專(zhuān)利名稱(chēng)：：含木輪轂刺桐衍生物的藥物組合物以及生產(chǎn)這些物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)膽堿能、5-羥色胺能和/或Y-氨基丁酸能系統(tǒng)起作用的分子。更具體而言，本發(fā)明涉及可用于制備抗焦慮藥物的刺桐副產(chǎn)物(Erythrinebyproduct)。還提供了含有所述分子的藥物組合物以及制備所述藥物組合物的方法。
背景技術(shù)：
：木輪轂刺桐(A/y^r//23則/卿w)(蝶形花科(Papilionaceae)-豆科(Leguminoseae))為具有紅色花朵的木本植物(高10-14米)，生和米那斯三角洲的灌木叢林地區(qū)(LORENZI,1992)。該植物的樹(shù)皮被當(dāng)?shù)厝擞米靼捕ㄋ幒玩?zhèn)靜藥。一般稱(chēng)之為木輪轂(mulungu)、珊瑚樹(shù)、珊瑚木輪轂和珊瑚灌木(種族名稱(chēng)包括ca;a-力o邁e邁，s"i/《-sw/"4，〃r/ce/ro等)(L0RENZI，1992)。巴西出產(chǎn)八個(gè)品種的刺桐木輪轂刺才同(f.邁w7w^u)、f.re/i/〃72a、7鳥(niǎo)冠刺桐(f.cr/fa—ga///)、A./7oe/7/72>/a/7a、褐花刺桐()、尸a/ca"、象牙花(A.s/7ec/osa)和i1.rei77a(L0RENZI，1992)。已進(jìn)行很多工作以確認(rèn)該刺桐屬的其他物種的植物化學(xué)(fitochemical)和藥理學(xué)性質(zhì)，所述其他物種還因?yàn)?皮廣泛地用作鎮(zhèn)靜藥、安定藥并且還用作輕瀉劑、抗炎劑和抗利尿劑而廣為人知(GAR重N-AGUILAR"".，2000)。盡管對(duì)木輪穀刺桐種的研究很少，但其提取物是巴西和國(guó)際藥物市場(chǎng)上銷(xiāo)售的植物治療制劑的部分成分，由于缺乏與所述產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)對(duì)所述消費(fèi)者的健康造成危險(xiǎn)。植物化學(xué)(Fitochemistry)對(duì)刺桐屬種的研究產(chǎn)生興趣始于1877年，當(dāng)時(shí)Domfnguez和Altamirano發(fā)現(xiàn)美國(guó)刺桐(Aa邊er/ca加)的種子提取物的藥理學(xué)作用與右旋氯筒箭毒堿(從南美防己(CAancTc^e/Jcrro/zto邊e/^os咖)中提取得到的物質(zhì))的作用相似(證GREAVES"，1974;HIDER"a/.，1986;GARiN-AGUILARefa/.，2000)。此后進(jìn)行了對(duì)不同刺桐物種的提取物的植物化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)的研究。數(shù)年之后，在確認(rèn)了不同刺桐物種的提取物所展示的藥理學(xué)作用后，研究致力于分離和鑒定這類(lèi)植物中的生物堿(SARRAGI0T0a/.，1981)。直到此時(shí)藥理學(xué)測(cè)試依然是用粗提產(chǎn)物進(jìn)行。1937年，F(xiàn)olkers和Major(1937)對(duì)美國(guó)剌桐(f.a邊er/ca加Mill.)的種子進(jìn)行了化學(xué)研究，并分離了結(jié)晶生物堿一刺桐定(erythroidine)，刺桐定呈現(xiàn)出與右旋氯筒箭毒堿相似的膽堿能活性。隨后的分析(BOEKELHEIDEandGRUNDON，1953;B0EKELHEIDE"W.，1953)表明刺桐定是命名為cc-刺桐定和p-刺桐定的兩種同分異構(gòu)生物堿的混合物，后者由于其能夠拮抗外周的煙堿受體而具有膽堿能活性(HARGREAVESe"/.，1974;HIDERe"/.，1986;GAR重N-AGUILAR，a/,，2000)。分離了美國(guó)刺桐的oc和P-刺桐定，并且發(fā)現(xiàn)了其藥學(xué)性質(zhì)之后，有大量的研究興趣針對(duì)其他種的刺桐，并分離出新的刺桐骨架生物堿(FOLKERSandKONIUSZY，1940;FOLKERSWa/.，1944;B0EKELHEIDEandGRUNDON，1953;B0EKELHEIDEWa/.，1953;TAND0Nefa/.，1969;ITO"aA，1970;BARTONa/.，1970;GHOSAL，1970;GHOSALa人，1971;ITO"a人，1971;MIANAa/.，1972;GHOSALa/.，1972a，b;BARTONa/.，1973;ITO"，1973，a,b,c，d;GHOSALandSRIVASTAVA，1974;MILLINGTONa/.，1974;GAMESa/.，1974;ITOaA，1976;BARAKATa/.，1977;EL—OLEMYa/.，1978;AHMADe"/.，1979;TIWARIandMASS0D，1979a，b;SARRAGI0TOe"/.，1981)。對(duì)刺桐生物堿的基本結(jié)構(gòu)的了解可通過(guò)降解和合成實(shí)現(xiàn)(GRUNDONandBOEKELHEIDE,1953;GRUND0NWa厶，1953;WEINSTOCKandBOEKELHEIDE，1953;BOEKELHEIDEa/.，1953)。證實(shí)了這些生物堿的結(jié)構(gòu)中存在螺旋胺骨架(spiroaminicskeleton),所述堿具有如下通式，有助于后面對(duì)新化合物的鑒定。對(duì)該結(jié)構(gòu)的了解有助于隨后鑒定新的化合物。目前，已知有三類(lèi)刺桐生物堿1)二烯類(lèi)(Dienoid)代表A環(huán)和B環(huán)中的二烯系統(tǒng)；2)生物堿在A環(huán)中具有雙鍵厶"；3)第三組刺桐堿包括刺桐二烯酮堿(erysodie醒e)、3-去曱氧基刺桐替定酮堿(3-desmethoxyerythratidinone)、a-刺桐定和P-刺桐定。