專利名稱：一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、飲料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種中藥提取物及其制備方法和用途，更具體地說是涉及一種以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備的中藥提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
(一)骨質(zhì)疏松癥的研究概況骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是一種常見、多發(fā)的老年性疾病。隨著人口老齡化現(xiàn)象日趨嚴重，骨質(zhì)疏松癥嚴重影響著老年人的生活質(zhì)量，尤其是絕經(jīng)后的婦女。據(jù)報載中國現(xiàn)有8000多萬人患有此癥需要治療，美國據(jù)統(tǒng)計患有此癥者約有2500萬人，日本則約有800萬人。在臥床不起的老年人中，有20％是骨質(zhì)疏松癥引起的，因該癥導致脆性骨折最終引起死亡已躍居各種病因死亡率的第12位，僅在美國為此病每年至少要支付100多億美元的醫(yī)療費用。有研究表明，未來60年內(nèi)，世界范圍內(nèi)由骨質(zhì)疏松引起的髖骨骨折人數(shù)將達到600萬，醫(yī)療費用的巨大開支，對社會和家庭都是一種沉重的負擔，給患者肉體及精神上也產(chǎn)生了很大的痛苦。
骨質(zhì)疏松癥的病因病理學研究表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要是由于雌激素(Estrogen，簡稱E)水平下降引起的。雌激素能夠增加降鈣素(Calcitonin，簡稱CT)的分泌，抑制甲狀旁腺素(簡稱PTH)的活動，從而抑制骨鈣融出。另外，雌激素能夠調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活性和功能。雌激素缺失時成骨細胞(osteoblast，簡稱OB)的形成減少和成骨功能減退，而破骨細胞(osteoclast，簡稱OC)的形成和募集增加，破骨作用增強，由于成骨細胞和破骨細胞之間出現(xiàn)負平衡使骨量減少。因此，早期預防骨質(zhì)疏松癥及其引起的各種骨折則顯得更為重要。雖然防治骨質(zhì)疏松癥的藥物較多，如雌激素、鈣制劑和雙磷酸鹽類等，但均有一定的副作用，如雌激素有誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌的危險，使其臨床應(yīng)用受到限制。中藥及其天然產(chǎn)物具有多種作用機制，副作用少，運用各種現(xiàn)代技術(shù)從中藥及復方中尋找具有這方面活性的先導化合物或新藥，將是一個重要的研究方向。
(二)組方中藥的研究概況1、概述二妙散、三妙丸均為中國藥典(2005版)收載的中藥成方。其中，三妙丸由黃柏、蒼術(shù)、牛膝三味中藥(3∶2∶1)制備組成，黃柏、蒼術(shù)(1∶1)組成二妙散。二妙散方名出自朱震亨(1281～1358)的《丹溪心法》，而后在1515虞摶所著的《醫(yī)學正傳》卷5將本方加入川牛膝，為細末，面糊為丸，如梧桐子大，名三妙丸，主治濕熱下流，兩腳麻木，或如火烙之熱，沿用至今的三妙丸、三妙散(湯)皆源于此，方中加牛膝后，則下行力增強，更長于治濕熱下注引起的腳氣病、腰膝關(guān)節(jié)酸痛，濕瘡以及帶下、淋濁。
三妙丸傳統(tǒng)用于清熱燥濕，臨床上可用于治療小兒水痘、肢體關(guān)節(jié)疼痛以及下焦?jié)駸帷⑴枨谎椎取?br> 研究表明三妙散提取液可提高小鼠的碳粒廓清速率，提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及紅細胞生成，可提高免疫力，提示對衰老引起的部分癥狀有效。方中含有的牛膝有補肝腎、強筋骨、逐瘀通絡(luò)、引血下行的功效，含有皂苷、蛻皮甾酮、齊墩果酸、葡萄糖醛酸等成分，其中所含的甾醇類成分在化學結(jié)構(gòu)上與雌激素的結(jié)構(gòu)相似，它能與成骨細胞上的雌激素受體結(jié)合，激活成骨細胞上的調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活性，促進骨形成、抑制骨吸收。從而達到防止骨丟失的作用。植物雌激素類成分已有在臨床上應(yīng)用防治骨質(zhì)疏松癥，副作用較小。
2、黃柏、蒼術(shù)、牛膝的研究概況(1)黃柏黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.或黃檗Phellodendron amurenseRupr.的干燥樹皮，前者習稱“川黃柏”，后者習稱“關(guān)黃柏”；“川黃柏”主產(chǎn)于四川、貴州、湖北、云南，湖南、甘肅、廣西亦產(chǎn)?！瓣P(guān)黃柏”主產(chǎn)于吉林、遼寧、河北，黑龍江、內(nèi)蒙古亦產(chǎn)。黃柏又名巢木(《神農(nóng)本草經(jīng)》)、栗皮(《傷寒論》)、黃聚(《本草經(jīng)集注》)、黃皮樹(四川)，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。味苦，性寒。歸腎、膀胱經(jīng)。能清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡。用于濕熱瀉痢，黃疽，帶下，熱淋，腳氣，骨蒸勞熱，盜汗，遺精，瘡瘍腫毒，濕疹瘙癢。鹽炙黃柏滋陰降火，用于陰虛火旺，盜汗骨蒸。
化學成分主要含生物堿，其主要組成有小檗堿(berberine)、巴馬汀(掌葉防己堿，palmatine)、藥根堿(jatrorrhizine)、木蘭花堿(magnoflorine)等，另含黃柏堿(phelldendrine)、蝙蝠葛堿(menisperine)、N一甲基大麥芽堿(candicine)等。此外尚含有黃柏內(nèi)酯(obaculactone)、黃柏酮(obacunone)、檸檬苦素(limonin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、菜油甾醇(campesterol)、7-去氫豆甾醇(7-dehydrostigmasterol)、白鮮交酯(dictamnolide)、黃柏酮酸(obacunonic acid)、青熒光酸(lumicaeruleic acid，berrubine)、氯原酸類化合物、木脂素單葡萄糖苷、脂肪油、揮發(fā)油、微量元素等。黃柏根皮與樹皮中所含化學成分基本相同，但小聚堿的含量，根皮高于樹皮。全株除葉外，果實及木質(zhì)部也均含小果堿。產(chǎn)地不同，小果堿含量有差異。根皮也含小栗堿、藥根堿、黃柏堿、N-甲基大麥芽堿。黃柏果中揮發(fā)油的主要成分為香葉烯(myrcene)，占總油量的60～70％。
藥理作用①抗菌作用黃柏水煎劑或醇浸劑對多種致病性細菌有不同程度的抑制作用，如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、白喉桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、腦膜炎雙球菌、糞產(chǎn)堿桿菌等及各型痢疾桿菌均有不同程度的抑制作用。此外，黃柏對結(jié)核桿菌、鉤端螺旋體等也有較強的抑制或殺滅作用，但對豚鼠的實驗性結(jié)核桿菌感染無效。近有研究，黃柏還能顯著抑制變形鏈球菌的生長。所含之多種生物堿是黃柏抗菌有效成分，如小巢堿、巴馬汀、藥根堿等均有較強的抗菌活性，巴馬汀的抗菌活性與小粱堿基本相同或略低。黃柏在體外對多種皮膚致病性真菌都有較強的抑制作用，對白色念珠菌、陰道滴蟲也有顯著抑制活性。此外，黃柏還有抗流感病毒等作用。黃柏對于乙肝表面抗原還有明顯的選擇性抑制作用。
小檗堿為黃柏最主要的抗菌成分，其有廣譜的體外抗菌效果，其于低濃度時抑菌，高濃度時殺菌?？沽〖矖U菌作用強度與磺胺相近，但其作用不受血清的影響?？顾幘戤a(chǎn)生較多，且無完全交叉耐藥性。另有研究表明，小檗堿能強烈抑制酵母菌和細菌糖代謝中間環(huán)節(jié)丙酮酸的氧化脫梭過程，其抗菌作用可被維生素B6，維生素PP、對氨基苯甲酸等所拮抗。小檗堿還抑制細菌的蛋白質(zhì)、核酸代謝，能使霍亂弧菌的RNA及蛋白質(zhì)合成抑制。小檗堿抑制細菌核酸合成與濃度有關(guān)。小檗堿還有抗細菌毒素作用，研究表明，小檗堿可對抗霍亂弧菌和大腸桿菌所致腸分泌亢進、腹瀉和死亡，并能對抗霍亂毒素所致腸絨毛的水腫，顯著抑制皮下注射霍亂毒素所引起的局部炎癥。
除小檗堿外，黃柏所含其它多種生物堿也具有顯著抗菌活性。有報道巴馬汀的抗菌作用略低于小檗堿或與其相似，0.05％的巴馬汀對金葡菌的抑菌圈為1.07cm，而同濃度的小聚堿為1.26cmo藥根堿也具有一定抗病原微生物作用。
②降壓作用黃柏流浸膏或醇提液堿性物質(zhì)腹腔注射均具有顯著的降壓效果。黃柏2g/kg灌服能使辜丸切除高血壓大鼠血壓降低。由黃柏配伍仙茅、淫羊蕾、巴戟天、知母、當歸組成的二仙合劑十二指腸給藥，對麻醉貓及慢性腎型高血壓也有一定降壓作用，黃柏為此方降壓主藥。黃柏所含多種成分，如小檗堿、黃柏堿、巴馬汀等都具有不同程度的降壓活性。其降壓機制與阻斷神經(jīng)節(jié)、抑制血管中樞及抗交感等神經(jīng)介質(zhì)有關(guān)。藥根堿的降壓效果則可能與抗交感神經(jīng)介質(zhì)有關(guān)。此外，木蘭花堿也有降壓作用。黃連解毒湯也有顯著降壓效果，黃柏為其降壓主藥之一，從中已分得具有α-腎上腺素及β-腎上腺素的活性物質(zhì)。
③對消化系統(tǒng)的影響 黃柏對胰蛋白酶活性有抑制作用，此作用與其所含小檗堿無明顯關(guān)系。對于鹽酸一乙醇所致大鼠實驗性胃潰瘍，黃柏50％甲醇提取物有顯著保護作用，小檗堿也有效，但總提取物抗?jié)兓钚员刃￠迚A為強。對于腸平滑肌，黃柏可增強家兔離體腸管收縮，其所含小檗堿也增加收縮幅度，黃柏酮也興奮腸平滑肌，黃柏內(nèi)酯則反使腸管弛緩。此外，黃柏水提液可促進饑餓家兔膽汁及胰液分泌。后有實驗表明黃柏確有利膽作用，能促進膽汁分泌，并促進膽紅素的排出。
④其他作用黃柏中含有小檗堿，可增強實驗性金黃色葡萄球菌敗血癥犬白細胞吞噬金葡菌的能力，并保護動物免于死亡，2～5mg/kg靜注于家兔，還可增強其網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力。小檗堿50mg/kg灌服1次或連續(xù)7日均能降低正常小鼠血糖，1次給藥于藥后2～4小時作用最強，且對葡萄糖和腎上腺素所致實驗性高血糖癥小鼠有降血糖效果。對于自發(fā)性糖尿病KK小鼠及四氧嘧啶性糖尿病小鼠，50mg/kg小檗堿連續(xù)半月也有顯著效果，能改善KK小鼠的葡萄糖耐量。
⑤毒性黃柏所含生物堿于腸道吸收少，故毒性低，其所含多種季胺堿胃腸道給藥毒性也小，但注射給藥則可有較大毒性。黃柏小鼠腹腔注射的LD50為2.7g/kg。
(2)蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz的干燥根莖。味辛、苦，性溫。歸脾、胃、肝經(jīng)。能燥濕健脾，祛風，散寒，明目。用于脫腹脹滿，泄瀉，水腫，腳氣瘓璧。風濕痹痛，風寒感冒，雀目夜盲。
蒼術(shù)又名赤術(shù)(陶弘景)，馬薊(《說文系傳》)，青術(shù)(張充《水南翰記》)，仙術(shù)(《本草綱目》)，茅術(shù)(江蘇)，華蒼術(shù)(寧夏)。蒼術(shù)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。
茅蒼術(shù)主產(chǎn)江蘇、湖北、河南。此外，浙江、安徽、江西等省亦產(chǎn)。北蒼術(shù)主產(chǎn)河北、山西、陜西等省。此外，遼寧、吉林、河南、山東、內(nèi)蒙古、甘肅亦產(chǎn)。
化學成分根莖含揮發(fā)油，油中主要成分有蒼術(shù)素(atractylodin)、茅術(shù)醇(hinesol)、桉油醇(eudesmol)、欖香油醇(elemol)、蒼術(shù)酮(atractylon)、聚傘花素(cymol)、甜沒藥醇(bisabolol)、羥基蒼術(shù)酮(hydroxyatractylon)、乙酰氧基蒼術(shù)酮(acetoxyatractylon)、蒼術(shù)素醇(atractylodinol)、乙酰蒼術(shù)素醇(acetylatractylodinol)。茅蒼術(shù)還含白術(shù)內(nèi)酯(butenolide)、倍半萜糖苷及微量。歐蒼術(shù)(A.gummidera L.)含有蒼術(shù)苷(atractyloside)，茅蒼術(shù)揮發(fā)油含量為5～9％，北蒼術(shù)含量為1～2.5％。
藥理作用①對血糖的影響家兔皮下注射蒼術(shù)水煎劑8g(生藥)/kg或醇浸膏8g(生藥)/kg時，可使家兔血糖上升。家兔灌胃蒼術(shù)水煎劑8g(生藥)/kg時，也可使血糖上升。蒼術(shù)苷對小鼠、大鼠、兔和犬則有降血糖作用，其降血糖和降低肝糖原作用，降低耗氧量，但使血乳酸含量增加，可能由于蒼術(shù)苷促進了糖酵解的緣故。
②抗?jié)冏饔蒙n術(shù)50％甲醇提取物具有抗?jié)冏饔谩?00mg/kg給大鼠灌胃給藥時，對幽門結(jié)扎型、組織胺型、阿司匹林型及應(yīng)激型胃潰瘍均有定的抗?jié)冏饔茫墒節(jié)冎笖?shù)降低，對胃液量、胃酸度及胃蛋白酶活性均有明顯抑制作用。血清性潰瘍系因胃粘膜缺血，循環(huán)障礙而引起的能量不足，粘膜抵抗力減弱，引起組織壞死而形成的潰瘍，蒼術(shù)對此有明顯效果。
③對胃腸運動的影響蒼術(shù)對胃腸運動有調(diào)節(jié)作用，對整體動物用碳末推進實驗發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)丙酮提取物能明顯促進胃腸運動，其主要成分為桉葉醇和茅術(shù)醇。蒼術(shù)的醇提取液和水溶液對兔十二指腸活動都有較明顯的抑制作用，具有對抗乙酰膽堿引起的腸管平滑肌收縮，而對馳張后的胃平滑肌則有輕微的增強收縮作用。
④其他作用用氰化鉀所致小鼠缺氧模型表明，蒼術(shù)丙酮提取物750mg/kg灌服能明顯提高小鼠存活時間，降低死亡率。蒼術(shù)揮發(fā)油、茅術(shù)醇和桉葉醇在體外對食管癌細胞有抑制作用，其中以茅術(shù)醇的作用最強。蒼術(shù)揮發(fā)油少量對蛙有鎮(zhèn)靜作用，同時使脊髓反射亢進；大量則呈抑制作用，最終使呼吸麻痹而死亡。
(3)牛膝牛膝又名懷牛膝、百倍、雞膠骨，為莧科(Amarathaceae)植物牛膝Achyranthes bidentataBL.的根。中華人民共和國藥典(2005年版)收載為常用中藥。廣泛分布于中國的河南、山西、山東、江蘇、安徽等地。性平，味甘苦酸，入肝、腎經(jīng)。生用散淤血，消腫癰；熟用補肝腎，強筋骨。具有填精補髓、益陰活血的功效。治腰膝骨痛，四肢拘攣。
化學成分牛膝含有多種寡糖、肽多糖及多糖。牛膝中還含有多種皂苷類成分，其中以齊墩果酸型三萜皂苷為主。如牛膝皂苷、懷牛膝皂苷。此外還有蛻皮甾酮和牛膝甾酮、變態(tài)激素甾酮。
牛膝還含有黃酮類和生物堿類及香豆素類成分。如槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷。
此外，尚含有揮發(fā)油、谷甾醇，琥珀酸、尿囊素、大黃酚、鄰苯二甲酸二丁酯、軟脂酸、胡蘿卜苷、異丁苯丙酸和大黃素甲醚以及重量元素等。
藥理作用①免疫調(diào)節(jié)作用牛膝多糖(簡稱ABPS)在體外可以提高老年鼠T淋巴細胞的增殖能力和IL-2的分泌。體內(nèi)能顯著提高老年大鼠T淋巴細胞和血清中TNF及NO的產(chǎn)生和NOS的活性，具有免疫調(diào)節(jié)作用。在體外具有增強自然殺傷細胞活性和促進伴刀豆球蛋白A(簡稱Con A)誘導的腫瘤壞死因子產(chǎn)生，增強二硝基氟苯誘導的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和對抗環(huán)磷酰胺對NK活性的抑制作用，但對Con A誘導的T細胞增殖反應(yīng)和IL-2的產(chǎn)生無明顯影響。ABPS ip 50mg/kg能明顯提高總IgG及特異性抗體溶血素的含量，并增加脾臟指數(shù)，還能對抗環(huán)孢霉素A引起的特異性抗體溶血素及IgG的下降。ABPS體外能刺激小鼠脾細胞增殖，也能增強LPS誘導的B淋巴細胞增殖，具有體液免疫增強功能。
②腫瘤抑制作用牛膝總皂苷具有腫瘤細胞抑制作用，能顯著抑制小鼠移植性肉瘤180生長，提高荷瘤小鼠低下的血清1 g-G含量和抗體形成細胞數(shù)量及脾淋巴細胞增殖反應(yīng)，還能提高荷瘤鼠NK細胞活性及LPS誘生的血清TNT-a產(chǎn)生，體外對5180細胞無直接細胞毒作用，但能增強M中對S180的殺傷作用。其抗腫瘤作用與其增強宿主免疫功能有關(guān)。
③抗炎、抗菌和鎮(zhèn)痛作用牛膝不同炮制品均有一定程度的鎮(zhèn)痛作用，其中以酒炙牛膝作用強而持久。牛膝具有較強的抗炎消腫作用。因其無促腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，因此抗炎作用并非通過腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)激素所致，而是提高機體免疫機能、激活小鼠巨噬細胞系統(tǒng)對細胞的吞噬作用，以及擴張血管、改善循環(huán)促進炎性病變吸收等。
④促智、抗衰老作用 懷牛膝水煎液給小鼠連續(xù)灌服7d，可明顯改善戊巴比妥所致的記憶障礙，用跳臺法使首次跳下的潛伏期明顯延長，5min內(nèi)錯誤次數(shù)明顯減少，使Y型臂法第三天正確反應(yīng)率明顯提高，且可明顯延長小鼠負荷游泳時間。懷牛膝煎液可顯著提高D-半乳糖所致衰老模型小鼠血SOD活力及小鼠血漿、肝勻漿LPO水平，升高衰老模型小鼠血過氧化氫(簡稱CAT)的活力。
⑤降血脂作用懷牛膝可使以高脂誘發(fā)飼料造成的動脈粥樣硬化模型鶴鶉，血清TC、TG水平顯著降低，并降低血清LPO水平，具有抗動脈粥樣硬化作用。
⑥抗骨質(zhì)疏松作用牛膝是一種補腎壯骨中藥，含杜仲、牛膝、牡蠣、熟地等藥的補腎中藥組方水煎劑可減輕大鼠子宮重量，增大骨小梁密度、面積、總體積及密質(zhì)骨面積，減小骨髓腔面積。
牛膝還具有子宮興奮作用與抗生育作用(三)常用中草藥有效成分的提取分離方法1、溶劑提取法(1)原理溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種化學成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對活性成分溶解度大，對不需要溶出的成分溶解度小的溶劑，將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。當溶劑加到中草藥原料(需適當粉碎)中時，溶劑由于擴散、滲透作用逐漸通過細胞壁透入到細胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細胞內(nèi)外的濃度差，于是細胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴散，溶劑又不斷進入藥材組織細胞中，如此多次往返，直至細胞內(nèi)外溶液濃度達到動態(tài)平衡時，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可分為親水性有機溶劑及親脂性有機溶劑，被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。有機化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團多，其極性大而疏于油；有的親水性基團少，其極性小而疏于水。各類溶劑的性質(zhì)，同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。這樣，發(fā)明人就可以通過對中草藥成分結(jié)構(gòu)分析，去估計它們的此類性質(zhì)和選用的溶劑。總的說來，只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項性質(zhì)相當，就會在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。
(2)溶劑的選擇運用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當?shù)娜軇?。溶劑選擇適當，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點①溶劑對有效成分溶解度大，對雜質(zhì)溶解度??；②溶劑不能與中藥的成分起化學變化；③溶劑要經(jīng)濟、易得、使用安全等。常見的提取溶劑可分為以下三類①水水是一種強的極性溶劑。中草藥中親水性的成分，如無機鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽及苷類等都能被水溶出。為了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及堿水作為提取溶劑。
②親水性的有機溶劑也就是一般所說的與水能混溶的有機溶劑，如乙醇(又稱酒精)、甲醇(又稱木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好，對中草藥細胞的穿透能力較強。親水性的成分除蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分，在乙醇中的溶解度也較大。還可以根據(jù)被提取物質(zhì)的性質(zhì)，采用不同濃度的乙醇進行提取。用乙醇提取比用水量較少，提取時間短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇為有機溶劑，雖易燃，但毒性小，價格便宜，來源方便，有一定設(shè)備即可回收反復使用，而且乙醇的提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。由于這些原因，用乙醇提取的方法是歷來最常用的方法之一。甲醇的性質(zhì)和乙醇相似，沸點較低(64℃)，但有毒性，使用時應(yīng)注意。
③親脂性的有機溶劑也就是一般所說的與水不能混溶的有機溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。這些溶劑的選擇性能強，不能或不容易提出親水性雜質(zhì)。但這類溶劑揮發(fā)性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，價格較貴，設(shè)備要求較高，且它們透入植物組織的能力較弱，往往需要長時間反復提取才能提取完全。如果藥材中含有較多的水分，用這類溶劑就很難浸出其有效成分，因此，大量提取中草藥原料時，直接應(yīng)用這類溶劑有一定的局限性。
(3)提取方法用溶劑提取中草藥成分，常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時，原料的粉碎度、提取時間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。
①浸漬提取法(簡稱浸漬法)浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝入適當?shù)娜萜髦?，加入適宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水)，浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡單易行，但浸出率較差，且如用水為溶劑，其提取液易發(fā)霉變質(zhì)，須注意加入適當?shù)姆栏瘎?br> ②滲漉提取法(簡稱滲漉法)滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過藥材，自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法。當溶劑滲進藥粉、溶出成分比重加大而向下移動時，上層的溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴散能較好地進行，故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應(yīng)控制流速，在滲渡過程中隨時自藥面上補充新溶劑，使藥材中有效成分充分浸出為止?；虍敐B滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當于原藥材重的10倍時，便可認為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀浸出液作為另一批新原料的溶劑之用。
③煎煮提取法(簡稱煎煮法)煎煮法是中國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時最好時常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠，多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個煎煮器通過管道互相連接，進行連續(xù)煎浸。
