化合物的制作方法

文檔序號：1123796閱讀：284來源：國知局

專利名稱：化合物的制作方法
化合物本發(fā)明涉及具有確定二級結構的核酸分子，所述二級結構使其能夠結合至病毒表面，特別是HIV的糖蛋白gpl20。這些核酸分子的結合中和了病毒。人類免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)是獲得性免疫缺陷綜合征 (AIDS)(2-4)的病原體，并導致每年約3百萬的死亡。盡管開發(fā)了關鍵病毒酶的有效抑制劑和組合療法，但由于極度的毒林間多樣性，根除HIV感染的目標依然是難以實現(xiàn)的(5)。因此，存在開發(fā)新抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑的強勁動力。經(jīng)典地，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑靶向病毒酶，但近期研究表明，靶向破壞病毒進入宿主細胞的物質(zhì)可以提供替代策略(6)。 HIV-1通過病毒包膜糖蛋白(Env)和原始細胞受體(CD4) (7)和共同受體(CCR5或CXCR4) (8-10) 之間分子相互作用的級聯(lián)而進入CD4+T細胞。表面糖蛋白gpl20首先結合至CD4，并從而被誘導經(jīng)歷構型改變，促進了共同受體的結合(ll)。這觸發(fā)了跨膜糖蛋白(gp41)中進一步的構型改變，導致N端融合肽插入靶細胞膜和病毒基因組最終釋放入宿主細胞質(zhì)(12)。因此，病毒進入在病毒 (gpl20和gp41)和宿主靶細胞(CD4和趨化因子共同受體)上呈遞了許多用于治療攻擊的靶?？紤]到驅(qū)動許多逃避策略(病毒用以逃避免疫監(jiān)督)的抗體(~ 150 kDa)所施加的選擇性壓力，假定較小的配體(例如適體(20-38 kDa))可能結合至包膜糖蛋白上的凹陷保守區(qū)并阻斷病毒進入。適體是包含通常20至120個核苷酸的核酸配體，并可用以確定蛋白質(zhì)表面上的功能上保守的位點。其可以通過被稱為SELEX的體外進化過程從合成組合文庫衍生而來(13, 14)。該方法已經(jīng)被用于分離一系列高親和力的單鏈RNA適體，所述適體結合至CCR5-依賴性HIV-1毒林(Ba.L ) 的gpU0 ( 1 )。在使用BIAcore第5輪選擇之后，分離了與gpl20高親和力結合的抗gpl20(Ba-O適體的25個不同的序列家族(1)。這些適體中和了人類外周血液單核細胞(PBMC)中超過1000倍的HIV-1b^感染性。
重要的是，其還比受試中和單克隆抗體更有效地中和了多種臨床隔離群，并產(chǎn)生了 80%或更大程度的HIV-1感染的抑制(l)。這些適體列于表1中?，F(xiàn)在，已經(jīng)在最小的gpl20結合區(qū)(其對于適體-gp120相互作用是重要的)內(nèi)鑒定了常見的二級結構基序。這反過來提供了修飾的/截短的適體，其依然提供(l)中描述的完整大小的適體結構的中和作用。因此，第一方面，本發(fā)明提供了形成如I中描述的二級結構的單鏈核酸分子其中Hl 、 H2和H3全部是螺旋； Ll、 L2和L3全部是環(huán)結構； L2包含序列CAC或CAXC;L3包含序列ACXX或AXXX;其中X是任意核苷酸，并且其中下一個核苷酸是G，其形成了部分H3;和在H2和H3之間的區(qū)域內(nèi)的L1，包含序列UUUU;其條件是所述核酸分子不包含選自表l中所列的那些核酸。當單鏈核酸分子兩部分之間形成沃森-克里克堿基對時形成螺旋。這通常在回文序列中發(fā)生。然而，允許一定程度的"搖擺，，，例如G-U堿基配對。在形成螺旋的兩部分序列之間的序列產(chǎn)生了環(huán)。因此，如果觀察附圖lc并考慮其中顯示的適體結構，則清晰可見三個不同長度的石威基配對區(qū)域。這些在說明中標記為1、 2和3?？梢钥吹?，H3僅由兩個堿基對組成，但為本發(fā)明的目的，如此短配對的序列依然被定義為螺旋。沒有形成堿基配對的其他部分的序列構成了根據(jù)本發(fā)明的環(huán)結構。
本發(fā)明的核酸分子必須優(yōu)選能夠中和病毒。在優(yōu)選實施方案中，通過結合至包膜蛋白(例如，HIV病毒的gpl20蛋白)來實現(xiàn)中和。術語"中和"在本文指中和/降低所述包膜病毒的感染性，優(yōu)選減少至少一個數(shù)量級，更優(yōu)選減少幾個數(shù)量級。所述核酸可以是單鏈或雙鏈的RNA或DNA。通常，所述核酸分子長度為20-120個核苷酸。形成所述核酸的核苦酸可以被化學修飾以提高所述分子的穩(wěn)定性，以提高其生物利用率或為其帶來其他活性。例如，可以使用CH3或囟素(例如I、 Br或Cl)在6或8位修飾嘧啶堿基，和在 5位修飾噤呤堿基。嘧咬堿基的修飾還包括2NH3、 06-CH3、 N、CH3和 N2-CH3。 2'位的修飾是糖修飾，并通常包括NH2、 F、 OCH3、 OCH2CH3、 O-丁基或任何O-烷基基團。修飾還可以包括3'和5'修飾，例如加帽。還可以在所述結構中加入對核糖部分的修飾?；蛘呖梢允褂眯揎椀暮丝嗨?，例如嗎啉代核苷酸、鎖定核酸(LNA) 和肽核酸(PNA)。嗎啉代寡核苷酸由不同的嗎啉代亞基組合，所述亞基各自含有一個連接至6元嗎啉環(huán)的四遺傳堿基(腺噪呤、胞嘧啶、鳥。票呤和胸腺嘧啶)。所述亞基通過非離子的磷酸二酰胺亞基間連接而結合，以生成嗎啉代寡核苷酸。LNA單體的特征在于，呋喃糖環(huán)構型由連接2'-0位至4'-C位的亞甲基連接體所限制。PNA是DNA類似物，其中骨架為擬肽而非糖。在本發(fā)明的實施方案中，Hl由4-10堿基對組成，另外還可以包含 A:A^"配配對?；蛘撸琀l可以由少于3個石咸基對或?qū)嶋H多于IO個石咸基對組成。我們已經(jīng)顯示了縮短H1的長度以減少適體結構的穩(wěn)定性，其反過來降低了結合。這可能歸因于Hl對Ll的穩(wěn)定化損失。因此，當Hl的長度減少時，應該通過引入修飾(例如交聯(lián)修飾或增加Hl或?qū)嶋HLl中磁< 基配對的修飾)來穩(wěn)定U。因此，例如，應該有可能去除Hl,但這將需要Ll環(huán)通過交聯(lián)或堿基配對修飾而"閉合"以穩(wěn)定Ll。圖9-11中可以看到改變H1的長度對結合等的作用。
可以通過本領域技術人員公知的方法制備適體，例如通過固相合成(Ogilvie, K,K,等(1988) Proc， Natl， Acad. Sci.U.S.A 85 (16) p5764-8; Scaringe, S.A (2000) Methods Enzymol 317 p 3-18)或體外轉(zhuǎn)錄(Heidenreich, O., W. Peiken和F. Eckstein (1993) Faseb J. 7(1) p90隱6.)。在另一實施方案中，所述適體是截短的適體，即，至少一個核苷S吏被除去的全長適體核酸分子。如本文討論的，這種分子的重要特征是其保留形成本文描述的二級結構的能力。本發(fā)明人已經(jīng)確定了所述適體分子為有效中和而必須具有的最小結構。第二方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明適體篩選潛在治療靶的方法。如上所述，病毒已經(jīng)適應以保護自身免受抗體檢測?；诒瓤贵w可變區(qū)小的分子的藥物應該能夠穿透這些適應設備。幾乎沒有藥物作用以防止病毒感染("Rossman"半裂結合(deft-binding)抗小RNA病毒劑是特別的例外)。這已經(jīng)被鑒定為抗病毒治療的全部設備中的顯著缺陷。由于適體-病毒結合的作用是防止細胞感染，則可能鑒定與所述適體竟爭用于病毒結合的小分子。這些分子將結合至病毒上相同的功能上保守的位點，從而抑制病毒感染，并因此用于抗病毒治療的開發(fā)。病毒中和測定不適合于高通量篩選方法，因為其依賴于挑戰(zhàn)性細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、延長的培養(yǎng)時間和復雜的讀出系統(tǒng)。適體可用于如Green和Janjic (2001) Biotechniques 30 1094-6， 1098, 1100各處所述的高通量篩選方法。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的適體被用于高通量篩選方法。這種方法涉及使用病毒蛋白，特別是包膜糖蛋白，例如gpl20。第三方面，本發(fā)明提供了用于鑒定阻滯或增強本發(fā)明適體與包含所述適體結合位點的生物分子之間相互作用的化合物的體外方法，該方法包括(a)生成包含一種或多種本發(fā)明適體、所述生物分子和候選化合物的混合物；和^f壬選;t也候選化合物)培育所述混合物；和
