專(zhuān)利名稱(chēng)：：含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗腫瘤藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物，具體是關(guān)于一種含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
：枸骨，是為常綠灌木或小喬木，生于山坡、谷地、溪邊雜木林及灌叢中，分布于長(zhǎng)江中下游。學(xué)名llexcomutaLindl，英文名HornyHolly;ChineseHolyLeaf,科名:冬青科Aquifoliaceae，別名鳥(niǎo)不宿，功勞葉、苦丁茶、八角刺，貓兒刺，枸骨刺，八角茶，老鼠剌，老虎刺，狗青窮，羊角刺。從枸骨中分離得到的化合物分別為枸骨甙l(fā)(坡摸酸3-P-O-a-L-吡喃阿拉伯糖甙)，枸骨甙2(3-P-O-D-吡喃葡萄糖基坡摸酸-3-28-0-D-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙3(3-0-O-(P-D-吡喃葡萄糖基)-a-L-吡喃葡萄糖基坡摸酸-3-28-0-D-吡喃葡萄糖酯的類(lèi)似物)，枸骨甙4(3-6-0-(卜0-吡喃葡萄糖基)-(1-L-吡喃葡萄糖基坡摸酸-0-28-0。-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙5(坡摸酸3-P-O-a-L-2'-乙酰氧基吡喃阿拉伯糖基-28-0-卩-0-吡喃葡萄糖酯),枸骨甙6(3-p_0_(p-D-吡喃葡萄糖基)-a-L-4-乙酰氧基吡喃阿拉伯糖基坡摸酸-P-28-O-D-吡喃葡萄糖酯)；枸骨甙7(3-P-O-a丄-卩比喃阿拉伯糖基-28-0-P-D-吡喃葡萄糖酯)，胡蘿卜甙，4-二羥基苯甲酸，4-二羥基桂皮酸，長(zhǎng)鏈脂肪酸或醇5個(gè),羽扇豆醇，ll-酮基-a-香樹(shù)脂醇棕櫚酸酯,a-香樹(shù)脂醇棕櫚酸酯，3，28-烏索酸二醇，熊果酸，30-醛基羽扇豆醇，30-酮基降羽扇豆醇，鏈狀倍半萜，甾醇0-谷甾醇，正二十二垸酸，正二十六烷酸，七葉內(nèi)酯，槲皮氣異鼠李素，金絲桃苷，3-0-a丄-阿拉伯吡喃糖-28-0-6'-0-甲基葡萄糖坡摸醇酸苷,23-羥基烏索酸_3-0-a丄-阿拉伯吡喃糖(1—2)P-0-葡萄糖醛酸-28-0-3-D-葡萄糖苷，6、7-二甲氧基香豆素，咖啡堿，皂甙，鞣質(zhì)和苦味質(zhì)(李維林等，植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003年02期，45-57;吳鼓等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2005年，19期，67-72)。文獻(xiàn)報(bào)道整個(gè)枸骨植物是墮胎藥、驅(qū)風(fēng)劑，避孕藥、退熱藥和補(bǔ)藥；能治療關(guān)節(jié)炎，肺結(jié)核，淋巴結(jié)核和腰痛；葉能補(bǔ)肝腎，養(yǎng)氣血，祛風(fēng)濕，用于肺癆咳嗽、勞傷失血、腰膝痿弱、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷,肺結(jié)核潮熱和咯血;枸骨莖是滋補(bǔ)藥;果實(shí)常用于白帶過(guò)多和慢性腹瀉;根常用治風(fēng)濕痛和黃疽肝炎(閻玉凝等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2000年zl期，25-38;王亞娜等，中草藥，1997，28(Suppl.):H7;李維林等，中藥材，2003，26(8):595-598);枸骨葉脂溶性化學(xué)成分具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用(吳撥等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2005年，19期，67-72)。枸骨的水及醇浸液或其他有關(guān)制劑給小鼠灌胃，皆可使之減少懷孕，抑孕率為80100%;陰道涂片法證明，枸骨能使小鼠正常性周期發(fā)生改變，主要是使休息期延長(zhǎng)，其次是超越或縮短動(dòng)情期；枸骨葉的醇提物(綠色粉狀物，有甙的反應(yīng))有避孕作用，組織切片未發(fā)現(xiàn)子宮及卵巢的病理變化，故認(rèn)為是生理性避孕(魏成武，中藥通報(bào)，1988,13(5):48)。枸骨葉的醇提物I、乙酸乙酯萃取物II、正丁醇萃取物III具有明顯抑制ConA刺激T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用；枸骨葉醇提物I與乙酸乙酯萃取物II能明顯抑制ConA刺激T淋巴細(xì)胞CD69分子的表達(dá)；枸骨葉水提物無(wú)免疫抑制作用；結(jié)論是枸骨葉脂溶性萃取物具有較強(qiáng)抑制T淋巴細(xì)胞活化、增殖的化學(xué)成分(林晨等，暨南大學(xué)學(xué)報(bào)；自然科學(xué)版，2006Vol.27No.2P.199-203)。