④加熱回流提取法應(yīng)用有機溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶內(nèi)裝藥材約為容量的20％～60％，溶劑浸過藥材表面約1～2cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰3～6小時，放冷過濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時，或至基本提盡有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。
⑤連續(xù)回流提取法應(yīng)用揮發(fā)性有機溶劑提取中草藥有效成分，不論小型實驗或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實驗室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時才能提取完全。提取成分受熱時間較長，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。
2、分離和純化方法上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物，需進一步除去雜質(zhì)，分離并進行精制。
(1)溶劑分離法一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進行提取分離。水浸膏或乙醇浸膏常為膠狀物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌入適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取，使總提取物中各組成成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離。利用中草藥化學成分，在不同極性溶劑中的溶解度進行分離純化，是最常用的方法。
(2)溶劑萃取法①萃取法溶劑提取萃取法又簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的方法。萃取時如果各成分在溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高；如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚進行萃取，如果有效成分是偏于親水性的物質(zhì)，在親脂性溶劑中難溶解，就需要改用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入適量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取黃酮類成分時，多用乙酸乙脂和水萃取。提取親水性強的皂苷則多選用正丁醇、異戊醇和水作萃取。不過，一般有機溶劑親水性越大，與水作萃取的效果就越不好，因為能使較多的親水性雜質(zhì)伴隨而出，對有效成分進一步精制影響很大。
②逆流連續(xù)萃取法是一種連續(xù)的溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加溶劑萃取時的接觸面。如果一種中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進行萃取，則需將水提濃縮液裝在萃取管內(nèi)，而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內(nèi)。萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進行檢查。
③逆流分配法逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達到混合物的分離。
④液滴逆流分配法液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來在逆流分配法基礎(chǔ)上改進的溶劑萃取法。對溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時間內(nèi)分離成，并可生成有效的液滴。由于移動相形成液滴，在細的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進溶質(zhì)在溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。
(3)大孔吸附樹脂法大孔吸附樹脂是20世紀60年代發(fā)展起來的一類有機高聚物吸附劑，具有良好的吸附性能，近十余年來逐漸被應(yīng)用于中草藥化學成分的提取分離和中藥新藥的開發(fā)研制。
大孔吸附樹脂為吸附和篩選原理相結(jié)合的分離材料。它的吸附性是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。篩選原理是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定。由于吸附和篩選原理，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。這使得有機化合物尤其是水溶性化合物的提純得以大大簡化。大孔吸附樹脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯縮聚而生成，由于改性劑的加入，大孔吸附樹脂的極性發(fā)生改變，按照樹脂的表面性質(zhì)，吸附樹脂一般分為非極性、中極性和極性三類。
非極性吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合物制得的不帶任何功能基的吸附樹脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯體系的吸附樹脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附樹脂。
中極性吸附樹脂指含酯基的吸附樹脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯與雙甲基丙烯酸酯等交聯(lián)的一類共聚物。它是在非極性大孔吸附樹脂的基礎(chǔ)上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈縮聚而成，如中國國內(nèi)經(jīng)常使用的AB-8大孔吸附樹脂。
極性吸附樹脂是指含酰胺基、腈基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂。此外，有時把含氮、氧、硫等配體基團的離子交換樹脂稱作強極性吸附樹脂，強極性吸附樹脂與離子交換樹脂的界限很難區(qū)別。極性大孔吸附樹脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亞砜類縮聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美國Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附樹脂。
與活性炭和其它吸附劑相比，大孔吸附樹脂具有很多的優(yōu)點，如對某種物質(zhì)的吸附選擇性較高；物理化學穩(wěn)定性和機械強度較好；品種規(guī)格較多，可根據(jù)需要改變樹脂物理或化學結(jié)構(gòu)；吸附樹脂一般為球狀顆粒，流體阻力較小等等。因而被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，近年來關(guān)于大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物提取分離中的應(yīng)用研究報道越來越多。大孔吸附樹脂對中草藥化學成分如生物堿、黃酮、皂苷、香豆素及其他一些苷類成分都有一定的吸附作用。對糖的吸附能力很差，對色素的吸附能力較強。
(4)沉淀法是在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。如鉛鹽沉淀法鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，使分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀。
(5)鹽析法鹽析法是在中草藥的水提液中，加入無機鹽至一定濃度，或達到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
(6)透析法透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達到分離的方法。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的物質(zhì)通過半透膜進入膜外溶液中，而加以分離精制。
(7)結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶法鑒定中草藥化學成分，研究其化學結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。在常溫下，物質(zhì)本身性質(zhì)是液體的化合物，可分別用分餾法或?qū)游龇ㄟM行分離精制。一般地說，中草藥化學成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，都具有結(jié)晶體的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來達到分離精制的目的。
3、常用干燥方法(1)真空干燥是基于這樣一基本原理水的飽和蒸氣壓與溫度緊密相關(guān)，在真空狀態(tài)下，水的沸點降低，即在真空下操作也就是在低溫下操作，可避免在高溫下營養(yǎng)成分如維生素等的破壞，同時提高了干燥速度。真空干燥在食品、制藥、化工等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，中國也開發(fā)和引進了各種真空干燥設(shè)備，其結(jié)構(gòu)形式多種多樣。常用的形式主要有箱式真空干燥器、雙錐式真空干燥器、帶式真空干燥器等。這些傳統(tǒng)的真空干燥裝置主要采用熱風，蒸汽或電等加熱，利用熱傳導、對流或輻射原理將熱量從外部傳到物料內(nèi)部。真空干燥具有干燥溫度低，干燥室內(nèi)相對缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐變等一系列優(yōu)點，適合于熱敏感性食品物料的干燥，此外設(shè)備成本、干燥費用也相對較低。
(2)噴霧干燥是流化技術(shù)用于液態(tài)物料干燥的一種方法。因是瞬間干燥，特別適用于熱敏性物料，故所得產(chǎn)品質(zhì)量好，保持原來的色香味，且易溶解。利用噴霧干燥來制備微囊的研究正在進行，它是將心料混懸在衣料的溶液中，經(jīng)離心噴霧器將其噴入熱氣流中，所得的產(chǎn)品是衣料包心料而成的微囊，這種微囊粉末可采用于直接壓片，也可制備膠囊劑、糖漿劑或混懸劑。
(3)冷凍干燥是將干燥液體物料冷凍成固體，在低溫減壓條件下利用冰的升華性能，使物料低溫脫水而達到干燥的一種方法。由于物料在高度真空及低溫條件下干燥，故對某些極不耐熱物品的干燥很適合。王大林報道了一種噴霧通氣凍干新技術(shù)，是利用冷的空氣或氮氣作為介質(zhì)，迅速流經(jīng)凍結(jié)物使水升華，噴霧凍干制得的產(chǎn)品微粒小、干燥快、時間短、均勻、流動性好，并具良好的速溶性。近年來，對膏狀物料和粘稠物料干燥的研究取得了較大進展，流態(tài)化技術(shù)、噴射技術(shù)、惰性載體技術(shù)，則是在此研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。旋轉(zhuǎn)閃蒸干燥機、熱噴射氣流干燥機、惰性載體干燥機均適合熱敏性物料和膏狀物料的干燥。這些新的研究成果用于中藥制劑生產(chǎn)，將大大改善中藥加工的技術(shù)水平，提高生產(chǎn)效率。
(4)遠紅外加熱干燥法是一項新的干燥技術(shù)，其干燥原理是將電能轉(zhuǎn)變?yōu)檫h紅外輻射，從而被藥材的分子吸收，產(chǎn)生共振，引起分子和原子的振動和轉(zhuǎn)動，導致物體變熱，經(jīng)過熱擴散、蒸發(fā)和化學變化，最終達到干燥的目的。遠紅外干燥可節(jié)省電能20％～50％，效果較好。
(5)微波干燥法是一項20世紀60年代迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，微波干燥實際上是通過感應(yīng)加熱和介質(zhì)加熱，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃繌亩_到干燥的目的。微波干燥可殺滅微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中國生產(chǎn)的微波加熱成套設(shè)備有915mhz和2450mhz兩個頻率。
4、超臨界CO2萃取方法(1)有關(guān)動、植物脂肪油成分的提取方法有水煮法、水媒分離法、分子蒸餾和減壓蒸餾法、金屬加合法、萃取結(jié)晶法、分盤冷凍壓榨法和有機溶劑法等。
采用水煮加熱法，因加熱時間長、溫度高，易使對熱不穩(wěn)定的揮發(fā)成分發(fā)生變化，如一些不飽和脂肪酸的氧化。水媒分離法，此分離法的明顯優(yōu)點是消除了有機溶劑法造成的高費用和公害，但是這種技術(shù)的缺點是得到的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的純度或級別不如有機溶劑分離法高。分子蒸餾和減壓蒸餾法為減少熱變性，需用尿素加合物等方法來除去大部分飽和脂肪酸，在得到的產(chǎn)品中必須將其除去；雖然可得到較純的脂肪酸，但需幾步才能達到目標，較費時、費力，增加了生產(chǎn)成本。金屬加合法分離需要較低的低溫處理，最后還要設(shè)法去除金屬離子，清除不盡還會造成金屬離子污染。萃取結(jié)晶法得到脂肪酸純度較高，在較低的溫度下進行，能防止脂肪酸的氧化，但時間較長，不太適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。分盤冷凍壓榨法缺點是，安放盤架和液壓機的冷凍室需要數(shù)千平方米的面積和龐大的冷卻系統(tǒng)，大的設(shè)施需要多人操作，勞動強度高，分離速度緩慢，效率低，不能連續(xù)操作。有機溶劑法是采用石油醚或乙醚有機溶劑在水浴上加熱情況下，進行回流循環(huán)提?。挥捎谒捎玫挠袡C溶劑如石油醚或乙醚等均為一種低沸點物質(zhì)，易燃易爆，同時，有機溶劑的使用一方面會污染環(huán)境，另一方面有機溶劑有可能在提取物中有殘留，會影響提取物在醫(yī)藥上的進一步應(yīng)用。
(2)有關(guān)動、植物脂肪油成分的超臨界CO2萃取方法一種流體當處在其臨界溫度和壓力狀態(tài)時，被稱為超臨界流體。由于超臨界流體的密度接近于液體，具有與液體溶劑相當?shù)妮腿∧芰ΑＳ志哂信c氣體相當?shù)牡驼扯?，擴散能力比液體要大100倍，因而具有較高的傳質(zhì)性。采用超臨界萃取的時候，利用超臨界流體的這些性質(zhì)，使之與待分離的物質(zhì)相接觸穿透基體，從中萃取出目標物質(zhì)。然后利用降壓和/或升溫的辦法降低其密度，從而降低溶質(zhì)在其中的溶解度，使被萃取物與溶劑分離。因為不同的物質(zhì)在相同的萃取條件下溶解度是不同的，因而有可能借助這種差異將它們進一步分開。超臨界流體萃取常常選用CO2等臨界溫度低且化學惰性的物質(zhì)為萃取劑，它特別適用于熱敏物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的分離，因此非常適用于對于動物油脂的提取分離。因此，本發(fā)明采取該方法，能夠制備高純度的被提取物的脂肪油。
超臨界CO2萃取方法是這樣提取的把干燥的被提取物的粗粉放在超臨界萃取設(shè)備中用CO2進行萃取，減壓后即得被提取物的脂肪油，室溫條件下呈淺黃色透明油狀；提取的被提取物的脂肪油中總脂肪酸的純度在40以上，優(yōu)于其他提取方法；總脂肪酸一般包括油酸、亞油酸、棕櫚酸以及余量的其他組分等。
超臨界CO2萃取被提取物的脂肪油的方法包括如下步驟(1)將干燥的被提取物粉碎至10～30目后，置于超臨界萃取釜中，連續(xù)地通入超臨界狀態(tài)下的CO2進行萃取，優(yōu)選的條件一般是CO2流量10～55kg/h·kg原料、壓力5～50Mpa、溫度15～75℃、時間0.5～6h；進一步優(yōu)選的條件一般是CO2流量45kg/h·kg原料、壓力35Mpa、溫度50℃、時間1h；(2)將萃取了被提取物的脂肪油的CO2減壓至1～12MPa，即可獲得在室溫條件下被提取物的脂肪油，被提取物的脂肪油中總脂肪酸的純度在40％以上，萃取物的理化性狀和脂肪酸純度都優(yōu)于其他提取方法。
萃取條件的選擇是通過以下辦法實現(xiàn)的首先選定四因素、三水平，根據(jù)正交設(shè)計方法，按L9(34)交設(shè)計表安排實驗(正交實驗設(shè)計安排參考郭祖超主編的《醫(yī)學統(tǒng)計學》，人民軍醫(yī)出版社，1999年第一版)。從正交實驗結(jié)果，分析得到萃取工藝條件。
對超臨界CO2萃取的被提取物的脂肪油進行脂肪酸甲酯化后，進行氣相色譜一質(zhì)譜分析。
超臨界CO2萃取被提取物的脂肪油的制備方法不使用有機溶劑等物質(zhì)，不會污染環(huán)境，也不存在有害溶劑殘留等問題，而且操作簡便、萃取時間短、產(chǎn)品純度高，使用的CO2廉價而且可重復循環(huán)使用，工業(yè)生產(chǎn)成本低廉。
經(jīng)文獻檢索等，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有對以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物的新復方的有關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是公開了一種新的中藥提取物及制備方法和用途，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
也就是說，本發(fā)明意在于明確一種新的以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備的中藥提取物及其制備方法和用途；即本發(fā)明涉及一種采用諸藥合提或單味藥提取精制后混合的工藝方法制備的中藥提取物及其制備方法和用途。
所述的抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品是指用于抗骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)病癥的產(chǎn)品，診斷、檢測、預防、保護、治療或研究骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)病癥的產(chǎn)品；其中，所述的抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品是包括醫(yī)藥、食品或飲料領(lǐng)域產(chǎn)品中的一種或多種，優(yōu)選藥物、試劑、食品、保健食品、添加劑或飲料中的一種或多種，進一步優(yōu)選抗骨質(zhì)疏松癥藥物、抗骨質(zhì)疏松癥試劑、抗骨質(zhì)疏松癥食品或抗骨質(zhì)疏松癥飲料等中的一種或多種，最優(yōu)選抗骨質(zhì)疏松癥藥物。
(一)技術(shù)構(gòu)思自主開發(fā)創(chuàng)新藥物是中國目前的一項緊迫任務(wù)。中國中醫(yī)藥學具有悠久的歷史，用中草藥預防和治療疾病方面也積累了豐富的經(jīng)驗，尤其是中藥復方多成分多靶點綜合作用起到標本兼治，對其進行開發(fā)大有作為，將具有重大前景，因此中藥的開發(fā)利用是一條有效的途徑，也是發(fā)揮中國藥物研制的優(yōu)勢之所在。
發(fā)明人初步研究發(fā)現(xiàn)牛膝乙醇提取物對成骨細胞和破骨細胞的作用，可以促進新生大鼠顱蓋骨成骨細胞的增殖和堿性磷酸酶活性、抑制破骨細胞的形成和分化及抗酒石酸酸性磷酸酶活性，顯示了一定的抗骨質(zhì)疏松癥作用；進一步對三妙丸進行了活性篩選，也證實了三妙丸具有具有抗骨質(zhì)疏松癥作用，并兼具健脾、燥濕之功效，可能對于老年期、更年期的骨質(zhì)疏松癥癥也有增效作用，并減少其帶來的燥熱副作用。骨質(zhì)疏松癥是老年人和絕經(jīng)后婦女的常見病和多發(fā)病，目前臨床上雖然有雌激素、鈣制劑和雙磷酸鹽類等藥物可供選擇，但因為副作用嚴重，遠期療效欠佳，很大程度上制約了其廣泛應(yīng)用，因此對三妙丸進行組方優(yōu)化，并提取活性部位制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品具有較好的前景。
根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”的理論，中醫(yī)認為骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)鍵是腎虛，腎虛使內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)，下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂。據(jù)此，發(fā)明人通過多年的臨床研究和分析大量的臨床資料后，認為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病是由于腎氣不足，腎精虧損，骨髓失常，暗弱無力，引起骨質(zhì)疏松和骨折。
《內(nèi)經(jīng)》曰“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，其華在發(fā)，其充在骨”， “腎生骨髓”，腎與骨有著密切的關(guān)系。髓由腎中精氣所化生，骨有賴于髓的滋養(yǎng)。腎中精氣充足，則骨骼發(fā)育正常，骨質(zhì)致密。若腎之精氣不足，則髓枯骨痿，骨質(zhì)疏松。腎虛使內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)，下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂，骨微環(huán)境中多種細胞因子的相對平衡被破壞，引起骨代謝紊亂。尤其是尤為常見婦婦絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(簡稱PMOP)，由破骨細胞介導，為高轉(zhuǎn)換型的快速骨丟失。婦女在絕經(jīng)后將迅速出現(xiàn)骨丟失，導致骨強度下降，骨折風險大大增加。大量的臨床和基礎(chǔ)研究認為，該病發(fā)病機制主要是由于絕經(jīng)后雌激素分泌不足，雌激素具有促進降鈣素分泌和抑制破骨細胞刺激成骨細胞的作用，雌激素分泌不足使破骨細胞過于活躍，骨轉(zhuǎn)換增加，即骨形成與骨吸收增加，骨吸收大于骨形成，影響骨膠原的成熟和轉(zhuǎn)化以及骨礦化。因此臨床上可應(yīng)用雌激素防治PMOP，目前常用的雌激素或半合成雌激素的衍生物均有一定的副作用。
補腎中藥可調(diào)整卵巢功能及雌激素水平，能有效控制婦女更年期癥狀。補腎中藥能夠恢復下丘腦-垂體-性腺軸的功能活動，抑制骨吸收，加快骨形成，延緩骨量丟失，提高骨礦含量，達到治療骨質(zhì)疏松癥之目的。其作用的機制可能是通過興奮垂體-腎上腺軸或性腺軸的功能，提高血中的雌激素水平，提高性腺上雌激素受體的敏感性或雌激素受體的數(shù)量實現(xiàn)的。大量實驗表明補腎中藥具有促進骨形成和抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換率、提高骨質(zhì)量的作用；能抑制破骨細胞增殖分化，調(diào)節(jié)微量元素平衡，還可使腦組織總膽固醇、總磷脂含量及二者比值降低，提高去甲腎上腺素含量，通過延緩腦組織老化改變中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平，達到防治骨質(zhì)疏松癥的目的。
發(fā)明人對臨床廣泛應(yīng)用的中藥復方進行調(diào)查研究，并結(jié)合前期研究的工作基礎(chǔ)，找到了具有防治骨質(zhì)疏松癥作用的中藥復方三妙丸，組方中藥僅有三個中藥，比較簡單，易于研究開發(fā)。從古自今應(yīng)用歷史悠久，安全性可得到保障。以前沒有用作防治骨質(zhì)疏松癥的記錄，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了它的新用途，并對其組成比例進行了優(yōu)化。
發(fā)明人研究后發(fā)現(xiàn)，這三味中藥組成的復方，具有補腎益精、滋陰降火的雙重功效。其中，主藥牛膝具有補腎益精的功能，本發(fā)明的現(xiàn)代藥理學研究表明具有調(diào)整卵巢功能及雌激素水平，延緩和抑制骨吸收和降低骨轉(zhuǎn)換率，并能促進成骨細胞分化，促進骨形成的作用；蒼術(shù)健脾燥濕，以資“后天之本”，助氣血生化之源，以不斷補充腎中精血；黃柏瀉火以協(xié)調(diào)沖任。全方以補腎益精、調(diào)和沖任、強筋骨為主，以維持機體性激素的正常水平，尤其是雌激素水平。雌激素能抑制骨吸收，刺激骨形成，減少骨量的丟失，達到防治骨質(zhì)疏松癥的目的。
