、10倍酶反應(yīng)緩沖液2.0^tl，加去離子水(DDW)至總體積20nl。37。C恒溫箱中酶切2h,各取1pl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。pLEX-TNHH酶切后顯示一860bp條帶和一2900bp條帶，pET3c顯示出一條4600bp帶(圖3)。③pET-3c與TNHH基因連接將上述酶切樣品全部進(jìn)行膠回收電泳，按DNARecoveryKit操作手冊(cè)方法回收酶切pLEX-TNHH后的目的片段和線性化pET-3c，將回收的線性化pET-3c和目的片段按DNALigationKit操作手冊(cè)，16'C連接30min，得到pET3-TNHH(圖4)。④感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化按常規(guī)氯化鈣方法進(jìn)行五.co//DH5a和￡.co//BL21(DE3)pLysS感受態(tài)制備和pET3-TNHH的轉(zhuǎn)化(《分子克隆試驗(yàn)指南》第二版，P55)。實(shí)施例41.連接和轉(zhuǎn)化將pET3-TNHH陽(yáng)性連接液及陰性連接液分別轉(zhuǎn)化五.co/z'DH5a，各自涂在含100mg/LAmpicillin的兩個(gè)LB平板上37。C恒溫培養(yǎng)12h,陰性平板生長(zhǎng)出5個(gè)單菌落，而陽(yáng)性平板生長(zhǎng)出IOO個(gè)左右的單菌落，證明連接和轉(zhuǎn)化成功，其形態(tài)特征為大腸桿菌典型表現(xiàn)。2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET3-TNHH的酶切鑒定用無(wú)菌牙簽挑取陽(yáng)性平板上兩個(gè)單菌落在含100mg/LAmpicillin的LB液體培養(yǎng)基37"C培養(yǎng)12h后，提取重組表達(dá)質(zhì)粒pET3-TNHH經(jīng)I和BawHI雙酶切，結(jié)果顯示出4600bp和860bp(該片段用TNHHPCR產(chǎn)物做對(duì)照)大小的兩片段，與設(shè)計(jì)的完全一致(圖5)。3.重組表達(dá)質(zhì)粒pET3-TNHH的測(cè)序鑒定從pET3-TNHH/￡.co//DH5a中提取質(zhì)粒pET3-TNHH，經(jīng)酶切鑒定正確后，取一部分送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序，見(jiàn)圖6。測(cè)序結(jié)果表明，所得表達(dá)質(zhì)粒中包含的TNHH序列與預(yù)先設(shè)計(jì)的一致。實(shí)施例5TNHH的提取與純化<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>TNHH原液實(shí)施例6TNHH原液的免疫印跡鑒定以及測(cè)序鑒定。將純化的TNHH以相同上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，再用電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上與鼠抗水蛭素(Himdin)抗體(一抗)結(jié)合，再與羊抗鼠IgG-HRP(二抗)結(jié)合后，通過(guò)底物顯色反應(yīng)得到免疫印跡鑒定(圖7)。從圖7看出，TNHH內(nèi)顯示了與抗Hirudin抗體特異結(jié)合的成分，這表明設(shè)計(jì)的HV2抗原表位充分暴露并能以抗體特異結(jié)合。從圖8看出，所得的TNHH的氨基酸N端測(cè)序結(jié)果為MNEHNLRCPQNGTEM，C端測(cè)序結(jié)果為EYL，與設(shè)計(jì)的序列DDDDDFGFLPDFAPRASKMRYLEYDCEAEKSAYMSARNCSDSSSPPEGYDENKYIFENSNNISEAALKAMISWAKEAFNLNKTKEGEGVLYRSNHDISNFANLAWDAREKFGCAVVNCPLGEIDDETNHDGETYATTIHVVCHYN端序列與C端序列完全吻合，結(jié)合DNA測(cè)序結(jié)果表明TNHH的氨基酸序列與設(shè)計(jì)的完全一致。其中，(Gly)5前面氨基酸序列為NIF,NGDFEEIPEEYL為水蛭原的氨基酸序列。從上可看出，所得TNHH具有如下結(jié)構(gòu)Met-NIF-GGGGG-FPRPGSGG-水蛭原。實(shí)施例7含交聯(lián)區(qū)1(Gly)15和交聯(lián)區(qū)2(GSGG)3的TNHH的制備用PCR技術(shù)將TNHH的基因的交聯(lián)區(qū)1和交聯(lián)區(qū)2替換成NIF—(Gly),5—FPRF—(GSGG)3—Hirogen形式。合成兩對(duì)引物序列P5(正向)同實(shí)施例2中P1P6(反向)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>_-3，P7(正向)5,—GGC阮CCAAGACCA卜GGTAGC—GGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTC—3，P8(反向)同實(shí)施例2中P4其中方框內(nèi)堿基編碼的氨基酸序列為FPRP，P6下劃線堿基編碼的氨基酸序列為(Gly)15，P7下劃線堿基編碼的氨基酸序列為(GSGG)3。