還分離了并不存在刺桐骨架的某些刺桐物種的一些生物堿，這些生物堿包括東翼粟靈(orientaline)、^降東翼粟靈(jV~Noorientaline)、原漢防已堿(protosinomenine)、jV"降原漢防己械(Morprotosinomenine)、異波爾定堿(isoboldine)、刺桐雙定(erybidine)、scoureline、異種荷包牡丹堿(coreximine)、hypaforin、可啉。使用由干花制得的乙醇提取物對(duì)木輪轂刺桐進(jìn)行植物化學(xué)研究分離得到五種生物械(erysothrina、iV~erysothrinaoxide、刺桐阿亭(erythrartine)、f氧化剌桐阿亭(A^-erythrartineoxide)和hypaforin)和薛類(lèi)化合物fithol(SARRAGI0T0etal.，1981;SARRAGI0T0，1981)。最近的植物化學(xué)研究表明刺桐物種還富含其他類(lèi)物質(zhì)，如黃烷酮、異黃烷酮、異黃酮和紫檀堿(pterocarpane)(DA-CUNHAetal.，1998;TANAKAetal.，1996，1997a，b;1998;2001;0Hetal.，1999;YENESEWetal.,2000;NKENGFACKetal.，2001)。藥理學(xué)活性刺桐的主要藥理學(xué)作用是其對(duì)膽堿能系統(tǒng)的外周活性，該活性已與右旋氯筒箭毒堿的作用相比較(HARGREAVESetal.，1974;HIDERetal.:1986;GARiN-AGUILAR，etal.，2000)。該作用歸因于生物堿二氫-/-刺桐定(DHBE)，它是從美國(guó)刺桐(A副r/c雄)(BOEKELHEIDEandGRUNDON，1953;B0EKELHEIDEWa7.，1953)和&Mo//o"ia/7a(CHAWLAetal，1985)分離獲得的煙堿樣拮抗劑受體(HIDERWa/.，1986)。近來(lái)，在一個(gè)體外實(shí)驗(yàn)中，DHBE被表征為5-羥色胺3拮抗劑受體(5-HL)(ELSELfeWa人，1993)。在其他研究中也觀(guān)察到了所述5-羥色胺能系統(tǒng)的活性(ROGERetal.，2001)，在文中作者已經(jīng)證明互M^7er"7/o的粗提取物抑制血小板血清素的釣依賴(lài)釋放，這種抑制作用是所述5-HT3受體拮抗劑的主要的活性之一。然而，所述工作的大多數(shù)仍然是使用不同種的刺桐的粗提取物完成的，沒(méi)有對(duì)被觀(guān)察到活性的物質(zhì)進(jìn)行鑒定。作為對(duì)所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性的實(shí)例，可以提及抗驚厥、催眠、麻醉、鎮(zhèn)靜和抗焦慮效果(GH0SALe"/"1972;HARGREAVES"".，1974;RATNAS00RIYAandDHARMASIRI，1999;0NUSICefa人，2002，2003)。對(duì)Are/y〃/za的研究表明，用水醇提取物(hydroalcoholicextract)短暫處理降低了小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的活動(dòng)情況(劑量為250和500mg/kg，口服攝入)，并且還增加了由戊巴比妥引起的睡眠時(shí)間以及毛果云香堿引起驚厥的起始時(shí)間(劑量為500和1000mg/kg，口服攝入)，這表明它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用(CABMLefaA，2000)。另一項(xiàng)研究工作(GARiN-AGULIARefa/.，2000)表明，與地西泮相似，用美國(guó)刺桐的己烷(hexanic)級(jí)分短暫處理(3mg/kg，i.p)降低了雄性小鼠的攻擊行為。最近，對(duì)木輪轂刺桐的水醇提取物的研究(ONUSICWaL，2002)觀(guān)察到，在高架式T迷宮試驗(yàn)的抑制逃避學(xué)習(xí)中，用200mg/kg的劑量短暫處理(口服攝入)表現(xiàn)出對(duì)小鼠的抗焦慮作用，這與苯二氮卓類(lèi)抗焦慮藥(BDZ)—地西泮的作用相當(dāng)。0NUSIC及其同事(2002)還在明暗箱模型中觀(guān)察到相同劑量木輪轂刺桐的抗焦慮效果，包括在兩模型箱之間的穿越次數(shù)以及在明箱里停留的時(shí)間方面。另一項(xiàng)研究工作表明，通過(guò)口服攝入劑量為50、100和200mg/kg的木輪轂提取物的長(zhǎng)期處理(9天)，在抑制逃避學(xué)習(xí)和從高架式T迷宮的開(kāi)放臂逃避中表現(xiàn)出抗焦慮效果(ONUSICWa人，2003)。在明暗箱模型中，劑量為50mg/kg的木輪轂刺桐提取物在長(zhǎng)期處理14天后也表現(xiàn)出抗焦慮效果(ONUSIC"aA，2003)。盡管已有很多方法，但是迄今為止，目前并沒(méi)有報(bào)道將分離得到的形式)或通過(guò)進(jìn)行化學(xué)合成開(kāi)發(fā)為抗焦慮藥劑，也沒(méi)有任何制備該藥劑的方法。7
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供含有來(lái)自所述刺桐屬植物的物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化的藥物組合物。在一方面，本發(fā)明的所述藥物組合物可以包含標(biāo)準(zhǔn)的粗提取物、刺桐生物堿富集純化的級(jí)分(F2)或分離的生物堿刺桐阿亭(erytrartine)、erytravine和ll-OH-erytravine,或者還有它們組成的能夠直接或間接地作用于所述膽堿能的、5-羥色胺能和Y-氨基丁酸能系統(tǒng)的組合物。在另一方面，可以提供一種獲得所述相關(guān)的藥物組合物的方法，以及包含它們的藥物組合物。在一方面，本發(fā)明所述粗提取物、所述生物堿的富集純化級(jí)分(F2)和所述分子在動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示作為抗焦慮劑的活性。