(C)測定所述候選化合物對所述適體至所述生物分子的結合的影響。阻滯或刺激本發(fā)明適體結合至適體結合位點的化合物被鑒定為在治療由適體至結合位點的結合基序所介導的疾病或疾患中具有潛在的藥理活性。本文使用的術語"特異性結合"表示適體與非特異性結合至生物分子其他區(qū)域相反地結合至結合基序，或者其中進行測定的容器表面。所述生物分子可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸(例如DNA或RNA)或其組合，例如肽核酸。在一個優(yōu)選實施方案中，生物組分包含HIV-1的包膜糖蛋白gpl20的適體結合基序。更優(yōu)選地，所述生物分子是HIV-1的包膜糖蛋白gpl20。在一個優(yōu)選實施方案中，所述適體和/或生物分子被標記以提供^r測信號。所述組分可以使用可直接或間接檢測的標記物(例如放射性標記(例如"S、 1251、 3￥和/或310、熒光或發(fā)光標記、酶或表位標簽)所標記，以促進一個或其他蛋白質(zhì)組分的特異性檢測。適當?shù)兀瑴y定混合物的其他組分可以包括鹽、緩沖劑組分等，以促進最佳的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結合，并降低反應組分的背景或非特異性相互作用。病毒蛋白結合至反應器，例如Moore, J. P., J. A. McKeating等(19卯) "來自HIV1的重組gpl20和gpl60的表征結合至單克隆抗體和可溶性 CD4 ( Characterization of recombinant gpl 20 and gp歸from HIV-1: binding to monoclonal antibodies and soluble CD4 ) ", Aids 4(4): 307-15中描述的 96孔板。化合物(例如來自組合文庫)與固定化的病毒蛋白培育。添加標記的中和適體。所述標記可以是放射性的或蛋白質(zhì)，例如鏈霉抗生物素。在均等化后洗去未結合的適體，并測定結合的適體的濃度。在結合的適體的量顯著低于對照(其中忽略了測試化合物)的容器對應潛在抑制病毒感染的測試化合物。然后，所鑒定的化合物可以不同濃度用于進一步篩選測試，以鑒定具有最低的IC50(產(chǎn)生對適體-蛋白質(zhì)結合50。/。抑制的濃度)的那些化合物。還可以使用超高通量方法。還可使用微流體技術和基于"芯片實驗室(lab-on-a-chip )"的技術來
實施這些篩選方法。在這些方法中，使用了具有直徑通常小于lmm的通道的設備。這種方法中使用的小體積(通常為納升)減少了所需要的試劑的量，因此減少了成本，特別是當需要昂貴試劑時。其還減少了均等化發(fā) 生所需要的時間量，從而加速了所述過程。這些設備的裝配是相對廉價的并允許多種多樣的設備被大量生成。微流體技術也允許在同一芯片上實現(xiàn) 幾種不同的功能。使用微流體技術的高通量篩選方法是本領域技術人員公知的，并描述于例如W098細231、 US5942443和US2002/031821 。本發(fā)明的核酸可以用于藥物組合物。因此，第四方面，本發(fā)明提供了包含本文定義的一種或多種核酸的藥物組合物，其任選包括一種或多種藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。本發(fā)明的組合物可適于通過任何適當途徑給藥，例如通過口(包括口腔或舌下)、直腸、鼻、表面(包括口腔、舌下或經(jīng)皮膚)、陰道或胃腸外 (包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)或皮內(nèi))途徑。這樣的制劑可以通過藥學領域已知的任何方法制備，例如通過將活性成分與載體或賦形劑結合。適于經(jīng)口給藥的藥物制劑可以分離的單位出現(xiàn)，例如膠嚢或片劑；粉劑或顆粒劑；于水或無水液體中的溶液劑或混懸劑；可食用的泡沫或泡沫劑；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。適于經(jīng)皮膚給藥的藥物制劑可以分離的貼劑出現(xiàn)，預期與受體的表皮在延長的時間期內(nèi)緊密接觸。例如，如Pharmaceutical Research, 3(6)， 318 (1986)中一般描述的，活性成分可以通過離子滲入法從貼劑被遞送。適于表面給藥的藥物制劑可以被配制成軟膏、乳膏、混懸劑、洗劑、粉末劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠或油劑。為應用于眼或其他外部組織(例如口和皮膚)，所述制劑優(yōu)選作為表面軟膏或乳膏使用。當制成軟膏時，活性成分可與石蠟或水混溶性軟膏基質(zhì)一起使用?；蛘撸龌钚猿煞挚膳c水包油乳膏基質(zhì)或油包水基質(zhì)一起配制成乳膏。適于表面給藥至眼的藥物制劑包括滴眼劑，其中活性成分溶解或懸浮于可溶性載體，特別是水溶劑。適于在口中表面給藥的藥物制劑包括錠劑、軟錠劑和漱口劑。適于直腸給藥的藥物制劑可作為栓劑或灌腸劑出現(xiàn)。適于鼻給藥的藥物制劑(其中載體是固體)包括顆粒尺寸例如在20微米至500微米范圍內(nèi)的粗粉，其以采用鼻煙的方式給藥，即，從向上靠近鼻子放置的粉末容器經(jīng)由鼻道快速吸入。作為鼻噴霧劑或滴鼻劑給藥的適當制劑(其中載體是液體)包括活性成分的水溶液或油溶液。適于吸入給藥的藥物制劑包括細小顆粒粉劑或霧劑，其可以通過各種類型的測定劑量增壓的氣溶膠、噴霧器或吸入器產(chǎn)生。適于陰道給藥的藥物制劑可以作為陰道栓劑、棉塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑出現(xiàn)。適于胃腸外給藥的藥物制劑包括水和非水無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使所述制劑與預期受體血液等滲的溶質(zhì)；和水和非水無菌混懸液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿和管形瓶)中出現(xiàn)，并可以保存于冷凍干燥(凍干的)條件下，僅需要在即將使用前加入無菌液體栽體，例如用于注射的水。臨時注射溶液或混懸液可以由無菌粉末、顆粒和片制備。本發(fā)明的組合物可以單位劑量形式出現(xiàn),每劑量含有預定量的各活性成分。這樣的單位可適以提供5-100 mg/天的化合物，優(yōu)選5-15mg/天、 10-30 mg/天、25-50 mg/天、40-80 mg/天或60-100 mg/天。對于式I的化合物，提供了范圍為100-1000 mg/天的劑量，優(yōu)選100-400 mg/天、300-600 mg/天或500-1000 mg/天。這樣的劑量可以單劑量或許多分離的劑量提供。最終劑量取決于患者的待治療疾患、給藥途徑以及年齡、體重和狀態(tài)，并將出于醫(yī)生的判斷。優(yōu)選的單位劑量制劑是含有如上所述日劑量或亞劑量或其適當部分的活性成分的那些單位劑量。應該理解，除了上面特別提到的成分，所述制劑還可以包括現(xiàn)有技術
中與正在討論的制劑類型有關的常規(guī)的其他物質(zhì)，例如那些適合口服給藥的物質(zhì)可以包括調(diào)味劑。另一方面，本發(fā)明提供了(i) 至少一種本發(fā)明的核酸分子在制備用于治療HIV感染的藥劑中的用途；和(ii) 用于治療HIV感染的方法，該方法包括為患者施用有效量的至少一種本發(fā)明的核酸分子?，F(xiàn)在參考下述非限制性實施例來更具體地描述本發(fā)明，所述實施例參考下述附圖