以TNHHcDNA基因?yàn)槟０澹凑諏?shí)施例2，3，4，5的方法，PCR獲得目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，連接和轉(zhuǎn)化以及鑒定，提取和分離純化。獲得的重組TNHH命名為T(mén)NHH—G15/n3。通過(guò)體外分析比較研究，證明TNHH-G15/n3和TNHH的抑制凝血酶活性及抗白細(xì)胞粘附活性一致。合成二對(duì)引物序列P5(正向)同實(shí)施例2中PIP6(反向)5，一ACCTGGTCTTGGGAAGCCACCGCCACCGCCACC「3，P7(正向)5，一GGCTTCCCAAGACCA—GGTAGC—GGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTC—3,P8(反向)同實(shí)施例2中P4其中方框內(nèi)堿基編碼的氨基酸序列為FPRP，P6下劃線堿基編碼的氨基酸序列為(Gly)15，P7下劃線堿基編碼的氨基酸序列為(GSGG)3。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例8TNHH的藥物組合物制劑8.1注射液用實(shí)施例5制備所得的TNHH重組蛋白溶液按照下列配方制備藥物組合物注射液配方A:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>配方B<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>8.2凍干粉用實(shí)施例5制備所得的重組蛋白TNHH液按下列配方制備成凍干粉配方C<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>配方E<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例8中的制備工藝均按照常規(guī)注射液和凍千粉的制備工藝制備。實(shí)施例9NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血損傷治療作用的比較1.材料藥物試藥NIF、NHH和TNHH由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥公司提供。試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)F20020610;APTT試劑盒，購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司，批號(hào)國(guó)藥器械(進(jìn))字2002第3401632號(hào)。動(dòng)物Wistar大鼠24只，雄性，180-230g,由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。2.方法將Wistar大鼠隨機(jī)分為四組，模型組，NHH組，NIF組和TNHH組，每組6只。各Wistar大鼠，用10%水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉。將其仰臥固定，沿頸正中切口切開(kāi)皮膚，純性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈并穿線2根游離備用。再分離出頸外動(dòng)脈，結(jié)扎之。在頸外動(dòng)脈下方分離出頸內(nèi)動(dòng)脈及翼突腭動(dòng)脈，將翼突腭動(dòng)脈結(jié)扎之。將分離的頸總動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉，于頸外動(dòng)脈上剪一小口，將一尼龍線棒(<D=0.220.30mm)插入小口，緩緩?fù)迫胫燎澳X動(dòng)脈(約20mm)再回拉約2mm即至大腦中動(dòng)脈口，長(zhǎng)約17mm，用7號(hào)縫線結(jié)扎固定尼龍棒，取下動(dòng)脈夾，縫合肌肉和皮膚，術(shù)畢放加大籠單獨(dú)飼養(yǎng)。待動(dòng)物清醒后，行為學(xué)評(píng)分小于11分為模型成功的標(biāo)志。在每組動(dòng)物模型成功后(按動(dòng)物麻醉清醒后行為學(xué)評(píng)分小于ll分為準(zhǔn))，各組動(dòng)物分別從尾靜脈給相應(yīng)的藥物，2mg/kg，bid，給藥容積為1ml/100g，模型組給予相應(yīng)容量的生理鹽水。分別于術(shù)后4h，8h，24h，48h，72h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(滿分為11分)。于術(shù)后72評(píng)分后，經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血1.8ml，迅速加入盛有0.2ml的0.109mol/L枸椽酸鈉抗凝液的硅化下班管中，輕輕顛倒混勻，300rpm離心15min，收集上層液體，按試劑說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定APTT。