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與焦慮或其他需要使用抗焦慮劑的臨床表現(xiàn)相關(guān)的紊亂的治療中使用的提取物、級(jí)分和/或分子。在另一方面，所述標(biāo)準(zhǔn)化的粗提取物的制備、所述生物堿的富集純化級(jí)分(F2)和所述分子的分離和結(jié)構(gòu)描述，以及本發(fā)明的藥理學(xué)活性的評(píng)估，使得用于焦慮紊亂治療中的標(biāo)準(zhǔn)化的藥物組合物的開(kāi)發(fā)成為可能。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含具有抗焦慮性質(zhì)的天然制劑和分子的藥物組合物。在又一方面，本發(fā)明所述提取物的制備、所述純化的級(jí)分和分子的分離和/或合成可以提供制備藥物組合物的方便的方法，所述藥物組合物包含所述的天然制劑和/或分子。因此，本發(fā)明的一個(gè)另外的目的是提供生產(chǎn)藥物組合物的方法。圖1示出木輪轂刺桐水醇粗提產(chǎn)物的提取和分級(jí)以及使用木輪轂刺桐水醇粗提產(chǎn)物分離生物堿刺桐阿亭、erythravine和ll-OH-erythravine的步驟的總體示意圖。具體實(shí)施方式就本發(fā)明的目的而言，"藥物組合物"應(yīng)該意味著含有活性成分、具有預(yù)防、姑息和/或治療目的、起著維持和/或恢復(fù)穩(wěn)態(tài)作用的全部和任何一種組合物，并且可被外部給藥、腸胃外給藥、腸內(nèi)給藥和/或鞘內(nèi)給藥。本發(fā)明中所說(shuō)的藥物組合物屬于刺桐副產(chǎn)物類(lèi)，包括11-0H-erythravine和/或其可藥用的電子等排體(isotheral)、鹽、副產(chǎn)物和/或溶劑合物，任選地包含從粗提取物或者從木輪轂刺桐的所述純化的級(jí)分或從化學(xué)合成中分離的刺桐阿亭和/或erythravine。本發(fā)明化合物的治療應(yīng)用在多個(gè)階段進(jìn)行。下文給出的所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及其各自的結(jié)果僅為示例性的，并不限定所附權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1:植物化學(xué)植物收集和提取物制備在冬季例如在阿拉拉夸拉(Araraquara)(SP)地區(qū)收集成年樹(shù)的花。通過(guò)采用乙醇/水(EtOH/H20)(7:3)的浸漬法對(duì)新鮮植物材料(6kg)處理7天進(jìn)行提取。然后過(guò)濾提取物并借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其濃縮，得到292g干燥水醇提取物。它在總生物堿中的標(biāo)準(zhǔn)化根據(jù)藥物方法通過(guò)中和的容積進(jìn)行，并且確定在生物堿中至少包含0.1%的erythravine。所述化學(xué)組成的生物監(jiān)控分級(jí)和分離進(jìn)行酸堿萃取以純化所述粗提取物并產(chǎn)生一個(gè)具有最優(yōu)刺桐生物堿濃度的級(jí)分。為實(shí)現(xiàn)該目的，將干的水醇提取物(120g)溶于乙酸的水溶液(10%)中，并用氯仿(CHC13)進(jìn)行液/液萃取。將氯仿相與水相分離并將溶劑蒸發(fā)得到級(jí)分1(7.83g)。然后，用足以獲得9-10之間pH的體積的氫氧化銨(冊(cè)40H)堿化水相，然后再用CHCl3萃取。將氯仿相分離并將溶劑蒸發(fā)得到富含生物堿的純化的級(jí)分2(F2)(670mg)。通過(guò)HPLC技術(shù)評(píng)估該級(jí)分，并且被標(biāo)定為至少包含20%的總生物堿和10°/。的erythravine。所述F2也可以,皮應(yīng)用于高架式T迷宮(高架式T迷宮)的藥理學(xué)測(cè)試中。實(shí)施例2:色鐠法、儀器操作和光語(yǔ)測(cè)定法使用Degree溶劑用于"分析"。為進(jìn)行分析，使用二氧化硅薄層色譜法(CCD)，CHCl3/甲醇(MeOH)(9:l)用作溶劑系統(tǒng)。F2中的生物堿的Dragendorf測(cè)試為陽(yáng)性，將所述F2進(jìn)行空心柱色鐠分析(open-columnchromatography,CCA)(直徑為5cm,高為15cm)。為進(jìn)行CCA(0，035-0，070mm，①6nm)，將硅膠用作固定相，CHCl3/Me0H(10:0-8:2)用作流動(dòng)相。為進(jìn)4亍分離，使用了670mgF2，并收集到約20ml的101級(jí)分。對(duì)101級(jí)分進(jìn)行了流動(dòng)相為CHCl3/MeOH(7:1)的分析性CCD并用Dragendorf分析顯示后，101級(jí)分被分為級(jí)分A(FA-136.2mg)(1-27)、級(jí)分B(FB-93.4mg)(28-50)、級(jí)分C(FC-148.3mg)(51-69)、級(jí)分D(FD-284.5mg)(70-101)。為分離和純化生物堿，使用制備型薄層色語(yǔ)法(CCDP)，將熒光素(fluoresceins)用于硅膠固定相(Merck),將甲苯、丙酮、乙醇和NH40H(45:45:7:3)用作流動(dòng)相。從級(jí)分B分離刺桐亭(48mg);從級(jí)分C和D分離eritravine(分別是61和34,82mg);并且從級(jí)分D分離ll-OH-eritravina(36,98mg)。為了對(duì)從CCDP分離得到的物質(zhì)進(jìn)行光譜測(cè)定分析，使用在500MHz進(jìn)行的核磁共振(NMR)光度計(jì)VarianUnit。將氘化氯仿(CDC13)用作溶劑。實(shí)施例3:藥理學(xué)3.1動(dòng)物試驗(yàn)使用自圣保羅州立大學(xué)(UNESP/Araraquara)的中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室獲得的、重25-35g的Swiss小鼠。