枸骨葉不同溶劑提取物的體外抑菌活性結(jié)果表明枸骨葉中的3種溶劑組分均顯示一定的抑菌效果，其乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌效果最為顯著；醇提取物和正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌也顯示較好的抑菌效果；枸骨葉脂溶劑萃取物成分對(duì)病原性念珠菌的生長(zhǎng)有一定的抑菌活性(邢瑩瑩等，暨南大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2004，25(1):119-121;張晶等，中國(guó)病理生理雜志，2003,19(11);1562;林晨等，中國(guó)人獸共患病雜志，2005年09期，186)。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，枸骨水提取物或枸骨醇提取物具有抗腫瘤的活性，能開(kāi)發(fā)成新的抗腫瘤藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗腫瘤藥物，它是以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作為有效成分的抗腫瘤藥物。抗腫瘤藥物中含有抗腫瘤有效量的枸骨水提取物或枸骨醇提取物及可藥用載體和/或賦形劑。可藥用載體和/或賦形劑可以是PBS、生理鹽水、玉米油、5-30。/。Captisol等。本發(fā)明人通過(guò)試驗(yàn)證明枸骨水提取物或枸骨醇提取物能廣泛抑制多種類(lèi)型的人腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在人腫瘤異種移植模型研究中，枸骨水提取物或醇提取物被證明是一種有效的抗腫瘤劑，能強(qiáng)烈抑制人子宮肉瘤，前列腺癌，肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)。枸骨水提取物或枸骨醇提取物具有被開(kāi)發(fā)成為新的廣譜抗腫瘤藥物的巨大潛力。枸骨水提取物或枸骨醇提取物的制備方法(參見(jiàn)秦文娟等，中草藥，1988，19(10):2)。藥物原材料采集枸骨全株植物，包括有枸骨葉，枸骨莖和枸骨根。將枸骨全株植物洗凈，曬干，切片和粉碎，粉碎后達(dá)100-500目。然后取粉碎的枸骨全株植物500克，分別采用水提和醇提方法對(duì)所述枸骨生藥進(jìn)行加工處理枸骨水提取物的制備用水提法，將粉碎的枸骨生藥500克，在(5-20升)蒸餾水中浸泡過(guò)夜，第二天將該浸泡的枸骨液煮沸提取5小時(shí)，然后用多層(4-12層)紗布過(guò)濾水提液，并將水提液加熱濃縮到50-200毫升體積后，離心(10000g)去渣，上清液通過(guò)0.2微米孔徑的濾膜過(guò)濾，然后將濾液經(jīng)低溫干燥(-14(TC)或熱噴霧(15(TC-19(rC)干燥，即得水提取物。枸骨水提取物為綠色粉末，在水中溶解度為500mg/ml。枸骨醇提取物的制備用醇提法，同樣取上述粉碎好的枸骨生藥500克浸泡在5升(2-10升)95%醫(yī)用乙醇(酒精)中，浸泡(3小時(shí)-5天)后，將乙醇浸泡液用多層(4-12層)紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，當(dāng)乙醇提取物濃縮到100-200毫升體積后，離心(10000g)，上清液通過(guò)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，然后將濾液低溫干燥(-14(TC)即得醇提取物。枸骨醇提取物為深綠色粉末，在乙醇中溶解度為80mg/ml。枸骨水提取物或枸骨醇提取物的藥理試驗(yàn)1.體外試驗(yàn)(1)使用人腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)在含有不同濃度枸骨水提取物或枸骨醇提取物的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)29種腫瘤細(xì)胞株，3天后應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活情況。結(jié)果(表1)顯示大多數(shù)人體腫瘤細(xì)胞對(duì)枸骨水提取物或枸骨醇提取物敏感。有些腫瘤細(xì)胞對(duì)枸骨水提取物或枸骨醇提取物的EC50低于0.1mg/ml。但是，正常人乳腺上皮細(xì)胞(MCF10a)對(duì)枸骨水提取物或枸骨醇提取物不敏感，即便枸骨水提取物或枸骨醇提取物的濃度高達(dá)10mg/ml,這些細(xì)胞仍然生長(zhǎng)良好。體外試驗(yàn)證明枸骨水提取物或枸骨醇提取物能廣泛抑制人體腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)正常細(xì)胞株沒(méi)有作用。表1枸骨水提取物或枸骨醇提取物體外抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)枸骨水提取物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期試驗(yàn)為了研究枸骨水提取物是否具有抑制腫瘤生長(zhǎng)周期作用，對(duì)枸骨水提取物抑制人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)周期作用進(jìn)行試驗(yàn)。分別加入濃度為0mg/ml，0.033mg/ml或O.lmg/ml枸骨水提取物。試驗(yàn)結(jié)果如圖1-圖3所示，枸骨水提取物能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停留在G1期。