然后再將大鼠斷頭，去除頭蓋骨后取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦于，余下部分稱其重量后，將大腦沿冠狀面切成5片，將腦片置4%TTC的磷酸緩沖液中37"C溫孵30min,其間翻動(dòng)34次，正常腦組織染成紅色，而梗死腦組織呈白色，剪下白色的梗死區(qū)稱重，以"重量求面積法"計(jì)算梗死腦組織重量占全腦重量的百分比作為梗死面積。每組再任選2只動(dòng)物，處死后取大腦作病理檢査。3.結(jié)果3.1NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血行為學(xué)評(píng)分比較如表2所示，NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血的行為學(xué)評(píng)分有明顯改善作用，各用藥組與模型組比較有差異和顯著差異(尸<0.05禾卩戶<0.01)。表2NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血行為學(xué)評(píng)分比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.2NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦梗死體積的比較如表3所示，NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦梗死體積有明顯的減少作用，各用藥組與模型組比較有差異和顯著差異(戶<0.05禾卩戶<0.01)。表3NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦梗死體積的比較組別動(dòng)物數(shù)腦梗死的體積(％)模型組439.4±5.7NIF纟且424.9±9.6*NHH組425.2±5.2**TNHH組423.2±5.4**3.3NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血后血清APTT的比較如表4所示，NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血后血清APTT值有延長(zhǎng)作用，各用藥組與模型組比較有差異和顯著差異(P<0.05禾卩尸<0.01)。表4NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血后血清_APTT比較_組另U_動(dòng)物數(shù)血清中APTT(秒)模型組618.5±4.8NIF組620.2±3.3NHH組628.5±2.7"TNHH組624.8±3.6*3.4NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦組織梗死的病理切片觀察結(jié)果與正常對(duì)照組的腦組織相比，模型組與各用藥組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次有不同程度的紊亂，胞核深染固縮，胞體皺縮。海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次有不同程度的紊亂，細(xì)胞排列疏松，胞漿淡染，胞核深染固縮，細(xì)胞數(shù)不同程度的下降。與模型組相比，NIF、NHH和TNHH的病理變化均輕于模型組，其中以TNHH組病理變化最輕(見(jiàn)圖9-14)。由以上病理切片可以看到，對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞性腦組織梗死，與模型組相比，NIF、NHH和TNHH有不同程度的保護(hù)作用，以TNHH組腦組織缺血壞死變化最輕。4.結(jié)論NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血損傷有明顯的治療作用，其中TNHH的治療保護(hù)作用最顯著。實(shí)施例10NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦血腫治療作用的比較1.材料藥物試藥NIF、NHH和NTHH由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥公司提供。動(dòng)物SD大鼠32只，雄性，180~230g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。2.方法2.1大鼠腦出血模型的建立將SD大鼠隨機(jī)分為四組，模型組，NHH組，NIF組和TNHH組，每組8只實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，斷尾取血0.1ml，將大鼠固定于立體定位儀上。頭皮正中切口，剪開(kāi)骨膜，暴露前囟，于前囟后lmm,中線左旁開(kāi)3mm處鉆一直徑為lmm的小孔，用固定于立體定位儀上的微量進(jìn)樣器沿鉆孔進(jìn)針，進(jìn)針深度為5.8mm(即尾狀核位置)，緩慢注射自體血液0.1ml。