專利名稱：：用于治療和預(yù)防血栓形成疾病的香葉木素衍生物的制作方法用于治療和預(yù)防血栓形成疾病的香葉木素衍生物本發(fā)明涉及香葉木素化合物在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，以及具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明具體涉及香葉木素化合物6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-411-1-苯并吡喃-4-酮，在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。淤血的生理過程是由于偶然原因或更復(fù)雜的病理原因，由血管內(nèi)皮細(xì)胞的不利改變而觸發(fā)的。其目的是通過彼此不同但又彼此相關(guān)并依賴的兩個步驟阻斷和阻止血液逸出初級淤血和血漿凝固。初級淤血是應(yīng)急機(jī)制，涉及粘附于內(nèi)皮形成白色血栓或血小板栓的循環(huán)血小板。其次，血小板栓通過形成血纖蛋白網(wǎng)而得到加強，所述的血纖蛋白在其網(wǎng)眼中包裹著聚集的血小板。不溶性的血纖蛋白從可溶性血漿蛋白質(zhì)一——血纖蛋白原開始，在凝固系統(tǒng)的酶促活化級^i^應(yīng)的終產(chǎn)物凝血酶的作用下產(chǎn)生。最后，血纖蛋白/血小板血栓通過血纖蛋白溶解現(xiàn)象被再吸收。實際上，由于其降低血管循環(huán)中血纖蛋白的量的能力，血纖蛋白溶解使機(jī)體能夠抵抗血栓形成并且破壞最初阻止出血的血栓。血纖蛋白溶解主要涉及纖溶酶，其為一種將多聚血纖蛋白長鏈分解成D-二聚體的蛋白7jC解酶。該酶以酶原形式(纖溶酶原)存在于血漿中，所述為纖溶酶。這些絲氨酸蛋白酶具體地是，組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，其基本是由活化的內(nèi)皮細(xì)胞所釋放，和尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)，其以尿激酶前體形式的釋放更為普遍。血纖蛋白溶解通過三成分系統(tǒng)進(jìn)行自身負(fù)調(diào)節(jié)，所述三成分系統(tǒng)包含纖溶酶抑制物(ot2-抗纖溶酶和(Xr巨球蛋白)、纖溶酶原激活抑制物(PAI-1或1型纖溶酶原激活物抑制物；PAI-2)和凝血酶激活的血纖蛋白溶解抑制物(TAFI)。主要的纖溶酶原激活物抑制物是PAI-1。PAI-1蛋白屬于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(絲氨酸蛋白酶抑制物)超家族，是379個IL^酸的糖蛋白(47kDa)，缺乏半胱氨酸但卻富含甲硫氨酸殘基。PAI-1蛋白質(zhì)存在于血漿和血小板中，可由多種類型的細(xì)胞例如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生。PAI-1的活性部位位于蛋白質(zhì)C-末端的(Arg^-MetS")處，作用類似于組織型纖溶酶原激活物的假底物。因此PAI-1主要的靶蛋白是t-PA和u-PA。從機(jī)體作為一個整體的角度來考慮調(diào)節(jié)於血和血纖蛋白溶解的機(jī)制，PAI-1水平升高與靜脈和動脈形成血栓的風(fēng)險增加之間呈正相關(guān)。這種正相關(guān)被報道過，特別在源于靜脈或動脈血栓形成的疾病病例中，例如心肌梗死(Hamsten等人,Plasminogenactivatorinhibitorinplasma:riskfactorforrecurrentmyocardialinfarction,1987，Lancet2，3畫9)、絞痛(Wieczorek等人，Tissue-typeplasminogenactivatorandtissueplasminogenactivatorinhibitoractivitiesaspredictorofadverseeventsinunstableangina,1994，AmJCardiol,24，424-429)、間歇性跛行、腦卒中綜合征、深靜脈血栓形成(Schulman等人，Thesignificanceofhypofibrinolysisfortheriskofrecurrenceofvenousthromboembolism,1996，ThrombHaemose，75,307-611)、肺栓塞，以及血栓形成風(fēng)險提高的疾病，例如高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥、血液凝固的遺傳性異?；蜓耗痰墨@得性異常。