專利名稱：纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法。具體說是通過對(duì)人體骨結(jié)構(gòu)和功能的仿生模擬，采用纖維蛋白凝膠和鈣磷粒子模擬骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，為骨修復(fù)提供一種制備復(fù)合結(jié)構(gòu)支架的方法。
背景技術(shù)：
骨損傷是目前常見的疾病。由于風(fēng)濕、類風(fēng)濕等各種骨關(guān)節(jié)疾病或運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷所造成的關(guān)節(jié)骨損傷給許多病人帶來痛苦。迄今為止，臨床上仍然缺少有效的方法修復(fù)大尺寸的骨缺損。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)的方法和原理來進(jìn)行骨組織的修復(fù)是目前的一個(gè)重要手段，且取得了良好的效果。其中，骨修復(fù)支架在骨再生中起著十分重要的作用。
骨是一族生物礦物材料的總稱，主要發(fā)育于脊椎動(dòng)物中。雖然每一種類型的骨的結(jié)構(gòu)和組成稍有變化，但都有一個(gè)共同的特點(diǎn)它們主要成分都是由I型膠原纖維、碳羥磷灰石和水組成。骨是最復(fù)雜的生物礦化系統(tǒng)之一，也是最典型的天然有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料。骨中的碳羥磷灰石晶體都是板形的，平均長度和寬度分別為50nm和25nm；晶體厚度極薄，且非常一致，一般1.5nm至4.0nm。骨的主要有機(jī)相為膠原纖維，另外還有少量骨涎酸蛋白、硫酸軟骨素、脂類、肽類等。膠原纖維中的原膠原分子具有三重螺旋結(jié)構(gòu)，骨中的礦物相位于原膠原分子間的間隙孔內(nèi)，排列成層，構(gòu)成骨的基本結(jié)構(gòu)。
模仿天然骨的成分及結(jié)構(gòu)特征制造的骨替代材料，可為細(xì)胞提供與天然骨相類似的微環(huán)境。這有助于骨系細(xì)胞的粘附、增殖及功能發(fā)揮。這種材料不僅可直接作為骨缺損修復(fù)材料，也是優(yōu)異的骨組織工程載體材料，尤其適用于無需承力的骨組織部位。
傳統(tǒng)的骨修復(fù)材料難以在較小的尺度上原位實(shí)現(xiàn)受損骨的修復(fù)。手術(shù)的可操作性同樣限制了大尺度材料在微創(chuàng)部位的應(yīng)用。近年來，注射型水凝膠材料由于其體內(nèi)培養(yǎng)和微創(chuàng)修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注。水凝膠的前驅(qū)物均為溶液狀態(tài)，極易注射，在物理或者化學(xué)刺激下在體內(nèi)能夠快速成型。模擬天然骨組織的化學(xué)組成，將纖維蛋白凝膠和鈣磷納米粒子混合，制備復(fù)合型的可注射凝膠，利用液態(tài)的水凝膠前驅(qū)物為運(yùn)輸載體注射到體內(nèi)受損部位后，前驅(qū)物在體內(nèi)快速固化形成凝膠。纖維蛋白凝膠的強(qiáng)大的粘結(jié)作用，可以有效地粘結(jié)受損的骨組織，為骨組織的再生提供良好的微環(huán)境。同時(shí)鈣磷納米粒子更有利于成骨細(xì)胞的生長，促進(jìn)成骨細(xì)胞活性的正常表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在體內(nèi)快速成型并快速粘結(jié)受損的組織，為受損的骨組織提供良好的微環(huán)境并且能夠有效地促進(jìn)骨細(xì)胞的遷移、生長與分化，促進(jìn)受損骨修復(fù)的纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法。
本發(fā)明的纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法，其制備過程包括以下步驟1)將氯化鈣和磷酸氫二氨分別溶解在50g/L聚乙烯醇水溶液中，分別配制濃度為0.1mol/L的磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液和濃度為0.1mol/L的氯化鈣的聚乙烯醇水溶液；將磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液加入到氯化鈣的聚乙烯醇水溶液中，攪拌混合；磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液與氯化鈣的聚乙烯醇水溶液的體積比為0.6或0.67；調(diào)節(jié)pH值至11；在0℃水浴中反應(yīng)至少15分鐘，陳化至少48小時(shí)，得非晶態(tài)的鈣磷粒子；2)將非晶態(tài)的鈣磷粒子在900℃煅燒至少6小時(shí)，再超聲振蕩5～15分鐘，得分散的晶態(tài)鈣磷納米粒子；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，于37℃恒溫水浴中孵育，使纖維蛋白原充分溶解，纖維蛋白原溶液的濃度為10～40mg/ml