根據(jù)發(fā)明人以上的見解，發(fā)明人以補腎強骨、健脾燥濕、清熱瀉火治標，重在調(diào)整機體陰陽氣血平衡的中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，選擇經(jīng)現(xiàn)代藥理研究具有促進成骨細胞生長、維持骨形成和骨吸收的協(xié)調(diào)平衡的中草藥配成的復方，來治療骨質(zhì)疏松癥，并取得較好的臨床療效。本方以補腎益精、兼清熱燥濕健脾，更合適絕經(jīng)后婦女腎虛不足、虛中有熱的生理病理特點。
發(fā)明人檢索了《新編國家中成藥》、《臨床常用方劑手冊》、《中國常用中成藥大全》等書籍，并對骨質(zhì)疏松癥的醫(yī)院用藥和市售藥進行了調(diào)查統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)由于對其化學成分研究不深入，藥理篩選不足，導致活性部位和活性成分不明確以及沒有可行的質(zhì)量標準，限制了以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物的進一步開發(fā)和利用。
經(jīng)過化學成分研究，證明以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物活性部位中的主要成分為揮發(fā)油、皂苷、甾醇和總生物堿類化合物。而根據(jù)文獻檢索，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)總二萜類化合物大多具有多種顯著的藥理活性，發(fā)明人從而推測以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物的防治骨質(zhì)疏松癥作用的臨床藥效，應(yīng)主要是通過活性部位以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備的提取物藥效來發(fā)揮的，研究結(jié)果也證明和證實了一種中藥提取物具有顯著的藥理活性。
也就是說，本發(fā)明通過對包括以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備的中藥提取物進行系統(tǒng)的活性和應(yīng)用研究，并篩選和證明該復方的組成和用途。
(二)一種中藥提取物的組成和制備方法發(fā)明人通過對以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物等進行系統(tǒng)的實驗研究和理論探索，包括化學成分分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定，藥理，藥劑，中藥配伍等實驗研究和分析，發(fā)現(xiàn)該中藥提取物的配方按君、臣、佐、使的關(guān)系等進行配方，各主要組分分別為以牛膝、黃柏、蒼術(shù)為原料制備提取物。
其中，以牛膝為原料制備提取物為補腎強骨類藥物；能夠用于替代牛膝的藥材是包括川牛膝、淫羊藿、補骨脂、續(xù)斷、女貞子、韭菜子或狗脊等中的一種或多種，優(yōu)選淫羊藿。
其中，黃柏為清熱解毒類藥物，能夠用于替代黃柏的藥材是包括黃連、金銀花、墨旱蓮、蒲公英、板藍根、半枝蓮或大青葉等中的一種或多種，優(yōu)選黃連；其中，蒼術(shù)為健脾燥濕類藥物，能夠用于替代蒼術(shù)的藥材是包括白術(shù)或山藥等中的一種或多種，優(yōu)選白術(shù)；
上述中藥提取物中的君藥與臣藥、佐藥、使藥相伍，取其補腎強骨之藥為君藥，以健脾燥濕之藥為輔藥，取其清熱解毒之藥為佐使藥，各藥協(xié)同作用，共成補腎強骨之功效。
本發(fā)明以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為主要原料制備的提取物對骨質(zhì)疏松癥具有明顯的調(diào)節(jié)作用，能夠用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品，尤其是抗骨質(zhì)疏松癥藥物。其提取物可采用三味藥合提或單味藥先單提、后精制再混合的方法制備，經(jīng)藥理實驗證明其對骨質(zhì)疏松癥具有顯著的防治作用。
該中藥提取物的組成為蒼術(shù)揮發(fā)油占10～25％(重量百分比，下同)，優(yōu)選10～20％；黃柏總生物堿占25～45％，優(yōu)選30～40％；牛膝總皂苷占10～40％，優(yōu)選20～30％；牛膝總甾酮占5～15％，優(yōu)選10～15％；其他成分占15～45％。
從本質(zhì)上講，本發(fā)明所述的該中藥提取物的制備方法，是包括溶劑提取法在內(nèi)的本領(lǐng)域公知的所有可以使用的方法，優(yōu)選溶劑提取法。
所述的溶劑提取法是包括常用的熱回流提取、連續(xù)逆流提取、超聲提取法、浸漬提取法、滲漉提取法、煎煮提取法或連續(xù)回流提取法中的一種或多種，提取次數(shù)是一次或多次；優(yōu)選超聲提取法、滲漉提取法、連續(xù)逆流提取或加熱回流提取法中的一種，提取次數(shù)是多次；進一步優(yōu)選加熱回流提取法，提取次數(shù)是多次。
所述的加熱回流提取法所使用的提取溶劑是包括常見的水試劑、親水性的有機溶劑或親脂性的有機溶劑三類提取溶劑中的一種或多種；所述的水試劑是包括水、酸水或堿水中的一種；所述的親水性的有機溶劑是包括乙醇、乙醇水溶液或甲醇中的一種或多種；所述的親脂性的有機溶劑是包括石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷中的一種或多種。
下面，就本發(fā)明提取物可采用的兩種制備方法進行詳細闡述方法一、合提法(1)配方和配比蒼術(shù)1～5份，黃柏1～5份，牛膝1～5份；優(yōu)選蒼術(shù)1～3份，黃柏1～3份，牛膝3～5份例；進一步優(yōu)選蒼術(shù)1～1.5份，黃柏2～3份，牛膝4～5份；需要強調(diào)的是，當蒼術(shù)、黃柏、牛膝配比與其作用和效果有較大的關(guān)系當三者比為3∶2∶1時，該配方則為三妙丸；當三者之比為3∶2∶0時，該配方則為二妙丸；當三者之比為1∶2∶3時，量比發(fā)生變化導致其作用發(fā)生了巨大變化，也就是說其抗骨質(zhì)疏松癥作用最優(yōu)。
(2)制備提取液分別按比例稱取各原料藥粗粉，蒼術(shù)按藥典法先提取揮發(fā)油備用，殘渣晾干，將上述原料粗粉浸泡于適量提取溶劑中，提取溶劑為0～95％乙醇或甲醇水溶液，按常規(guī)滲漉至皂苷類、生物堿類檢定反應(yīng)呈陰性為止，收集滲漉液，得提取液。本步驟也可采用5～10倍提取溶劑回流提取一到多次，得提取液。
本步驟所用提取溶劑優(yōu)選30～95％乙醇或甲醇，特別優(yōu)選70～95％乙醇?；亓魈崛r優(yōu)選8倍提取溶劑，回流3次，每次2小時。
(3)精制濃縮干燥將上述提取液濃縮至無醇味，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml(25℃)，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱(每Kg藥材用活化濕樹脂1Kg)，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；之后，采用含水低級醇如30～70％乙醇等洗脫吸附柱，并收集該低級醇洗脫液，濃縮該低級醇洗脫液至無醇，收集洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，干燥后粉碎，加蒼術(shù)揮發(fā)油混合即得本發(fā)明粉末。
吸附柱吸附提取液后，優(yōu)選用1～5BV(柱床體積)的水洗滌，洗脫液流速優(yōu)選為0.5～2.5 BV/小時；所述的含水低級醇為含水C1～C5的低級醇，優(yōu)選含水乙醇；該含水低級醇洗脫液濃度為20～70％，優(yōu)選20～70％乙醇水溶液，洗脫液流通速度優(yōu)選為0.5～2.5BV/小時。
所述大孔樹脂通常為聚苯乙烯型多孔性吸附樹脂，優(yōu)選苯乙烯型共聚體的含有酯基或氰基的中等極性吸附樹脂，其結(jié)構(gòu)為大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，例如D-101大孔樹脂、SIPI-40大孔樹脂、AB-8大孔樹脂、ZTC-1大孔樹脂、SP905大孔樹脂、SIPI-2 1大孔樹脂或SIPI-8大孔樹脂等，優(yōu)選ZTC-1大孔樹脂和SP-905大孔樹脂。
在上樣前，應(yīng)當對大孔樹脂進行前處理，以防止有效成分從廢液中流失。在樹脂前處理時，通常先用5％HCl洗脫，后用純化水洗至中性，再用2％NaOH洗脫，后用純化水洗至中性，連續(xù)生產(chǎn)時，用95％乙醇洗柱，后用純化水洗至蜂為零度，即可再次使用。
(4)壓片若將所得提取物粉末與片劑常用輔料混合、壓片，即得片劑，也可按常規(guī)制成膠囊劑、滴丸劑、丸劑、注射劑、膏劑、合劑等不同劑型。
方法二、單提后混合(1)配方和配比蒼木1～5份，黃柏1～5份，牛膝1～5份；優(yōu)選蒼術(shù)1～3份，黃柏1～3份，牛膝3～5份例；進一步優(yōu)選蒼術(shù)1～1.5份，黃柏2～3份，牛膝4～5份。
(2)制備提取液分別按比例稱取各原料藥粗粉，蒼術(shù)按藥典法提取揮發(fā)油后，殘渣加0～95％的乙醇或甲醇水溶液常規(guī)滲漉。分別將黃柏、牛膝原料粗粉浸泡于適量提取溶劑中，提取溶劑為0～95％乙醇或甲醇水溶液，分別按常規(guī)滲漉，分別滲漉至生物堿類、皂苷類成分檢定反應(yīng)呈陰性為止，收集各滲漉液，得各單味藥提取液；本步驟也可分別采用5～10倍提取溶劑回流提取一到多次，得各單味藥提取液。
本步驟提取溶劑優(yōu)選30～95％乙醇或甲醇。特別優(yōu)選蒼術(shù)提取溶劑為85％乙醇；黃柏提取溶劑為85％乙醇；牛膝提取溶劑為85％乙醇。
(3)濃縮干燥分別將上述蒼術(shù)、黃柏、牛膝各單味藥提取液減壓回收至無醇味，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml(25℃)，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱(每Kg藥材用活化濕樹脂1Kg)，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；之后，采用含水低級醇如30～70％乙醇等洗脫大孔樹脂柱，并收集該低級醇洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，干燥后粉碎得粉末A、B、C。
吸附柱吸附提取液后，優(yōu)選用1～5BV(柱床體積)的水洗滌，洗脫液流速優(yōu)選為0.5～2.5 BV/小時；所述的含水低級醇為含水C1～C5的低級醇，優(yōu)選含水乙醇；該含水低級醇洗脫液濃度為20～70％，優(yōu)選20～70％乙醇水溶液，洗脫液流通速度優(yōu)選為0.5～2.5BV/小時。
所述大孔樹脂通常為聚苯乙烯型多孔性吸附樹脂，優(yōu)選苯乙烯型共聚體的含有酯基或氰基的中等極性吸附樹脂，其結(jié)構(gòu)為大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，例如D-101大孔樹脂、SIPI-40大孔樹脂、AB-8大孔樹脂、ZTC-1大孔樹脂、SP905大孔樹脂、SIPI-21大孔樹脂或SIPI-8大孔樹脂等，優(yōu)選ZTC-1大孔樹脂和SP-905大孔樹脂。
在上樣前，應(yīng)當對大孔樹脂進行前處理，以防止有效成分從廢液中流失。在樹脂前處理時，通常先用5％HCl洗脫，后用純化水洗至中性，再用2％NaOH洗脫，后用純化水洗至中性，連續(xù)生產(chǎn)時，用95％乙醇洗柱，后用純化水洗至蜂為零度，即可再次使用。
(4)混合將所得粉末A、B、C與蒼術(shù)揮發(fā)油混合，即得本發(fā)明提取物。
(5)壓片將所得提取物粉末與片劑常用輔料混合、壓片，可得片劑，也可按常規(guī)制成膠囊劑、滴丸劑、丸劑、注射劑、膏劑、合劑等不同劑型。
本發(fā)明的中藥提取物治以脾腎虛衰、氣血不足，調(diào)整機體免疫為本，又顧及風寒之邪，外襲之標，標本并重，并以主藥為基礎(chǔ)，諸藥合用共奏治療之功效。因此，本發(fā)明提取物經(jīng)動物實驗證明具有顯著的防治骨質(zhì)疏松癥的作用，故可用于制備防治骨質(zhì)疏松癥的藥物或食品，例如其能夠與藥學上可接受的輔料制備成任何常用藥物劑型。
(三)中藥提取物的成分驗證方法及其結(jié)果1、蒼術(shù)揮發(fā)油驗證取提取物0.1g，加正已烷2ml，超聲處理品5min，濾過，濾液作為供試品液。另取蒼術(shù)對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005版一部附錄VIB)試驗，吸取上述新制備的兩種溶液各2～6μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％對二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；并應(yīng)顯有一相同的污綠色主斑點(蒼術(shù)素)。
2、牛膝總皂苷鑒定驗證方法取提取物1g，加乙醇20ml，加熱回流40分鐘，靜置。取上清液10ml，加鹽酸1ml，加熱回流1小時后濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚(60～90℃)20ml提取，提取液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取齊墩果酸對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液10～20μl、對照品溶液10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以氯仿-甲醇(40∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜中相應(yīng)的位置上，顯相同的藍色斑點。
3、黃柏小檗堿鑒定驗證方法取提取物0.1g，加甲醇5ml，加熱回流15分鐘，濾過，濾液補充甲醇至5ml，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI B)試驗，吸取上述三種溶液各1μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個黃色熒光斑點。
各組分含量測定方法及結(jié)果1.總生物堿的測定1.1標準曲線的制備 (1)標準溶液的配置精密稱取鹽酸小檗堿對照品5.0mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該液5.0ml，置25ml容量瓶中，加95％乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液。(2)標準曲線的繪制精密吸取對照品母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置于10ml容量瓶中，加入0.1mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻。以95％乙醇為空白，在紫外最大吸收波長345nm下測定吸收值，以吸收值A(chǔ)為縱坐標，濃度C為橫坐標，得出回歸方程A＝6.5234C，R＝0.9997。
1.2樣品溶液制備精密稱取提取物50.0mg，置于50ml容量瓶中，先加入少量甲醇，超聲波振蕩溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻備用。
1.3樣品含量測定精密吸取供試液5.0ml，置于中性氧化鋁柱(5g，濕法裝柱，乙醇預洗)，95％乙醇洗脫，收集洗脫液，置于25ml容量瓶中，用95％乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取2.0ml此液，置于10ml容量瓶中，加入0.1moL/L鹽酸溶液稀釋至刻度，紫外345nm下測定吸收度，按照標準曲線計算含量。
1.4加樣回收率測定精密稱取已知含量樣品25.0mg，置于25ml容量瓶中，同時加入鹽酸小檗堿對照品2.5mg，甲醇超聲振蕩溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取此液5.0ml上中性氧化鋁柱，按1.3項下方法操作。
1.5方法重現(xiàn)性考察對同一樣品分別按樣品處理方法和測定方法測定。
結(jié)果表明該測定方法準確度好，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。適用于該中藥提取物工業(yè)化生產(chǎn)中總生物堿的含量控制。測定結(jié)果以鹽酸小檗堿計為26.1～42.3％。
2.揮發(fā)油含量測定按照中國藥典一部規(guī)定的方法甲法測定揮發(fā)油，取中藥提取物適量(約相當于含揮發(fā)油0.5～1.0ml)，稱定重量(準確至0.01g)，置燒瓶中，加水300～500ml(或適量)與玻璃珠數(shù)粒，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止。置電熱套中或用其他適宜方法緩緩加熱至沸，并保持微沸約5小時，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達刻度0線上面5mm處為止。放置1小時以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發(fā)油量，并計算供試品中揮發(fā)油的含量(％)。測定結(jié)果揮發(fā)油含量為11.3～21.5％。
3.牛膝總皂苷含量測定3.1標準曲線的繪制精密吸取齊墩果酸對照品(0.1mg/ml)0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml，分別置于具塞試管中，揮干，加入新制的5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，于60℃水浴加熱15min，冰水浴冷卻2～3min，于527nm波長處測定吸收值。以齊墩果酸的濃度(C)對吸光度(A)進行回歸，得回歸方程C＝0.1097A-0.0419(r＝0.9975)。結(jié)果，齊墩果酸檢測濃度在0.01mg～0.05mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
3.2精密度試驗精密吸取對照品溶液0.3ml共5份，按照3.1項下方法顯色后測定吸收度，結(jié)果RSD＝1.16％，表明精密度良好。
3.3供試品液制備取中藥提取物1g，以70％乙醇25ml，超聲提取30min，提取液水浴濃縮至無醇味，加入蒸餾水攪拌并定容至50ml，冷卻后抽濾得澄清液即為供試品液。
3.4回收率試驗取已知濃度提提液5份，每份0.9ml，分別加入齊墩果酸對照品溶液0.1ml，按照3.4項下操作方法制成供試品溶液，測定總皂苷含量。結(jié)果，加樣回收率分別為97.17％、99.13％、98.14％、93.14％、92.15％，平均加樣回收率為96.13％，RSD＝3.1％。
測定結(jié)果，按回歸方程計算中藥提取物中總皂苷含量為17～36％。
4.牛膝總甾酮含量測定4.1對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蛻皮甾酮對照品，甲醇制成ρ(蛻皮甾酮)＝5.02mg/ml的溶液，作為對照品溶液。
4.2樣品溶液的制備精密稱取提取物適量，甲醇制成溶液，作為樣品溶液。
4.3測定波長的選擇取對照品溶液適量于試管中，80℃揮發(fā)去除溶劑，加入0.12ml新鮮配制的香草醛50mg/ml的冰醋酸溶液，高氯酸0.18ml，置60℃水浴中15min，取出放冰水浴中冷卻，加入冰醋酸5ml，搖勻后以試劑作空白對照，用紫外可見分光光度計在400～800nm掃描，樣品最大吸收峰在550nm作為測定波長。
4.4標準曲線的建立和方法學考察分別精密移取蛻皮甾酮的對照品溶液20、30、40、50、60μl于試管中，按4.3項下方法操作，以蛻皮甾酮對照品吸收度A對其濃度C進行線性回歸，得線性方程為A＝0.00327.1C-0.085，r＝0.9970，線性范圍為100.4～301.2μg。經(jīng)方法學考察，在80min內(nèi)，樣品穩(wěn)定性RSD為0.42％，儀器精密度RSD為0.54％，樣品重現(xiàn)性RSD為3.43％，平均加樣回收率為101.1％，RSD為2.02％。
4.5牛膝總甾酮含量的測定分別精密移取樣品溶液100μl，測定吸收度，按標準曲線計算得到牛膝總甾酮的含量為10％～15％。
(四)該中藥提取物的作用及有關(guān)實驗1.提取物對大鼠成骨細胞增殖及礦化功能的影響1.1試劑及材料新生Wistar大鼠為第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，I型膠原酶為Worthington公司產(chǎn)品，小牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品，3H-TdR購自中國科學院上海原子能研究所，四甲基偶氮噻唑藍(簡稱MTT)購自上海生物工程有限公司。對硝基苯酚磷酸二鈉，對硝基苯酚，二乙醇胺均購自上海生化試劑公司，其他均為國產(chǎn)分析純試劑。藥材原料由安徽毫州劉金貴提供，制成提取物(簡稱SMW)。
1.2方法細胞培養(yǎng) 取新生Wistar大鼠，在無菌條件下，分離顱頂蓋骨，剔除骨膜及其他組織，用D-Hank′s液沖洗3次，用眼科剪將骨片剪成1mm×1mm的小塊，加入0.25％的胰蛋白酶，于37℃消化30分鐘，棄上清液，D-Hank′s沖洗3次，加入含0.05％胰蛋白酶及1mg/ml的I型膠原酶的消化液，37℃消化2小時，吸取消化液，經(jīng)140目尼龍網(wǎng)過濾，再用RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗消化的骨殘集，收集沖洗液，過濾后與消化液混合，以1000r/min離心10分鐘，收集細胞，即為新鮮的成骨細胞，加入含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整密度為1×105細胞/ml，接種于100ml的培養(yǎng)瓶中，置37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第二繼代細胞進行以下試驗。
增殖測定 取培養(yǎng)第二代末的成骨細胞，用0.25％胰蛋白酶進行消化，將細胞懸浮在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為1×105細胞/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后，換含不同濃度的楮實子提取液的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時和72小時，培養(yǎng)結(jié)束前4小時，每孔加入20μl的MTT(5mg/ml)，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，每孔加入150μl的DMSO，放置，使形成的甲臜顆粒完全溶解，于550nm處測吸收值。
堿性磷酸酶(簡稱ALP)的活性測定取第二代培養(yǎng)結(jié)束末的成骨細胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，將細胞懸浮在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為1×105細胞/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，培養(yǎng)24小時，細胞貼壁后，換含不同濃度楮實子提取液的10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。用PBS洗滌細胞3次，加入50mmol/L的二乙醇胺200μl，2.5mmol/L的對硝基苯酚磷酸二鈉100μl，37℃反應(yīng)30分鐘，0.3mol/L的NaOH計100μl終止反應(yīng)，取150μl加入96孔板內(nèi)，在酶標儀上于405nm處測其吸光度。標準曲線為不同濃度的對硝基苯酚溶液在405nm處的吸收值與濃度所作的標準曲線。
礦化結(jié)節(jié)形成測定細胞以2.2×104/ml密度接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液為加50ug/ml維生素C和10mmol/L甘油磷酸鈉的10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，2d換液1次，于14d用95％乙醇原位固定，0.1％茜素紅染色(簡稱ARS)30min，用有格滌綸薄膜貼附于培養(yǎng)板底部，低倍光鏡下作礦化結(jié)節(jié)計數(shù)。
1.3結(jié)果中藥提取物對成骨細胞增殖的影響 從表1-1(Tab 1-1 Effect of SMW on proliferation ofosteoblasts Cultured in vitro)可以看出，中藥提取物在48h時間點，在0.25～25mg/L濃度范圍內(nèi)對成骨細胞的增殖呈濃度依賴性增加，以25mg/L濃度作用最強，比陰性對照增加58.3％。在72h時間點，SMW在0.0025～25mg/L濃度范圍內(nèi)對成骨細胞的增殖具有顯著的促進作用，以2.5mg/L濃度作用最強，比陰性對照增加46.7％。
表1-1、中藥提取物對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖的影響(n＝4，x±SD)

