專利名稱：：顯像劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性涉及強化食品領(lǐng)域。更具體地涉及用鐵強化食品。本發(fā)明還涉及用于由鐵強化和補充食品及其它產(chǎn)品的添加劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：鐵是動物和人類營養(yǎng)中的基本微量元素。它是血紅蛋白中的原血紅素和肌紅蛋白、細胞色素以及多種酶的組分。鐵的主要作用是其參與了氧的輸送、存儲和利用。鐵缺乏癥不僅在發(fā)展中國家而且在發(fā)達國家都是而且一直是常見的營養(yǎng)學問題。飲食鐵的攝取不足造成貧血癥高發(fā)，這一點通過對兒童、青少年和女性的營養(yǎng)學普查得到證實。由于人體不產(chǎn)生礦物質(zhì)，所以完全依賴于營養(yǎng)品或補充劑從外部供給鐵。在人類整個生命中適當鐵攝取的重要性得到公認。推薦的每日鐵攝取限量為10-18mg每天，取決于年齡和性別。兒童、絕經(jīng)期婦女以及孕婦和產(chǎn)婦都是鐵需求較高的人群。一般水溶性無機礦物質(zhì)有可能削弱食品的穩(wěn)定性，其含量很難超過某一限量，不能大量用于礦物質(zhì)的補充。此外，奇怪的苦味或金屬味道對于許多食品類型也是問題。一般可或多或少地添加影響食品穩(wěn)定性和味道的水不溶性礦物質(zhì)。然而，礦物質(zhì)的高比重(一般高達1.5或更高)會使其在分散到諸如牛奶的液體產(chǎn)品中時在短時間內(nèi)沉淀，從而對食品的穩(wěn)定性和外觀帶來負面影響。因此，其添加量仍很有限。此外，采用不溶性大顆粒形式的礦物質(zhì)補充劑會造成混合和加工設(shè)備磨損和嚴重損壞。可在食品和/或飲料中添加水溶性鹽或絡(luò)合物形式的鐵，以提供日常限量。食品和飲料中添加的鐵源帶來的主要問題是產(chǎn)生顏色和異味，特別是在氧、光以及高溫存在下。此外，向飲料中，特別是向茶、巧克力奶或含香蕉飲料中添加鐵會非常困難。如果采用高度或輕微可溶性的鐵源，鐵與諸如多酚的鐵敏感性成分之間就會發(fā)生相互作用。因此，加近環(huán)境中帶電側(cè)鏈的不同而不同。用例如丙氨酸等殘基來替換諸如門冬氨酸或谷氨酸之類的帶電殘基可以出乎意料地使金屬離子結(jié)合親和力減少高達100倍。就多功能顯像劑來說，例如如果顯像劑使熒光蛋白時，需要誘導金屬結(jié)合位點但不能顯著改變發(fā)色團的環(huán)境因為這樣會減小熒光/光信號。這些金屬結(jié)合位點可以添加到遠離發(fā)色團的位置或者簡單地融合到熒光團中。這種位置可以明顯地從序列或蛋白折疊中找到。在其它實施方式中，接枝方法可以和設(shè)計法一起使用以便創(chuàng)建最佳的金屬結(jié)合位點。例如，金屬結(jié)合位點可以通過使用由計算機設(shè)計所獲得的部分連續(xù)結(jié)合位點和部分配體殘基來創(chuàng)建。蛋白的環(huán)或任何序列可以移除或修飾以便獲得最佳的所學結(jié)合親和性、金屬選擇性、弛豫度和穩(wěn)定性。因此，通過改變金屬結(jié)合位點的一級、二級和/或三級結(jié)構(gòu)，使得獲取具有所期望特異性的和親和性以及更多重要顯像性能的金屬離子結(jié)合位點成為可能。3.其它方法金屬離子的螯合或結(jié)合可以采用已知或以后發(fā)明的方法來進行研發(fā)。這些方法包括現(xiàn)有技術(shù)中容易獲得的蛋白質(zhì)工程法，其包括通過修飾已有的金屬結(jié)合位點來改變金屬結(jié)合特異性和動力學性質(zhì)。這些方法也包括用蛋白質(zhì)配體殘基來修飾已有結(jié)合位點或?qū)⑵淙诤系骄哂衅渌肿拥牡鞍罪@像劑中。其包括用其它含非天然氨基酸或碳水化合物或磷酸鹽等其它分子/輔基的金屬結(jié)合位點構(gòu)象。用于蛋白質(zhì)制備或設(shè)計合適方式的示例性方法在BarondeauD.P和GetzoffE.D.，蛋白-金屬離子結(jié)合關(guān)系的結(jié)構(gòu)探索(StructuralInsightsintoProtein-metalIonPartnerships),CurrentOpinoninchemicalBiology,2004，14:7;禾卩Lu,Y,含非天然氨基酸或非原始的金屬輔助因子的蛋白質(zhì)的設(shè)計和制備(DesignandEngineeringofMetalloproteinsContainingUnnaturalAminoAcidsorNon-Native25r下j)t藏幾個小時內(nèi)，白色的環(huán)在乳狀液頂部形成。