動(dòng)物被分為10-12只/組、在底部填有木屑的聚丙烯籠中飼養(yǎng)，給予足量的食物和水。將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室保持在22土lt:的恒定溫度，光照控制為12小時(shí)的晝夜循環(huán)，從7:00am至7:00pm，濕度保持在50-60%之間。實(shí)施例4:粗的標(biāo)準(zhǔn)提取物和富含堿的純化的級(jí)分、標(biāo)準(zhǔn)的藥物和載體因此，除了使用F2(3、6、10、17和30mg/kg)和生物堿剌桐阿亭、erythravine和ll-OH-erythravine(3和10mg/kg)夕卜，還使用了冷凍干燥的水醇提取物(50、100、200和400mg/kg)，通過(guò)采用管飼法的口服攝入給藥。所使用的標(biāo)準(zhǔn)藥物是劑量為2血g/kg的地西泮(DZP)(通過(guò)腹膜內(nèi)給藥，i.p)。所有溶液在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用0.9%氯化鈉(0.9%NaCl)配制得到，并對(duì)其進(jìn)行超聲處理15分鐘。地西泮溶于0.9°/。NaCl和Tween-80的溶液中。實(shí)驗(yàn)在11:00am和5:00pm之間進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)儀器和步驟高架式T迷宮由透明玻璃壁和木質(zhì)地板制成，包括兩個(gè)開(kāi)放臂(30x5x0.25cm)和與其垂直連接的一個(gè)封閉臂(30x5x15cm)，由木質(zhì)支持物使其距離地面38.5cm。在該測(cè)試中，對(duì)抑制逃避進(jìn)行了五次連續(xù)測(cè)量(基礎(chǔ)反應(yīng)時(shí)間、逃避l、2、3和4)并對(duì)從開(kāi)放臂逃避進(jìn)行了一次測(cè)量，每次測(cè)試之間間隔30秒鐘。在逃避測(cè)量中，將動(dòng)物置于封閉臂的遠(yuǎn)端，記錄從該封閉臂爬行至開(kāi)放臂的逃避時(shí)間。在逃避測(cè)量中，將動(dòng)物置于右手側(cè)開(kāi)放臂的端部，并測(cè)量從該開(kāi)放臂離開(kāi)的時(shí)間。在這些測(cè)量中動(dòng)物停留在迷宮的臂中的最長(zhǎng)時(shí)間為300秒。對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行測(cè)量之后，用20%乙醇清洗該裝置。為了避免假陽(yáng)性或假陰性，在高架式T迷宮中測(cè)試后，立即在活動(dòng)場(chǎng)所對(duì)動(dòng)物進(jìn)行活動(dòng)度測(cè)試。所述裝置由具有30cm高的壁體圍繞的矩形基底(40x48cm)的白色聚丙烯盒組成。將其底面分為30個(gè)正方格(8x8cm)。在該測(cè)試中，將動(dòng)物置于盒中央，并將其活動(dòng)情況錄像記錄五分鐘，用于隨后進(jìn)行對(duì)穿過(guò)方格區(qū)域(quadrantarea)的數(shù)目以及伸展(stretch-attend)姿勢(shì)的次數(shù)的分析(WALSHandCU醒INS，1976)。模型結(jié)果分析為測(cè)定分離出的生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用4和"C的NMR光譜測(cè)定法，以及HMQC、HMBC和COSY二維光諉測(cè)定法。將結(jié)果與已經(jīng)存在于文獻(xiàn)中的關(guān)于刺桐生物堿的信息相比較。來(lái)自動(dòng)物模型的結(jié)果首先進(jìn)行Levene同質(zhì)性檢驗(yàn)。將異質(zhì)性結(jié)果轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)尺度，隨后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。自高架式T迷宮獲得的數(shù)據(jù)用于雙因子方差分析(ANOVA),處理情況作為獨(dú)立因子，測(cè)試情況作為非獨(dú)立因子。處理效果被證明為顯著時(shí)，使用單因子ANOVA然后使用Duncan/70W力oc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。將得自活動(dòng)場(chǎng)所的結(jié)果進(jìn)行單因子AN0VA檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Duncan;70"力oc檢驗(yàn)。p《0.05的數(shù)值被當(dāng)作顯著結(jié)果。結(jié)果1)植物化學(xué)的(核磁共振-RMN)通過(guò)含F(xiàn)B的CCDP分離得到生物堿l,自FC和FD分離出生物堿2。通過(guò)FD還可分離得到生物堿3。物質(zhì)1、2和3在CDCh中的卞和"CNMR光譜(表2)表明存在具有刺桐堿骨架特征的信號(hào)。在這一點(diǎn)上，可以鑒定與氫H-14和H-17相關(guān)的芳香族質(zhì)子的兩個(gè)單峰信號(hào)以及由碳C-15和C-16位的曱氧基氫所引起的兩個(gè)單峰信號(hào)。三個(gè)烯屬質(zhì)子信號(hào)(較寬單峰(sl)，H-7;較寬雙峰(dl)，H-l;兩個(gè)雙峰(dd)，H-2)的存在可能是由于刺桐骨架的二烯系統(tǒng)氫所導(dǎo)致。Sarragioto(1982)已報(bào)道C一l和C-2分別在5125.3和5131.2發(fā)生共振。但是，在本發(fā)明的開(kāi)發(fā)工作中，服QC二維光語(yǔ)的化學(xué)位移之間的關(guān)系表明這些共振分別發(fā)生在5131.5和5125.5。化學(xué)位移和耦合的值顯示于表1中。表1:刺桐阿亭、erythravine和ll-OH-erythravine的'H和"C(在CD3C1中)的NMR(500MHz)的化學(xué)位移測(cè)量值(5)和耦合常數(shù)(/)。