備注*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 vs controlConcentration表示濃度，Controle表示對照品。
SMW對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響 從表1-2(Tab 1-2 Effect of SMW on the alkalinephosphatase activity ofosteoblasts Cultured in vitro)可以看出，成骨細胞分泌堿性磷酸酶，隨著培養(yǎng)時間的延長活性逐漸增強，但10d后，活性開始下降。加SMW后，6d時，在0.0025mg/L～0.25mg/L的濃度范圍內(nèi)，對成骨細胞堿性磷酸酶的活性顯著促進作用，以0.025mg/L濃度作用最強，與陰性對照相比，增加31.2％，10d時，0.0025和0.025mg/L的SMW能不同程度增加成骨細胞堿性磷酸酶的活性，差異不顯著性。
表1-2、SMW對體外培養(yǎng)成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響(n＝4，x±SD)

備注*P＜0.05**P＜0.01vs controlALP activity表示ALP活性。
SMW對礦化結(jié)節(jié)形成的影響 見表1-3(Tab 1-3 Effect of SMW on the number ofmineral nodes of osteoblasts ultured in vitro)，成骨細胞培養(yǎng)14d可見礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色后呈現(xiàn)大小、形態(tài)不一的紅色陽性結(jié)節(jié)，SMW的0.025～2.5mg/L濃度組的結(jié)節(jié)形成數(shù)與陰性對照組相比有顯著提高，其中2.5mg/L濃度組與對照組相比提高了18.2％。
表1-3、SMW對體外培養(yǎng)成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響(n＝4，x±SD)