{頓TurbiscanLabE鄧ert(Foimulaction,France),該環(huán)會繼續(xù)發(fā)展。結(jié)果表明，該不穩(wěn)定過程是不可逆的。驅(qū)散的起始狀態(tài)不可以M搖動乳狀液獲得。的蛋白質(zhì)框架發(fā)生碰撞。雖然直接將發(fā)色團殘基用作螯合位點并不是優(yōu)選的，但是其也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。金屬離子金屬離子是微粒和離子，包括各自的同位素以及放射性同位素，其可以結(jié)合到蛋白或肽上。金屬離子可以進行可逆或不可逆地結(jié)合，并且這種鍵可以是共價的也可以是非共價的。如果本發(fā)明優(yōu)選實施方式中使用Gd"作為MRI顯像劑的示例性金屬離子，可以理解適用于本發(fā)明的金屬離子包括但不限于這些金屬離子，其包括順磁性金屬離子、過渡金屬離子以及鑭系離子。示例性金屬離子包括但不限于，鎂、鈣、鈧、鈦、錳、鐵、硼、鉻、鈷、鎳、銅、鋅、鎵、鍶、釔、鍶、锝、釕、銦、鉿、鴇、錸、鋨以及鉍的離子及其同位素、和/或放射性同位素形式。在本發(fā)明中也可以采用金屬的放射性同位素。本發(fā)明優(yōu)選使用順磁性金屬離子。顯像劑螯合離子的選擇部分取決于離子在診斷中的角色?？梢酝ㄟ^例如螯合的方法進行結(jié)合的金屬包括鑭系和其它金屬離子，其包括它們的同位素和放射性同位素。在MR顯像應(yīng)用中，優(yōu)選的金屬離子是釓等順磁性金屬離子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于預(yù)期的診斷應(yīng)用來選擇螯合用的金屬離子，而無需過多的實驗。如上所述，本發(fā)明中處于顯像劑形成的螯合復合物中的金屬離子的選擇有賴于采用該試劑的診斷技術(shù)。對于MRI或MRS或EPR應(yīng)用，金屬離子應(yīng)當是順磁性的(具有不成對電子的離子)，并且優(yōu)選是非放射性的。對于X射線和超聲顯像，應(yīng)當采用例如至少30個、優(yōu)選50個微粒數(shù)的重金屬離子，更優(yōu)選是非放射性的。對于閃爍掃描法而言，該金屬離子應(yīng)當是放射性同位素離子。對于MR、X射線、EIT或磁力顯像而言，技術(shù)人員可以使用螯合基團來結(jié)合重金屬簇(例如，多金屬氧酸鹽以及全部或部分硫似物)或者結(jié)合氧化鐵或者其它超順磁多微粒物質(zhì)。用螯合劑和多聚螯合劑結(jié)合金屬離子的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。金屬可以通過直接結(jié)合、模板合成以及轉(zhuǎn)甲基作用而結(jié)合到顯像劑中，也就是經(jīng)剪接的結(jié)合位點上。優(yōu)選地，金屬離子可以通過直接結(jié)合法與顯像劑螯合，其包括用亞化學計量溶液進行滴定直至達到完全結(jié)合的水平。實施例在下列實施例中，發(fā)明人集中于完全不同的蛋白質(zhì)，即免疫球蛋白超家族蛋白質(zhì)以及熒光蛋白。例如，出于幾個原因，選用細胞粘附蛋白CD2的結(jié)構(gòu)域1和綠色熒光蛋白作為連接所制備的多種不同金屬(例如Gd3+)結(jié)合位點的骨架蛋白(例如附圖1A和1B)。進一步地，CD2變異體的6D79的三維模型結(jié)構(gòu)根據(jù)設(shè)計金屬結(jié)合位點(球)的不同而有所不同，而6D79和7E15的模型結(jié)構(gòu)則基于鼠CD2(lhng)的結(jié)構(gòu)域1。GFP(lb9c)的3D結(jié)構(gòu)具有設(shè)計的Gd"位點和突出的發(fā)色團。GdS+結(jié)合殘基和鄰近的殘基已經(jīng)被顯示出來了。該接近于鏈B的殘基也在圖中顯示。例如，圖1A顯示了具有設(shè)計金屬結(jié)合位點的CD2的三維結(jié)構(gòu)。動力學性質(zhì)經(jīng)歷了相對較大變化的回環(huán)被顯示成紅色。在連續(xù)幾個殘基都被染色的情況下，只對一個殘基作了標記。第一，這些蛋白在對抗pH變性和蛋白水解性裂解方面具有較強的穩(wěn)定性。