(3)枸骨水提取物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡試驗(yàn)為了研究枸骨水提取物是否具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，采用AnnexinV(AV)和7-ADD聯(lián)合染色法檢測(cè)枸骨水提取物處理后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期的細(xì)胞的胞膜結(jié)合，因此AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。本發(fā)明對(duì)枸骨水提取物誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A459細(xì)胞凋亡進(jìn)行試驗(yàn)，分別加入濃度為0毫克/毫升，0.033毫克/毫升，0.1毫克/毫升枸骨水提取物樣品，經(jīng)培養(yǎng)，消化，反應(yīng)后，在細(xì)胞流動(dòng)儀(FACS)上分析。對(duì)照組為未經(jīng)處理的細(xì)胞對(duì)照,排除自發(fā)凋亡;不加染色劑的對(duì)照；只加AV的對(duì)照；只加7—ADD的對(duì)照。結(jié)果判斷正常細(xì)胞AnnexinV和7—AAD均低染，凋亡細(xì)胞AnnexinV高染，7—AAD低染，壞死細(xì)胞AnnexinV和7—AAD均高染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示枸骨水提取物具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。(4)枸骨水提取物含有抗癌活性成分的分析試驗(yàn)取枸骨水提取物樣品上柱葡聚糖凝膠SephadexLH-20色譜分離柱，共收集16個(gè)分離組份(這16個(gè)分離組分都是含有不同化合物的混合物)，減壓濃縮干燥后，各自用1毫升生理鹽水溶解并進(jìn)行檢測(cè)是否含有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離組份3，分離組份7，分離組份9，分離組份11和分離組份13都具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，而且還發(fā)現(xiàn)這些組份混合在一起具有強(qiáng)大的協(xié)同作用。這一結(jié)果說(shuō)明枸骨水提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個(gè)至少由5種以上的有機(jī)化合物所組成的混合物。(5)枸骨醇提取物含有抗癌活性成分的分析試驗(yàn)取枸骨醇提取物樣品減壓濃縮成膠狀物，然后逐次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇和乙醇進(jìn)行抽提，各有機(jī)溶劑抽提液(這些抽提液樣本也都是含有多種化合物的混合物)減壓，濃縮和干燥，并各自用0.5毫升二甲基亞砜溶解，然后檢測(cè)是否含有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性成分，結(jié)果石油醚和乙酸乙酯抽提物都含有抗腫瘤的有效成份，這一結(jié)果說(shuō)明枸骨醇提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個(gè)至少由2種以上的有機(jī)化合物所組成的混合物。2.應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠模型進(jìn)行枸骨水提取物的抗腫瘤有效性試驗(yàn)在枸骨水提取物有效抑制多種腫瘤細(xì)胞體外增殖的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠(皮下接種)評(píng)價(jià)枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液的抗腫瘤作用，受試的腫瘤細(xì)胞包括人前列腺癌細(xì)胞LnCAP，人肺癌細(xì)胞NCI-H23，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和人子宮肉瘤細(xì)胞MES-SA。結(jié)果(圖5-圖8)顯示，枸骨水提取物注射液強(qiáng)烈抑制這四種腫瘤生長(zhǎng)，其TGI值分別為25.8%,37%，40.8%，和19.8%。同樣也發(fā)現(xiàn)枸骨水提取物口服液能非常有效地抑制這四種腫瘤生長(zhǎng)，其TGI值分別為33.8%，48.4%，48.7%,和24.2%。同時(shí)未發(fā)現(xiàn)枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液具有明顯的副作用，包括體重的變化。這些數(shù)據(jù)明顯提示，枸骨水提取物和枸骨醇提取物是開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物很好的候選物。3.