；將凝血酶溶解于濃度為40mM氯化鈣溶液中，放入37℃恒溫水浴中孵育，配制成濃度為10～40U/ml的溶液；4)將步驟2)獲得的晶態(tài)鈣磷納米粒子與纖維蛋白原溶液混合，其中晶態(tài)鈣磷納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為1.5％～6％，在振蕩器上震蕩使鈣磷納米粒子均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有晶態(tài)鈣磷納米粒子的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積均勻混合，放入37℃恒溫烘箱中孵育2～5分鐘，促使纖維蛋白原交聯(lián)，形成凝膠，得到纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架。
上述步驟2)得到的晶態(tài)鈣磷納米粒子是指晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子或β晶型磷酸鈣納米粒子。
本發(fā)明的有益效果在于采用了纖維蛋白凝膠為輸運(yùn)載體，以混合的方法將鈣磷納米粒子引入到纖維蛋白凝膠體系中，得到具有復(fù)合結(jié)構(gòu)的可注射型支架。纖維蛋白凝膠具有良好的粘結(jié)性能，鈣磷納米粒子能夠有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞的正常生長和功能表達(dá)。本發(fā)明的支架具有微創(chuàng)修復(fù)、生物相容性好、綜合性能優(yōu)良和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，有利于提高骨組織的修復(fù)效率。材料的制備方法簡單、材料來源廣泛、生產(chǎn)效率高，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是非晶態(tài)磷酸鈣粒子的掃描電鏡照片；圖2是非晶態(tài)磷酸鈣粒子的X射線衍射圖；圖3是β晶型磷酸鈣納米粒子的X射線衍射圖；圖4是β晶型磷酸鈣納米粒子的掃描電鏡照片；圖5是β晶型磷酸鈣納米粒子的透射電鏡照片；圖6是纖維蛋白凝膠復(fù)合β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架的掃描電鏡照片(β晶型磷酸鈣納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為6％)；圖7是纖維蛋白凝膠復(fù)合β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架的透射電鏡照片(β晶型磷酸鈣納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為6％)；圖8是纖維蛋白凝膠復(fù)合β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架的動(dòng)態(tài)粘彈性能隨β晶型磷酸鈣納米粒子加入量的變化曲線；圖9是晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子的透射電鏡照片。
具體實(shí)施方法以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來限制本發(fā)明。
實(shí)例11)將氯化鈣和磷酸氫二氨分別溶解在50g/L的聚乙烯醇水溶液中，分別配制成濃度為0.1mol/L的磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液和氯化鈣的聚乙烯醇水溶液；將磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液加入到氯化鈣的聚乙烯醇水溶液中，攪拌速度為750轉(zhuǎn)/分；磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液與氯化鈣的聚乙烯醇水溶液的體積比為0.67；用氫氧化鈉將此混合溶液的pH值調(diào)節(jié)到11后，在0℃水浴中反應(yīng)15分鐘后，陳化48小時(shí)，即獲得非晶態(tài)的磷酸鈣粒子。圖1是非晶態(tài)磷酸鈣粒子的掃描電鏡照片；圖2是非晶態(tài)磷酸鈣粒子的X射線衍射圖；2)將非晶態(tài)的磷酸鈣粒子在900℃的高溫烘箱中煅燒6小時(shí)，然后超聲振蕩處理5分鐘，即獲得β晶型的磷酸鈣納米粒子；圖3是β晶型磷酸鈣納米粒子的X射線衍射圖；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，于37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，使纖維蛋白原充分溶解，纖維蛋白原溶液的濃度為10mg/ml；將凝血酶溶解于40mM氯化鈣溶液中，放入37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，配制成10U/ml的溶液；4)將步驟2)所獲得的β晶型磷酸鈣納米粒子與纖維蛋白原溶液混合，其中β晶型磷酸鈣納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為1.5％，在振蕩器上震蕩使β晶型磷酸鈣納米粒子均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有β晶型磷酸鈣納米粒子的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積均勻混合，放入37℃恒溫烘箱中孵育2分鐘，促使纖維蛋白原交聯(lián)，形成凝膠，即獲得纖維蛋白凝膠與β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架。