例如，已知GFP是特別穩(wěn)定的并且不會被諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶。此外，之前的研究已經(jīng)表明CD2的結(jié)構(gòu)域1在pH2-11之間可以維持其天然構(gòu)象。第二，CD2和GFP的各種結(jié)構(gòu)信息是可以獲知的，其允許設(shè)計合理地設(shè)計具有優(yōu)化的內(nèi)部、次級和外部球形弛豫以及金屬結(jié)合性質(zhì)的金屬結(jié)合位點。第三，這些蛋白經(jīng)受突變而不至于損害它們的天然構(gòu)象和折疊。第四，這些蛋白具有緊密結(jié)構(gòu)，分子量在11-30KDa之間，其旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間為10-30ns。這些蛋白已經(jīng)匹配于目前臨床所允許的磁場強度的優(yōu)化弛豫度。第五，分子尺寸適用于良好的循環(huán)和組織穿透。第六，對GFP而言，固有的熒光允許構(gòu)建多功能探針，并且其熒光被用作設(shè)計分子顯像用的MRI顯像劑的輔助工具，而無需其它熒光團。圖2顯示了這種方法的離子，其中幾個Gc^+結(jié)合位點被設(shè)計在CD2的不同位置上。Gd3+、Tb3+、La"和其它鑭系金屬離子具有與Ca^相似的配位性質(zhì)。在示意性的具有一個被大量水分子包圍的內(nèi)部球形水分子的G(^+螯合劑中，化表示分子的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間，Kex表示水/質(zhì)子交換率或者是等同配位水Tm駐留壽命的倒數(shù)，而1/Tue表示Gd"電子旋轉(zhuǎn)的弛豫率。他們都強烈地優(yōu)先選擇來自Asp、Glu、Asn和Gln中羧基側(cè)鏈的氧微粒。小的螯合劑螯合物相對于Gd"和C^+通常各自具有8個和7個配位氧微粒。對于諸如蛋白質(zhì)之類的大分子而言，可能是由于空間位阻效應(yīng)其配位數(shù)目要稍稍小一些。Gd"和Ca"各自的平均值是7.2和6.5。五角雙錐體構(gòu)型和潛在的金屬結(jié)合配體殘基被用于采用計算機算法來創(chuàng)建CD2中的金屬結(jié)合位點當中，其參數(shù)基于發(fā)明人的選擇。由于Gd"是高度帶正電荷的，因此在配位層上設(shè)置了更多帶負電的殘基以便提高對Gd^的親和性并超過Ca2+。具有不同數(shù)量配位水(q=l和2)的金屬結(jié)合位點已經(jīng)被設(shè)計到CD2之中(用CA.CD2表示)。例如，CA1.CD2(見下文)，該金屬結(jié)合配體殘基來自蛋白的不同位置從而形成金屬結(jié)合袋(不連續(xù)的)，同時CA9.CD2(見下文)含有通過來自柔性甘氨酸連接物鈣調(diào)素的連續(xù)EF-手相回環(huán)所形成的金屬結(jié)合位點。對該位點進行設(shè)計從而對之前所報道的結(jié)合有大分子的高彈性顯像劑進行模擬并驗證我們的假設(shè)。如圖7-25所示，示例性顯像劑的氨基酸序列分別顯示在序列號(SequenceId.Nos.)為l-19的序列中。具有發(fā)色團的熒光蛋白的蛋白質(zhì)中進行選擇。19.一種多功能探針包括a)具有光學特性的熒光蛋白；以及b)至少一種能可操作地結(jié)合到熒光蛋白中的至少一種金屬螯合位點，其特征在于，該探針用作顯像應(yīng)用中的顯像劑。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的探針，其特征在于，金屬結(jié)合位點優(yōu)先選擇結(jié)合選自下列組中的順磁性金屬離子，所述組包括Gd(III)，Mn(11)，F(xiàn)e(III),Co(11)，Co(III)，Ni(III),Mo(V)以及V(IV)。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的探針，其特征在于，金屬結(jié)合位點優(yōu)先選擇結(jié)合選自由鑭系金屬構(gòu)成的組中的金屬離子。22.—種產(chǎn)生對象的強化圖像的方法a)施加具有至少一種可操作地嵌入骨架蛋白中的金屬離子螯合位點的顯像劑；以及b)產(chǎn)生對象的一個或多個圖像。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述一種或多種圖像由核磁共振產(chǎn)生。24.