事實上，在30%患靜脈血栓栓塞的患者中血漿PAI-1水平增高(Tabernero等人Incidenceofincreasedplasminogenactivatiorinhibitorinpatientswithdeepvenousthrombosisand/orpulmonaryembolism,1989:ThrombRes，f^，565-570)。其結(jié)果是血纖蛋白溶解系統(tǒng)的全面功能異常，特別是t-PA降低，在患肺動脈高壓(并發(fā)栓塞)患者中同樣觀察到(Huber等人，F(xiàn)ibrinogen,t國PAandPAI醫(yī)1plasmalevelsinpatientswithprimarypulmonaryhypertension,1994，AmJCritCareMed，雄，929-933)。在此特別病例中，PAI-1水平的升高是由于位于血栓形成區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞，其表現(xiàn)出與凝血酶或血小板釋放的介體誘導(dǎo)相關(guān)的PAI-1釋放增加。假如PAI-1的水平升高在心血管綜合征的背景中是有害的，認(rèn)為恢復(fù)正常的血纖蛋白溶解活性將預(yù)防有風(fēng)險的患者中血栓形成事件的發(fā)生。因此，血纖蛋白溶解過程的控制構(gòu)成了醫(yī)學(xué)心血管疾病的中心問題?？鼓齽┖涂寡“鍎┰诖蠓秶男难芗膊≈谐蔀槌Ｒ?guī)治療。它們在預(yù)防心血管意外的背景中的價值并且還有對于心血管急癥的價值已經(jīng)在流行病學(xué)研究中得到證實。但是，風(fēng)險/利益的比例必須經(jīng)常衡量，因為與抗凝劑和抗血小板劑有關(guān)的出血意外是占主導(dǎo)的，所述出血會產(chǎn)生功能性的或致命的預(yù)后問題。事實上，抗凝劑和抗血小板劑治療的主要并發(fā)癥是出血。通過腸胃外途徑給藥的抗凝劑具體是未分級肝素(NFH)、分級肝素(LMWH)和醋硝香豆素(Sintrom⑧)。流行病學(xué)研究已顯示在血栓栓塞發(fā)作的治療背景中分級肝素和未分級肝素治療類型在0到7%的病例中引起嚴(yán)重出血，致死率范圍從0到2%。在血栓栓塞癥狀的預(yù)防和治療性治療中開發(fā)的抗凝劑Sintrom⑧在高達(dá)2.2%的病例中也會引起威脅生命的嚴(yán)重出血事件。考慮到在Sintrom⑧與抗血小板劑如阿司匹林的組合中出血風(fēng)險嚴(yán)重升高，在作出治療選擇時必須不能低估該組合的風(fēng)險/利益的比例。更多近來的具有血纖蛋白溶解或栓溶作用的治療已被開發(fā)；它們通過促進(jìn)無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化成有活性的纖溶酶來加速血管內(nèi)凝塊的溶解(MarderVJ.Thrombolytictherapy:foundationsandclinicalresultsin《HaemostasisandThrombosis》，第四版，2001，編者ColmanRW等人)。這些纖溶劑或溶栓劑通過腸胃外途徑單獨給藥，所述途徑可以通過普通的靜脈內(nèi)途徑灌注或作為丸劑給藥，或通過局部例如冠狀動脈內(nèi)或動J3^內(nèi)的途徑給藥。此外這些藥物組合物必須在血栓形成后盡可能早的給藥以試圖溶解它并由此除去血管中的阻塞。這些新溶栓劑因此由組織纖溶酶原激活物或t-PA的類似物組成，例如通過遺傳工程獲得且與t-PA完全相同的組織血纖蛋白溶原酶激活劑；人t-PA的簡單類似物瑞替普酶;或替耐普酶，其為類似于內(nèi)源t-PA的重組蛋白質(zhì)且對于血栓的血纖蛋白具有更高的親和力。這些纖溶劑^f艮快顯示出其在急救醫(yī)院用途方面的局限性和它們的給藥問題，例如將導(dǎo)管引入到栓塞的動脈。已經(jīng)設(shè)想了其他潛在的療法來改變PAI-1的水平，所述PAI-1水平增加與血栓栓塞意外相關(guān)。具體而言，已經(jīng)開發(fā)了單克隆抗體作為PAI-1活性的抑制物。MAI12是人PAI-1特異性的鼠抗體，其不干涉PAI-2,或t-PA，或oc2-抗纖溶酶。通過阻斷PAI-1與t-PA的相互作用，該單克隆抗體增加了體夕卜和體內(nèi)的血纖蛋白溶解(Levi等人，Inhibitionofplasminogenactivatorinhibitor-1activityresultsinpromotionofendogenousthrombolysisandinhibitionofthrombusextensioninmodelsofexperimentalthrombolysis,1992，Circulation,85，305-312)。在單克隆抗體CLB-2C的情況下，該抗體與玻連蛋白的M酸序列的第128位和笫145位之間結(jié)合，并因此阻止蛋白質(zhì)PAI-1與之結(jié)合，所以加速其失活。