圖1:適體B40和B40t77的酶^果針4企測，RNA足跡和溶液結構。(A) 18。/。聚丙烯酰胺(8M尿素)凝膠的放射自顯影圖，顯示了在不存在 (0)和存在(5、 25 nM)HIV-lBa.L gpl20下使用RNA酶Tl 、核酸酶VI和Sl 的5'-末端標記的B40消化產(chǎn)物。部分堿水解產(chǎn)物(OIT)和RNA酶Tl消化液(G殘基)梯沿側面電泳，以利于比對已知序列。垂直線標記主要的gpl20 保護區(qū)。對照(C)相應于在含有gpl20但不含核酸酶下培育的5'末端標記的B40(wn)適體。堿水解(OH-)梯中的缺口指示2'-氟嘧啶。凝膠頂部邊楔形物指示增加濃度(O nM、 5 nM、 25 nM)的gpl20。(B) 使用CMCT的適體B40的二級結構分析。適體40用CMCT修飾，然后使用5'末端標記的3'引物和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。然后通過變性PAGE顯影cDNA產(chǎn)物。條帶(箭頭所示)指示DMS修飾的位置，在天然適體結構中未配對的殘基處。未修飾的(對照)適體B40平^f電泳，以分辨化學j務飾特別誘導的停止和那些由于存在穩(wěn)定二級結構的停止和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶錯誤停止。N-天然條件下完成的修飾；SD-半變性條件下完成的修飾(l mMEDTA)。泳道A、 G、 C、 U表示雙脫氧RT測序梯。凝膠頂部楔形物指示增加濃度(IO pmol和20 pmol)的CMCT。(C和D)如從酶探針檢測數(shù)據(jù)(其用以限制w/oW預測算法)推導出的，提出的適體B40t77和B40的各自二級結構。突出顯示了在gpl20結合上由RNA酶VI (綠色)、核酸酶S1(紅色)靶向的殘基和對核酸酶V1(綠
色箭頭)或Sl (紅色箭頭)變得更^:感的殘基。勾畫了在結合至gpl20上顯示核酸酶保護的殘基，且線的粗細表明了保護的程度。沃森-克里克堿基對由*指示，其中搖擺G-U由a指示。(E)適體B40中沃森-克里克位置對DMS (Nl-A和N3-C)和CMCT (N1-G和N3-U)的反應性。天然(以及在半變性)條件下有反應性DMS (□□)沃森-克里克石咸基對由*指示，其中搖擺G-U由a指示。圖2:適體B40和B40t77的結合親和力的凝膠遷移率變動分析。(A和D)分析適體B40和B40t77各自結合親和力的代表性凝膠的放射自顯影圖，如在1%瓊脂糖凝膠上分析的，使用了增加的蛋白質(zhì)濃度(25 至400 nM)范圍。(B和E)由gpl20結合的適體百分比作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)的代表性曲線。數(shù)據(jù)符合Graph-Pad Prism的非線性曲線配合方法的雙曲線函數(shù)。滴定生成適體B40和B40t77的平衡解離常數(shù)(Kd)分別為 21±2 nM和31±2 nM。 (C和F)適體B40 (C)和B40t77 (F)對固定于CM5 傳感器芯片(10 000RU)上的gpl20的劑量依賴性結合，使用了 BIAcore表面等離子體共振。條棒指示了適體流過芯片表面的時間。圖3:通過適體B40和B40t77中和人類PBMC中的HIV-lBa-L。病毒p24抗原的輸出用以^^用p24抗原ELISA測定適體的效力。病溶的人類CD4 (shCD4)被用作陽性對照，而針對鏈霉抗生物素(23)生成的適體SA19被用作陰性對照。該實驗進行兩次，每次三份，并且誤差棒表示平均標準偏差。圖4: BIAcore結合測定以分析適體中修飾2'-氟嘧啶在配體結合中的作用。(A)如通過BIAcore表面等離子體技術(SPR)所測定的，適體2'-氟嘧咬取代的B40和B40t77、 2'-氟胞嘧咬取代的B40t77、 2'-氟尿嘧咬取代的B40t77和未取代的(含有核糖核普酸)mB40t77適體(~ 100 nM)至固定的gpl20 (2500 RU)的相對結合分數(shù)(RU)。標繪了三個獨立實驗的平
均士SD。相對結合(RU)分數(shù)是在1=180 s時的結合值。雖然2'-氟嘧啶取代的適體B40和B40t77如預期地結合至gpl20,但2'-氟胞嘧咬取代的 B40t77適體保留了對gpl20的結合能力，而2'-氟尿嘧咬取代的B40t77 和未取代的B40t77適體沒有結合至固定的gpl20。(B)對照覆蓋校正了顯示所述適體的代表性結合的SPR曲線(僅一組結合曲線)。粗棒指示了適體流過芯片表面過程的時間。圖5:適體B40t77的gpl20足跡區(qū)內(nèi)的序列需求分析。通過二級結構實驗揭示的分支構型中顯示了截短的B40的序列。黑體顯示了似乎通過結合至gp 120而避免核酸酶介導的切割的結構的5個部分，并且存在有關涉及gpl20結合的最明顯證據(jù)的那些殘基被加了下劃線。使用BIAcore SPR技術研究了 5個區(qū)域中的突變對gpl20結合的影響。使用GraphPad prism評分了所有突變體在t=180 s時相比較于野生型 B40t77序列的相對結合，并顯示為平均值土SD,并且是從三次獨立實驗獲得的結果。相對結合(RU)分數(shù)是在t二180s時的結合值。在統(tǒng)計學上與野生型序列無差異的值表示為n/s。與野生型序列的顯著差異表示為* (p<0.05)、 ** (pO.01)或^承(pO.001)。圖6:用于gpl20結合的二級結構需求分析。A. B40t77的兩種可能的替代構象異構體的圖解表示。通過足跡分析和誘變作用鑒定為對gpl20結合重要的區(qū)域被標記并顯示為加粗區(qū)域，以表明其存在于替代結構中。B-E.如對圖5的插圖說明中所描述的，通過 BIAcoreSPR分析分析了突變對gpl20結合的影響。在每種情況下，通過略高于相關數(shù)據(jù)條之上的漫畫表示了各突變體的構象異構體，除了圖D 的突變體AG18，其被預測的異常分支結構完整顯示。圖7:適體B40t77的RNA印跡和溶液結構。18。/。聚丙烯酰胺(8M尿素)凝膠的放射自顯影圖，顯示了在不存在(0 ) 和存在(5 nm、 25 nm) HIV-lBa-Lgpl20下使用RNA酶T1、核酸酶V1和 Sl的5'末端標記的B40的消化產(chǎn)物。部分》威水解產(chǎn)物(OIT)和RNA酶Tl 消化液(G殘基)梯(TlD)沿側面電泳，以利于比對已知序列。垂直線標記主
要的gpl20保護區(qū)。對照(C)相應于在存在有gpl20但無核酸酶下培育的5'末端標記的B40適體。凝膠頂部邊楔形物指示增加濃度(O nM、 5 nM、 25nM)的gpl20。圖8:使用DMS化學探測適體B40。適體B40使用DMS進行化學修飾，然后使用5 '末端標記的3 '引物被逆轉(zhuǎn)錄，然后通過18%變性(8 M尿素)PAGE顯影cDNA產(chǎn)物。箭頭指示引物延伸過程中的轉(zhuǎn)錄終止，表示處理RNA中被化學修飾的堿基，其移行的距離比相應DNA梯短一個核芬酸。對照-未^f'務飾的RNA對照；N-天然條件下完成的^f'務飾；SD-半變性條件下完成的修飾(l mMEDTA)。泳道A、 G、 C、 U表示雙脫氧RT測序梯。凝膠頂部楔形物指示增加濃度(30 (imol和60(imol)的DMS。左長移行，右短移行。圖9:為各種適體結構預測的最小能量結構，其中H1的長度是可變的。圖10'.顯示圖9中所示最小結構至gpl20的結合。圖11:顯示最小結構的結合與結構穩(wěn)定性之間關系的分析。圖12:顯示247系列合成B40適體衍生物的預測結構和熱力學性質(zhì)。圖13:顯示265系列合成B40適體衍生物的預測結構和熱力學性質(zhì)。圖14:顯示299系列合成B40適體衍生物的預測結構和熱力學性質(zhì)。圖15:顯示某些B40衍生適體對重組gpl20的結合研究結果。實施例才才沖+和方法細胞草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9s細胞由 John Sinclair (Laboratory of Molecular Biophysics, University of Oxford, UK)友情提供。通過牛津國立血液服務(Oxford National Blood Services ),從Bristol醫(yī)院服務(Bristol Hospital Services )提供的血液棕黃層組分獲得人類白細胞。