—種顯像劑以及用于制備本文所公開的顯像劑的方法。盆170(或者在第三盆的位置上的第一盆)將接納可再利用的包屑材料。雖然一些結(jié)團的包屑材料有可能最后處于第三盆170中，一些可再利用的包屑材料將最后處于第二盆140中，但是在一實施例中這些數(shù)量相對比較小。文中使用的"盆，，可以包括盆、桶、碗、盒子、貯槽或其它能夠接納并保持食品覆層材料的物品。支架110可提供對食品包屑設(shè)備100的其它部件的支承。支架110可包括第一盆位112、第二盆位114和第三盆位116。第一盆位112可位于支架110的頂部。第二盆位114和第三盆位116中的每個都位于支架110的下部或與支架110的下部相連，和/或它們都在支架110的內(nèi)部。第一盆位112、第二盆位114和第三盆位116中的每一個都支承一個或多個盆。盆的大小制成用于安裝到相應(yīng)的盆位的尺寸中。在一實施例中，第一盆位112可包括門118。如圖2所示，門118可以打開以便于更容易地從笫一盆位中取下第一盆130。在另一個實施例中，第一盆位112沒有門，為了從支架110上取下盆，可以從第一盆位112中提起盆?；蛘?，可以在門118的位置提供開口，而不i殳置門。門118可以連接到鉸鏈、閂鎖或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的機構(gòu)上，這些機構(gòu)允許門從打開位置移動到關(guān)閉位置并將門保持在每個想要的位置上的。第一盆位112的大小制成用于接納第一盆130。在一實施例中，第一盆130可包括聚丙烯。但是可以使用包括金屬或其它塑料的其它材料。在一實施例中，第一盆130具有排出口，例如其底部中的開口210。開口210可以是圓的、方的或其它形狀，并且可以具有任何想要的大小。較大的開口210將允許材料通過開口更快地從盆中移走，而較小的開口提供更可控的材料的釋放。在一實施例中，需要的時候可以用如塞子(未示出)、板或其它物品將開口210蓋住、塞住或用別的方式堵住。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的提供障礙物來減少或抑制材料通過的任何塞子都可以使用。應(yīng)當理解，上面列舉的塞子及其大小不用于限制，而僅僅是對用來塞住開口210的裝置的類型或大小進行說明。在一實施例中，可在開口210下方安置漏斗管、滑槽或其它導引件或合物中順磁部分的高內(nèi)在遷移率。在3特斯拉(Tesla)磁場中測定弛豫時間Tl和T2。采用反轉(zhuǎn)恢復來測定Tl，并用多回波(multi-echo)Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列測定T2。在以l:l的摩爾比加入Gc^+并在GdS+結(jié)合之前計算弛豫參數(shù)并對樣品進行顯像。如表l所示(見下文)，所設(shè)計的顯像劑CA1.CD2表現(xiàn)出的T1弛豫度高達48mM—、—、和DTPA相比靈敏度提高約10倍。濃度為50uM的顯像劑CA1.CD2能夠產(chǎn)生橋狀圖像，同時Gd-DTPA則不會產(chǎn)生可見的圖象。這暗示明顯較低的局部濃度(10pM)對順利顯像而言是足夠的。此外，其它幾個所設(shè)計的CD2變異體，例如CA3.CD2-6D79和EEDDN也表現(xiàn)出〉30mM—、—'的弛豫度值。另一方面，來自鈣調(diào)節(jié)素(CA9.CD2)的具有接枝EF回環(huán)III的CD2和DTPA具有相似的弛豫度，這可能是由于金屬結(jié)合位點存在內(nèi)在遷移率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>'來自參考文獻所設(shè)計蛋白的質(zhì)子弛豫在存在過量C^+的情況下也不會改變，并且較強的天然C^+結(jié)合蛋白不具有加強的質(zhì)子弛豫度。為了評價模擬細胞外環(huán)境中Gd^結(jié)合的穩(wěn)定性以及評價其它處于所設(shè)計Gd"結(jié)合蛋白的弛豫上的生物金屬離子，在<^2+和Gd^的比例為1:1或100:1(直至10mMCa2+)的情況下測定Tl參數(shù)。表1中的結(jié)果顯示常規(guī)開發(fā)的顯像劑的弛豫在100倍過量(^2+存在的情況下并不會受到明顯的影響。用源自不同器官的組織和鼠血清來進一步測定這些所設(shè)計的顯像劑的弛豫度，測定時間超過兩天。