動(dòng)物蘇醒后按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)立即進(jìn)行神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分。行為學(xué)評(píng)分小于11分動(dòng)物入選本實(shí)驗(yàn)。以后分別于造模后進(jìn)行行為評(píng)分，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。2.2觀察指標(biāo)神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分的觀察及選造模后4h、12h、24h、48h、72h5個(gè)時(shí)間點(diǎn)；腦含水量的變化及組織病理學(xué)觀察在造模后72h處死動(dòng)物后進(jìn)行。2.3給藥方法每組動(dòng)物模型建成后(按動(dòng)物麻醉清醒后行為學(xué)評(píng)分小于11分為準(zhǔn))，各組動(dòng)物分別從尾靜脈給相應(yīng)的藥物，2mg/kg，bid，給藥容積為1ml/100g，模型組給予相應(yīng)容量的生理鹽水。2.4腦含水量的測(cè)定動(dòng)物處死后迅速取腦，取血腫邊緣處腦灰質(zhì)150200g(去除皮質(zhì))。采用干濕法測(cè)腦組織含水量，按公式腦含水量=(濕重-干重)/濕重x100%，計(jì)算腦含水量。2.5普通光鏡觀察在選定的時(shí)間點(diǎn)迅速斷頭取腦，沿冠狀面切下厚2mm的腦片，置入10%甲醛中固定，常規(guī)HE染色，封片，觀察病變區(qū)及附近腦組織病理變化。2.6行為指標(biāo)評(píng)分于術(shù)后4h、12h、24h、48h、72h進(jìn)行行為評(píng)分。方法簡(jiǎn)述于下提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如前肢對(duì)稱伸向地面，計(jì)為O分，如手術(shù)的對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈，肘屈，肩內(nèi)旋，既有腕肘屈曲又有肩內(nèi)旋者，分別計(jì)分1，2，3，4分。將動(dòng)物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢査阻力，如雙側(cè)阻力對(duì)等且有力，計(jì)為O分，如向手術(shù)的對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降則根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計(jì)為l，2，3分。將動(dòng)物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對(duì)等且用力者計(jì)為O分，同樣根據(jù)手術(shù)對(duì)側(cè)肢張力下降程度不同計(jì)為1，2，3分。動(dòng)物有不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計(jì)為1分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，滿分為11分，分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。3結(jié)果3.1NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦血腫行為學(xué)評(píng)分比較如表5所示，NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦血腫行為學(xué)評(píng)分有明顯改善作用，各用藥組與模型組比較有差異和顯著差異(戶<0.05和戶<0.01)。表5NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦血腫行為學(xué)評(píng)分比較動(dòng)行為學(xué)評(píng)分__組別物4h12h24h48h72h必,_^_模型組82.50±0.842.83±0.753.83±1.725.33±1.636.17±1.47NIF組81.86±0.902.14±0.90*2.43±0.53**3.14±0.90**4.14±1.68**NHH組82.14±0.691.86±0.90**2.43±1.00**2.57士0.13**3.57±1.72**TNHH組82.00±1.072.00±0.76**2.25±0.46**2.12±0.64**2.88±1.46**與模型組比較*尸<0.05，**/><0.01，以下相同。3.2NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦血腫腦含水量的比較結(jié)果如表6所示，NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦血腫腦含水量有明顯的減少作用，各用藥組與模型組比較有差異和顯著差異(/><0.05禾口尸<0.01)。