枸骨水提取物給藥后對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)受試小鼠處死后，進(jìn)行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量15g/Kg或多次劑量3g/kg(QDX15)灌胃給予枸骨水提取物口服液，或以單次劑量1.5g/kg或多次劑量0.3g/kg(QDX15)尾靜脈注射給予枸骨水提取物注射液，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。4.枸骨醇提取物給藥后對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)受試小鼠處死后進(jìn)行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量1.5g/kg或多次劑量0.3g/kg(QDX15)給予枸骨醇提取物口服液或枸骨醇提取物注射液，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。由以上藥理試驗(yàn)的效果證明，枸骨水提取物或枸骨醇提取物對(duì)29種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示有廣譜的抗腫瘤作用；枸骨水提取物能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停留在Gl期；枸骨水提取物具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力；在人腫瘤移植裸鼠模型試驗(yàn)中，枸骨水提取物顯示出對(duì)人前列腺癌細(xì)胞LnCAP、人肺癌細(xì)胞NCI-H23、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和人子宮內(nèi)瘤細(xì)胞MES-SA有強(qiáng)烈的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)未有明顯的副作用；對(duì)小鼠的急性毒理試驗(yàn)也顯示未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。因此枸骨水提取物或枸骨醇提取物是具有很大開(kāi)發(fā)前景的廣譜抗腫瘤新藥，枸骨水提取物或枸骨醇提取物可作為抗腫瘤藥物的原料藥，優(yōu)先作為抗惡性實(shí)體瘤藥物的原料藥，枸骨水提取物或枸骨醇提取物也可與可藥用載體和/或賦形劑制成抗腫瘤藥物。所述可藥用載體和/或賦形劑例如PBS，生理鹽水，玉米油，5-30。/。Captisol等。枸骨水提取物或枸骨醇提取物在應(yīng)用時(shí)，可采用常規(guī)方法，分別制成口服液或注射液枸骨水提取物口服液制備取制得的枸骨水提取物樣品，溶解于蒸餾水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，濃縮成每毫升含300毫克干重枸骨根水提取物，滅菌，即為口服液。枸骨水提取物注射液制備取制得的枸骨水提取物樣品，經(jīng)多次反復(fù)90%酒精沉淀(酒精沉淀的目的是沉淀掉植物粘多糖化合物，植物多肽或植物蛋白，這些物質(zhì)在配制注射液時(shí)都會(huì)造成受試動(dòng)物發(fā)生變態(tài)反應(yīng))，其上清液經(jīng)減壓濃縮回收酒精，最后冷凍(-14(TC斤燥，將干燥物溶解在生理鹽水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，濃縮成每毫升含30毫克干重枸骨水提取物，滅菌，即為注射液。枸骨醇提取物口服液制備取制得的枸骨醇提取物樣品，用精制玉米油溶解，配制成每毫升精制玉米油含30毫克干重枸骨醇提取物，最后經(jīng)高溫(IO(TC)消毒30分鐘后，即得枸骨醇提取物的口服液。枸骨醇提取物注射液制備取制得的枸骨醇提取物樣品，溶解于15%Captisol中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，濃縮成每毫升15%Captisol含30毫克干重枸骨醇提取物，再滅菌消毒，即得枸骨醇提取物的注射液。枸骨水提取物口服液有效劑量為每天15g干重枸骨水提取物/體表面積m2,連續(xù)三周，休息一周為一療程。枸骨水提取物注射液一般靜脈滴注有效劑量為每天1.5g干重枸骨水提取物/體表面積m2,連續(xù)三周，休息一周為一療程。枸骨水提取物口服液或枸骨水提取物注射液每天總劑量一次于早餐后半小時(shí)服用或注射用，具體病例可由醫(yī)師根據(jù)病情調(diào)整。圖1是枸骨水提取物抑制人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)并將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停留在G1期(16小時(shí))的示圖。圖2是枸骨水提取物抑制人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)并將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停留在G1期(24小時(shí))的示圖。圖3是枸骨水提取物抑制人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)并將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停留在G1期(36小時(shí))的示圖。