實(shí)例2步驟1)同實(shí)例1的步驟1)；步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，制備了β晶型磷酸鈣納米粒子，但煅燒時(shí)間為8小時(shí)；其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例3步驟1)同實(shí)例1的步驟1)；步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，制備了β晶型磷酸鈣納米粒子，但超聲處理時(shí)間為15分鐘；圖4為β晶型磷酸鈣納米粒子的掃描電鏡照片；圖5為β晶型磷酸鈣納米粒子的透射電鏡照片；其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例4步驟1)～2)同實(shí)例3的步驟1)～2)；步驟3)同實(shí)例1的步驟3)，但纖維蛋白原溶液的濃度為40mg/ml；其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例5步驟1)～2)同實(shí)例3的步驟1)～2)；步驟3)同實(shí)例4的步驟3)，但凝血酶溶液的濃度為40U/ml；其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例6步驟1)～3)同實(shí)例1的步驟1)～3)；步驟4)同實(shí)例1的步驟4)，但凝膠時(shí)間為5分鐘。
實(shí)例7步驟1)～3)同實(shí)例5的步驟1)～3)。
步驟4)同實(shí)例1的步驟4)，但β晶型磷酸鈣納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為1.5％、3％或6％；圖6為纖維蛋白凝膠復(fù)合β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架的掃描電鏡照片(β晶型磷酸鈣納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為6％)；圖7為纖維蛋白凝膠復(fù)合β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架的透射電鏡照片(β晶型磷酸鈣納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為6％)；圖8為纖維蛋白凝膠復(fù)合β晶型磷酸鈣納米粒子復(fù)合支架的動(dòng)態(tài)粘彈性能隨β晶型磷酸鈣納米粒子加入量的變化曲線。
實(shí)例81)同實(shí)例1的步驟1)，但磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液與氯化鈣的聚乙烯醇水溶液的體積比固定為0.6，制備了非晶態(tài)的羥基磷灰石粒子；2)將非晶態(tài)的羥基磷灰石粒子在900℃的高溫烘箱中煅燒6小時(shí)，再通過超聲處理5分鐘后，即獲得晶態(tài)的羥基磷灰石納米粒子；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，于37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，使纖維蛋白原充分溶解，纖維蛋白原溶液的濃度為10mg/ml；將凝血酶溶解于40mM氯化鈣溶液中，放入37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，配制成10U/ml的溶液；4)將步驟2)所獲得的晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子與纖維蛋白原溶液混合，其中羥基磷灰石納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為1.5％，在振蕩器上震蕩使晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積均勻混合，放入37℃恒溫烘箱中孵育2分鐘，促使纖維蛋白原交聯(lián)，形成凝膠，即獲得纖維蛋白凝膠與晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子復(fù)合支架。
實(shí)例9步驟1)同實(shí)例8的步驟1)；步驟2)同實(shí)例8的步驟2)，但煅燒時(shí)間為8小時(shí)，制備了晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子；其余步驟同實(shí)例8。