病毒原種本研究中使用的HIV-lBa-L菌抹通過AIDS Research and Reference Reagent program (目錄號510 ) , National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of Health, Bethesda, MD獲得。寡核苷酸使用寡核苷酸1和2用于各適體(5'—3'列出)的T7轉(zhuǎn)錄的模板。列出了 5'和3'引物并下劃線T7啟動子。1.適體B40(wn)-GACATGAGACTCACAACAGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATT 5'引4勿(T3 SELEX)畫3' primer (T7 SELEX)-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGACTAGACGCTCAA. 2.適體B40t77(w4ccc) C5'引物-GGGAAACAAACCAATCGCG3'引物畫TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGACTAGACGC。hiv-i^t gpi20的表達Sf9s細胞在28。C下培養(yǎng)于SF 900 II不含血清的昆蟲培養(yǎng)基 (GibcoBRL)中，以低于lxl()S細胞/ml懸浮培養(yǎng)。使用編碼mV-lBa-LSU糖蛋白(gpl20)的p2BaC-gpl20(28)和線性化pAcBAK6(Invitrogen)的500 ng 混合物轉(zhuǎn)染Sf9s細胞，以才艮據(jù)標準方法(29)生成重組病毒。細胞在m.o丄
為5下被感染并在28。C下培養(yǎng)4天，此時gpl20分泌進入培養(yǎng)基是最佳的。使用抗FLAG M2 (Sigma)親和色譜從澄清的培養(yǎng)上清液純化gpl20, 并通過SDS-PAGE和western點雜交評價組分。使用Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia)通過FPLC凝膠過濾進一步純化蛋白質(zhì)以排除高級聚集物，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce， Chester, UK)根據(jù)生產(chǎn)商說明書定量所述蛋白質(zhì)。體外轉(zhuǎn)錄共225 pmol的DNA才莫一反纟皮添加至最終500 (il的轉(zhuǎn)錄反應混合物并在37。C下培育16小時，所述轉(zhuǎn)錄反應混合物組成為40 mMTris-Cl pH 7.5、 1 mM 2T UTP、 1 mM 2'F CTP (Trilink BioTechnologies)、 1 mM ATP、 1 mM GTP(Amersham Pharmacia)、 6 mM MgCl2、 5 mM 二硫蘇糖醇(DTT)、 1 mM 亞精胺和1，500 U的T7 RNA聚合酶(New England Biolabs)。通過每嗎 DNA模板添加1 U不含脂A酶的DNA酶I(Sigma)終止了轉(zhuǎn)錄，所述反應混合物在37。C下培育20分鐘，隨后進行苯酚-氯仿抽提。使用乙醇沉淀RNA,再溶解于水(Sigma),使用Sephadex-G50缺口旋轉(zhuǎn)柱(Amersham Pharmacia)分離低分子量污染物，并通過A260測定來定量。RNA通過在水中加熱至95。C、 3分鐘后緩慢冷卻至室溫、5分鐘而被重折疊，然后被調(diào)節(jié)至1 xcHBS緩沖液(IO mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl， 1 mM CaCl2， 1 mMMgCl2,2.7mMKCl),并進一步在室溫下培育10分鐘。RNA的32P 5'-末端標記為5'末端標記，使用細菌堿性磷酸酶(NewEnglandBiolabs)進行了末端5'磷酸的去磷酸化，并使用T4多聚核苷酸激酶(Roche)替換為來自 [Y-32P]-ATP的Y-磷酸。然后在12%變性(8 M尿素)聚丙烯酰胺凝膠上電泳標記的RNA并通過放射自顯影法來顯影，然后通過被動洗脫從凝膠切片回收所述RNA。酶的探針檢測和足跡32P 5'末端標記的RNA在存在有載體RNA (1昭tRNA)的lxcHBS緩沖液中使用RNA酶Tl(Amersham Pharmacia; 5x10-3 U)、核酸酶VI(Pierce;
5x10-3 U)或SI (Amersham Pharmacia; 0.05 U)在20。C下酶消化5分鐘。停止反應，RNA經(jīng)受苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀并溶解于曱酰胺緩沖液中。足跡的獲得是通過使用不同濃度的HrV-W丄gpl20在25。C下培育類似標記的適體l小時，隨后適當核酸酶消化。通過苯酚抽^提終止所述消化，乙醇沉淀并溶解于曱酰胺緩沖液。然后通過在18。/。變性(8M尿素)聚丙烯酰胺凝膠上電泳并隨后放射自顯影來確定RNA片段的大小。通過電泳部分堿水解梯(通過在50 mM NaHC03, pH 9.2中將標記的RNA在95°C下加熱 10分鐘而獲得)和RNA酶Tl-消化梯(通過55。C下于10 pl的20 mM檸檬酸鈉，1 mM EDTA, 7 M尿素，pH 4.6中消化50,000 c.p.m (Cerenkov)變性的RNA而產(chǎn)生)來指示G殘基的位置。化學探針檢測如之前所描述的(15-17)，使用二曱基硫酸(DMS; Fluka)和l-環(huán)己基-3國 (2-嗎啉代乙基)碳化二亞胺曱基-對苯磺酸(CMCT; Sigma)進行了化學探針檢測。在存在有2嗎t(yī)RNA下20 (il反應體積中進行了 0.1嗎的經(jīng)凝膠純化和重新折疊的適體B40( wn)的DMS (修飾N1-A和N3-C)和CMCT(修飾N3-U、N1-G)修飾。對于DMS,所述緩沖液含有50 mM Tris-HCl pH 7.5、 5mMMgCl2和150mMKCl、 5mM卩-巰基乙醇，而對于CMCT,所述緩沖液含有50 mM硼酸鹽-NaOH pH 8.0、 5 mM Mg (C2H302)2.H20、 150 mM CH3COOK和5 mM |3-巰基乙醇。半變性緩沖液含有1 mM EDTA。反應在20。C下在30 pmol和60 (imol DMS存在下進行5分鐘，在10 )imol和 20 (amol CMCT存在下進行20分鐘。在乙醇沉淀后，經(jīng)修飾的RNA溶解于水中。同時處理了對照，即未修飾的適體B40。引物延伸進行引物延伸(18)以檢測修飾殘基。將探針和對照(未修飾的)RNA 雜交至與靶序列 3'末端互補的5'-32P標記的DNA引物 (5'AATTAACCCTCAC3')和使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Amersham pharmacia; 4 U) 延伸引物。在8%變性(8M尿素)聚丙烯酰胺凝膠上分析通過探針測定的 (和對照)RNA的引物延伸所生成的cDNA模式，并放射自顯影。使用雙脫氧核普酸和未處理的RNA進行測序反應(19)并平行電泳，以利于
鑒定修飾殘基。為檢測逆轉(zhuǎn)錄酶在引物延長過程中的自然中止，還平行電泳了未修飾RNA的延長對照。B40適體的二級結構預測使用^/b似折疊算法(20)和STAR軟件包(21,22)推導出了適體B40 和B40t77的二級結構模型。使用來自酶和化學探針實驗的數(shù)據(jù)限制了預測值。凝膠遷移率變動分析非變性凝膠遷移率分析被用于定量結合至gpl20的B40和B40t77適體的解離常數(shù)。在通常的結合測定中，于lxcHBS緩沖液中的5'末端標記的適體(5000 c.p.m. Cerenkov)和1嗎t(yī)RNA在增加量的gpl20存在下于室溫培育1小時。當培育結束后，向各反應添加3 (al的含有70% (v/v)甘油和0.025% (w/v)溴酚藍的上樣溶液。然后在1%瓊脂糖凝膠上分離樣品。電泳后，凝膠上分離的樣品被轉(zhuǎn) 移至Hybond-N膜(Amersham Pharmacia)上。使用儲磷放射自顯影和 STORM磷成像儀(Molecular Dynamics)獲得了在結合和未結合組分中的適體的量。B40和B40t77適體的解離常數(shù)來自對下述方程的擬合(fit): 結合的部分=Bmax (gp 120)/((gp 120)+ Kd)，其中Bmax代表所觀察到的最大部分的結合的適體，(gpl20)代表蛋白質(zhì)濃度，而Kd是解離常數(shù)。