備注P＜0.05**P＜0.01 vs controlnumber of mineral nodes表示礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。
2.SMW對體外培養(yǎng)破骨細胞的影響破骨細胞是調(diào)控骨吸收的多核細胞，其前體細胞為血性來源的細胞，如骨髓單核細胞、脾臟細胞等，這些細胞在骨調(diào)激素和局部因子的作用下，可以分化形成多核破骨細胞。參與骨吸收的激素，如1，25(OH)2D3、PTH和PGE等，在骨髓細胞培養(yǎng)中，明顯刺激破骨細胞樣多核細胞的形成。成骨細胞參與破骨細胞形成和分化過程，成骨細胞分泌一些因子促進破骨細胞的形成和分化。本實驗采用成骨細胞和骨髓單核細胞聯(lián)合培養(yǎng)，在1，25(OH)2D3和地塞米松誘導下，使骨髓單核細胞分化為破骨細胞，考察SMW對破骨細胞的作用。
2.1材料和試劑3～4d的Wistar大鼠購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心。成骨細胞培養(yǎng)所用試劑同前，α-MEM培養(yǎng)基，新生胎牛血清，均為Gibco公司產(chǎn)品，1，25-二羥基維生素D3(1，25-(OH)2VitaminD3)，地塞米松，萘酚AS-BI磷酸鹽，六偶氮副品紅，均為Sigma公司產(chǎn)品。乙二醇單甲醚，酒石酸鉀鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。
2.2方法破骨細胞培養(yǎng) 選取3～4d的新生Wistar大鼠，頸椎拉斷處死，以體積分數(shù)為75％的乙醇浸泡5分鐘，在無菌條件下分離股骨，用5ml含10-8M的1，25-二羥基維生素D3和10-7M地塞米松及10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將骨髓內(nèi)的細胞沖出。用PBS緩沖液洗細胞2次。即得新鮮的骨髓細胞。將骨髓細胞和成骨細胞共同懸浮在含10-8M的1，25-二羥基維生素D3，10-7M的地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，使成骨細胞的濃度為105細胞/ml，骨髓單核細胞的濃度為106細胞/ml，接種于6孔板內(nèi)，每孔1.5ml，板內(nèi)置一蓋玻片。于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
抗酒石酸酸性磷酸酶活性測定如前所述，將成骨細胞和骨髓單核細胞懸浮于含10-8M的1，25-二羥基維生素D3，10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，使成骨細胞的濃度為105細胞/ml，骨髓單核細胞為106細胞/ml，將細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8天后，破骨細胞分化成熟，換含不同濃度SMW的α-MEM培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)24，48及72小時，棄上清液，用PBS洗滌兩次，用10μl的0.1％的區(qū)拉通破碎細胞，15分鐘后加入反應(yīng)液(反應(yīng)液的配制稱取對硝基苯基磷酸二鈉0.4g，用去離子水溶解，加入酒石酸鉀2.0g，加水溶解至150ml，用1N的HCl調(diào)節(jié)PH至3.5，再加去離子水至200ml。)100μl，于37℃反應(yīng)30分鐘，迅速加入100μl的1N的氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，于波長410nm處測定其吸收值，以對硝基苯酚溶液作標準曲線，以每孔生成的對硝基苯酚的納摩爾數(shù)表示抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。
骨吸收陷窩面積的測定將成骨細胞懸液和骨髓單核細胞共同懸浮在含10-8M的1，25-二羥基維生素D3，10-7M的地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度，使成骨細胞的濃度為105細胞/ml，骨髓單核細胞的濃度為106細胞/ml，取96孔培養(yǎng)板，每孔中放一無菌的牛皮質(zhì)骨骨片，將細胞懸液100μl接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時后，換含不同濃度的SMW及10-8M的1，25-二羥基維生素D3，10-7M的地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10天(每2天換液一次)，棄培養(yǎng)基，取出骨片，70％乙醇中固定，過夜，伊紅染色，中性樹膠封片。用計算機圖像處理系統(tǒng)計算骨片上骨吸收陷窩的面積。
2.3結(jié)果SMW對破骨細胞產(chǎn)生抗酒石酸酸性磷酸酶的影響 從表1-4(Tab 1-4 Effects of SMWon TRAP activity ofosteoclasts in cultures)可知，破骨細胞分泌抗酒石酸酸性磷酸酶隨著時間的延長活性逐漸增強。在24h時間點，SMW在0.25～25mg/L的濃度范圍內(nèi)，濃度依賴地抑制破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶的產(chǎn)生；在48h時間點，2.5及25mg/L的SMW作用于破骨細胞后，其抗酒石酸酸性磷酸梅的活性與對照比較分別下降16.27％、25.44％；在72h時間點，2.5～25mg/L的SMW濃度依賴地抑制破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶的產(chǎn)生，與對照組比較，分別下降了16.88％和24.87％，并且與對照比較具有顯著性差異。
表1-4、SMW對破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影響(n＝3，x±SD)