圖4是枸骨水提取物誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡(18小時(shí))的示圖，圖中R2代表活細(xì)胞染色R3代理凋亡細(xì)胞染色。圖5枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人前列腺癌(LnCAP)腫瘤細(xì)胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖6是枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人肺癌(NCI-H23)腫瘤細(xì)胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖7是枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人結(jié)腸癌(HCT-116)腫瘤細(xì)胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖8是枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人子宮內(nèi)瘤(MES-SA)腫瘤細(xì)胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1枸骨水提取物的制備(參見(jiàn)秦文娟等，中草藥，1988，19(10):2)藥物原材料采集生長(zhǎng)在廣東省英德縣的枸骨全株植物，包括有枸骨葉，枸骨莖和枸骨根。將枸骨全株植物洗凈、曬干，切片和粉碎，粉碎后達(dá)300目。然后取粉碎的枸骨全株植物500克，浸泡在10升蒸餾水中過(guò)夜，第二天將該浸泡的枸骨液煮沸提取5小時(shí)，然后用IO層紗布過(guò)濾水提液，并將水提液加熱濃縮到100ml體積后，經(jīng)10000g離心速度離心去渣。上清液通過(guò)0.2微米孔徑的濾膜過(guò)濾，然后將濾液經(jīng)低溫干燥(-140°C)12小時(shí)或熱噴霧法170'C干燥，即得綠色粉末枸骨水提取物15克。實(shí)施例2枸骨醇提取物的制備(參見(jiàn)秦文娟等，中草藥，1988，19(10):2)藥材原材料的采集，洗凈，曬干，切片和粉碎同實(shí)施例l，取粉碎的枸骨全株植物500克，浸泡在5升95%醫(yī)用乙醇(酒精)中，浸泡2天后將乙醇浸泡液用IO層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，當(dāng)乙醇提取物濃縮到150毫升體積后，10000g離心，上清液通過(guò)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，然后將濾液低溫干燥(-14(TC)，即得深綠色粉末的枸骨醇提取物2克。實(shí)施例3枸骨水提取物口服液的制備取實(shí)施例1制得的枸骨水提取物樣品60克，溶解于300ml蒸餾水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，濃縮成每毫升含300mg干重的枸骨水提取物，滅菌，共得200毫升的口服液，分裝入瓶。實(shí)施例4枸骨水提取物注射液的制備取實(shí)施例1制得的枸骨水提取物樣品60克，經(jīng)3次(每次1000ml)90%酒精沉淀，其上清液合并，經(jīng)減壓濃縮回收酒精，最后冷凍(-140°C)干燥，將干燥物溶解在30ml生理鹽水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，濃縮成每毫升生理鹽水含30毫克干重枸骨水提取物，滅菌，共得20毫升注射液，分裝入安瓿瓶。實(shí)施例5枸骨醇提取物口服液的制備取實(shí)施例2制得的枸骨醇提取物樣品30克，用950毫升精制玉米油溶解，配制成每毫升精制玉米油含30毫克干重物枸骨醇提取物，經(jīng)高溫10(TC消毒30分鐘后，共得1000毫升的口服液，分裝入瓶。實(shí)施例6枸骨醇提取物注射液的制備取實(shí)施例2制得的枸骨醇提取物樣品30克，用950毫升15%Captisol溶解，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過(guò)濾，濃縮成每毫升15%Captisol含30毫克干重枸骨醇提取物，滅菌消毒，共得1000毫升注射液，分裝入安瓿瓶。實(shí)施例7細(xì)胞毒性試驗(yàn)(參見(jiàn)CarmichaelJetal.，CancerResearch,1987,47:943-946)使用人腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。人腫瘤細(xì)胞系購(gòu)自ATCC(美國(guó)細(xì)胞菌種庫(kù))和NCI(美國(guó)國(guó)立癌癥研究所)，用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)液，在含5%(:02的37"C孵箱中培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化匯合的細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后計(jì)數(shù)。向96孔培養(yǎng)板的每孔中加入30006000個(gè)細(xì)胞，孵育16小時(shí)或24小時(shí)。