由于適體-gpl20復合體在凝膠上的擴散(diflision),從游離(未結合的)適體(泳道1，圖A和B)的部分推斷出結合至gpl20的適體的部分。BIAcoreTM表面等離子體共振BIAcore 2000被用于進行全部的結合測定。研究級CM5傳感器芯片、 NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)/EDC(l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亞胺氫氯化物)偶合試劑、乙醇胺和甘氨酸-HCl來自BIAcore AB (Uppsala， Sweden)。 lxcHBS緩沖液經(jīng)除氣1小時，并用作電泳緩沖液。流速設為5 pl/min。利用胺偶合化學，gpl20被固定于CM5傳感器芯片上。使用EDC (0.2 M)和NHS (0.05 M)的混合物活化流動細胞10分鐘。gpl20被更換緩沖液于10 mM醋酸鈉，pH 5.2中，然后以500嗎/ml 的濃度注射。對于劑量依賴性結合測定，10 000 RU、 5 000 RU和1 000 RU 被固定于三種不同的流動細胞之上，而第四流動細胞作為模擬固定的空白對照。在研究2'-氟嘧啶修飾在RNA中作用的結合測定中，固定了 2500 RU。固定后，注射10分鐘的乙醇胺(1M, pH 8.5),以封閉剩余的活化基團。然后使用甘氨酸-HCl (10 mM, pH 2.5)來洗掉任何非特異結合的配體。適體在結合緩沖液中重新折疊(如上所述)并注射(35 pl或15 )il)在5 jil/min的流動細胞之上。注射之間，在使用電泳緩沖液清洗10分鐘之后，通過注射2次5 [il的10 mM NaOH來再生表面。為了校正屈光指數(shù)變化照表面的響應數(shù)據(jù)。人類PBMC的培養(yǎng)通過Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia)密度梯度離心從正常的 HIV-陰性供體的肝素化血液棕黃層分離了人類PBMC。稀釋的自體血漿被保存、熱滅活和澄清，以提供對白細胞培養(yǎng)的自體血清(AS)補充。 PBMC在4。C下于PBS (Sigma)中洗滌6次，并基本不含血小板和粒細胞。為了研究HIV-1中和，我們使用了沒有促分裂原活化和白介素-2 (IL-2)所培養(yǎng)的PBMC培養(yǎng)物。細胞在含有2% AS的X-VIVO-10 (BioWhittaker) 中保持7天。沒有促有絲分裂原和IL-2的系統(tǒng)緩慢增殖了淋巴細胞和巨噬細胞的混合培養(yǎng)物，在我們手中，其相對經(jīng)過促有絲分裂原處理、細胞因子補充的培養(yǎng)物而言，支持病毒分離物較高水平的復制。之后，細胞培養(yǎng)物在96孔板中用于感染性和中和測定。中和測定第7天，使用培養(yǎng)物中103感染單位/1111的HIV-1ba感染以105細胞/ 孔接種的PBMC，所述培養(yǎng)物已經(jīng)使用50 pi連續(xù)稀釋的(半對數(shù)稀釋) 抗gpl20單克隆適體或?qū)φ者m體SA19或可溶性人類CD4在室溫下預培養(yǎng)30分鐘。Tahiri-Alaoui等(23)從與B40相同的SELEX文庫篩選了抗鏈霉抗生物素的適體SA19。在各稀釋度下進行三組實驗。在注射后16小時，使用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒接種物和適體的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)物保持另外3天。如之前所描述的(24，25),通過測量來自上清液的細胞外p24
抗原的含量來測定病毒復制的程度。突變體B40t77適體的RNA突變和BIAcore結合分析為突變研究，首先使用w/oW計算機模擬測試了 RNA突變體，以便其保留三方向接頭結構。因此，除非另有說明，用于該研究的突變適體保留了所述二級結構。突變(包括置換或刪除)被引入DNA模板中，并且從Sigma-Aldrich獲得了突變的寡聚體。使用B40t77特異性的5'引物和 3'引物完成了 PCR擴增。進行了體外轉(zhuǎn)錄(如上所述)以獲得突變的B40t77 適體，并通過A260測定定量收率。BIAcore 2000被用來進行結合測定。使用了研究級CM5傳感器芯片并如上所述被激活。2500 RU的gpl20通過胺偶合固定于一流動細胞上，而模擬固定的空白流動細胞被用作對照。所述適體在結合緩沖液重新折疊(如上所述)，且15 注射在5 pl/min 的流動細胞之上。注射之間，如上所述再生表面。在各情況下，進行了三次獨立實驗，且樣品以隨機順序注射。所有突變體的相對結合(減去來自對照通道的響應之后)被評分(在T^80s時)，數(shù)據(jù)表示為該時間點的響應的平均值士標準偏差(圖5)。結果適體B40 二級結構的闡明使用幾種算法計算機模擬預測B40的RNA 二級結構，形成小數(shù)目預測的穩(wěn)定折疊。為確定任何這些預測的結構是否能夠被實驗證實，我們同時使用了酶(S1、 VI或Tl)和化學探測方法。發(fā)現(xiàn)在酶探測(圖1)中觀察到的敏感性和保護模式證實了如使用幾種算法(包括w/o械版本3.1)) 所預測的最穩(wěn)定的折疊。該推導出的二級結構可以分為兩個結構域。結構域I由核苷酸l至76組成并包括莖環(huán)1、 2和3，而結構域II由核菩酸77 至117組成并包括莖環(huán)4?；瘜W探測數(shù)據(jù)也強力支持了該預測-這些數(shù)據(jù)唯一未解釋的特征是位于einter-螺力走(einter-helical)區(qū)的幾個核香酸缺乏反應性。例如，A-39、 58、 80以及C-21、 33、 54和55沒有顯示對DMS (圖1E和補充數(shù)據(jù)S2) 的反應性。類似地，G-25、 77、 84以及U-20、 24、 48和49沒有對CMCT
成反應性(圖1B和1E)。這些缺陷的產(chǎn)生可能由于適體內(nèi)的三級相互作用(其影響DMS和CMCT的反應性)或者由于替代構象異構體的存在。為估計不同螺旋結構域的穩(wěn)定性程度，還在半變性條件下(即，存在EDTA)進行了與DMS和CMCT的類似反應。在天然條件下沒有與CMCT反應的U-68、 69、 74、 81、 87和G-82在半變性條件下溶解了，并顯示出對相同探針的反應性(圖1B和IE)。因此，我們提出這些殘基很可能參與螺旋內(nèi)的較弱相互作用，其在這樣的條件下變性。如下，在缺陷型突變體環(huán)境中遺傳上考察了適體B40分子群可能含有小比例的gpl20結合形式(交替折疊成本文所示的形式)的可能性。適體上的gpl20結合位點和結合親和力的測定為測定gpl20在適體B40上的足跡，我們比較了在存在和不存在蛋白質(zhì)時核酸酶切割的位置。足跡數(shù)據(jù)顯示，gpl20的結合在結構域I (圖 IA和ID)中以濃度依賴型方式誘導了不同程度的保護。主要的保護涉及包含結構域I中核苷酸21-57的區(qū)域，表明117-mer親本適體上的主要 gpl20結合位點基本存在于該結構域。我們還觀察了蛋白質(zhì)結合之后對 RNA酶VI和SI的敏感性的變化(圖IA和ID),表明了適體中蛋白質(zhì) 誘導的結構變化。這兩個結構域中，結構域II沒有參與gpl20結合。結構域I的螺旋1似乎穩(wěn)定莖環(huán)2和3的幾何形狀。綜合而言，數(shù)據(jù)使我們假設僅包含結構域I的適體將保留gpl20結合活性。因此，我們構建了適體B40t77(1_74CCC)，其保留了結構域I的核香酸1-74,且在3'末端具有兩個胞嘧啶，以完成3 bp的5'-3' GC封條(圖1C)。如通過酶探針切割才莫式和^^用m/oW的二級結構預測(圖1C和補充凄t據(jù)Sl)所推斷的，該77核苷酸截短的適體(下面只是被稱為B40t77)保持了其構型(如親本適體的結構域I )。所述截短的適體中的足跡模式類似于親本適體B40,但在前者(圖 1C和Sl)中觀察到了強的多的蛋白質(zhì)誘導的結構變化(未折疊)，特別是在結構域I的螺旋莖1中。如果結構域n當缺乏蛋白質(zhì)時在親本分子中的作用為穩(wěn)定結構域I的該區(qū)域，則這是合理的。為了測定親本適體和截短適體的結合親和力，我們進行了非變性凝膠遷移率變動分析。