表6NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦血腫行為學(xué)評(píng)分比較組別_動(dòng)物數(shù)腦含水量(％)模型組883.35土2.07NIF組879.36±0.47"NHH組878.66±0.55**TNHH組878.28±1.97**3.3NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦血腫的病理切片觀察結(jié)果觀察指標(biāo)腦水腫，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，神經(jīng)纖維脫髓鞘，膠質(zhì)細(xì)胞增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)出血。對(duì)側(cè)腦對(duì)照組觀察大腦皮髓結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、血管分布、血管結(jié)構(gòu)均無(wú)異常，無(wú)腦水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血。模型組大腦皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，神經(jīng)細(xì)胞有變性及壞死，有明顯腦水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)有出血，膠質(zhì)細(xì)胞有增生。上述病變表現(xiàn)程度為多數(shù)動(dòng)物為++—+++度病變，2例為+度病變。NIF組上述病變多數(shù)為±—+度病變，3例為+—++度病變。NHH組上述病變多數(shù)為0—+度病變，3例為+—++度病變。TNHH組上述病變有明顯好轉(zhuǎn)，多數(shù)為0—±度病變，僅2例±度病變。4結(jié)論NIF、NHH和TNHH對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦血腫有明顯的治療作用，其中TNHH的治療保護(hù)作用最顯著。大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞性腦缺血損傷實(shí)驗(yàn)病理照片實(shí)施例IITNHH與纖維蛋白和凝血酶在體外結(jié)合情況。1試驗(yàn)材料1.1藥物TNHH原液(3.0mg/ml)。人纖維蛋白(lg/支，F(xiàn)5386)，sigma公司。人凝血酶(127Unit/支)，批號(hào)20021105，中國(guó)藥品生物制品檢定所。1.2溶液磷酸鹽緩沖液(10mmol/LPB，0.15mol/LNaCl，pH7.4)。色譜流動(dòng)相緩沖液20mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4，0.15mol/LNH4S04，pH6.8。1.3儀器恒溫水浴鍋。凝膠色譜注(ShodexPROTEINKW-82.5)。Waters600HPLC系統(tǒng)帶浙江大學(xué)N2000色譜工作站。1mlEP管架1個(gè)，1mlEP管若干，lml移液槍及槍頭。2試驗(yàn)方法及結(jié)果2.1供試品取TNHH，用磷酸緩沖液稀釋為1.0mg/ml，待用；精密稱取適量取纖維蛋白，用磷酸緩沖液溶解并稀釋為0.1mg/ml，待用；取凝血酶，按標(biāo)示量用磷酸緩沖液溶解并稀釋為100單位/ml，待用。2.2供試品反應(yīng)按下所列方法分組取各供試品置37C反應(yīng)1小時(shí)，然后按色譜條件進(jìn)行分析。(1)分別取各供試品溶液20pl進(jìn)樣分析，記錄各自保閨時(shí)間。(2)取纖維蛋白和凝血酶供試品溶液各0.5ml，混勻后置37'C反應(yīng)1小時(shí)，取樣20pl進(jìn)樣分析。(3)取TNHH和纖維蛋白供試品溶液各0.5ml，混勻后置37。C反應(yīng)l小時(shí)，取樣20]id進(jìn)樣分析。(4)取TNHH和凝血酶供試品溶液各0.5ml，混勻后置37'C反應(yīng)1小時(shí)，取樣20pl進(jìn)樣分析。(5)取TNHH和纖維蛋白與凝血酶混合反應(yīng)樣品各0.5ml，混勻后置37'C反應(yīng)1小時(shí)，取樣20pl進(jìn)樣分析。2.3色譜條件流速0.5ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)214nm;柱溫室溫；記錄色譜圖25min。2.4色譜結(jié)果表7TNHH與纖維蛋和凝血酶結(jié)合SEC-HPLC分析色譜結(jié)果,、，保留時(shí)間(min)峰1峰2TNHH(T)23.657/纖維蛋白(F)16.680/凝血酶")18.778/凝血酶+纖維蛋白(f+F)12.58218.578TNHH+纖維蛋白(T+F)14.598/TNHH+凝血酶+纖維蛋白(T+F+f)10.26512.772結(jié)果分析TNHH,纖維蛋白及凝血酶在SEP-HPLC中保留時(shí)間各不相同，分別為23.657，16.680和18.778min，能有效分離。