無論這些單克隆抗體在體外和體內(nèi)模型中的功效如何，因為與缺少抗體人源化相關(guān)的困難、免疫原性的風(fēng)險以及開發(fā)的費用，這些特異性的PAI-1抑制物無法從醫(yī)學(xué)角度進(jìn)行開發(fā)。因此本發(fā)明旨在對已經(jīng)可用的調(diào)節(jié)血纖蛋白溶解的機(jī)制提出一種備選的方案，用于對血栓形成疾病的預(yù)防和治療性目的，從而至少部分的克服血栓栓塞意外已知治療的缺點。該備選方案基于PAI-1基因表達(dá)的抑制。為此效果，本發(fā)明提出了香葉木素化合物在獲取旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的香葉木素化合物是通式(I)的化合物、其非對映異構(gòu)體和對映異構(gòu)體，以及其與可藥用酸或堿的加成鹽。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中，-Ri代表氫原子、丙基或烯丙基；誦R2代表氬原子或丙基、烯丙基、2，3畫二羥基丙基、(2,2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基或3-乙酰l^-2-羥丙基基團(tuán)；-議3代表氫原子、丙基或烯丙基；-R4代表氫原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基或(2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基或式-<:011'4的基團(tuán)，其中R、代表直鏈或支鏈(d-Cs)烷基或苯基；-Rs代表氫原子、丙基或烯丙基，以及-R6代表氫原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基或(2,2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基、式-COR'6的基團(tuán)(其中R，6代表直鏈或支鏈(d-Cs)烷基或苯基)，或式(T)基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>糾是-基團(tuán)Ri、R2、R3、R4、Rs和R6中至少一個不是氬原子，并且-如果RpR2和R3各自同時代表氫原子，那么Rt也代表氬原子。通式(I)的化合物的制備在EP0709383專利說明書中描述。更具體地，本發(fā)明使用的香草木素化合物是指在EP0709383專利說明書中描述的下列式(II)至式(XVII)的化合物(II)7-烯丙氧基-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲H^苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(III)5，7-二羥基-2-3-(2，3-二羥基丙氧基)-4-甲氧基苯基I-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(IV)(R，S)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮OCH,(V)5，7-喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(|V)(2，3-二羥基丙猛)-2-(3-羥基-4-甲絲苯基)-4H-l-苯并吡(VI)5-羥基-2-(4-甲氧基-3-新戊酰氧基苯基)-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(VII)5-烯丙氧基-2-(3-烯丙氧基-4-甲氧基苯基)-7-(2，3-二鞋基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(VII)(VIII)6-烯丙基-5-羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-5-甲IL^苯基)-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮OHHO、(IX)5-羥基-2-(3-羥基-4-甲猛-2-丙基苯基)-6-丙基-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(X)(1^)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XI)(R)-5-羥基-2-(3-羥基-4-曱氧基-2-丙基苯基)-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XII)。)