沒有觀察到明顯的弛豫度值的改變，這進一步表明那些經(jīng)過純設(shè)計而得的顯像劑具有體內(nèi)穩(wěn)定性。在以1:1的摩爾比加入GdS+之前和之后對樣品進行顯像并對弛豫參數(shù)進行計算。圖3A示出了樣品順序，從最上面一行的左邊到右邊，然后到第二行，從左到右，隨后第三行從左到右分別是l)dH20，2)Tris，3)Gd-DTPA的水溶液，0.10mMGd3+，4)Gd隱DTPA的Tris溶液，0.10mMGd3+，5)0.092mMGd3+《t.CD2，6)0.077mMGd3+一CA4.CD2，7)0.10mMGd3+-CA2.6D31，8)0.10mMGd3+-CA9.CD2，9)0.020mMGd3+-CA1.CD2-GST，以及10)0.050mMGd3+-CA1.CD2。圖3B顯示采用旋轉(zhuǎn)回聲序列所產(chǎn)生的MR圖像，在3T的磁場中TR6000ms，T1960ms，TE7.6ms。這些結(jié)果表明在骨架蛋白中創(chuàng)建結(jié)合位點獲得了成功，其可以優(yōu)先選擇與Gc^+進行結(jié)合。所設(shè)計金屬結(jié)合蛋白的相關(guān)時間發(fā)明人也把高分辨率核磁共振(NMR)用于探測所設(shè)計金屬結(jié)合蛋白的動力學性質(zhì)。圖4A顯示了兩種制備的金屬結(jié)合蛋白的動力學性質(zhì)。圖4B顯示了具有不連續(xù)配體殘基的CA1-CD2的順序因子，這些在骨架蛋白中具有相同的動力學性質(zhì)。具有由柔性Gly連接物所連接的連續(xù)金屬結(jié)合位點的CA9.CD2的Tl值。該金屬結(jié)合位點比基于柔性連接物的骨架蛋白具有明顯更高的柔性。所設(shè)計的金屬結(jié)合蛋白的整體相關(guān)時間為9.2ns，其于類似大小的蛋白一致。配體殘基的順序因子SZ與蛋白的平均值相似。因此，所測得的蛋白相關(guān)時間直接反映金屬結(jié)合位點的TR。另一方面，具有鈣調(diào)節(jié)素接枝EF-回環(huán)III的CD2顯示出比宿主蛋白更好的柔性。綜上，這些結(jié)果顯示蛋白中所設(shè)計的遷移率最小化的金屬結(jié)合位點可以提高質(zhì)子弛豫度。所設(shè)計的顯像劑的血清穩(wěn)定性通過把與等摩爾GdCl3復合的設(shè)計蛋白與人血清進行孵育的方法來研究所設(shè)計的顯像劑的血清穩(wěn)定性。示例性顯像劑的弛豫度在人血清中沒有變化并且在100倍過量Ca"存在的情況下也沒有受到明顯的影響。此外，這些所設(shè)計的顯像劑在人血清中孵育超過48小時。通過設(shè)計開發(fā)基于蛋白的顯像劑根據(jù)Blombergen、Solomon和其它人所建立的理論以及這些結(jié)果，配位層中的水q、TR旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間以及水交換率是質(zhì)子弛豫度的關(guān)鍵因素。所建立的用于在CD2的結(jié)構(gòu)域1和GFP中設(shè)計額外GdT的設(shè)計方法可以對下列因素進行優(yōu)化以實現(xiàn)更高的MRI弛豫信號。1)不同的配位構(gòu)型Gd"被期望比C^+多具有一個或兩個配位氧配體。已經(jīng)表明所設(shè)計的具有五角六錐體構(gòu)型以及4-5個帶負電荷的配體殘基能夠牢固地結(jié)合Gd3+，并且對C+和Mg具有良好的選擇性。為了測試增加配體微粒是否能夠增加金屬結(jié)合的親和性和選擇性，通過改變表2所示的總共具有6-8個配體殘基的骨架蛋白的配位構(gòu)型，可以對骨架蛋白中的金屬結(jié)合位點進行設(shè)計。表2通過蛋白和水的不同配位數(shù)來設(shè)計金屬結(jié)合位點<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>2)改變配位層中的水數(shù)目q:增加配位層中的水分子數(shù)可以提高弛豫度，而金屬結(jié)合親和性和選擇性則可以折中。已經(jīng)設(shè)計了配位層中具有l(wèi)-3個含水的結(jié)合水(hydraedwater)氧微粒金屬結(jié)合位點(表3)，其中配位層中的總配位數(shù)為7-9，來測試用兩個配位水微粒又不犧牲結(jié)合親和性和選擇性的方式是否可以實現(xiàn)最大的質(zhì)子弛豫度。