備注*P＜0.05**P＜0.01 vs control表1-5、SMW對破骨細胞形成的骨吸收陷窩面積的影響(n＝3，x±SD)

備注*P＜0.05**P＜0.01 vs controlSMW對破骨細胞形成的骨吸收陷窩面積的影響從表1-5(Tab 1-5 Effect of SMW onthe pit area on bone slices formed by osteoclast in cultures)可以看出，將牛皮質(zhì)骨骨片與新生大鼠顱蓋骨成骨細胞和骨髓單核細胞共同培養(yǎng)，在1，25-二羥基維生素D3和地塞米松的誘導下，骨髓單核細胞分化形成破骨細胞，并在牛皮質(zhì)骨骨片上形成吸收陷窩。SMW能夠抑制破骨細胞性骨吸收陷窩的形成。SMW在0.0025～0.25mg/L及25mg/L的濃度下，顯著降低破骨細胞性骨吸收陷窩的面積，抑制率分別為14.91％、20.62％、12.58％和15.33％。
2.4討論破骨細胞(osteoclast)是一種多核的巨細胞，在骨的重吸收和改建過程中，主要是進行骨吸收。破骨細胞中的溶酶體酶在破骨細胞中，形成一個局部酸性的微環(huán)境。再由不同的酸性水解酶溶解骨的無機鹽和有機質(zhì)，并被吸收到破骨細胞內(nèi)，然后排到細胞外液，從而完成其重吸收過程，使骨的局部形成陷窩。SMW能夠抑制1，25-二羥基維生素D3誘導的骨髓單核細胞分化形成破骨細胞，從而抑制了骨重建過程中的骨吸收，減少了骨量的丟失。
抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨細胞的標志酶之一，其活性與破骨細胞的骨吸收作用直接相關(guān)。SMW通過抑制成熟破骨細胞產(chǎn)生抗酒石酸酸性磷酸酶，抑制骨吸收，并且能夠抑制骨片上破骨細胞性骨吸收陷窩的形成。
根據(jù)《中藥新藥研究的技術(shù)要求》有關(guān)規(guī)定，對該中藥提取物(干浸膏粉)進行了急性毒性的最大給藥量試驗。
選取健康6周齡昆明小鼠20只，雌雄各半。24小時內(nèi)以該中藥提取物最大濃度、最大體積灌胃給藥2次，間隔3小時，該最大給藥量為660g生藥/kg/日，連續(xù)觀察7天。結(jié)果動物未見中毒死亡，也未出現(xiàn)嚴重毒性反應(yīng)。該劑量為臨床人用量的180倍以上。
本試驗觀察連續(xù)反復給予以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物膠囊對大鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物(干浸膏粉)制成膠囊。SD大鼠，6周齡120只，隨機分為大劑量組，30只，8g生藥/kg·d(約相當于臨床劑量的60倍)中劑量組，30只，4g生藥/kg·d(約相當于臨床劑量的30倍)小劑量組，30只，1.33g生藥/kg·d(實驗有效劑量，約相當于臨床劑量的10倍)蒸餾水組，30只，灌服等容積蒸餾水1ml/100g體重。連續(xù)給藥六個月，停藥后繼續(xù)觀察1個月。
結(jié)果大鼠自始至終一般狀態(tài)良好，活動正常，未見任何癥狀和死亡；血液學、血液生化學、病理學檢查在給藥中期(3個月)、給藥結(jié)束(6個月)和恢復期(停藥1個月)均未見到與藥物明顯相關(guān)的毒性反應(yīng)。
結(jié)論以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物膠囊大鼠6個月灌胃給藥長期毒性試驗未發(fā)現(xiàn)明顯毒性。
(五)該中藥提取物的用途1、概述骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。中國已步入老齡化社會，有1億以上的人患有不同程度的骨質(zhì)疏松癥，預計每年因骨質(zhì)疏松癥而并發(fā)骨折人數(shù)的百分率也將在兩位數(shù)以上。
以上的實驗研究證明以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物活性部位中的主要成分為揮發(fā)油、皂苷、甾醇和總生物堿類化合物，該中藥提取物具有顯著的藥理活性，發(fā)明人因此認定以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備的提取物所具有的防治骨質(zhì)疏松癥作用的臨床藥效，應(yīng)主要是通過活性部位以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備的提取物藥效來發(fā)揮的，當三者組成之比為1∶2∶3時活性最強。
本發(fā)明所指的該中藥提取物主要由中藥以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物等組成，能清熱解毒、祛風、益氣、活血，能夠用于治療骨質(zhì)疏松癥等疾病，本發(fā)明的實驗結(jié)果顯示該中藥提取物有較好療效，上述實驗為該中藥提取物臨床用于治療骨質(zhì)疏松癥，提供了更多的藥理學依據(jù)。由此可見該中藥提取物具有的作用，是該中藥提取物對骨質(zhì)疏松癥治療的機理之一。
2、該中藥提取物的使用方法與要求本發(fā)明該中藥提取物可以單獨或與其它活性組分聯(lián)合使用，包括用于制備用于診斷、檢測、預防、保護、治療或研究相關(guān)疾病的產(chǎn)品，包括藥物、試劑、食品或飲料等，尤其是藥物。
在具體使用方面，本發(fā)明所述的該中藥提取物能夠單獨使用，還能夠與其他許多化學物質(zhì)一起使用。無論這些化學物質(zhì)是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，包括輔助功能如協(xié)同放大作用、拮抗或緩解該中藥提取物的副作用等，這些化學物質(zhì)是包括醫(yī)藥學上可接受的載體、食品、天然產(chǎn)物、化學合成藥物或人類用藥等中的一種或多種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學上可接受的載體或者食品等中的一種或多種；進一步優(yōu)選醫(yī)藥學上可接受的載體。
所述的有活性的化學物質(zhì)是包括有治療作用的化學物質(zhì)，或者是對治療有輔助作用的化學物質(zhì)等中的一種或多種。有治療作用的化學物質(zhì)是包括雌激素、雙磷酸鹽類等中的一種或多種，對治療有輔助作用的化學物質(zhì)包括鈣劑、植物雌激素等物質(zhì)中的一種或多種。
本文使用的“醫(yī)藥學上可接受的載體”包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。醫(yī)藥學上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇等等及其組合物中的一種或多種。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉等中的一種或多種。醫(yī)藥學上可接受載體還可以包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等中的一種或多種，它們增強了該中藥提取物的有效期或效力。
從具體的分類上看，所說的醫(yī)藥學上可接受的載體是指醫(yī)藥學領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括賦形劑，如淀粉或水等中的一種或多種；潤滑劑，如甘油或硬脂酸鎂等中的一種或多種；崩解劑，如微晶纖維素等；填充劑，如淀粉或乳糖等中的一種或多種；粘接劑，如預膠化淀粉、糊精、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等中的一種或多種；滲透壓調(diào)節(jié)劑，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一種或多種；稀釋劑，如水等；崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉等中的一種或多種；吸收促進劑，如季銨化合物等；表面活性劑，如十六烷醇等；吸附載體，如高嶺土或皂粘土等中的一種或多種；潤滑劑，如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇等中的一種或多種；另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑或甜味劑等中的一種或多種。
例如，將活性組分該中藥提取物溶解、混懸或乳化于適宜的水性溶劑中(例如，蒸餾水、生理鹽水或格林溶液等中的一種或多種)或油性溶劑中(例如，植物油例如橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一種或多種)中，即可制得注射制劑，其中溶劑中可含有分散劑(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一種或多種)、滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如，氯化鈉、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一種或多種)。在這種情況下，如有必要，可加入添加劑，例如增溶劑(例如，水楊酸鈉或醋酸鈉等中的一種或多種)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白等)、止痛劑(例如，苯甲醇等)等。
本發(fā)明所述及的該中藥提取物還可以以組合物的形式聯(lián)合使用，特別是與用其它化學物質(zhì)如藥物對動物尤其是哺乳動物包括人或其他動物進行治療所用的組合物或者是類似的組合物。所述哺乳動物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、豬、馬、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、獼猴或恒河猴等中的一種或多種。例如，可以將本發(fā)明該中藥提取物加入適于給與受治療者的藥用組合物中。通常，該藥用組合物包含本發(fā)明該中藥提取物和藥學上可接受的載體。
該中藥提取物的組合物特別是藥物組合物可以有各種形式，包括例如液體、半固體和固體等劑量形式中的一種或多種；其中所說的藥物組合物包括治療有效量的該中藥提取物為活性成分，以及一種或多種醫(yī)藥學上可接受的載體。
該中藥提取物的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)生產(chǎn)方法制成各種劑型，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑或注射劑等中的一種或多種，采取口服或注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種)、粘膜透析等中的一種或多種給藥途徑進行抗骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)病癥的診斷、檢測、治療或科學研究。
藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.5～99％的活性成分該中藥提取物，進一步優(yōu)選含有重量比為1～95％的活性成分該中藥提取物，最優(yōu)選含有重量比為5～90％的活性成分該中藥提取物。
該中藥提取物的藥物組合物一般必須無菌且在生產(chǎn)儲存條件下穩(wěn)定?？梢詫⒃摻M合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將所需量的該中藥提取物與所需上述成分的一種或組合一起加入適當?shù)娜軇┲胁⒔又M行除菌過濾制備無菌注射液。一般而言，通過將該中藥提取物加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥劑。例如，通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當流動性。通過在該組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽或明膠)可以達到注射組合物的延長吸收。
用于患者時，本發(fā)明所述的該中藥提取物劑量為5～20mg/kg·d，該劑量或用量通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。
本發(fā)明該中藥提取物及其藥用組合物可以包括“治療有效量”或“預防有效量”的本發(fā)明該中藥提取物?！爸委熡行Я俊笔侵冈诒匾膭┝亢蜁r間下有效達到所需治療效果的量。該中藥提取物的治療有效量可以根據(jù)諸如個體的病況、年齡、性別和體重以及該中藥提取物在該個體引起所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦指該中藥提取物的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量?！邦A防有效量”是指在必要劑量和時間下有效達到所需預防效果的量。因為預防劑量用于患病前或疾病早期的受治療者，預防有效量通常小于治療有效量。本發(fā)明該中藥提取物的治療或預防有效量的典型的非限制性范圍是5～20mg/kg，更優(yōu)選為5～10mg/kg。應(yīng)注意，劑量值將根據(jù)欲減輕的疾病類型和嚴重性變化，也就是說用于患者時，本發(fā)明所述的該中藥提取物的劑量或用量，通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。另外，應(yīng)理解，對于任何特定受治療者，應(yīng)隨著時間根據(jù)個體需要和給與或監(jiān)督給與所述組合物的人的專業(yè)判斷調(diào)整特定劑量制度，并且本文設(shè)定的劑量范圍僅為例證性的，并不會限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵺`。
也就是說，需要根據(jù)治療的對象、給藥途徑、所治療疾病和狀況等，變化本發(fā)明該中藥提取物的每次和/或每日的劑量或用量。例如，經(jīng)靜脈給予哺乳動物，尤其是成年人(如體重60kg)，所述該中藥提取物的單劑量約為5～10mg，優(yōu)選約10mg，優(yōu)選每日給藥1～3次?？梢哉{(diào)整劑量單位，以提拱最佳所需反應(yīng)(例如治療或預防應(yīng)答)。例如，可以單次大劑量給藥，可以在一段時間內(nèi)給予幾個均分量或根據(jù)治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配制易于給藥和劑量統(tǒng)一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式，指適于欲治療的哺乳動物受治療者的單元劑量的物理分離單位；每個單位含有預定量的計算用于與所需藥用載體一同產(chǎn)生所需治療效果的活性物該中藥提取物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格，由以下確定并直接取決于以下(a)該中藥提取物的獨特特征和欲達到的特定治療或預防效果，和(b)在混合這種用于治療個體敏感性該中藥提取物的技術(shù)中的內(nèi)在限制。
3、該中藥提取物的藥物劑型和給藥途徑本發(fā)明所述的該中藥提取物制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品，其中按照飲料、食品技術(shù)領(lǐng)域的要求制備的產(chǎn)品能夠診斷、檢測、預防、保護、治療或研究骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥；按照醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的要求制備的產(chǎn)品能夠用于患者的治療或保健，既能夠單獨直接用于制備治療或保健的藥物，也能夠與許多化學物質(zhì)進行混合或組合，直接或間接用于制備治療或保健的藥物。這里所述的化學物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。
在本發(fā)明中，所需物料包括本發(fā)明的原料、上述配套使用的化學物質(zhì)等，均應(yīng)根據(jù)實際情況和需要，采用食品級或藥用級的物料。
本發(fā)明所述的該中藥提取物，可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥，盡管在許多治療用途中推薦的給藥途徑/給藥方式是口服給藥。但是，技術(shù)人員會理解給藥途徑/給藥方式隨所需的結(jié)果而變化。在某些具體實施中，該活性化合物可以與保護該化合物免于快速釋放的載體一同制備例如空釋制劑，包括移植物傳遞系統(tǒng)、透皮貼傳遞系統(tǒng)或微囊傳遞系統(tǒng)等中的一種或多種。此外，還可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一種或多種。制備這種制劑的許多方法均已申請專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(參見例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，紐約，1978)。
本發(fā)明所述的該中藥提取物，通常通過口服、直腸或腸胃外給藥等中的一種或多種方式，施用于需要這種治療的患者。
用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粒劑或膠囊等中的一種或多種。在實施時，本發(fā)明該中藥提取物可以與例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一同口服。該中藥提取物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或軟殼明膠膠囊、壓制成片劑或直接加入受治療者的膳食中。關(guān)于口服治療給藥，可以將所述該中藥提取物與賦形劑一起加入并以可食片劑、頰含片劑、酊劑、膠囊、懸液、糖漿或糯米紙囊劑等等中的一種或多種形式使用。
為了以非腸道給藥之外給予本發(fā)明該中藥提取物，可能需要用防止其失活的材料對該中藥提取物包衣或與該中藥提取物一同給予。亦可以將補充的活性化合物加入該組合物中。在具體實施時，將本發(fā)明該中藥提取物與一種或多種可以用于治療疾病的其它治療藥物共配制和/或共給予。這種聯(lián)合使用，可以優(yōu)越地利用較低劑量的該給予的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。
制成液體制劑如水劑、油懸浮劑或其它液體制劑中的一種或多種，如糖漿或酏劑等中的一種或多種；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液劑、水劑或油性懸浮劑等中的一種或多種。
以上所述的使用形式中，優(yōu)選的形式是顆粒劑、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑或注射劑等中的一種或多種，進一步優(yōu)選顆粒劑、片劑、包衣片劑或膠囊等中的一種或多種，特別優(yōu)選顆粒劑、包衣片劑。
此外，該中藥提取物所使用的藥材原料在某些情況下也能夠單獨直接用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品，也能夠與許多化學物質(zhì)進行混合或組合，以組合物的形式直接或間接用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品。這里所述的化學物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。
例如，該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品特別是藥物的各種劑型，或者是該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔料用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品尤其是藥物的各種劑型，或者是該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品如藥物一起用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品如藥物的各種劑型，或者是該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品如藥物的各種劑型，如優(yōu)選顆粒劑、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑或注射劑等中的一種或多種，特別優(yōu)選包衣片劑。
所述的方法之一是將該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末灌裝為膠囊劑，方法之二是將該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品如藥物一起灌裝為膠囊劑，方法之三是將該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起灌裝為膠囊劑；方法之四是將該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔料一起按常規(guī)方法直接壓為片劑或顆粒劑，方法之五是將該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末、有關(guān)的制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品如藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑或顆粒劑，方法之六是將該中藥提取物所使用的藥材原料的粉末、有關(guān)的輔助藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑或顆粒劑等。
除上述的六種基本方法外，還能夠選擇該中藥提取物所使用的藥材原料的其他形式或?qū)υ撝兴幪崛∥锼褂玫乃幉脑线M行本領(lǐng)域公知的方法處理后，制備各種劑型的含有該中藥提取物所使用的藥材原料的產(chǎn)品如藥物。但是，需要注意的是，在上述直接使用該中藥提取物所使用的藥材原料的時候，應(yīng)先根據(jù)所使用的該中藥提取物的劑量要求，換算得到所需要使用的該中藥提取物所使用的藥材原料的用量。
綜上所述，本發(fā)明該中藥提取物可用于制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品，優(yōu)選藥物和食品，進一步優(yōu)選藥物。
(六)技術(shù)特長本發(fā)明有針對性地研究一種中藥提取物，該原料使用安全，互為兼顧，一物多用，最大限度地發(fā)揮了作用，而且使用范圍特別廣，因此容易推廣應(yīng)用，能夠在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
也就是說，本發(fā)明的研究結(jié)果可被進一步深入開發(fā)為具有臨床應(yīng)用前景的防治骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品尤其是新藥。該產(chǎn)品具有療效確切、有效劑量低、無毒副作用的優(yōu)點，與同類產(chǎn)品相比具有顯著的優(yōu)勢。骨質(zhì)疏松癥為臨床常見病、多發(fā)病，隨著老齡化的加劇，預計骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)病率將不斷攀升。因此，本發(fā)明還可為后續(xù)的新藥研究打下良好的基礎(chǔ)，并進一步產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益和社會效益。
經(jīng)過長期的藥理學試驗，一種中藥提取物具有抗骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥的活性，直接使用一種中藥提取物，作用更直接，從而克服了中藥給藥劑量難以控制的問題，并提高了生物利用度；而且該中藥提取物藥理作用較強，其原料來源豐富，制備工藝簡單。
本發(fā)明選用經(jīng)典方的三個中藥，經(jīng)優(yōu)化組成，達到最優(yōu)抗骨質(zhì)疏松癥活性，并降低了副作用。
總之，本發(fā)明積極適應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)療和科研領(lǐng)域的工作需要和人性化服務(wù)的需要，是用于抗骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥的安全原料。
具體實施例方式
本發(fā)明研究了一種新的中藥復方及其提取物和用途，提供了一種能夠用于制備抗骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥產(chǎn)品如藥物的原料，便于醫(yī)療行業(yè)和相關(guān)行業(yè)如食品、飲料等領(lǐng)域的安全使用，包括疾病治療、科學研究等。
下面以該中藥提取物的幾個典型配方為例，詳細闡述該中藥提取物的具體配方及其方法。
方法一牛膝600克、黃柏400克、蒼術(shù)200克。
方法二牛膝500克、黃柏400克、蒼術(shù)300克。
方法二牛膝400克、黃柏400克、蒼術(shù)400克。
該中藥提取物的提取方法如下方法一(1)將上述藥材洗凈，浸泡6～24小時后置入提取溶器內(nèi)煎煮2～6次，每次煎煮的時間為0.5～3小時。
(2)將數(shù)次提取的藥液合并，一齊進行濃縮成浸膏。
(3)將浸膏靜置后，加入乙醇進醇沉，回收乙醇去沉淀。
(4)取醇沉后的上清液，濃縮成純浸膏，該純浸膏比重1.0～1.5(得率8～16％)(5)加入輔料制粒干燥過200～400目篩。
(6)包裝成10～15g/袋，成品顆粒。
方法二(1)將上述藥材浸泡6～24小時，置入提取容器中，煎煮2～6次，每次煎煮的時間為0.5～3小時。
(2)將數(shù)次提取藥液合并，一齊進行負壓濃縮成稠膏，該稠膏比重1.0～1.5。
(3)將稠膏負壓真空干燥(-0.085±0.005mpa)，70℃±5℃得干膏(水分＜3％)；粉碎過50～200目篩得干膏細粉，得率為6.8％。
現(xiàn)有的研究表明，其他成分對藥效或藥物的使用等方面至少沒有負面的影響，而且分離這些成分成本較高，因此目前沒有進一步純化的必要。
下面以幾個典型的劑型為例，詳細闡述該中藥提取物各種劑型的具體制備方法。
本發(fā)明制備粉針劑一般采用常規(guī)的冷凍干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取該中藥提取物，加入賦形劑，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，灌裝，半軋塞，冷凍干燥，壓塞軋蓋即可。所用的賦形劑選自甘露醇、水解明膠、葡萄糖、乳糖或右旋糖苷等中的一種或幾種。每瓶含該中藥提取物10～100mg。
本發(fā)明制備粉針劑也可采用噴霧干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取該中藥提取物，加或不加賦形劑(賦形劑同上)，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，噴霧干燥，無菌分裝，壓塞軋蓋即可。每瓶含該中藥提取物10～100mg。
本發(fā)明制備小針劑時，以注射用水作為溶媒配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯或二甲基乙酰胺等中的一種或幾種。每支含該中藥提取物10～100mg。
本發(fā)明制備葡萄糖輸液或氯化鈉輸液，以注射用水作為溶媒，加入適量葡萄糖或氯化鈉配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯或二甲基乙酰胺等中的一種或幾種。每瓶含該中藥提取物10～100mg。
本發(fā)明制備片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等口服制劑，輔料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸鹽等，按常規(guī)技術(shù)制備。
該中藥提取物急性毒性試驗一、試驗?zāi)康挠^察該中藥提取物24小時內(nèi)大量給小鼠口服后的毒性作用。
二、材料1、受試藥物該中藥提取物由安徽省安徽毫州市劉金貴提供原藥材，提取干浸膏粉制成膠囊。
2、動物昆明種小鼠，6周齡，雌雄各半，第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號滬SCXK2002-2006。
三、方法1、實驗環(huán)境第二軍醫(yī)大學實驗動物中心SPF級實驗室。
環(huán)境溫度23℃。
2、給藥途徑灌胃。
3、受試物配制方法稱20g受試藥物，加蒸餾水達80ml(該濃度為動物允許條件下的最高濃度)。每毫升內(nèi)含受試物0.25g。
4、給藥劑量和方法選取健康6周齡昆明種小鼠20只，雌雄各半，禁食過夜(不禁水)。第二天稱重后按0.4ml/10g體重灌胃給藥，3h后按以上劑量重復給藥一次。每次劑量為10g/kg/日，二次給藥劑量達20g/kg/日。
5、實驗觀察給藥后按下表內(nèi)容嚴密觀察動物表現(xiàn)，連續(xù)7天。
四、結(jié)果給藥當天約半數(shù)動物自發(fā)活動明顯減少，出現(xiàn)稀便。第二天起活動自如，基本恢復正常。其它方面未見異常，無死亡。體重增長良好，由給前21.2±0.66g增加為29.1±1.0g。體征觀察結(jié)果見表2。
表2、該中藥提取物急性毒性試驗體征

五、結(jié)論該中藥提取物按最大給藥量給予小鼠，20g/kg/日，相當于生藥量580g/kg/日，動物未出現(xiàn)嚴重毒性反應(yīng)。該劑量是臨床人用量218g(生藥)/60kg/日)的159倍以上。
該中藥提取物對大鼠的長期毒性試驗一、試驗?zāi)康挠^察連續(xù)反復給予該中藥提取物對大鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，確定無毒反應(yīng)的劑量。
二、材料1、受試藥物該中藥提取物由安徽毫州市劉金貴提供原料，實驗組按常規(guī)方法制成顆粒，系為藥效學試驗和長期毒性試驗專門制備的受試物，批號050920。
2、動物SD大鼠，6周齡，雌雄各半，第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號滬SCXK2002-2006。
三、方法1、分組根據(jù)新藥審批辦法和《中藥新藥研究的技術(shù)要求》(國家藥品監(jiān)督管理局中藥新藥研究的技術(shù)要求199922)的規(guī)定，本試驗設(shè)三個劑量組和一個對照組。取6周齡SD大鼠，雌雄各半，實驗前先飼養(yǎng)適應(yīng)一周，取健康正常的動物120只，隨機分為四組大劑量組，30只，8g生藥/kg·d(約相當于臨床劑量的60倍)中劑量組，30只，4g生藥/kg·d(約相當于臨床劑量的30倍)小劑量組，30只，1.33g生藥/kg·d(實驗有效劑量，約相當于臨床劑量的10倍)蒸餾水組，30只，灌服等容積蒸餾水1ml/100g體重。
2、給藥起止日期2005年10月09日～2006年04月11日，共六個月。
3、實驗程序大鼠分組編號后，雌雄分養(yǎng)，每籠5只。連續(xù)給藥六個月。每天觀察其行為表現(xiàn)，糞便性狀及其他癥狀、體征。每周測一次體重和進食量，并根據(jù)體重變化，調(diào)整藥量。給藥三個月時，每組各處死10只動物(雌雄各半)進行大體解剖、病理組織學檢查和血液學檢查、血液生化學檢查。剩余80只動物(每組20只，雌雄各半)繼續(xù)給藥三個月，給藥結(jié)束后，每組再處死10只動物(雌雄各半)進行大體解剖、病理組織學檢查和血液學檢查、血液生化檢查。剩余40只動物(每組10只，雌雄各半)停藥后繼續(xù)觀察一個月，進行大體解剖、病理組織學檢查和血液學檢查、血液生化學檢查。
4、檢測項目(1)體重、進食量每周測定一次。
(2)血液學檢查血球計數(shù)儀測紅細胞(簡稱RBC)計數(shù)、血紅蛋白(簡稱Hb)、白細胞(簡稱WBC)計數(shù)、白細胞分類、血小板(簡稱Plt)計數(shù)。
(3)血液生化學檢查分別用生化分析儀，以乳酸脫氫酶動力學法測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱ALT)，蘋果酸脫氫酶動力學法測定天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱AST)，磷酸對硝基質(zhì)動力學法測堿性磷酸酶(簡稱ALP)，苦味酸動力學法測定肌酐(簡稱Crea)，單一試劑酶學測定法測定總膽固醇(簡稱Tch)，葡萄糖氧化酶法測血糖(簡稱Glu)，二甲基亞砜法測定總膽紅素(簡稱Tbil)，雙縮脲法測定總蛋白(簡稱TP)，溴甲酚綠法測定白蛋白(簡稱Alb)，脲酶-Berthelot比色法測定尿素氮(簡稱BUN)。
(4)病理學檢查臟器指數(shù)心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、胸腺、睪丸和附睪或卵巢和子宮。臟器用濾紙吸去余血，電子天平稱重，乘以100。
病理組織學檢查心、肝、脾、肺、腎、睪丸和附睪或卵巢和子宮。臟器經(jīng)10％福爾馬林固定，常規(guī)取材，酒精、二甲苯處理，石蠟包理，HE染色，光鏡觀察。
四、試驗結(jié)果1、體重及進食時從給藥開始到結(jié)束，各組大鼠活動，糞便等均未見異常。給藥中期結(jié)束期和恢復期的動物體重變化和進食量各給藥組與對照組比較無明顯差異。體重、進食量變化見表3、表4、表5和表6。
表3、該中藥提取物長毒給藥6個月及恢復期雄性大鼠體重變化(X＝SD)


注1、給藥3個月(0～13周)期間，對照組、大劑量組、中劑量組和小劑量組n＝15；2、給藥3個月后至6個月(14～15周)期間，每組n＝10；恢復期(26～30周)每組n＝5。
表4、該中藥提取物長毒給藥6個月及恢復期雌性大鼠體重變化(X＝SD)


表5、該中藥提取物長毒給藥6個月及恢復期雄性大鼠食量變化(X＝SD)