然后向孔內(nèi)加入不同濃度的枸骨水提取物或枸骨醇提取物。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，對(duì)藥物處理組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行MTT試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表l。實(shí)施例8枸骨水提取物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期試驗(yàn)(參見(jiàn)BasuS，etal.,GlycoconjJ.2004;20(9):563-77)首先在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔種植2乂105人體肺癌細(xì)胞A549，24小時(shí)后，分別加入Omg/ml，0.033mg/ml或0.1mg/ml枸骨水提取物樣品，并繼續(xù)在37t;，5。/。C02條件下培養(yǎng)16小時(shí)，24小時(shí)或36小時(shí)，在終止每組培養(yǎng)前4小時(shí)，加入BrdU，BrdU最終濃度為20uM，當(dāng)細(xì)胞終止培養(yǎng)后，及時(shí)將細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2次，然后經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，再次用PBS洗滌一次，之后用冷卻的70%乙醇固定細(xì)胞一個(gè)小時(shí)。固定好的細(xì)胞離心收集并懸浮在2N鹽酸，在室溫溫育30分鐘，過(guò)后這些細(xì)胞用PBS洗滌3次，處理好的細(xì)胞與1微克抗BrdU抗體反應(yīng)30分鐘(美國(guó)腫瘤基因公司購(gòu)買(mǎi))，然后用PBS洗滌這些細(xì)胞2次，再與2微克異硫氰酸熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)腫瘤基因公司)在室溫反應(yīng)30分鐘，二抗反應(yīng)后用PBS洗滌細(xì)胞2次，過(guò)后這些細(xì)胞與4微克核苷核酸酶A(購(gòu)買(mǎi)美羅斯應(yīng)用科技公司)在室溫溫育30分鐘，最后每管樣品加入碘化丙啶，最終濃度為每毫升含20微克碘化丙啶，并在室溫條件下反應(yīng)30分鐘，這些處理好的細(xì)胞馬上用美國(guó)BectonDickinson生產(chǎn)的FACscan細(xì)胞流動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定分析，其結(jié)果量化分析采用美國(guó)多功能軟件大廈生產(chǎn)的WINLIST軟件程序。結(jié)果見(jiàn)圖1-圖3。實(shí)施例9枸骨水提取物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡試驗(yàn)(參見(jiàn)WickW，etal.，JPharmacolExpTher.1999Jun;289(3):1306-12)采用AnnexinV(AV)和7—ADD聯(lián)合染色法檢測(cè)枸骨水提取物處理后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期的細(xì)胞的胞膜結(jié)合，因此AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。在進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先在100厘米直徑的培養(yǎng)皿中種植1X10S人體肺癌A549細(xì)胞，24小時(shí)后分別加入濃度為0毫克/毫升，0.033毫克/毫升，0.1毫克/毫升枸骨水提取物樣品，并繼續(xù)在37'C，5XC02條件下培養(yǎng)18小時(shí)，然后終止細(xì)胞培養(yǎng)，并用PBS洗滌細(xì)胞2次，經(jīng)胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用冷卻的PBS再次洗滌細(xì)胞之后用4"C的結(jié)合緩沖液(含14mMNaCl和25mMCaCl2的O.OlmM，PH7.0，Hepe/NaOH緩沖液)將細(xì)胞配制成lX106/ml。取0.1ml細(xì)胞懸液置5ml培養(yǎng)管中，加入5微升的AV-FITC，再加5微升7—AAD。稍稍混懸細(xì)胞置暗處，室溫(20'C—25'C)反應(yīng)15分鐘，加上0.4ml結(jié)合緩沖液，終止反應(yīng)。立即在細(xì)胞流動(dòng)儀(FACS)上分析。結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)照組為未經(jīng)處理的細(xì)胞對(duì)照,排除自發(fā)凋亡;不加染色劑的對(duì)照;只加AV的對(duì)照;只加7—ADD的對(duì)照。