3)改變配體類型和帶電配體殘基的數(shù)目由于gW+比c^+更優(yōu)先選擇具有負電荷的配體，因此通過改變圖3所示的作為位點7E15配體殘基的Asp和Glu的數(shù)量設(shè)計了總共帶2-6個負電荷的配體殘基。更多的負電荷有望加強Gtf+的結(jié)合親和性和穩(wěn)定性。通過方便內(nèi)部和外部水交換也可以提高弛豫度。4)改變金屬結(jié)合位點的位置選擇合適的金屬結(jié)合位點不僅對蛋白折疊和穩(wěn)定性來說是必要的，而且對質(zhì)子弛豫度而言也是必要的，因為蛋白環(huán)境會對二級和外部球形水交換性質(zhì)的產(chǎn)生影響。表3列出了CD2中不同位置上所設(shè)計的金屬結(jié)合位點。表3在CD2上設(shè)計的金屬結(jié)合位點<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>基于下列考慮(圖1A-1E)對CD2禾PGFP中幾個位點進行了選擇。首先，這些蛋白變異體展現(xiàn)了天然狀的結(jié)構(gòu)以及折疊性質(zhì)。此外，GFP的熒光性質(zhì)并沒有改變。進一步地，通過突變移除結(jié)合到CD48上所涉及的關(guān)鍵殘基并不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。消除了CD2的細胞粘附功能以允許僅僅起到蛋白顯像劑的作用。其次，由于被Tb^熒光能量轉(zhuǎn)換所展現(xiàn)出來，所有的這些金屬結(jié)合位點都結(jié)合到Gc^+的類似物tW+上。第三，這些金屬結(jié)合位點具有不同的二級結(jié)構(gòu)和溶解性，其允許測試二級和外部球形環(huán)境是否會影響水弛豫和金屬結(jié)合親和性。按照圖1A、1B和1C所示，通過(3鏈B和3個來自J3鏈B回環(huán)區(qū)域的配體殘基形成了金屬結(jié)合位點例如(CA1.CD27E15)，而所有的6D79蛋白配體殘基都來自P鏈。5)改變Gc^+結(jié)合位點的數(shù)目由于MR顯像的質(zhì)量涉及到顯像劑的弛豫度和濃度，為了提高局部Gd"濃度同時不改變蛋白濃度把多個位點植入單個多肽中?？梢韵葘λO(shè)計的利用了不交迭配基的Gc^+結(jié)合位點各自進行檢測，隨后植入到單個蛋白中。例如，可以用全部3個Gd3+結(jié)合位點7E15(CA1.CD2)，6D79(CA2.CD2)以及6D31(CA2.CD2)來創(chuàng)建CD2。類似的方法可以用于GFP。其它金屬結(jié)合位點可以通過串聯(lián)重復連接具有多個金屬結(jié)合位點的CD2和GFP來實現(xiàn)。如圖1E所示，具有高有效荷載的多功能顯像劑可以創(chuàng)建成帶有多個Gc^+結(jié)合位點的CD2-GFP融合蛋白。6)改變蛋白的大小所開發(fā)的蛋白的大小對顯像劑的性質(zhì)有幾個影響。根據(jù)本發(fā)明以及Lauffer所指出的，為獲取在現(xiàn)有臨床磁場強度下優(yōu)化弛豫度的相關(guān)時間是10-50ns，其與具有10-30KDa緊湊結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)。具有不同結(jié)構(gòu)域的蛋白在其域之間具有額外的內(nèi)部運動。此外，顯像劑的生物分布和循環(huán)也有賴于蛋白的大小，已知分子量在10-60KDa之間的蛋白在蛋白識別和快速血液擴散以及通過腎臟消除方面是理想的。采用本文所公開的方法，本發(fā)明的發(fā)明人在諸如分子量各不相同的CD2(llKDa)的結(jié)構(gòu)域1、CD2-CD2串聯(lián)融合蛋白、GFP(28KDa)、CD-GST融合蛋白(38KDa)、CD2和GFP的融合蛋白(40KDa)中設(shè)計了金屬結(jié)合位點。這些設(shè)計允許開發(fā)具有為磁場強度、生物分布和生物消除而具有經(jīng)優(yōu)化的高弛豫度的顯像劑。此外，嵌入穩(wěn)定蛋白中的0(13+結(jié)合位點消除了順磁性基團的內(nèi)部遷移并優(yōu)化了總相關(guān)時間和水交換率。此外，這些含有多金屬結(jié)合位點的串聯(lián)重復的CD2和GFP獲得了具有高靈敏度的高有效荷載試劑并減小了顯像劑的使用量，并由此明顯減小了毒性。多功能靶向的顯像劑已經(jīng)創(chuàng)建了具有MR顯像能力和熒光光學顯像能力的多功能顯像劑。參見，例如圖1D，由于熒光的高靈敏度因此可以利用熒光顯像。參見，例如，序列16-19。