凝血酶與纖維蛋白能部分結(jié)合后侈時(shí)間為12.582min，TNHH與纖維蛋白有效結(jié)合后保留時(shí)間為期不遠(yuǎn)14.598min，TNHH與凝血酶和纖維蛋白三者結(jié)合后的.保留時(shí)間為10.265min。3結(jié)論TNHH，人纖維蛋白和人凝血酶三種不同蛋白在SEC-HPLC色譜保留時(shí)間分別不同。根據(jù)試驗(yàn)條件(生理緩沖)相互混合后出現(xiàn)了明顯的高分子量蛋白峰，其中纖維蛋白和凝血酶可相互結(jié)合，本品TNHH與纖維蛋白和凝血酶可相互結(jié)合。此結(jié)果表明TNHH在體外可以和纖維蛋白及凝血酶相結(jié)合，證明本品結(jié)構(gòu)中含有與凝血酶或纖維蛋白結(jié)合的水蛭原保留了其空間構(gòu)象。實(shí)施例12TNHH與凝血酶體外可逆反應(yīng)試驗(yàn)1.試驗(yàn)材料1.1藥物TNHH(3.0mg/ml);凝血酶(127Unit/支，中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)20021105);IMUBINDHirudinELISA(AmericanDiagnosticainc.ProductNo.853》1.2儀器電熱恒溫水浴鍋(XMTB/H-3000上海儀表集團(tuán)有限公司)；UniversalMicroplateReader(Elx國(guó)800，BIO-TEKINSTRUMENTSINC.);離心機(jī)(TGL-16B上海安亭科學(xué)儀器廠)。2.試驗(yàn)方法取人凝血酶1支，加入1.27ml水，混勻得100Unit/ml的溶液；另取TNHH原液用水稀釋成1.0mg/ml后，取0.5ml加入0.1ml凝血酶溶液(50個(gè)單位的凝血酶)，于37t:反應(yīng)2hr，離心收集上清液，用稀釋液(IMUBINDHirudinELISAKit說(shuō)明書(shū)中所述的稀釋液)稀釋10倍后，按4倍梯度稀釋6次后按照IMUBINDHirudinELISAKit使用說(shuō)明書(shū)上方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值。3試驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論樣品均不顯色，水蛭素陽(yáng)性標(biāo)記品(試劑盒自帶)呈線性關(guān)系。說(shuō)明TNHH與凝血酶體外作用是不可逆的。HirudinELISAKit是特異與水蛭素C肽結(jié)合并測(cè)定其濃度的ELISA試劑盒(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附件)，本試劑盒可最低檢測(cè)出0.1ng/ml的水蛭素C肽。根據(jù)Angiomax(二價(jià)水蛭素)的資料其含D-FPRP-4xGly-Himgen的結(jié)構(gòu)中PG之間肽鍵可被凝血酶水解，釋放出含Himgen(水蛭原)的C端肽段。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明，本品TNHH中的"FPRP-GSGG-水蛭原"結(jié)構(gòu)不能被凝血酶酶解，兩者結(jié)合具有不可逆性。實(shí)施例13體外抗血小板凝集試驗(yàn)1試驗(yàn)材料1.1藥物TNHH(6.0mg/ml)人凝血酶(127Unit/支)，批號(hào)20021105，中國(guó)藥品生物制品檢定所。甘露醇注射液(20%甘露醇)，北京雙鶴藥業(yè)。重組水蛭素(1.0mg/支)，批號(hào)20050301，-20°<:保存，富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司。1.2動(dòng)物健康雄性日本大耳白家兔，體重2.32土0.21kg，由第三軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3儀器血小板凝集儀，BS634型，北京生化儀器廠。2.試驗(yàn)方法給藥前穿刺耳中動(dòng)脈測(cè)定血小板聚集率，根據(jù)血小板聚集率水平及體重將兔子隨機(jī)分為5組(每組4只)；①陰性對(duì)照組(5.12mg甘露醇/kg)，②TNHH高劑量組(4.0mg/kg)，③TNHH中劑量組(2.0mg/kg)，TNHH小劑量組(1.0mg/kg),⑤陽(yáng)性對(duì)照組(0.1mg重組水蛭素/kg)。各組家兔均按所述劑量經(jīng)耳緣靜脈注射給藥一次，給藥后15min(秒表準(zhǔn)確計(jì)時(shí))，穿刺耳中動(dòng)脈取血，測(cè)定血小板聚集率。血小板聚集率測(cè)定方法用硅化注射器穿刺耳中動(dòng)脈取血，3.8%枸櫞酸鈉溶液抗凝(血抗凝劑=9:1)，200xg離心8分鐘，取上清即為富血小板血漿(PRP)，剩余部分2200xg離心10分鐘，取上清即為貧血小板血漿(PPP)。PRP中血小板計(jì)數(shù)為4.0xl()S/mm3左右。