實(shí)施例10枸骨水提取物含有抗癌活性成分的分析試驗(yàn)(參見(jiàn)李維林等，植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003年02期，45-57)采用葡聚糖凝膠Sephadex-LH-20對(duì)枸骨水提取物根據(jù)各化合物分子量的大小進(jìn)行分離純化，然后對(duì)各分離組分進(jìn)行抗腫瘤作用試驗(yàn)，本試驗(yàn)取l毫升枸骨水提取物(含有干重300毫克)上柱葡聚糖凝膠Sephadex-LH20色譜分離柱，上樣后用甲醇洗脫共收集16個(gè)分離組份(這16個(gè)分離組份都是含有不同化合物的混合物)，減壓濃縮干燥這些分離組份后，各分離組分用1毫升生理鹽水溶解并進(jìn)行前述抗腫瘤作用分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離組份3，分離組份7，分離組份9，分離組份11和分離組份13都具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，而且還發(fā)現(xiàn)這些組份混合在一起具有強(qiáng)大的協(xié)同作用。這一結(jié)果說(shuō)明枸骨水提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個(gè)至少由5種以上的有機(jī)化合物所組成的混合物。實(shí)施例ll枸骨醇提取物含有抗癌活性成分的分析試驗(yàn)(參見(jiàn)吳鎪等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2005年19期，67-72)取l毫升枸骨醇提取物樣品(每毫升含15毫克干重枸骨醇提取物)減壓濃縮成膠狀物，然后逐次用4毫升石油醚，4毫升乙酸乙酯，4毫升正丁醇和4毫升乙醇進(jìn)行抽提，各有機(jī)溶劑抽提液減壓，濃縮和干燥，最后各自用0.5毫升二甲基亞砜溶解，然后進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各有機(jī)溶劑抽提組分是否含有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性成分。結(jié)果石油醚和乙酸乙酯抽提物都含有抗腫瘤的有效成份，這一結(jié)果說(shuō)明枸骨醇提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個(gè)至少由2種以上的有機(jī)化合物所組成的混合物。實(shí)施例12枸骨水提取物給藥后對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)(參見(jiàn)GoldbergLE,etal.,AntibioticMedBiotekhnol.32(12):910-5)枸骨水提取物口服液采用灌胃給藥,而枸骨水提取物注射液采用尾靜脈注射給藥。取兩組8周齡的BlabC小鼠，每組10只(5只雄性和5只雌性)，分別以單次劑量15g/kg或多次劑量3g/kg(QDX15)灌胃給予枸骨水提取物口服液，或分別以單次劑量1.5g/kg或多次劑量0.3g/kg(QDX15)尾靜脈注射給予枸骨水提取物注射液(用無(wú)菌生理鹽水配制)，然后分別觀察1周和4周。每?jī)商旆Q(chēng)體重。試驗(yàn)結(jié)束后，將受試小鼠處死，進(jìn)行病理分析。結(jié)果顯示，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好,無(wú)一死亡。實(shí)施例13枸骨醇提取物給藥后對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)(參見(jiàn)GoldergLE,etal.，AntibioticMedBiotekhnol32(12):910-5)枸骨醇提取物口服液采用灌胃給藥，而枸骨醇提取物注射液采用尾靜脈注射給藥。取兩組8周齡的BlabC小鼠，每組10只(5只雄性和5只雌性)，分別以單次劑量1.5g/kg和多次劑量0.3g/kg(QDX15)灌胃給予枸骨醇提取物口服液(精制玉米油配制)或分別以單次劑量1.5g/kg和多次劑量0.3g/kg(QDX15)尾靜脈注射給予枸骨醇提取物注射液(15%Captisol配制)，然后分別觀察1周和4周。每?jī)商旆Q(chēng)體重。試驗(yàn)結(jié)束后，將受試小鼠處死，進(jìn)行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量1.5g/kg和多次劑量0.3g/kg(QDX15)給予枸骨醇提取物口服液或枸骨醇提取物注射液，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。實(shí)施例14應(yīng)用人腫瘤異種移植模型進(jìn)行枸骨水提取物的抗腫瘤有效性試驗(yàn)(1)建立人腫瘤移植裸鼠模型(參見(jiàn)HarrisonSDJretal.，JNatlCancerInst，1991,83(20):1509T細(xì)胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，雄性，6周齡，購(gòu)自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，按照大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用委員會(huì)指南飼養(yǎng)于無(wú)病原體環(huán)境。