具有順磁結(jié)合位點和熒光性質(zhì)的蛋白已經(jīng)通過直接處于GFP中的Gd"結(jié)合位點來產(chǎn)生。研究允許對來自閃爍圖和PET的結(jié)果作直接對比，它們?yōu)榘┌Y的病因以及治療的進步提供了空間信息?；铙w顯像采用Gd的ICP-MS和利用了宿主蛋白CD2抗體的免疫學方法對0(13+在不同CD-1鼠的器官中的分布進行了分析。收集了關(guān)鍵器官并對其進行了分析。如圖5A-D所示，這是按時間順序排列的圖，免疫組織化學染色研究進一步揭示了所設(shè)計的蛋白主要停留在腎臟的皮層，這和施用所制備的顯像劑后相對加強后較強的MR圖像是一致。在注射顯像劑后，在>5天的時間里動物仍舊有生機活力并表現(xiàn)出正常的行為。分別參見圖5B和圖5D。蛋白顯像劑的器官分布被進一步用腎臟、肝和肺組織的免疫組織化學染色驗證了。Gd-CA1.CD2在腎臟中的體內(nèi)Tl和T2弛豫度值是49和56.8mM"s"kg組織，這比那些報道中的腎臟中Gd-DTPA的值(分別是1.0和10.8mM"s"kg組織)明顯要高。該結(jié)果和采用純化蛋白所測定的體內(nèi)弛豫度一致。腎臟中體內(nèi)R2弛豫度約比R1弛豫度高11.6倍。毒性首先，測試細胞(1"04細胞/孔，每孔ioow培養(yǎng)基)和所設(shè)計的蛋白在存在或不存在Gd3+(到達5(HiM)的情況下溫育48小時。通過MTT檢測進行細胞生存能力分析。用濃度高達5(HiM的示例性顯像劑(例如，CA1.CD2)處理的任何測試細胞中都沒有觀測到毒性。例如，如圖6所示，在用濃度高達5(HiM所設(shè)計的蛋白處理的所有測試細胞中都沒有發(fā)現(xiàn)毒性。此外，發(fā)現(xiàn)顯像劑對來自注射顯像劑48小時后的鼠的肝臟酶(ALT、ALP、AST、LDH)、尿素態(tài)氮、膽紅素以及總蛋白的作用相對于控制組而言是可以忽略不計的。進一步地，在注射顯像劑后沒有發(fā)現(xiàn)突發(fā)毒性，這暗示本發(fā)明的顯像劑有可能維持了金屬復合物的穩(wěn)定性以及體內(nèi)對Gd"強親和性。上文中對優(yōu)選實施方式以及附圖的具體描述僅僅作為闡述性和說明的目的。它們并不意味著是窮盡性的并且也不意圖限制本發(fā)明的范圍和實質(zhì)。對實施方式的選擇和描述是為了最佳地解釋本發(fā)明的原理及其實際應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認識到在不脫離本發(fā)明范圍和實質(zhì)的情況下對說明書所公開的發(fā)明作出多種變型。權(quán)利要求1.一種顯像劑，包含a)骨架蛋白；以及b)至少一個經(jīng)剪接的金屬離子螯合位點，其特征在于，所述至少一個金屬離子鰲合位點被結(jié)合到骨架蛋白中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，所述至少一種金屬離子螯合位點嵌入骨架蛋白中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，所述至少一種金屬離子螯合位點被完全嵌入到骨架蛋白中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，該顯像劑的馳豫度比骨架蛋白要強。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，金屬結(jié)合位點優(yōu)先選擇結(jié)合選擇自下列組中的順磁性金屬離子，所述組包括Gd(III)，Mn(ID,Fe(III),Co(11)，Co(III),Ni(III),Mo(V)以及V(IV)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，金屬結(jié)合位點優(yōu)先選擇結(jié)合選自由鑭系金屬構(gòu)成的組中的金屬離子。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，骨架蛋白是其本身可以結(jié)合金屬離子的蛋白。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，骨架蛋白是具有發(fā)色團的熒光蛋白。9.一種用于觀察細胞、組織、有機體或動物的方法，包括施用權(quán)利要求l所述的顯像劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，觀察通過核磁共振實現(xiàn)。