刺桐阿亭erythravinell一OH-erythravineSH(/,Hz)Sc5H(/,Hz)Sc5H(/,Hz)Sc15.94(d;化i)131.525.9(d化幼134.186.01(d;",J)13526.52(dd;7《》125.536.4(dd;化《'124.966.56(dd)124.533.98m75.984.37m67.734.5m67.2712<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>頁(yè)下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>1.2)Erythravine與以前的物質(zhì)不同，物質(zhì)2的^RMN鐠在所述C-3位置不存在甲氧基的信號(hào)(表2)。在54,37處觀(guān)察到的多峰(m)以及所述13C譜的S67.73處觀(guān)察到的化學(xué)位移表明在這個(gè)位置存在一個(gè)氧取代。對(duì)于戶(hù)斤述C一11位置，在S2.9(JHllax-H10ax=10,0Hz;JHllax—Hlleq=6,5Hz)處觀(guān)察到的雙峰和在所述S2.65-2.69區(qū)中觀(guān)察到的多重峰分別歸因于軸H-ll(ax)和中絆線(xiàn)(eq)。這個(gè)物質(zhì)^皮鑒定為erythravine,它是一種在EM中還沒(méi)有被分離出來(lái)的erhitrinic生物堿(圖4)。所述生物堿erhytravine從EM花的粗提取物中分離，化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示如下。1.3)ll-羥基-erythravine(ll-OH-erythravine)在11-OH-erythravine的^的NMR語(yǔ)中(表2)，與erythravine類(lèi)似，在所述C-3位沒(méi)有觀(guān)察到曱氧基氫的信號(hào)，僅在54.5處觀(guān)察到一個(gè)與C-3位的氧合取代相關(guān)的多峰。與在刺桐阿亭觀(guān)察到的相同，4和"CNMR光語(yǔ)反映在54.74(t)和563.69分別存在化學(xué)位移，這是由于在C-11存在羥基。這些結(jié)果首次公開(kāi)，因此物質(zhì)3被認(rèn)為是新的刺桐生物堿，并被稱(chēng)為ll一羥基一erythravine(ll-OH-erythravine)。表2:用11-OH-erythravine進(jìn)行短暫處理對(duì)進(jìn)行高架式T迷宮測(cè)試的小家鼠的影響(平均值士EPM)處理抑制逃避逃脫LBElE2E3E4鹽水32,6±5，3107，7±37,9142,6±",7165,0±37,7232，8±35，521，8±3，1DZP2mg/kg24,6±4,115,3±3,8*12，25±1,6*22,3±7,7*24，2±7,3*19，0±3,211-0H3mg/kg30,7±5，841,8±14，296,0±34,4132,3±39，7194,4±39,521，5±3，711-0H10mg/kg22,6±3，530,0±6，1*54,0±21，166，6±30,3*94,8±31，7*26,8±4，8*p<0，05。分離自木輪轂刺桐的花的粗提產(chǎn)物的生物堿ll-OH-erythravine的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示。〇H2)藥理學(xué)粗提取物2.1)高架式T迷宮(或高架式T迷宮測(cè)試)如表3所示，在高架式T迷宮的開(kāi)放臂的抑制逃避中，標(biāo)準(zhǔn)的EM粗提取物的短暫處理?yè)p害了動(dòng)物的行為表現(xiàn)。雙因子ANOVA顯示處理(F(5，49)=5,44;p<0,0001)和測(cè)試(F(4，196)=27,37;p<0，0001)有顯著作用，但處理和測(cè)試的交互沒(méi)有顯著作用(F(20，196)=0，87，p=0,628)。單因子ANOVA表明處理組次基礎(chǔ)反應(yīng)時(shí)間(LB)(F(5，49)=2,34;p-0，056)、逃避l(El)(F(5，49)-3，97;p-0,004)、逃避2(E2)(F(5，49)=3,75;p=0,005);逃避3(E3)(F(5，49)=3,39;p-0，01)和逃避4(E4)(F(5,49)-2,62;p=0,03)有顯著差異。在表3中，可以觀(guān)察到根據(jù)Duncan/;o"力oc檢驗(yàn)的、與對(duì)照組相比的所述組次之間的差異。在高架式T迷宮的開(kāi)放臂的測(cè)量中，單因子ANOVA表明，組之間有顯著的不同(F(5，49)=3,48;p=0，009)。Duncan/o"力oc檢驗(yàn)顯示，該不同指的是，與對(duì)照組相比，用400mg/kg的EM的劑量處理的組表現(xiàn)出離開(kāi)開(kāi)放臂進(jìn)入封閉臂的反應(yīng)時(shí)間的縮短(表3)。表3:EM粗提取物進(jìn)行的短暫處理對(duì)進(jìn)行高架式T迷宮測(cè)試(n=9-10)的小家鼠的影響(平均值士EPM)。處理抑制逃避逃脫ElE2E3E4鹽水54.4±5.864.4±18.2148.6±33.3205.8±37.5216.9±30.620.6±3.3DZP2mg/kg25.4±4.119.1±4.0*25.3±7.0*59.8±30.9*91.3±40.3*28.4±7.1EM50mg/kg41.7±11.8120.5±45.1120.6±41.1153.4±35.9209.3±36.825.4±9.7EM100mg/kg42.4±17.757.7±20.7276.1±34.1*126.2±45.6138.5±43.632.1±19.3EM200mg/kg23.4±7.516.8±2.3*52.1±31.1*62.2±26.4*142.1±46.817.6±4.5EM400mg/kg26.4±5.145.±21.355.0±18.8*130.8±29.9131.2±35.46.7±1.1**p<0,05,Du織n檢驗(yàn)。