按照Born氏比濁法，將盛有200plPRP及1小磁棒的比濁管置于血小板聚集儀中，37。C保溫lmin，經(jīng)PPP標(biāo)定后，在攪拌情況下加入誘導(dǎo)劑人凝血酶(0.76IU/ml)誘導(dǎo)聚集。根據(jù)儀器自動(dòng)打印出來(lái)的聚集曲線及最大聚集率分析藥物對(duì)血小板聚集的影響。最大聚集率計(jì)算公式如下聚集后PRP透光度一聚集前PRP透光度inne/PPP透光度一聚集前PRP透過(guò)度3.試驗(yàn)結(jié)果表8TNHH對(duì)家兔血小板聚集率的影響聚集率(％，F(xiàn)±SD)組別劑量(mg/kg)兔數(shù)(只)藥前藥后15min差值甘露醇/4高劑量4.04中劑量2.04小劑量1.04水蛭素0.1458.13±9.6160.51±9.182.38±7.0459.23±6.309.22±4.5150.92±4.33*59.62±7.2219.33±10.2530.30±9.92*57.19±4.4236.27士12.1320.82±7.98*58.44±4.424.34±6.8854.09±8.69**與對(duì)照組(甘露醇)比較尸<0.01由測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)凝血酶誘導(dǎo)家兔血小板聚集時(shí)，給藥前各組間血小板聚集率無(wú)明顯差異，給藥后15min，各給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組水蛭素的血小板聚集率均顯著低于陰性對(duì)照組(PO.01)，且量效關(guān)系明顯。4.結(jié)論上述結(jié)果表明經(jīng)兔耳緣靜脈注射給藥一次，藥后15mhi，TNHH三個(gè)劑量均顯著降低凝血酶誘導(dǎo)的家兔血小板聚集率(尸O.Ol)。提示TNHH具有抑制血小板聚集的作用，但明顯低于陽(yáng)性藥物水蛭素的抑制血小板聚集作用。實(shí)施例14抑制人外周血白細(xì)胞釋放11202試驗(yàn)l.試驗(yàn)材料1.1人外周血白細(xì)胞的制備取健康人靜脈血lOml，肝素鈉抗凝全血，加入10mlHASBuffer(含RPMI1640+10mMHEPES+1.2mMCaCl2+1.0mMMgCl2+1%HAS，pH7.4)混勻。取白細(xì)胞分離液(上海生工)到無(wú)菌離心管中，然后緩慢加入等體積的全血混合液，2000rpm離心15分鐘。取交界處白細(xì)胞液，加入適量1640培養(yǎng)液，于無(wú)菌離心管離心10分鐘，洗滌2次。棄去上清，加入適量HASBuffer,重懸沉淀制成白細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為4xl0"ml，37。C分離后一個(gè)小時(shí)內(nèi)使用。1.2藥物和試劑TNHH(1.0mg/ml，抗白細(xì)胞粘附效價(jià)720單位/ml)，辣根過(guò)氧化氫酶(100單位/mg)，上海生工。FMLP(5mg/支，F(xiàn)3506)，Sigma公司。11202來(lái)源于重慶東試化工公司。釋放分析緩沖液含25mM葡萄糖，10%胎牛血清，200mg/ml酚紅，32mg/ml辣根過(guò)氧化氫酶的Hank's液。1.3儀器UniversalMicroplateReader(Elx-800，BIO-TEKINSTRUMENTSINC.);離心機(jī)(TGL-16B上海安亭科學(xué)儀器廠)。2.試驗(yàn)方法取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含50%胎牛血清的Hank's液包被細(xì)胞培養(yǎng)板，37"C培養(yǎng)60min，再用0.15MNaCl洗板兩次。用釋放分析緩沖液稀釋細(xì)胞至6.0xl06/ml，加細(xì)胞，37。C培養(yǎng)5min。加入FMLP至終濃度250nM。加入不同濃度TNHH供試品，37。C培養(yǎng)60min。吸取細(xì)胞懸浮液8000xg離心3min取上清，復(fù)孔加入96孔酶標(biāo)板后每也加入1NNaOH(25終止反應(yīng)，置610nm波長(zhǎng)讀數(shù)。同時(shí)取標(biāo)準(zhǔn)11202的溶液做對(duì)照，計(jì)算TNHH抑制白細(xì)胞釋放H202的IC5()值。3.試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表9):表9抑制人外周血白細(xì)胞釋放11202試驗(yàn)TNHH濃度(嗎/ml)_平均OD值_抑制率(％)1000.12181.99500.13579.91250.25961.4512.50.31750.826.250.40240.173.1250.51922.761.5620.6286.550.7810.681-1.3對(duì)照0.672&02抑制率-(對(duì)照OD值-樣品OD值)/對(duì)照OD值xiooy。4.結(jié)論表9表明TNHH抑制人外周血白細(xì)胞釋放H2O2的IC50為8.5ng/ml。提示TNHH具有抑制人外周血白細(xì)胞釋放H202的作用，與對(duì)照組相比，抑制率為70%左右。