注1、給藥三個月(0～13周)期間對照組、大劑量組、中劑量組和小劑量組n-3籠2、給藥3個月后至6個月(14～15周)期間，各組n-2籠恢復期(26～30周)每組n-1籠。
表6、該中藥提取物長毒給藥6個月及恢復期雌性大鼠食量變化(X＝SD)


2、血液學檢查大鼠腹主動脈取血，作血液學檢查，測定Hb含量、RBC計數(shù)、WBC計數(shù)和分類、血小板計數(shù)。結(jié)果表明用藥三個月后，大劑量組血中自細胞數(shù)、中性粒細胞百分升高，淋巴細胞百分降低(p＜0.05)，但均在正常范圍內(nèi)，中、小劑量組與正常組比較，無顯著差異；其他各組指標給藥組與對照組比較均無顯著差異。用藥六個月后，中劑量組血中血紅蛋白降低(p＜0.05)，但仍在正常范圍內(nèi)，大、小劑量組與正常組比較并無顯著性差異；其他各指標給藥組與對照組比較均無顯著差異?；謴推诟髦笜私o藥組與對照組比較均無顯著差異。給藥三個月后結(jié)果見表7，給藥六個月后結(jié)果見表8，恢復期結(jié)果見表9。
表7、該中藥提取物長毒給藥三個月大鼠血液學檢查(X＝SD)

注1、由于凝血，正常組n＝8；大劑量組n＝9。
2、其余各組n＝10。
表8、該中藥提取物長毒給藥六個月大鼠血液學檢查(X＝SD)

表9、該中藥提取物恢復期大鼠血液學檢查(X＝SD)

3、血液生化學檢查大鼠腹主動脈取血，離心，取血清作血液生化檢查，測定ALT、AST、ALP、BUN、Crea、Chol、Clu、TP、Alb、Tbil。結(jié)果表明給藥三個月后，大劑量組的BUN高于正常組(p＜0.05)，中、小劑量組與正常組比較并無顯著差異。小劑量組的Tbil低于正常組(p＜0.05)，但在正常范圍內(nèi)；給藥六個月生，大、中、小劑量組的Tbil低于正常組，均為在正常范圍內(nèi)的波動，無病理學意義?；謴推诖?、中、小劑量組的Glu低于正常組，小劑量組的TP低于正常組，均為正常范圍內(nèi)的波動，無病理學意義。給藥三個月后結(jié)果見表10，給藥六個月結(jié)果見表11，恢復期結(jié)果見表12。
表10、該中藥提取物長毒給藥三個月大鼠血液生化學檢查(X＝SD)

表11、該中藥提取物長毒給藥六個月大鼠血液生化學檢查(X＝SD)

表12、該中藥提取物長毒恢復期大鼠血液生化學檢查(X＝SD)


注1.*P＞0.05，**P＜0.01，n＝10。
4.病理檢查(1)大體尸解動物處死后，立即解剖，摘取主要臟器，稱取其濕重，求出臟器指數(shù)，以T檢驗作組間比較。結(jié)果表明給藥三個月后，大劑量組腎重高于對照組，中、小劑量組與正常組比較無明顯差異。六個月后恢復期，各劑量組大鼠主要臟器指數(shù)與正常組比較無明顯差異。給藥三個月后結(jié)果見表13，給藥六個月后結(jié)果見表14，恢復期結(jié)果見表15。
表13、該中藥提取物長毒三個月大鼠主要臟器指數(shù)(X＝SD)

注睪丸、子宮、卵巢，n＝5， 其他臟器n＝10表14、該中藥提取物長毒六個月大鼠主要臟器指數(shù)(X＝SD)


注睪丸、子宮、卵巢，n＝5， 其他臟器n＝10表15、該中藥提取物長毒恢復期大鼠主要臟器指數(shù)(X＝SD)

注睪丸、子宮、卵巢，n＝5，其他臟器n＝10(2)病理檢查動物處死后，摘取心、肝、脾、肺、腎、大腦等臟器，經(jīng)10％福爾馬林固定，常規(guī)取材，酒精、二甲苯處理，石蠟包理，HE染色，光鏡下病理檢查。
結(jié)果表明給藥三個月肺臟各組均見輕度間質(zhì)性肺炎變化，肝臟各組均有個別動物出現(xiàn)點狀炎性浸潤灶，均散見于各組(含正常組)，與藥物無明顯關(guān)性。
心、肝、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、睪丸、附件組織病理光鏡下均未見異常改變。
給藥六個月肝組織切片中有兩例見小灶性炎細胞浸潤，該變化與藥物無明顯相關(guān)性。肺臟各組均有少數(shù)組織出現(xiàn)輕度間質(zhì)肺炎病變，其中#1(正常組)和#29(中劑量組)并見輕度小葉性肺炎病理變化。這些變化與藥物無明顯相關(guān)性。心、脾、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪組織病理光鏡下均未見異常改變。
恢復期肝臟組織偶見一例出現(xiàn)輕度細胞脂肪性變。另有7例偶見點狀炎細胞浸潤灶，與藥物無明顯相關(guān)性。肺臟各組動物中都見有較輕的間質(zhì)性肺炎病變，中、小劑量組各見1例少數(shù)肺泡腔中有滲出，上述改變與藥物無明顯相關(guān)性。
五、討論與結(jié)論本試驗該中藥提取物大鼠6個月灌胃給藥，從開始到結(jié)束，各組大鼠活動、糞便等均未見異常，一般狀況良好，未見任何癥狀和體征。體重進食量各給藥組與對照組比較并無明顯差異。
血液學檢查，給藥中期WBC和中性粒細胞百分數(shù)高于正常組，淋巴細胞百分數(shù)低于正常組，但均在本實驗室歷年長毒測試正常范圍內(nèi)(陳長勛，金若敏，李儀奎.等正常SD大鼠的部分生物數(shù)據(jù)測定，動物學雜志1996；31(4)19)。且給藥結(jié)束時(6個月)并未出現(xiàn)這些變化，分析其原因與藥物因素無關(guān)。給藥6個月時，中劑量組Hb降低，但大劑量與正常組比較，反而未見明顯變化，分析中劑量組的變化與藥物無關(guān)。
血液生化學檢查，給藥中期大劑量組BUN高于正常組，但并未超過正常范圍(陳長勛，金若敏，李儀奎.等正常SD大鼠的部分生物數(shù)據(jù)測定，動物學雜志1996；31(4)19)，且給藥結(jié)束時(6個月)該指標與正常組比較并無顯著差異。病理組織學檢查，給藥中期和結(jié)束期均未見給藥組在腎臟方面表現(xiàn)明顯病理變化，故分析認為給藥3個月時BUN的變化與藥物因素無關(guān)。
病理形態(tài)學檢查，給藥中期和6個月時均見有少數(shù)肝臟出現(xiàn)點狀局灶性炎癥，但這些變化可以在正常狀態(tài)下出現(xiàn)，且散見于正常組和給藥各組，故認為與藥物無關(guān)；肺臟病變也散見于正常組和給藥各組，故也認為與藥物無關(guān)。
綜上所述，該中藥提取物長期毒性試驗大鼠自始至終一般狀態(tài)良好，活動正常，未見任何癥狀和死亡；血液學、血液生化學、病理學檢查在給藥中期(3個月)、給藥結(jié)束(6個月)和恢復期(停藥1個月)均未見到與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)。
結(jié)論該中藥提取物大鼠6個月灌胃給藥長期毒性試驗未發(fā)現(xiàn)明顯毒性。
在本發(fā)明中，以上所述的具體實施方式
和以下所述的實例均是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制發(fā)明的范圍。
下面通過實施例對本發(fā)明作詳細描述。
實施例1、該中藥提取物膠囊劑的制備(1)處方該中藥提取物1000.0g微晶纖維素 1000g羧甲基淀粉鈉140g無水乙醇適量滑石粉 80g
共制成 10000膠囊(2)制備工藝 按以上處方分別取原料藥該中藥提取物及處方中其它輔料分別過100目篩，置60℃烘干，稱取處方量該中藥提取物與微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等量遞加法混合均勻，用適量無水乙醇制軟材，30目篩制粒，50～60℃干燥2小時，用30目篩整粒，加入處方量的滑石粉和羧甲基淀粉鈉混合均勻。
實施例2、該中藥提取物片劑的制備取該中藥提取物計80g，微晶纖維素80g、乳糖15g、預膠化淀粉60g，過篩，混合均勻，用適量10％PVP乙醇溶液制軟材，制粒，干燥，加入硬脂酸鎂3g，整粒，壓片，制成1000片。
實施例3、該中藥提取物片劑的制備(1)處方該中藥提取物1000.0g微晶纖維素 1170.0g預膠化淀粉 690.0g乳糖125.0g5％PVP無水乙醇 適量硬脂酸鎂15.0g
共制成 10000片(2)制備工藝按以上處方分別稱取處方量的主藥與輔料，按等量遞加法混合均勻后照處方工藝項下進行制軟材、制顆粒，干燥，整粒等過程，計算好片重后用單沖壓片機和10.5mm淺凹沖模壓片，控制裸片硬度5～7kg，共制得片劑9698片，成品率為96.98％。采用滾轉(zhuǎn)噴霧法包衣，包衣工藝如下包衣液的配制胃溶薄膜衣料85G61235，由上?？房蛋录夹g(shù)有限公司提供包衣工藝將待包衣裸片(硬度5～7kg)放入包衣鍋中，啟動攪拌裝置和鼓風加熱裝置，待裸片溫度升至40℃時，開始打開噴槍對準片床的上1/3處噴入包衣液包衣，控制片床溫度38～42℃，氣磅壓力6kg，包衣液流速為50ml/min，包衣膜重占包衣片重的3％。
實施例4、該中藥提取物的制備方法(1)將該中藥提取物的各藥材洗凈，浸泡12小時后置入提取溶器內(nèi)煎煮三次，時間為1小時、1小時、0.5小時。
(2)將三次提取藥液合并一齊進行濃縮成浸膏。
(3)將浸膏靜置后，加入乙醇進醇沉，回收乙醇去沉淀。
(4)取醇沉后的上清液濃縮成純浸膏，該純浸膏比重1.2～1.3(得率12.5％)。
(5)加入輔料制粒干燥過300目篩。
(6)包裝成10g/袋，成品顆粒。
實施例5、該中藥提取物的制備方法合提法之一(1)制備提取液 取蒼術(shù)粗粉1kg(先提取揮發(fā)油)、黃柏粗粉2kg、牛膝粗粉3kg，加95％乙醇3000ml，浸泡24小時，按常規(guī)滲漉，控制滲漉速度3～5ml/分鐘，滲漉過程中隨時添加溶劑，滲漉至生物堿、皂苷類成分檢定反應(yīng)呈陰性為止，收集滲漉液，即為提取液。
(2)制備提取物將上述提取液減壓回收溶劑至無醇味，過濾除去懸浮物和不溶性雜質(zhì)，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml(25℃)，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱(每Kg藥材用活化濕樹脂1Kg)，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；繼續(xù)用50％乙醇洗脫大孔樹脂柱，收集洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，與蒼術(shù)揮發(fā)油混合，得提取物粉末121.0g。TLC檢定含生物堿及皂苷類成分，以總生物堿含量為指標，用HPLC法測定總生物堿含量13.55％。
(3)制備制劑配方及配比提取物粉末100g淀粉 40g乳糖 30g微晶纖維素30g7％淀粉漿 適量硬脂酸鎂 1％按上述配比將提取物粉末、淀粉、乳糖、微晶纖維素分別過80目篩，混勻，再過40目篩3次，將上述混合粉用7％淀粉漿制軟材，過24目篩粒，50℃干燥2小時，干燥顆粒過30目篩整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，得片劑1000片。
實施例6、該中藥提取物的制備方法合提法之二取蒼術(shù)粗粉1kg(先提取揮發(fā)油)、黃柏粗粉2kg、牛膝粗粉3kg，浸泡于15000ml蒸餾水中，加熱煎煮2次，每次1小時，過濾，濃縮濾液至1.05g/ml(25℃)，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱(每Kg藥材用活化濕樹脂1Kg)，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；繼續(xù)用50％乙醇洗脫大孔樹脂柱，收集洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，干燥后粉碎，得提取物粉末131.40g，TLC檢定含生物堿類、皂苷類成分，HPLC法測定總生物堿含量11.10％。
已有研究表明小檗堿類成分具有抗骨質(zhì)疏松癥作用，實施例2與實施例1比較，提取物粉末得率稍高，總生物堿類成分含量相似，所用溶劑為廉價無污染的水，因此實施例2為適合規(guī)模生產(chǎn)制備方法。
實施例7、該中藥提取物的制備方法合提法之三(1)制備提取液 取蒼術(shù)粗粉1kg(先提取揮發(fā)油)、黃柏粗粉2kg、牛膝粗粉3kg，加95％乙醇3000ml，浸泡24小時，加熱回流3次，每次2小時，合并3次回流的提取液，濾過。
(2)制備提取物 將上述提取液減壓回收溶劑至無醇味，過濾除去懸浮物和不溶性雜質(zhì)，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml(25℃)，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱(每Kg藥材用活化濕樹脂1Kg)，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；繼續(xù)用50％乙醇洗脫大孔樹脂柱，收集洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，與蒼術(shù)揮發(fā)油混合，得提取物粉末113.0g。TLC檢定含生物堿及皂苷類成分，以總生物堿含量為指標，用HPLC法測定總生物堿含量12.3％。
(3)制備制劑配方及配比提取物粉末100g淀粉 40g乳糖 30g微晶纖維素30g7％淀粉漿 適量硬脂酸鎂 1％按上述配比將提取物粉末、淀粉、乳糖、微晶纖維素分別過80目篩，混勻，再過40目篩3次，將上述混合粉用7％淀粉漿制軟材，過24目篩粒，50℃干燥2小時，干燥顆粒過30目篩整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，得片劑1000片。
實施例8、該中藥提取物的制備方法(1)將該中藥提取物的各藥材用8倍量蒸餾水浸泡12小時，置入提取容器中，煎煮三次，時間為1小時、1小時、0.5小時。
(2)將三次提取藥液合并一齊進行負壓濃縮成稠膏，該稠膏比重1.3。
(3)將稠膏負壓真空干燥-0.085±0.005mpa，70℃±5℃得干膏(水分＜3％)；粉碎過80目篩得干膏細粉，得率為6.8％。
實施例9、該中藥提取物的制備方法單提法分別稱取蒼術(shù)粗粉1kg(先提揮發(fā)油)、黃柏粗粉2kg、牛膝粗粉3kg，分別將上述各原料粗粉加95％乙醇1000ml浸泡，分別按常規(guī)滲漉，蒼術(shù)、黃柏、牛膝分別滲漉至生物堿類、皂苷類成分檢定反應(yīng)呈陰性為止，收集滲漉液，得各單味藥提取液；分別將各單味藥提取液減壓回收至無醇味，過濾得濾液，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml(25℃)，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱(每Kg藥材用活化濕樹脂1Kg)，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；繼續(xù)用50％乙醇洗脫大孔樹脂柱，收集洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，干燥后粉碎，分別得33.2g蒼術(shù)粉末A、47.1g黃柏粉末B、32.40g牛膝粉末C。將A、B、C與蒼術(shù)揮發(fā)油混合，即得本發(fā)明提取物粉末，TLC檢定含生物堿、皂苷類成分，HPLC法測定總生物堿含量11.43％。
實施例10、藥理實驗維甲酸可造成骨質(zhì)疏松癥，羥乙基膦酸鈉是目前臨床上用于防治骨質(zhì)疏松癥的藥物。通過藥理實驗，觀察本發(fā)明中藥提取物防治骨質(zhì)疏松癥作用。
1實驗材料1.1動物SD大鼠 第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號第二軍醫(yī)大學SCXK(滬)2002-0006。
1.2藥物羥乙基膦酸鈉第二軍醫(yī)大學藥學院新藥評價中心提供，用0.5％CMC-Na配成2.0％混懸液維甲酸 上海第六制藥廠 批號200106012 用0.5％CMC-Na配成1.5％混懸液提取物A由實施例1制備用0.5％CMC-Na配成相當于原藥材2g/ml混懸液提取物B由實施例2制備用0.5％CMC-Na配成相當于原藥材2g/ml混懸液CMC-Na上?；瘜W試劑公司1.3儀器QCT-骨密度分析系統(tǒng) 美國LACA公司2方法與結(jié)果2.1對實驗性骨質(zhì)疏松癥的預防作用SD大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，即正常對照組(溶劑組)、模型對照組、陽性對照組(羥乙基膦酸鈉組)，實驗組A(實例1所得提取物，分高低劑量)、實驗組B(實例2所得提取物，分高低劑量)，除正常對照組外，其余各組大鼠均灌胃給予維甲酸0.5ml/kg，每天1次，連續(xù)14天，給予維甲酸的同時，各用藥組按表1的給藥劑量灌胃給藥每天1次，連續(xù)28天，正常對照組及模型組給予0.5％CMC，服用量均為每公斤體重0.5ml，其間每周稱體重1次，并據(jù)此調(diào)整給藥用量。第29天斷頭處死，取大鼠雙側(cè)股骨，剝凈肉及其它組織，其中一側(cè)股骨在雙能X線骨密度儀上作大鼠股骨掃描，測出骨密度(g/cm2)，然后于120℃烘干一小時，再置于mnffer爐內(nèi)200℃、400℃、600℃、800℃各灰化2小時，灰化結(jié)束冷卻后，稱灰重(Wash·g)，用6N的HCL提取鈣、磷后測定骨灰鈣、骨灰磷含量。
另一側(cè)股骨制作脫鈣石蠟切片，顯微鏡下觀察骨結(jié)構(gòu)。結(jié)果見表16。由表16可見，本發(fā)明提取物組大鼠的股骨股密度、骨灰重、骨鈣含量及骨磷含量均明顯高于模型組，接近正常對照組和陽性對照組，表明本發(fā)明提取物對骨質(zhì)疏松癥具有顯著的預防作用。
從病理切片可見，模型組的骨皮質(zhì)呈現(xiàn)疏松、變薄及骨小梁疏松、變細的病理改變。各給藥組及陽性對照組病理改變顯著減輕，亦表明本發(fā)明提取物對骨質(zhì)疏松癥具有顯著的預防作用。
表16、本發(fā)明中藥提取物對實驗性骨質(zhì)疏松癥的預防作用