使用全長適體B40(圖2A&B)和截短適體B40t77(圖2D &￡)對§口120的培育生成了復合體，該復合體與游離RNA相比，在~50 nM蛋白質(zhì)濃度下具有較慢的電泳遷移率。三次獨立重復實驗產(chǎn)生了對解離常數(shù)(Kd)的估計，親本適體(圖2B)為21+2 nM，截短適體(圖2E) 為31士2nM。由此，可以得出結論截短適體保留了親本適體~ 90%的結合能，并因此必然含有有效結合所需要的主要元件。我們還使用BlAcore SPR技術實時考察了適體B40 (圖2C)和B40t77 (圖2F)對CM5傳感器芯片上固定的gpl20的結合。觀察到了清晰的劑量依賴型響應。然而，數(shù)據(jù)不能使用1:1的Langmuir結合或其他簡單模型來擬合。我們認為這可能是由于適體中的構型多相性，實時結合對其是壽文感的。親本適體和截短適體對HTV-1的R5毒林(Ba-L)的中和早期研究已經(jīng)證明，多數(shù)(25/27)的HIV-lBa-L gpl20導向適體(包括 B40 )能夠中和PBMC中的同源HIV-lBa.L(Khati等，2003)。因此在該研究中，我們希望確定截短適體是否也能預防或限制該HIV-1毒抹在靶細胞中的感染性。使用終點稀釋和p24抗原ELISA,我們發(fā)現(xiàn)截短適體在中和人類PBMC中的同源fflV-lBa.L中與親本適體一樣有效(圖3)。在300 nM 下，兩種適體都中和了 HIV-lBa丄進入至本底水平，相反無適體和無關適體對照對病毒感染性沒有影響。300nM濃度下的可溶性人類CD4也中和了 HIV-lBa丄至接近本底水平。研究了一系列不同濃度來推導出IC50(抑制 50%病毒感染性的有效適體濃度)，發(fā)現(xiàn)其對于兩個B40適體而言都為約 2 nM。 KD和IC50之間的10倍差異可能僅反映測定所述常數(shù)的測定法非常不同的性質(zhì)，但也可以解釋為表明當大致少于50%的存在于病毒上的 gpl20位點被適體結合時，實現(xiàn)病毒中和?？赡茉诟鞔掏蝗垠w中僅一個 gpl20單位需要被封閉以抑制相應的gp41三聚體的六聚融合促進復合體的形成。似乎還可能是少于全部刺突三聚體需要以該方式被功能性封閉，以抑制病毒包膜和細胞質(zhì)膜之間的融合。然而，我們的數(shù)據(jù)不能使人對進入所需要的三聚體的最小比例做出精確計算。適體中經(jīng)修飾的2'氟嘧咬在配體結合中的作用為考察氟嘧啶在gpl20結合中的潛在作用，我們分析了適體的gpl20
結合能力，所述適體中2'氟胞嘧啶或2'氟尿嘧咬之一或兩者都被其2' OH 等價物所取代(圖4)。我們發(fā)現(xiàn)其中2-F尿嘧咬被2'-OH尿嘧咬取代但保留2' F-胞嘧啶的適體保持了 gpl20結合能力。這表明，在足跡區(qū)內(nèi)相對常見的尿嘧啶的2'F基團沒有直接參與結合gp120。另一方面，其中2'F-胞嘧啶被2' OH-胞嘧啶取代但保留了 2'F-尿嘧啶的適體失去了結合活性。這清楚表明一個或多個2'氟胞嘧啶是與gpl20相互作用所必需的，但不表明必要的2'修飾是否存在于螺旋(例如螺旋2)或環(huán)(例如環(huán)2)中。不令人驚訝地，當2'F嘧p定一皮相應的2' OH嘧啶取代時，結合消除。足跡區(qū)內(nèi)的序列需求分析可能僅通過結合至gpl20而免受核酸酶的適體B40部分內(nèi)的核苷酸亞型是蛋白質(zhì)-核酸相互作用所必需的。為了考察其，我們進行了所述區(qū) 域的突變分析。盡管在足跡區(qū)內(nèi)理論上可能有超過150個單個點突變體(和> 1024多突變體)，但我們初期選擇研究預期不改變上述二級結構的亞型，以獲得可判斷的結果。該型的多數(shù)突變位于單鏈環(huán)和接頭區(qū)域，并在詳盡的計算機模擬分析可能的突變后被鑒定。接頭1中的殘基突變導致 gpl20結合的顯著損失，表明其是與gpl20相互作用所必需的。該區(qū)中唯一沒有在gpl20結合中顯示任何顯著差異的突變是C21A的取代(圖5)。如果該序列的5'核苷酸對B40t77適體的gpl20結合的自由能變化貢獻4艮少，則這是可能的。發(fā)夾環(huán)1和2中的所有突變體顯示了結合的幾乎完全喪失，并且如根據(jù)足跡數(shù)據(jù)所預期的，這些殘基也是gpl20識別和結合所必需的。U40-U43區(qū)域(接頭l"內(nèi)的所有突變也導致了至gpl20的結合的顯著損失(圖5B)。通常，該區(qū)域內(nèi)的多取代(例如UUUU — CCCC)具有比點突變(例如U40A)具有更極端的效果。有趣的是，盡管我們已經(jīng)表明(如上)2' F U可以被2' OH U取代而無活性損失，但這些四尿嘧咬(不考慮2'核糖取代)顯得是必需的。另外，我們分析了螺旋3中的雙和四重突變體，其被設計為保留天然的二級結構。與野生型B40t77適體相比較，所有突變體顯示了顯著的結合損失(圖5)。總體上，這些結果表明，盡管保留了所述二級結構，但足跡區(qū)(接頭1和1*、環(huán)1和2和螺旋3)內(nèi)多數(shù) 核苷酸的變化導致gpl20結合的損失。 gpl20結合所需要的二級結構的分析二級結構模擬表明理論上，適體B40t77應該能夠采用除了由實驗證據(jù)支持的分支結構以外的線性二級結構(參見圖6A)。這兩種替代結構預期具有彼此類似的穩(wěn)定性，并分享共有的幾個結構特征。因此，可能適體群的小部分可以采用線性形式并逃避生化檢測，而還具有gpl20結合活性。為考察這種可能性，我們再次轉(zhuǎn)入遺傳分析。這被下述事實所復雜化了二級結構的潛在差別區(qū)位于gpl20足跡內(nèi)，并因此基本序列作用可能混淆二級結構作用。例如，螺旋3中破壞分支結構的點突變(G64C和C47G)導致了結合的損失(見圖6B)，但恢復結構的補償突變未能恢復結合(見上述圖5)。因此，重要的是判斷該區(qū)域的序列或二級結構之一或兩者都是否是功能所必需的。螺旋1中保持了其完整性的突變(G18C+C61G、 A14G+U65C、 C7U+G71A和AA9)保持了 gpl20結合(見圖6C)。然而，其線性和分支形式全部一致，所以在兩種形式之間沒有區(qū)別。螺旋1中導致分支和線性結構同時損失的突變(AG18)導致了顯著的結合損失。該突變體預期采用異常的分支結構，其中螺旋3、環(huán)2和上部螺旋1大致扭曲(見圖6D)?；謴土嘶菊５姆种Ш途€性形式的補償缺失(AG18+AC61)也恢復了 gpl20結合。這清楚表明適體B40t77的二級結構的保持是gpl20結合所必需的，但沒有闡明結合形式是分支結構、線性結構或是兩者。最后，我們考察了螺旋2中的突變，其被明確設計以區(qū)別兩種二級結了適體至gpl20的結合(見圖6E)?；謴土朔种ЫY構但消除線性結構的補償突變(GWC+C3 G)顯著恢復了 gp乜0結合(P^.0015,t檢驗)，盡管沒有恢復至完全野生型的水平。該結果強力支持了適體的三方向分支結構是功能形式的假設，并顯示了如果線性替代異構體在B40t77群中實際與分支形式共存，則其不是gpl20的配體。然而，在雙突變體中分支形式的恢復之后沒能完全恢復gpl20結合，這說明殘基27和/或37除了在穩(wěn)定總體