2.2)活動(dòng)度-活動(dòng)場(chǎng)所在活動(dòng)場(chǎng)所測(cè)量的活動(dòng)度沒(méi)有受到任何劑量的所述EM粗提取物的短暫處理的改變(表4)。單因子ANOVA沒(méi)有顯示出組之間測(cè)定的混合的數(shù)目中的任何顯著差異(^(5，49)=0.78;=0.56)以及測(cè)定的調(diào)查的數(shù)目中的任何顯著差異(,(5，49)-1.90;/<0.11)。表4:用EM粗提取物進(jìn)行短暫處理對(duì)小家鼠在活動(dòng)場(chǎng)所的活動(dòng)性的影響(n=9-10)(平均值士EPM)。處理混合升高鹽水159.0±14.832.5±3.7DZP2mg/kg167.4±23.627.33±2.3EM50mg/kg178.8±8.740.4±3.116<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3)純化的級(jí)分-富含Eritrinic生物堿(F2)3.1)高架式T迷宮在高架式T迷宮的開(kāi)放臂中，用F2的短暫處理?yè)p害了抑制逃避的獲得，如表5所示。雙因子ANOVA顯示處理(尸(4，40)=7.00;p<0.0001)和測(cè)試(尸(4,160)=11.18;/7<O.OOOl)有顯著作用，但處理和測(cè)試的交互沒(méi)有顯著作用(F(16，160)=1.48，0.112)。單因子ANOVA表明處理組LBCP(6，69)=2.7;/=0.02)、El(,(6，69)=4.86;/K0.0001)、E2(F(6，69)=7.49;;<0.0001);E3(尸(6，69)=5.60;p<0.0001)和E4(尸(6，69)=7.83;<0.OOOl)之間有顯著差異。根據(jù)Duncanpo"力oc檢驗(yàn)的所述組之間的差異在表5中顯示。在高架式T迷宮的開(kāi)放臂的逃避學(xué)習(xí)中，單因子ANOVA表明，組之間沒(méi)有顯著的不同(尸(4，4Q)=0.96;=0.46)(表5)。表5:用F2進(jìn)行短暫處理對(duì)進(jìn)行高架式T迷宮測(cè)試(n=8-16)的小家鼠的影響(平均值士EPM)。處理抑制逃避逃脫<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3.2)活動(dòng)度-活動(dòng)場(chǎng)所在活動(dòng)場(chǎng)所測(cè)量的活動(dòng)度沒(méi)有受到任何劑量的F2的短暫處理的改變(表6)。單因子ANOVA沒(méi)有顯示出組之間測(cè)定的混合的數(shù)目中的任何顯著差異(尸(4，40)=0.30;;7-0.87)，以及測(cè)定的升高的數(shù)目中的任何顯著差異(/"(4，40)=0.81;=0.52)。表6:用富含生物堿的純化級(jí)分(F2)進(jìn)行短暫處理對(duì)小家鼠在活動(dòng)場(chǎng)所的活動(dòng)性的影響(n=8-16)(平均值士EPM)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>分離的生物堿的新結(jié)果1)Erhytravine用Erythravine處理的小家鼠進(jìn)行明暗箱模型測(cè)試獲得的結(jié)果在表7中顯示。單因子ANOVA顯示，處理對(duì)于測(cè)量的位于明箱的時(shí)間長(zhǎng)度有顯著的影響(F(3,39)=4.27;P=0.01)。Duncan力oc檢驗(yàn)顯示，用口月艮劑量3mg/kg和10mg/kg的erythravine以及用DZP處理的動(dòng)物組在明箱中的時(shí)間長(zhǎng)度比對(duì)照組明顯地高。對(duì)于測(cè)量的在兩個(gè)箱之間轉(zhuǎn)移的次數(shù)，單因子ANOVA沒(méi)有在組之間顯示出顯著的差異(F(3，39)=1.13;P=0.34)。表7:用erythravine進(jìn)行短暫處理對(duì)進(jìn)行明暗箱模型測(cè)試(n-10-12)的小家鼠的影響(平均值土EPM)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*與鹽7JCt匕較p<0，05,(Duncan力oc檢驗(yàn))2)11-0H-ERYTHRAVINE在表8中顯示用11-0H-erhytravine進(jìn)行的明暗箱模型測(cè)試獲得的結(jié)果。單因子AN0VA顯示，所述處理對(duì)于測(cè)量的動(dòng)物位于明箱的時(shí)間長(zhǎng)度有顯著的影響(F(3，38)=3.14;P<0.05)，并且對(duì)在兩個(gè)箱之間轉(zhuǎn)移的次數(shù)也有顯著影響(F(3，38)=3.36;P<0.05)。Duncan力oc檢驗(yàn)揭示，與對(duì)照組相比，劑量為10mg/kg的ll-OH-erythravine和DZP顯著地增加動(dòng)物在明箱中的時(shí)間。施以劑量為3mg/kg的ll-OH-erythravine也增加在模型的兩個(gè)箱之間轉(zhuǎn)移的次數(shù)(P<0.05)。表8-用11-OH-erythravine進(jìn)行短暫處理對(duì)進(jìn)行明暗箱模型測(cè)試(n=8-10)的小家鼠的影響(平均值士EPM)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*與鹽水t匕較p<0，05,(Duncanposf力oc檢驗(yàn))3)刺桐亭用刺桐亭進(jìn)行明暗箱模型測(cè)試獲得的結(jié)果通過(guò)表9中的數(shù)據(jù)顯示。單因子ANOVA顯示，處理對(duì)于測(cè)量的動(dòng)物位于明箱的時(shí)間有顯著的影響(F(3，49)=3.66;P<0.01)。根據(jù)Duncan檢驗(yàn)(P<0.05),這個(gè)影響僅在用DZP(2mg/kg)處理的動(dòng)物組中被觀(guān)察到。然而，單因子ANOVA顯示，處理對(duì)測(cè)量的在兩個(gè)箱之間轉(zhuǎn)移的次數(shù)沒(méi)有顯著的影響(F(3，49)=1.19;P<0.31)。