表17、本發(fā)明中藥提取物對實驗性骨質(zhì)疏松癥的治療作用

2.2對實驗性骨質(zhì)疏松癥的治療作用大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，即正常對照組(溶劑組)、模型對照組、陽性對照組(羥乙基膦酸鈉組)，實驗組A(實例1所得提取物，分高低劑量)、實驗組B(實例2所得提取物，分高低劑量)，除正常對照組外，各組大鼠均灌胃維甲酸0.5m1/kg，每天1次，連續(xù)14天，第15天各用藥組按表2中給藥劑量灌胃給藥每天1次，連續(xù)28天，正常對照組及模型組給予0.5％CMC，服用量均為0.5ml/kg，其間每周稱體重1次，并據(jù)此調(diào)整給藥用量。觀察指標同實驗2.1，結(jié)果見表17。
由表17可見，提取物A組、提取物B組大鼠股骨骨密度、骨灰重、骨鈣含量及骨磷含量均明顯高于模型組，與正常對照組比較亦處于同一水平，表明本發(fā)明提取物對骨質(zhì)疏松癥具有顯著的治療作用從病理切片可見，模型組的骨皮質(zhì)均有疏松、變薄及骨小梁疏松、變細和消失的病理改變。各給藥組及陽性對照組僅有個別動物的骨皮質(zhì)變薄及骨小梁變細的改變，并且病變較輕，亦表明本發(fā)明提取物對骨質(zhì)疏松癥具有顯著的治療作用。
本發(fā)明提取物的制備方法簡單，成本低廉，防治骨質(zhì)疏松癥效果顯著，無毒副作用，因而可用于制備防治骨質(zhì)疏松癥的藥物或食品。
實施例11、臨床病例之一王××，女，71歲，2001年12月5日初診?；颊哂刑悄虿∈?，常服降糖藥控制病情。近5、6年來經(jīng)常腰痛，轉(zhuǎn)側(cè)不利，疼痛難忍，影響生活起居，去年經(jīng)腰椎片檢查L4、L5椎體雙面凹陷呈魚尾狀改變，椎體骨小梁稀疏間隙加寬，椎間隙增寬呈梭形，經(jīng)過中西醫(yī)治療、理療、針灸效果皆不顯著。刻診，腰府酸痛不能站立，近1月來幾乎不能步履，下肢膝蓋畏冷，經(jīng)常以棉布裹之。喉間如梗，時有痰涎粘稠，夜溲頻多，以至濕床，大便干結(jié)。苔白厚脈象沉細，證屬下元不足，肝腎精虧。處置用以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物復方制劑，每次0.5g，每日3次，服藥一個療程(三個月)，臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，又服藥鞏固一個療程后檢查，復查諸癥消失，腰椎片與前次對比示骨密度增大、透明度減低、骨質(zhì)疏松有明顯好轉(zhuǎn)。囑繼續(xù)服用本藥一個療程鞏固療效，隨訪至今(2006年12月)病情穩(wěn)定。
實施例12、臨床病例之二吳××，女，68歲，患者2001年11月5日來診，患者因類風濕關(guān)節(jié)炎10余年，長期口服糖皮質(zhì)激素，因腰痛曾經(jīng)作CT檢查腰椎骨皮質(zhì)變薄，骨小梁減少變細，骨密度減低，透明度加大，L2，L3椎間盤膨出，L4，L5椎間盤突出(中央型)，腰椎右側(cè)彎。骨密度測量(X線二重能量吸收測量術(shù))確診為骨質(zhì)疏松癥?？诜}劑，雌激素，行理療推拿仍疼痛難忍，癥狀為腰腿酸楚，疼痛無力，腰腿時有針刺疼痛感，下肢肌肉瘦削，活動功能受限，近日因天氣寒冷病情增重，右腿疼痛如錐刺，日夜難忍，食欲尚可，二便如常，舌苔薄白，脈象沉緊。處置用以蒼術(shù)、黃柏、牛膝為原料制備提取物復方制劑每次0.5g，每日3次，服藥一個療程(三個月)，復查諸癥消失，骨密度測定較前次明顯增高，對比增加8％，CT片腰椎病變大為改善。囑繼續(xù)服用本藥一個療程鞏固療效，隨訪至今病情穩(wěn)定。
實施例13、臨床統(tǒng)計病例一般資料入選病例全部試驗病例285例，男性150例，女性135例。病例來源于2002年1月至2004年12月就診于甲、乙、丙、丁、戊、己等6家醫(yī)院的患者。患者根據(jù)中醫(yī)辨證診斷采用雙能量X線骨密度儀測定骨密度(簡稱BMD)，少于或等于同性別正常健康人30～35歲組215個標準差，并依據(jù)相關(guān)診斷標準的結(jié)果進行分組。
病例入選標準參照劉忠厚主編《骨質(zhì)疏松癥》有關(guān)診斷標準[劉忠厚.骨質(zhì)疏松癥，北京北京科學技術(shù)出版社，1998142～162，529～534]。入選條件為①自述有自發(fā)性腰痛或/和負重性疼痛；②應(yīng)用雙能量X線骨密度儀測定骨密度(簡稱BMD)，少于或等于同性別正常健康人30～35歲組215個標準差；③血鈣、磷、堿性磷酸酶正常；④排除甲狀旁腺功能亢進癥、多發(fā)性骨髓瘤、長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等所致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥；⑤近3個月無使用影響骨代謝藥物，如維生素D、雌激素、鈣制劑、二磷酸鹽等；⑥無嚴重心、肝、腎病變。年齡45～75歲。
治療方法包括基礎(chǔ)治療(①飲食治療；②常規(guī)預防骨質(zhì)疏松癥治療，口服藥如鈣劑等，③給予本中藥復方提取物膠襄，每次0.5g，每日3次，一個月為一療程。
療效評價標準兩組患者于治療前、治療后3個月采用雙能量X線骨密度儀測定腰椎(L2～4)及非優(yōu)勢側(cè)股骨近端(Total)骨密度，并測定血、尿常規(guī)、血脂、肝功能、腎功能等。顯效腰背痛、全身乏力及肌肉痙攣性疼痛消失，胸或腰椎X線攝片提示椎體致密度減低未再進展，骨小梁變細不明顯，椎體輕度雙凹形畸形。好轉(zhuǎn)腰背痛明顯減輕，全身乏力、肌肉痙攣性疼痛消失，胸或腰椎X線攝片提示椎體致密度略減低，骨小梁變細，椎體呈中度雙凹形或輕度楔形改變。無效癥狀及體征均無改善，骨小梁變模糊、椎體雙凹形明顯，一個或多個椎體楔形改變。
統(tǒng)計方法采用SAS 8.0統(tǒng)計分析系統(tǒng)進行，計量資料用方差分析、t檢驗；等級資料用Ridit分析、Kruskal-Wallis法秩和檢驗；計數(shù)資料比較用X2檢驗。
臨床病例統(tǒng)計選擇112例老年性骨質(zhì)疏松癥患者，隨機分為治療組和對照組，治療組58例，其中男11例，女47例；有4例并腰椎壓縮性骨折，32例伴頸、胸、腰椎不同程度的骨質(zhì)增生。對照組54例，其中男13例，女41例；有2例并腰椎壓縮性骨折，28例伴頸、胸、腰椎不同程度的骨質(zhì)增生，兩組一般情況比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)，具有可比性。對照組給予鈣爾奇D(蘇州立達制藥有限公司生產(chǎn))，1粒/次，每日2次，治療組給予復方中藥提取物膠襄(按照實施例8制備的原料并按照實施例1方法制備)，3個月后觀察兩組的療效。
結(jié)果治療組總有效率為87.93％(顯效34例，有效17例，無效7例)，對照組為64.81％(顯效13例，有效22例，無效19例)，治療組與對照組比較，P＜0.01，差異有顯著性意義。
權(quán)利要求
1.一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，該中藥提取物是以牛膝、黃柏、蒼術(shù)為原料制備的提取物，包括蒼術(shù)揮發(fā)油、黃柏總生物堿、牛膝總皂苷、牛膝總甾酮以及其他成分，其中蒼術(shù)揮發(fā)油占10～25％(重量百分比，下同)、黃柏總生物堿占25～45％、牛膝總皂苷占10～40％、牛膝總甾酮占5～15％以及其他成分占15～45％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的該中藥提取物中的蒼術(shù)揮發(fā)油占10～20％、黃柏總生物堿占30～40％、牛膝總皂苷占20～30％、牛膝總甾酮占10～15％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的牛膝為補腎強骨類藥物，能夠用于替代牛膝的藥材是包括川牛膝、淫羊藿、補骨脂、續(xù)斷、女貞子、韭菜子或狗脊中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的能夠用于替代牛膝的藥材是淫羊藿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的黃柏為清熱解毒類藥物，能夠用于替代黃柏的藥材是包括黃連、金銀花、墨旱蓮、蒲公英、板藍根、半枝蓮或大青葉中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的能夠用于替代黃柏的藥材是黃連。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的蒼術(shù)為健脾燥濕類藥物，能夠用于替代蒼術(shù)的藥材是包括白術(shù)或山藥中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的用于制備該中藥提取物的原料是包括蒼術(shù)1～5份、黃柏1～5份、牛膝1～5份。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的用于制備該中藥提取物的原料是包括蒼術(shù)1～1.5份、黃柏2～3份、牛膝4～5份。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物，其特征在于，所述的用于制備該中藥提取物的原料蒼術(shù)、黃柏、牛膝三者之比為1∶2∶3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、8～10任一項所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的提取方法是包括溶劑提取法在內(nèi)的本領(lǐng)域公知的所有可以使用的方法。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的提取方法是溶劑提取法。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法是包括常用的熱回流提取、連續(xù)逆流提取、超聲提取法、浸漬提取法、滲漉提取法、煎煮提取法或連續(xù)回流提取法中的一種或多種；提取次數(shù)是一次或多次。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法是包括超聲提取法、滲漉提取法、連續(xù)逆流提取或加熱回流提取法中的一種；提取次數(shù)是多次。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法是加熱回流提取法；提取次數(shù)是多次。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的加熱回流提取法所使用的提取溶劑是包括常見的水試劑、親水性的有機溶劑或親脂性的有機溶劑三類提取溶劑中的一種或多種。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述的水試劑是包括水、酸水或堿水中的一種；所述的親水性的有機溶劑是包括乙醇、乙醇水溶液或甲醇中的一種或多種；所述的親脂性的有機溶劑是包括石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷中的一種或多種。
18.根據(jù)權(quán)利要求1、2、8～10任一項所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)制備提取液分別按比例稱取各原料藥粗粉，蒼術(shù)按藥典法先提取揮發(fā)油備用，殘渣晾干，將上述原料粗粉浸泡于適量提取溶劑中，提取溶劑為0～95％乙醇或甲醇水溶液，按常規(guī)滲漉至皂苷類、生物堿類檢定反應(yīng)呈陰性為止，收集滲漉液，得提取液；或者本步驟采用5～10倍提取溶劑回流提取一到多次，得提取液；(2)精制濃縮干燥將上述提取液濃縮至無醇味，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；繼續(xù)用30～70％乙醇洗脫大孔樹脂柱，收集洗脫液；洗脫液60℃減壓濃縮至干，干燥后粉碎，加蒼術(shù)揮發(fā)油混合即得本發(fā)明粉末。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該方法的步驟(1)中所用提取溶劑為30～95％乙醇或甲醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該方法的步驟(1)中所用提取溶劑為70～95％乙醇，回流提取時8倍提取溶劑，回流3次，每次2小時。
21.根據(jù)權(quán)利要求1、2、8～10任一項所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)制備提取液分別按比例稱取各原料藥粗粉，蒼術(shù)按藥典法提取揮發(fā)油后，殘渣加0～95％的乙醇或甲醇水溶液常規(guī)滲漉。分別將黃柏、牛膝原料粗粉浸泡于適量提取溶劑中，提取溶劑為0～95％乙醇或甲醇水溶液，分別按常規(guī)滲漉，分別滲漉至生物堿類、皂苷類成分檢定反應(yīng)呈陰性為止，收集各滲漉液，得各單味藥提取液；或者本步驟采用5～10倍提取溶劑回流提取一到多次，得各單味藥提取液；(2)濃縮干燥分別將上述蒼術(shù)、黃柏、牛膝各單味藥提取液減壓回收至無醇味，蒸餾水調(diào)節(jié)比重至1.05g/ml，濾液通過活化處理過的大孔樹脂柱，使濾液中的活性成分被樹脂柱吸附，并棄去流出液。用水洗脫大孔樹脂柱，棄去洗脫液；繼續(xù)用30～70％乙醇洗脫大孔樹脂柱，收集洗脫液，洗脫液60℃減壓濃縮至干，干燥后粉碎得粉末A、B、C。(3)混合將所得粉末A、B、C與蒼術(shù)揮發(fā)油混合，即得本發(fā)明提取物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該方法的步驟(1)中所用提取溶劑為30～95％乙醇或甲醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該方法的步驟(1)中所用提取溶劑分別是蒼術(shù)提取溶劑為85％乙醇、黃柏提取溶劑為85％乙醇、牛膝提取溶劑為85％乙醇。
24.一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物在制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品中的應(yīng)用。
25.一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的組合物在制備抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品中的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品是指用于抗骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)病癥的產(chǎn)品，診斷、檢測、預防、保護、治療或研究骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)病癥的產(chǎn)品。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品是包括藥物、試劑、食品或飲料中的一種或多種。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的所述的抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品是包括藥物、試劑、食品、保健食品、添加劑或飲料中的一種或多種。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的所述的抗骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)品是包括抗骨質(zhì)疏松癥藥物、抗骨質(zhì)疏松癥試劑、抗骨質(zhì)疏松癥食品或抗骨質(zhì)疏松癥飲料中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于防治骨質(zhì)疏松癥的中藥提取物及其制備方法和用途。該中藥提取物主要包括蒼術(shù)揮發(fā)油、黃柏總生物堿、牛膝總皂苷和牛膝總甾酮等，能夠預防和/或治療骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)病癥，而這些疾病已逐漸成為影響日趨老齡化的人口生活質(zhì)量的重要致病原因。該中藥提取物的原料來源豐富，制備工藝簡單，提取效率高；該中藥提取物藥理作用較強，性質(zhì)穩(wěn)定，安全低毒，質(zhì)量可控。本發(fā)明選用經(jīng)典方的三個中藥，經(jīng)優(yōu)化組成，達到最優(yōu)抗骨質(zhì)疏松癥的活性，并降低了副作用，為預防、診斷、檢測、保護、治療和研究這些疾病及其相關(guān)疾病提供了一種新的藥物來源。
文檔編號A61P19/00GK101085091SQ20071004185
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月11日
發(fā)明者黃寶康, 秦路平, 張巧艷, 鄭漢臣, 張宏, 韓婷 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學