表明本品除可抑制白細(xì)胞粘附作用外，尚可抑制外周血白細(xì)胞的活化功能。實(shí)施例15體外抗全血凝固試驗(yàn)1.試驗(yàn)材料1.1藥物TNHH;肝素鈉，上海生工；磷酸鹽緩沖液(10mmol/LPB，0.15mol/LNaCl，pH7.4)。1.2動(dòng)物一只健康大耳白色家兔，體重2.49kg。1.3儀器兔子固定箱l個(gè)，10ml注射器2支，試管架1個(gè)，試管6支，lml移液槍及槍頭。2.試驗(yàn)方法及結(jié)果2.1樣品稀釋將TNHH用磷酸鹽緩沖液(10mmol/LPB，0.15mol/LNaCl，pH7.4)分別稀釋為4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml。肝素鈉用相同緩沖液配制成1mg/ml。2.2試驗(yàn)方法取新鮮家兔耳緣靜脈血，迅速加lml于0-5號(hào)試管中，將己稀釋好的不同濃度的TNHH樣品分別加0.2ml于l-4號(hào)試管中，0號(hào)試管中加入0.2ml磷酸鹽緩沖液為陰性對(duì)照管，5號(hào)試管中加入0.2ml肝素鈉(1mg/ml)為陽(yáng)性對(duì)照管。迅速混勻后于室溫放置15分鐘，觀察其結(jié)果。3.結(jié)果(表10)表10TNHH體外抗血液凝固試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>4.結(jié)論磷酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照(血液凝固)，肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照(血液未凝固)，不同濃度的TNHH(血液凝固)。上述結(jié)果表明TNHH在體外無(wú)抗全血凝固作用。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。權(quán)利要求1.重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其具有如下結(jié)構(gòu)Met-白細(xì)胞抑制因子-交聯(lián)區(qū)1-FPRP-交聯(lián)區(qū)2-水蛭原。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其中交聯(lián)區(qū)1為5~15的甘氨酸；交聯(lián)區(qū)2為(GSGG)n，n為1~3。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其中FPRP中的F為L(zhǎng)型。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其中交聯(lián)區(qū)1為5個(gè)甘氨酸，交聯(lián)區(qū)2為GSGG。5.權(quán)利要求1至4任一所述的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的cDNA序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，其特征在于該序列為SEQID.2。7.包含權(quán)利要求5或6中所述cDNA的表達(dá)載體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體為pET-3c。9.包含權(quán)利要求7或8所述的表達(dá)載體的微生物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。11.一種藥物組合物，其包括一種權(quán)利要求1至5任一所述的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的組合物，其中所述組合物為注射劑型。13.權(quán)利要求1至5任一所述的重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白在制備治療心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述心腦血管疾病為腦卒中。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)、其cDNA基因、含有該cDNA基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的微生物、以及含有該重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的藥物組合物。文檔編號(hào)A61P9/00GK101245110SQ20071008413公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2007年2月16日優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日發(fā)明者開(kāi)范,趙志全申請(qǐng)人:魯南制藥集團(tuán)股份有限公司;重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司