表9-用刺桐亭進(jìn)行短暫處理對(duì)進(jìn)行明暗箱模型測(cè)試(n=8-9)的小鼠的影響(平均值士EPM)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>DZP(2mg/kg)140.67±18.59*17.42±2.40ERIT(3mg/kg)67.67±8.3313.00±1.56ERIT(10mg/kg)83.42±14.1714.25±1.59*與鹽水t匕較p<0，05，(Duncan/osf力oc檢驗(yàn))從木輪轂刺桐的水醇粗提取物中分離三種刺桐生物堿刺桐亭、erhytravine和ll-OH-erhytravine。以前,Sarragiotoetal.(1981)已經(jīng)報(bào)道，在木輪轂剌桐的甲醇粗提取物中含有刺桐亭、^氧-剌桐亭、刺桐春(erhysotrine)和f氧-刺桐春。然而，通過(guò)該二維的g麗QC檢測(cè)，本工作已經(jīng)修正了碳原子C-l和C-2耦合常數(shù)的值。已經(jīng)從A./。/ire"27(MILLINGTONefW.，1973)和Acoc力/ea"(CHAWLAWa/.，1985)的種子提取物中分離出erythravine。這是在文獻(xiàn)中第一次報(bào)道11-0H-erhytravine的分離。本發(fā)明的結(jié)果可以顯示，木輪轂刺桐的富含生物堿純化的級(jí)分可以對(duì)高架式T迷宮的焦慮動(dòng)物模型有抗焦慮的效果。在高架式T迷宮的開(kāi)放臂的抑制逃避和逃脫中，已經(jīng)觀(guān)察到木輪轂刺桐的粗提取物的抗焦慮效果。100、200和400mg/kg的短暫施藥的劑量損傷了所述開(kāi)放臂的抑制逃避的獲得。這些結(jié)果也證實(shí)最近的證明木輪轂刺桐提取物的抗焦慮效果的證據(jù)，所述證據(jù)也是用200mg/kg的劑量測(cè)量所有小鼠在高架式T迷宮中的逃避而得到的(ONUSIC"a/.，2002)。在該工作中，木輪轂刺桐提取物的抗焦慮效果也與明暗箱模型相關(guān)聯(lián)(O而SICWa/.,2002)。當(dāng)對(duì)小鼠短暫施藥的時(shí)候，200和400mg/kg的劑量被觀(guān)察到可以提高在所述兩個(gè)模型箱之間的轉(zhuǎn)移次數(shù)，以及提高動(dòng)物處于明箱中的時(shí)間?？紤]到某些化合物在藥物療法中被應(yīng)用于治療廣泛性焦慮癥，如BDZ、地西泮、和5-羥色胺受體A型激動(dòng)劑、丁螺環(huán)酮(LADER，1998;DAVIDSONJR.，2001;RICKELS"".，2001)，它們?cè)诟呒苄蚑迷宮的開(kāi)放臂的抑制逃避的測(cè)量中(GRAEFFe"/.，1993;VIANA"，1994;GRAEFF"1998;CARVALH0NETTOeNUNESDES0UZA，2004)，以及在明暗箱模型中(MERLOPICHeSAMANIN，1989;C畫(huà)LOFF"".，1997;HASCdETeB0URIN，1998)表現(xiàn)出抗焦慮效果，一些作者建議，這些試驗(yàn)可以為一般性焦慮癥的研究提供有效性預(yù)期(GRAEFFWa7.,1993;VIAMWa/.，1994;GRAEFFWa/.，1998;GRAEFFeZANGROSSI,2002;20B0URINeHASC6ET，2003)。用F2(富含刺桐生物堿的純化的級(jí)分為主要成分)獲得的結(jié)果表明，在測(cè)量的開(kāi)放臂的抑制逃避中有抗焦慮的效果。以3、6、10和17mg/kg的劑量的F2短暫施藥損害抑制逃避的獲得，與以前使用的標(biāo)準(zhǔn)藥物地西泮相似，這表明F2有一種抗焦慮的效果。這些結(jié)果支持如下的結(jié)論，即觀(guān)察到的所述粗提取物的抗焦慮效果與在其組成中存在的刺桐生物堿有關(guān)。這可以通過(guò)實(shí)施試驗(yàn)(realizedtest)進(jìn)行確i人，所述試驗(yàn)是在明暗箱模型中使用所分離的生物堿而進(jìn)行的。所述明暗箱試驗(yàn)是一種經(jīng)典的用于Y-氨基丁酸能和5-羥色胺能的藥物研究中的焦慮動(dòng)物模型，明暗箱試驗(yàn)被應(yīng)用于評(píng)估所述刺桐亭、erythravine和ll-OH-erhytravine的抗焦慮效果。，見(jiàn)察了標(biāo)準(zhǔn)的粗提取物(100和200mg/kg)和生物堿erythravine(3和10mg/kg)和ll-OH-erhytravine(10mg/kg)對(duì)測(cè)量的動(dòng)物在明箱中的時(shí)間的抗焦慮效果。最近報(bào)道了用木輪轂刺桐提取物在這個(gè)模型中的陽(yáng)性結(jié)果(ONUSICWa/.，2002)。，見(jiàn)察到當(dāng)200和400mg/kg的劑量被短暫施于小鼠的時(shí)候增加了在模型的兩個(gè)箱之間的轉(zhuǎn)移次數(shù)和動(dòng)物在明箱中的時(shí)間。在本發(fā)明中也觀(guān)察到，低劑量(3mg/kg)的11-OH-erhytravine的施藥增加了在模型的兩個(gè)箱之間的轉(zhuǎn)移次數(shù)。這種轉(zhuǎn)移次數(shù)的增加可以被認(rèn)為是一種抗焦慮效果，是行為的缺乏抑制的結(jié)果而不是所述動(dòng)物的活性被刺激的結(jié)果，在活動(dòng)場(chǎng)所的活動(dòng)度測(cè)試的反應(yīng)時(shí)間沒(méi)有增加?？梢缘贸鋈缦陆Y(jié)論—一本發(fā)明描述了用高架式T迷宮得到的新結(jié)果，所述結(jié)果證明了，當(dāng)通過(guò)口服的時(shí)候，木輪轂刺桐水醇提取物(EM)(100-400mg/kg)以及從中提取的生物堿的抗焦慮效果，所述生物堿為ll-OH-erhytravine、erythravine和刺桐亭(3和10mg/kg);——通過(guò)所述活動(dòng)場(chǎng)所的測(cè)試獲得的描述的結(jié)果證明，EM和所迷測(cè)試的物質(zhì)并不會(huì)改變所述動(dòng)物的活動(dòng)度；—一所述結(jié)果顯示，至少包含O.1°/。