結構中的作用以外還對結合略有貢獻。討論我們近期報道了適體對多種組織培養(yǎng)的、實驗室改造的(TCLA)和臨床CCR5向性的(R5)HIV-1分離物的感染性的中和作用明顯提高了對抗 HIV-1 R5毒抹的gp120。這里，我們描述了一種這樣的中和適體B40的必要結構特征。通過確定親本適體的二級結構和完全gpl20結合所必需的最小區(qū)域，我們已經(jīng)能夠截短所述適體至較小的尺寸，同時保留其結合和中和性質(zhì)。本文HIV gpl20結合適體更廣泛的接觸及其由此更高的親和力，反映了靶蛋白的更大尺寸。截短適體B40t77的分子量為~23 kDa: 小于IgG分子尺寸的六分之一，為抗體的抗原結合片段(Fab)尺寸的約二分之一。因此，我們認為其應該能夠容易達到"核心，，糖蛋白的深部保守區(qū)，而較大的進入抑制劑由于空間阻礙未能達到所述區(qū)域。這得到了 A. F. Labrijn等(Labrijn等，2003)的近期發(fā)現(xiàn)的支持，A. F. Labrijn等清楚表明 CD4i特異性中和劑的尺寸與其中和主要HIV-l分離物的能力成反比?；?于核酸的治療劑和診斷劑，除了高親和性和特異性結合至其靶以外，需要是核酸酶抗性的和在生物流體中穩(wěn)定。RNA的2'氟和2'氨基修飾帶來了對堿水解和核酸酶降解的抵抗力(Pieken等，1991)。 2'氟修飾和未修飾適體對gpl20的SPR結合分析結果(圖4)表明，2'位置的修飾顯著影響配體-靶的相互作用。2' OH基團嘧咬對2'氟嘧啶的取代導致適體對gpl20結合的完全喪失。這可能是由于2' F RNA形成大致上較強的分子內(nèi)螺旋的能力，所述分子內(nèi)螺旋比未修飾的RNA在熱力學上更穩(wěn)定并形成剛性結構 (Pagratis等，1997)，其以更高的親和性結合至其耙。2'F胞嘧啶被其核糖核苷類似物的取代導致類似的結合損失，并且這可以促進一個或多個胞嘧啶的2'位氟原子在配體結合中的明確作用。此外，在2'位的取代還表現(xiàn)出在其形成氫鍵能力上的差異，并可以解釋所觀察到的結合差異。雖然RNA 的2' OH基團可作為氫鍵受體和供體起作用，但2' F基團僅能作為可能的弱氬鍵受體起作用(Aurup等，1992)。然而，在每種情況中，寡核苷酸的局部構型變化(由取代引起)也可以是適體的配體結合性質(zhì)喪失或保留的重要因素。因此，使用具有不同2'部分的核酸文庫進行的篩選可以產(chǎn)生明顯
不同的適體家族，其具有針對相同靶或不同靶的不同的結合性質(zhì)?？紤]到親本適體和截短適體的納摩爾(nanomolar)親和力及其強的中和效價，適體可能通過占領必要的受體結合位點或通過誘導gpl20中的非生產(chǎn)構型變化來發(fā)揮其中和作用。因此，所述適體可作為能夠?qū)崿F(xiàn)更好理解gpl20與其在靶細胞上的受體之間分子相互作用的工具。突變研究和SPR結合分析的結果強力支持RNA足跡數(shù)據(jù)和上述二級結構模型。截短適體的足跡區(qū)內(nèi)的多數(shù)突變顯著消除了 gpl20結合。在足跡區(qū)之外，被設計以特異性破壞RNA莖內(nèi)堿基對的突變消除了 gpl20結合，而恢復了所述結構的補償突變或沒有破壞所述結構的突變保持了 gpl20結合。更重要的是，足跡的螺旋2內(nèi)的突變(其破壞了所提出的分支結構，同時穩(wěn)定了線性替代異構體)消除了結合，而第二補償突變(其恢復了分支結構和消除了線性替代異構體)顯著恢復了 gpl20結合。這為下述假設提供了強力支持:特異性三方向適體結構是為gpl20結合呈現(xiàn)小序列特異性基序所必需的。我們注意到該結構接頭部分中的序列在結合至 gpl20之后變得對VI核酸酶更加敏感，表明了所述相互作用引發(fā)適體結構改變的可能性。引人注意的是，盡管適體B4和B116 (其也針對HIV- IBaL gpl20而產(chǎn)生并被發(fā)現(xiàn)中和了病毒感染性(Khati等，2003))顯得與適體B40在種系發(fā)生上沒有關聯(lián)，并且在基本序列水平上表現(xiàn)出無統(tǒng)計學上的顯著關聯(lián)，但其可能分享了本文描述的有關適體B40的結構基序。結構分析表明，其也包括兩個發(fā)夾環(huán)和一個終端螺旋的三方向接頭(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，其分享環(huán)1中的一部分基本序歹'j(與CAC相比較，在B4、 B116和B40中分別為CAgC和CAaC),并且可能分享環(huán)2中的一部分基本序列(基序 ANNYG)。盡管該證據(jù)不是結論性的，但我們認為可能全部三種適體都可能分享允許中和性結合至gpl20的基本結構基序。適體-gpl20的高分辨結構將能夠進一步說明該問題并揭示確定總體gpl20識別事件的多重相互作用。
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合成的B40適體衍生物原理可以通過體外轉(zhuǎn)錄(通常使用T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶)或者通過固相化學合成(如寡核苷酸)來生成適體。前一方法是用于通過SELEX方法發(fā)現(xiàn)適體及其早期結構和功能分析所必需的。化學合成是實現(xiàn)大規(guī)模成本有效生產(chǎn) 用于應用(例如化學治療、化學預防和結晶學)的適體所必要的，但不適用于比60nt長度大的多的序列。我們已經(jīng)表明能夠有效轉(zhuǎn)錄的最短的 B40衍生物為77 nt長(B40t77),而且其31 nt包括螺旋1，我們推斷其僅對適體結構穩(wěn)定性是必需的，而不包含結合元件的必要組分。因此，我們設計了一系列用于化學合成的適體，其將保留適體B40的核心的推定功能結構，同時大量清除螺旋1。我們提出了這些合成適體的序列(表 2-4)、其預測的結構(圖12-14)及其gpl20結合能力(圖15)。247.2和247.1這些適體保留在親本B40和B40 t77中發(fā)現(xiàn)的A:A錯配，遠離三方向4妄頭的4個石成基對。如同B40t77,其能夠采用分支和線性形式。B40t77 具有A:A錯配的15 bp螺旋1 ， 247.2具有A:A錯配的10 bp螺旋1,而 247.1具有A:A錯配的7 bp螺旋1。螺旋1的縮短與預測的適體熱穩(wěn)定性的減小有關，目的是B40t77〉 247.2 > 247.1。適體對gpl20的結合潛力表明，將錯配的螺旋1縮短至7 bp導致所述功能性適體結構的小但顯著的穩(wěn)定性損失。因此，我們考察了 A:A錯配是否能夠被清除，實現(xiàn)螺旋1的進一步縮短，且無穩(wěn)定性損失。247.5、 247.3和247.4這些適體包括A:A錯配(如上)的刪除，螺旋長度分別為7bp、 6 bp 和4 bp。與等價的錯配247.1相比較，錯配的清除提高了 247.5和247.3 的熱穩(wěn)定性，但減少至4bp導致生成四種可選構型。雖然247.5保留了完全的gpl20結合能力，但247.3已經(jīng)失去了一些結合能力，而247.4被嚴重破壞。因此，我們考察了下述可能性抑制替代異構體生成的進一步突變將提高縮短適體的結合能力。247.6該適體具有4bp螺旋l (例如247.4)，但另外在接頭區(qū)域具有突變，其與后者相關的替代構型不相容。如預測的，247.6保留了完全的gpl20 結合活性。使用疏水取代來穩(wěn)定二級結構(265系列)之前已經(jīng)注意到，在核糖2'的疏水取代能夠影響螺旋的穩(wěn)定性。當存在于僅一條鏈上時，其作用是去穩(wěn)定所述螺旋。相反，當存在于相對鏈上時(以3'方向位移1 nt)，其相互作用以穩(wěn)定所述螺旋。適體265.1具有6 bp螺旋1,并在序列上與247.3相同，除了螺旋1中三個堿基對被二甲基 -烯丙基對所穩(wěn)定。其預期比247.3具有更高的總體熱穩(wěn)定性，但依然能夠同時采用分支和線性結構。如預測的，265.1比247.3更好地結合至 gpl20。實際上，與對照B40 t77相比較，所述修飾導致了結合的顯著提高。在穩(wěn)定分支結構的嘗試中，合成了 247.3的三種進一步衍生物(265.2、 265.3和265.4)，其中二曱基-烯丙基對被引入螺旋2中三個位置的一個。 265.3顯示了比247.3提高的結合(但沒有達到野生型水平)，但265.2 (未顯示)和265.4顯示沒有提高。突變和疏水相互作用的組合(299.2、 299.3和299.1)我們已經(jīng)在上文表明了二曱基-烯丙基取代可以有利穩(wěn)定短形式的螺