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯像劑，其特征在于，觀察通過光學分析實現(xiàn)。12.—種用于制備顯像劑的方法包括如下步驟a)選擇骨架蛋白b)構(gòu)建至少一種金屬離子螯合位點；以及C)可操作地把金屬離子嵌入到蛋白中，其特征在于，步驟C)把顯像劑的性質(zhì)賦予骨架蛋白。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，該顯像劑比骨架蛋白具有更強的馳豫度。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，該骨架蛋白根據(jù)以下進行選擇-a)對pH變性的抵抗性；b)對蛋白水解裂解的抵抗性；C)可以耐受突變；以及d)分子大小。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，基于骨架固有的熒光來選擇骨架蛋白。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述至少一種金屬結(jié)合位點按照以下構(gòu)建a)識別可以特異性結(jié)合金屬離子的分析物結(jié)合肽，其中所述分析物是金屬離子；b)確定至少一部分編碼金屬結(jié)合肽的氨基酸序列；以及C)把編碼分析物結(jié)合肽的氨基酸序列剪接成金屬結(jié)合位點。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，骨架蛋白從免疫球蛋白中選擇。18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，骨架蛋白從源自酮糖醇、氫化的淀粉水解產(chǎn)物及它們的混和物。使用的優(yōu)選多元醇選自甘油、乙二醇、丙二醇、二甘醇和三甘醇，甘油是最優(yōu)選的。羥基酸可選自乳酸、蘋果酸或酒石酸、葡萄糖酸及它們的鹽。多元羧酸可選自琥珀酸、己二酸、檸檬酸、異檸檬酸、葡糖二酸及它們的鹽。這些增塑劑可以單獨使用或組合使用。在本發(fā)明的方法中，增塑劑含量優(yōu)選為15-40%。更優(yōu)選增塑劑含量為小于35%，甚至更優(yōu)選其小于30%,更優(yōu)選其小于25%。最優(yōu)選增塑劑含量為大于20%。那樣的小麥谷蛋白材料在流變性能上可表現(xiàn)出一些可變性，如通過面團張力4義測定或通過Brabender塑性變形儀測定所證明。這些變化是由于使用的小麥原料的來源、由于收割條件不同，以及由于加工條件不同。在本發(fā)明的方法中，谷蛋白含量優(yōu)選為60-85wt%。合適的連續(xù)混合機可選自連續(xù)螺桿混合機、連續(xù)螺條混合機和裝有螺桿結(jié)構(gòu)、允許在不需要大量機械能輸入下進行混合的擠出機。該類型的螺桿結(jié)構(gòu)對于熟練技術(shù)人員是已知的。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用含有所需螺桿結(jié)構(gòu)的擠出機。當使用擠出機時，將機筒和螺桿溫度設(shè)定在-10。C至45。C是有益的。因此在混合螺桿區(qū)的機筒溫度應(yīng)不超過60。C,優(yōu)選為50。C。同時，離開連續(xù)混合單元的材料的溫度將不超過90。C，優(yōu)選為80°C。應(yīng)該注意的是施加在機筒上的溫度的目的是限制溫度增加。在另一個有利實施方案中，增塑的小麥谷蛋白材料包含65-75重量份的活性小麥谷蛋白和35-25重量份的增塑劑。在一個優(yōu)選實施方案中，增塑劑是甘油。此甘油可含有至多20%的水。根據(jù)加工條件結(jié)合所用組分的量，可以獲得各種適合的增塑材料。根據(jù)本發(fā)明的寵物食品可通過本文描述的方法獲得。這些組合物的性能可從均勻、塑性和可變形的到韌性、橡膠彈性及高度可延展的變化。全文摘要本發(fā)明公開了一種含有骨架蛋白的顯像劑包括至少一個可操作的一體化金屬離子的結(jié)合位點。文檔編號A61B8/00GK101222878SQ200680025549公開日2008年7月16日申請日期2006年7月13日優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日發(fā)明者劉知人,珍妮J·楊申請人:佐治亞州立大學研究基金會