實(shí)例10步驟1)同實(shí)例8的步驟1)；步驟2)同實(shí)例8的步驟2)，制備了晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子，但超聲時(shí)間為15分鐘；其余步驟同實(shí)例8；圖9為晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子的透射電鏡圖。
實(shí)例11步驟1)～2)同實(shí)例10的步驟1)～2)；步驟3)同實(shí)例8的步驟3)，但纖維蛋白原溶液的濃度為40mg/ml；其余步驟同實(shí)例8。
實(shí)例12步驟1)～2)同實(shí)例10的步驟1)～2)；步驟3)同實(shí)例11的步驟3)，但凝血酶溶液的濃度為40U/ml；其余步驟同實(shí)例8。
實(shí)例13
步驟1)～3)同實(shí)例8的步驟1)～3)；步驟4)同實(shí)例8的步驟4)，但凝膠時(shí)間為5分鐘。
實(shí)例14步驟1)～3)同實(shí)例12的步驟1)～3)；步驟4)同實(shí)例8的步驟4)，但晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為6％。
權(quán)利要求
1.一種纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法，其制備過程包括以下步驟1)將氯化鈣和磷酸氫二氨分別溶解在50g/L聚乙烯醇水溶液中，分別配制濃度為0.1mol/L的磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液和濃度為0.1mol/L的氯化鈣的聚乙烯醇水溶液；將磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液加入到氯化鈣的聚乙烯醇水溶液中，攪拌混合；磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液與氯化鈣的聚乙烯醇水溶液的體積比為0.6或0.67；調(diào)節(jié)pH值至11；在0℃水浴中反應(yīng)至少15分鐘，陳化至少48小時(shí)，得非晶態(tài)的鈣磷粒子；2)將非晶態(tài)的鈣磷粒子在900℃煅燒至少6小時(shí)，再超聲振蕩5～15分鐘，得分散的晶態(tài)鈣磷納米粒子；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，于37℃恒溫水浴中孵育，使纖維蛋白原充分溶解，纖維蛋白原溶液的濃度為10～40mg/ml；將凝血酶溶解于濃度為40mM氯化鈣溶液中，放入37℃恒溫水浴中孵育，配制成濃度為10～40U/ml的溶液；4)將步驟2)獲得的晶態(tài)鈣磷納米粒子與纖維蛋白原溶液混合，其中晶態(tài)鈣磷納米粒子的最終質(zhì)量百分濃度為1.5％～6％，在振蕩器上震蕩使鈣磷納米粒子均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有晶態(tài)鈣磷納米粒子的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積均勻混合，放入37℃恒溫烘箱中孵育2～5分鐘，促使纖維蛋白原交聯(lián)，形成凝膠，得到纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架。
2.按權(quán)利要求1所述的纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法，其特征在于步驟2)得到的晶態(tài)鈣磷納米粒子是指晶態(tài)羥基磷灰石納米粒子或β晶型磷酸鈣納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開了纖維蛋白凝膠與鈣磷納米粒子復(fù)合支架的制備方法，步驟包括1)分別配制磷酸氫二氨的聚乙烯醇水溶液和氯化鈣的聚乙烯醇水溶液；將上述兩種水溶液混合，得非晶態(tài)的鈣磷粒子；2)煅燒非晶態(tài)的鈣磷納米粒子，超聲振蕩，得分散的晶態(tài)鈣磷納米粒子；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中；將凝血酶溶解于氯化鈣溶液中；4)將晶態(tài)鈣磷納米粒子均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后與凝血酶溶液混合，在37℃恒溫孵育形成凝膠。本發(fā)明以纖維蛋白凝膠為輸運(yùn)載體，采用混合的方法將鈣磷納米粒子引入到纖維蛋白凝膠體系中，得到復(fù)合結(jié)構(gòu)的可注射型支架，具有微創(chuàng)修復(fù)、生物相容好和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，利于提高骨組織的修復(fù)效率。本發(fā)明制備方法簡單，材料來源廣泛。
文檔編號(hào)A61L27/46GK101066473SQ200710069109
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者高長有, 馬列, 趙海光, 沈家驄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)