旋1,并且可以通過接頭區(qū)域或螺旋2中的突變損失線性形式來穩(wěn)定分支形式。顯然，任一方法的許多變化可以被有利地使用，并且其可以許多潛在有利的方式組合。為描述其，我們僅描述三種可能的變化。適體299.2 是dma穩(wěn)定的6 bp螺旋1適體(類似265.1 )，但另外具有通過額外的GG 堿基對所穩(wěn)定的螺旋l。該修飾清除了線性構型，并導致甚至比265.1所顯示的更高的對gpl20的結合。適體299.3類似于299.2，除了其另外具有接頭突變(之前在247.6被有利引入的)。該進一步的改變對gpl20結合沒有產(chǎn)生其他影響。適體299.1在螺旋1中包含2'0-丁基取代(而不是二甲基-烯丙基)，并另外具有247.6中引入的接頭突變。該適體的結合可與 B40 t77相區(qū)別，并因此可能丁基取代比二曱基-烯丙基取代較小穩(wěn)定化。299.4該短適體在具有4 bp螺旋1和穩(wěn)定化接頭突變上類似于247.6,但另外在螺旋2的堿基上被突變以取代U:G搖擺，具有潛在更穩(wěn)定的C:G規(guī) 范堿基。盡管其預期在功能上比247.6更穩(wěn)定，但其具有非常小的對gpl20 的結合能力，表明在螺旋2堿基的搖擺對的一些特征對于活性而言是重要的。299.5該短適體與247.6相同，除了在5'末端加入了生物素酰化的尿嘧咬，以促進適體和gpl20的捕獲和^r測。無法區(qū)分該適體對gpl20的結合性質(zhì) 與247.6的結合性質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。(2)93該適體組成上與本研究中描述的那些適體類似，但是針對不相關蛋白質(zhì)PrP而產(chǎn)生的(Sayer, Cubin等2004)。表2合成的B40適體衍生物的序列。列出T7聚合酶轉(zhuǎn)錄的B40t77用于比較。請注意，較低情況"c，，和"g，，表示2'0-丁基(299.1)或2，二曱基-烯丙基(265.1、 265.2、 265.3、 265.4、 299.2和299.3),且"bU，，表示生物素酰化的尿嘧咬(299.5)。10 20 30 40 50 6070B40 t77 CGAUUGGUDU 247*1GGGAGACAAG GUUUCCC CCGACGOTCAACUAGACGCU AUGUGGGGCACAMK3UGGGC CGCCCGAUUUCACGCCCGAU UACGCUU0UAU0UAO3CUUU CCCGCACGCGDACCCGCACG ACGG......CCGCCGACGCDCAAUGUGGGCCACGCCCGAUUACCCGCACGCGAUGGCGG247,3CCGCGCUCAAUGUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUACCCGCACGCGCGG........247 ，4CCGCUCAATOUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUA(XC247,5CCGCCGOTCAAUGUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUACCCGCACGCG247 ，6CCGCCCAACGUGGGCCACGCCCGAUUUUAC(3CUUUUACCC265,1CCgcgCUCAAUGUGGGCCACGCCCGAUOU0ACGCUUUUACCCGCACGCgcgG........CCGCGOTCAAGCCcGAUUUUACGOJUUUACCCGC2VCGCGCGG........265、 3CCGCGG17CAAUGUGQgCGACGCcCGAUUUUAC(3C0UUUACCCGCACGCGCCCGCGCUCAAUGUGGGGCACGcCCGAUUUUCCGCACGCGC........GCgcgCCCAACGUGGGCCACgcc:cgauuuuACC3CUUUUACCCGCACGCgcgG........CCgcgOTCAAUGUGGCGCCACGCGCCGATOUUACGCUAOCCGCACGCgcgG......CGUGGCGCCACGCGCCGAUUUUACGCUUUUACCCC3CACGCCCGCCCAACGCGGGCCACGCCCGAUUUUACGCAUUUACAC239*5bUCCGCCCAACGCGGGCCACGCCCGAUUIK7acgcauuuacACGCACGCGG表3合成的B40適體的比對，" ，,僅是用于比對目的的補充特征。沒有顯示共價修飾。<image>image see original document page 36</image>
權利要求
1.一種單鏈核酸分子，其形成如I所描述的二級結構其中H1、H2和H3都是螺旋；L1、L2和L3都是環(huán)結構；L2包含序列CAC或CAXC；L3包含序列ACXX或AXXX；其中X是任意核苷酸，并且其中下一個核苷酸是G，其形成了部分H3；且L1，在H2和H3之間的區(qū)域，包含序列UUUU；條件是所述核酸分子不包含選自表1中所列的那些核酸。
2. 如權利要求1所述的核酸分子，其能夠中和病毒。
3. 如權利要求2所述的核酸分子，其能夠中和HIV-1病毒。
4. 如權利要求3所述的核酸分子，其通過結合至包膜糖蛋白gpl20 來中和HIV-1病毒。
5. 如權利要求l-4任一項所述的核酸分子，其是截短的適體。
6. 如權利要求1-5任一項所述的核酸分子，其中Hl由4-10個堿基對組成。
7. 如權利要求6所述的核酸，其包含如下序列 UUUACCCGCACG CGAUUGGUUU GUUUCCC; CCGACGCUCA AUGUGGGCCA CGCCCGAUUU UACGCUUUUA CCCGCACGCG ACGG;CCGCCGACGC UCAAUGUGGG CCACGCCCGA UUUUACGCUU UUACCCGCAC GCGAUGGCGGjCCGCGCUCAA UGUGGGCCAC GCCCGAUUUU ACGCUUUUAC CCGCACGCGC GG;GCACGCGG;CCCGCACGCG GCGG;GCACGCGG;CCGCGCUCAA UGUGGGCCAC GCCCGAUUUU ACGCUUUUAC CCGCACGCGC GC;CCGCACGCGC GG;CCGCACGCGC GG;或CCGCACGCGC GGCCGCACGCGC GGACCCGCACGC GCGGACCCGCACGC GCGGUCCGCCCAA CGCGGGCCAC GCCCGAUUUU ACGCAUUUAC ACGCACGCGG。
8. 如權利要求1至7任一項所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含修飾的核香酸。
9. 如權利要求8所述的核酸分子，其中所述修飾的堿基是通過下述方式的任意一種或多種來修4牟 (i) 使用I、 Br、 Cl或CH3在嘧啶6或8位或者。票呤5位的修飾；(ii) 使用NH3在嘧，定2位的修飾；(iii) 嘧啶修飾C)6-CH3、 N6-CH3和N2-CH3;(iv) 2，糖修飾；(v) 3'和5'加帽。
10. —種與權利要求1至7任一項所述的序列互補的核酸。
11. 一種體外鑒定阻滯或增強如權利要求1至IO任一項所述的核酸方法，該方法包4舌(a) 生成包含一種或多種如權利要求1至IO任一項所述的核酸分子、所述生物分子和候選化合物的混合物；和任選地(b) 當不存在所述候選化合物時，在允許所述核酸分子特異性結合至所述生物分子的條件下培育所述混合物；和(c) 測定所述候選化合物對所述核酸分子結合至所述生物分子的影響。
12. 如權利要求11所述的方法，其中所述方法使用微流體設備。
13. 如權利要求ll或12所述的方法，其中所述方法包括高通量篩選。
14. 如權利要求11至13任一項所述的方法，其中所述方法包括竟爭性抑制。
15. 如權利要求11至14任一項所述的方法，其中所述方法-使用 gpl20。
16. —種包含至少一種如一又利要求1至10任一項所述的核酸分子的藥物組合物，該藥物組合物任選包含一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
17. 如權利要求1至IO任一項所述的核酸分子在治療HIV感染中的用途。
18. 如權利要求1至IO任一項所述的核酸分子在制備用于治療HIV 感染的藥物中的用途。
19. 一種用于治療HIV感染的方法，該方法包括為需要其的患者施用有效量的至少一種如權利要求1至IO任一項所述的核酸分子或者如權利要求16所述的藥物制劑。
20. —種核酸分子，其具有如表l所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的適體衍生物，其用于結合并中和病毒。還提供了包含適體的藥物制劑以及所述適體在篩選有用化合物中的用途。
文檔編號A61K31/7115GK101160400SQ200680012565
公開日2008年4月9日申請日期2006年2月15日優(yōu)先權日2005年2月15日
發(fā)明者W·詹姆斯, 布賴恩·斯蒂芬·史伯樂申請人:埃西斯創(chuàng)新有限公司

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