將5X106個(gè)LnCAP、NCI-H23、HCT-116,MES-SA細(xì)胞分別懸浮于0.2mlHBSS(Hanvs，平衡鹽溶液)或基質(zhì)膠(50:50,v/v)中，皮下接種到小鼠的側(cè)腹部區(qū)域。當(dāng)腫瘤平均直徑達(dá)78mm時(shí)，選出腫瘤大小為100200mm3的小鼠，分為給予生理鹽水配制的枸骨水提取物口服液,枸骨水提取物注射液的處理組和只給予載體(生理鹽水)的對(duì)照組。為保證枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液處理組和對(duì)照組在處理開(kāi)始時(shí)腫瘤體積分布大致相等，將小鼠分成三類(lèi)腫瘤體積小(長(zhǎng)度〈4mm)，腫瘤體積中等(48mm)，腫瘤體積大(>8mm)。對(duì)照組，枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液處理組中來(lái)自相同類(lèi)別的小鼠數(shù)目大致相等。(2)裸小鼠腫瘤移植模型的給藥(枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液)在口服給藥和尾靜脈注射給藥試驗(yàn)中，用生理鹽水配制枸骨水提取物口服液按3g/kg和枸骨水提取物注射液按0.3g/kg給藥。每日給予單次劑量200ml藥液(含30mg枸骨水提取物口服液和含3mg枸水提取物注射液)，每周5次，持續(xù)3周；對(duì)照組按同樣方法給予載體(生理鹽水)。小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，允許自由采食。(3)抗腫瘤效應(yīng)評(píng)價(jià)每34天沿兩個(gè)垂直方向?qū)δ[瘤進(jìn)行測(cè)量。腫瘤體積根據(jù)以下公式計(jì)算V=(a2Xb)/2其中a是腫瘤寬度(較小直徑)，b是長(zhǎng)度(較大直徑)。每個(gè)腫瘤的相對(duì)腫瘤體積(RTV)定義為給定時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積與處理開(kāi)始時(shí)腫瘤體積的比值。每個(gè)處理組均計(jì)算平均值。根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制值(TGI)，判斷抗腫瘤活性TGI(%)=T/CX100其中T是處理組試驗(yàn)終點(diǎn)(4周)RTV的平均值，C是對(duì)照組試驗(yàn)終點(diǎn)RTV的平均值。采用美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的最小抗腫瘤活性標(biāo)準(zhǔn)(T/C《42%)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將腫瘤切除并在甲醛中固定，進(jìn)行組織學(xué)觀察。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5-圖8。權(quán)利要求1.一種抗腫瘤藥物，其特征在于它是以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作為有效成分的抗腫瘤藥物。2.如權(quán)利要求1所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述抗腫瘤藥物中含有抗腫瘤有效量的枸骨水提取物或枸骨醇提取物及可藥用載體和/或賦形劑。3.如權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述抗腫瘤藥物制成枸骨水提取物口服液或注射液,或枸骨醇提取物口服液或注射液。全文摘要一種以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作為有效成分的抗腫瘤藥物，可制成口服液及注射液。藥理試驗(yàn)效果證明枸骨水提取物或枸骨醇提取物對(duì)29種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示有廣譜的抗腫瘤作用；枸骨水提取物能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停留在G1期，并具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力；在人腫瘤移植裸鼠模型試驗(yàn)中，枸骨水提取物顯示出對(duì)人前列腺癌LnCAP、人肺癌細(xì)胞NCI-H23、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和人子宮內(nèi)瘤細(xì)胞MES-SA有強(qiáng)烈的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)未有明顯的副作用；對(duì)小鼠的急性毒理試驗(yàn)也顯示無(wú)毒性。因此枸骨水提取物或枸骨醇提取物是具有很大開(kāi)發(fā)前景的廣譜抗腫瘤新藥。文檔編號(hào)A61K125/00GK101095706SQ20071004399公開(kāi)日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年7月19日優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日發(fā)明者南張,邱日輝申請(qǐng)人:邱日輝;張南