的總刺桐生物堿的粗提取物，和至少包含20%的總刺桐生物堿和10%的刺桐生物堿erythravine以及其他微量的生物堿和其他極性和非極性物質(zhì)的純化的級(jí)分(F2)在LTE(3-30mg/kg;v.o)中也表現(xiàn)出了抗焦慮效果，并且不改變小家鼠的運(yùn)動(dòng)度；一一用明暗箱模型(一種體內(nèi)藥物篩選的經(jīng)典裝置)獲得的結(jié)果證明，當(dāng)以3和10mg/kg的劑量口月艮施藥的時(shí)4吳，ll-OH-erhytravine和erythravine表現(xiàn)出了抗焦慮效果；---項(xiàng)探索性的短暫毒性試驗(yàn)(7天，口服)證明，在所用劑量(200-3600mg/kg)下的所述粗提取物沒(méi)有引起雄性或雌性的小家鼠的死亡，因此表明所述粗提取物的低毒性。因此，本文檔中的數(shù)據(jù)可以支持以前的結(jié)果，這表明分離的木輪轂刺桐的生物堿，即ll-OH-erhytravine、erythravine和刺桐亭是與所述水醇提取物的抗焦慮效果相關(guān)的主要活性物，并且當(dāng)以粗提取物或純化的級(jí)分(F2)施藥的時(shí)候它們保持這個(gè)活性，這可以解釋這種植物普遍地被應(yīng)用作鎮(zhèn)靜劑；還提供標(biāo)準(zhǔn)化的藥物組合物的制劑，所述制劑對(duì)具體的治療需求有合適的藥理作用，而且可以避免以天然形式使用植物通常M到的問(wèn)題。除此之外，以前研究中觀(guān)察到的粗提取物的抗焦慮效果可以說(shuō)是在其組成中存在刺桐生物堿的結(jié)果，可以或者通過(guò)用分離的生物堿的測(cè)試或者通過(guò)富集生物堿的純化的級(jí)分觀(guān)察到這個(gè)結(jié)果。權(quán)利要求1.一種粗的培植植物提取物在制備一種藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物的膽堿能和/或5-羥色胺能和/或γ-氨基丁酸能系統(tǒng)，其特征在于所述的植物提取物包含-至少0.1％的總刺桐生物堿，其中一種純化的級(jí)分包含至少20％的總刺桐生物堿；和-至少10％的刺桐生物堿erythravine或者它們的電子等排體、鹽、衍生物和/或它們的可藥用的溶劑合物。2.活性物質(zhì)在制備一種藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于調(diào)節(jié)脊推動(dòng)物的膽堿能和/或5-羥色胺能和/或Y-氨基丁酸能系統(tǒng)，所述活性物質(zhì)特征為具有通式OH或者為它們的電子等排體、鹽、衍生物和/或它們的可藥用的溶劑合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述的物質(zhì)被用作抗焦慮劑。4.一種藥物組合物，所述組合物用于治療與膽堿能和/或5-羥色胺能和/或Y-氨基丁酸能系統(tǒng)功能障礙相關(guān)的紊亂，其特征是包含-至少0.1°/的總刺桐生物堿，其中一種純化的級(jí)分包含至少20%的總刺桐生物堿；和-至少10。/。的刺桐生物堿erythravine或者它們的電子等排體、鹽、-時(shí)生物和/或它們的可藥用的溶劑合物。5.—種藥物組合物，所述組合物用于治療與膽堿能和/或5-羥色胺能和/或Y-氨基丁酸能系統(tǒng)功能障礙相關(guān)的紊亂，其特征在于包含一種藥用載體和至少一種具有如下通式的活性物質(zhì)6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的組合物，其特征在于所述的物質(zhì)被用作抗焦慮劑o7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其特征在于還包含刺桐亭和/或erythravine。8.根據(jù)權(quán)利要求4、5或6的組合物，其特征在于包含木輪轂刺桐的水醇提取物，所述提取物包含所述的活性物質(zhì)。9.一種方法，所述方法制備用于調(diào)節(jié)脊推動(dòng)物的膽堿能和/或5-羥色胺能和/或Y-氨基丁酸能系統(tǒng)的藥劑，其特征在于包含以下步驟-制備一種藥物栽體；以及-在所述的載體中摻入至少一種具有通式0H的活性物質(zhì)或者它們的電子等排體、鹽、衍生物和/或它們的可藥用的溶劑合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述的活性物質(zhì)是通過(guò)化學(xué)合成獲得的。11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于在所述載體中另外摻入所述的活性物質(zhì)刺桐亭和/或erythravine。12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述的活性物質(zhì)是通過(guò)刺桐屬植物的水醇提取物獲得。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述的活性物質(zhì)是通過(guò)木輪轂刺桐種植林的水醇提取物獲得。全文摘要本發(fā)明提供分子對(duì)于膽堿能、5-羥色胺能和/或γ-氨基丁酸能系統(tǒng)模型的用途，給出了用于治療焦慮癥的藥物組合物，所述組合物包含11-OH-erythravine、erythravine、刺桐亭和/或它們的可藥用的電子等排體、鹽、副產(chǎn)物和/或溶劑合物，任選地包含其他刺桐副產(chǎn)物；還給出了用于獲得所述藥物組合物的方法。文檔編號(hào)A61K31/395GK101330915SQ200680046978公開(kāi)日2008年12月24日申請(qǐng)日期2006年10月20日優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日發(fā)明者O·A·費(fèi)洛辛歐朱捏,R·L·N·迪索撒,V·D·S·博爾贊申請(qǐng)人:圣保羅州立大學(xué)儒利奧清真學(xué)院