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XIII)(R，S)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-7-(3-乙酰氧基-2-羥基丙Hi0-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XIV)5-羥基-2-4-甲氧基-2-丙基-3-(6-羧基-3，4，5-三羥基-四氫吡喃-2-基-狄)-苯基-7-(2，3-二羥基丙狄)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(XV)5-羥基-2-4-甲氧基-3-(2，3-二羥基丙氧基)-苯基-7-(2，3-二羥基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XVI)5，7-二羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-6，8-二丙基-4H-l-苯并吡喃_4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>更為有利的是，本發(fā)明優(yōu)選的式(I)化合物是式(XVII)的6，8-二烯丙基.5,7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲緣苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>因此本發(fā)明涉及式(I)香葉木素化合物、其非對映異構(gòu)體和對映異構(gòu)體,以及其與可藥用酸或堿的加成鹽在獲取旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病的藥物組合物中的用途。其中，-Ri代表氫原子、丙基或烯丙基；-R2代表氫原子或丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基、(2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基或3-乙酰HJ^-2-羥丙基；-R3代表氫原子、丙基或烯丙基；-R4代表氫原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基或(2，2-二甲基-l，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基或式-COR，4基團(tuán)，其中R、代表直鏈或支鏈(d-Cs)烷基或苯基；國Rs代表氫原子、丙基或烯丙基，以及-R6代表氫原子或曱基、丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基或(2，2-二曱基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基、式-COR'6基團(tuán)(其中R'6代表直鏈或支鏈(d-Cs)烷基或苯基)或式(I')基團(tuán)-基團(tuán)Ri、R2、R3、R4、Rs和R6中至少一個不是氫原子，并且-如果R^R2和R3各自同時代表氫原子，那么Rj也代表氫原子。與本發(fā)明框架中的通常含義一致，"血栓形成疾病"的表達(dá)定義為在心血管系統(tǒng)(靜脈、動脈、心臟、微循環(huán))中血栓形成引起的任何疾病。由凝塊導(dǎo)致的血管局部阻塞或凝塊栓化導(dǎo)致的遠(yuǎn)距離部位阻塞是引起血栓形成疾病臨M征的原因。深靜脈血栓形成基本上出現(xiàn)在腿部；如果它們栓化到肺部將會引起肺栓塞。動脈血栓形成最經(jīng)常伴隨有血管疾病發(fā)生，最常見的是動脈粥樣硬化。它們通過阻止血液在動脈中流動從而導(dǎo)致組織缺血，例如由于冠狀動脈血栓形成或栓化后微循環(huán)遠(yuǎn)端血栓形成的情糾是:形中的心肌梗死，或在例如心內(nèi)或頸總動脈血栓栓化后產(chǎn)生的腦卒中綜合征(CVA)。最終，微循環(huán)栓塞通常是彌散性血管內(nèi)凝血(其中孩ibfe栓產(chǎn)生缺血性壞死)的并發(fā)癥。才艮據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"預(yù)防"對應(yīng)于預(yù)防性目的的治療，其具有在易感背景例如動脈粥樣硬化疾病、糖尿病或代謝綜合征中降低血栓形成發(fā)展的風(fēng)險的目的。此外，術(shù)語"預(yù)防，，可理解為旨在通過減少疾病的發(fā)展和持續(xù)期來降低患病數(shù)的二級預(yù)防。二級預(yù)防是在心血管意外和腦卒中綜合征之后為降低復(fù)發(fā)危險所必需的。"治療，，理解成為了治療栓塞并發(fā)或未并發(fā)的血栓形成目的的治愈性目的的治療。本發(fā)明優(yōu)選涉及式(XVII)的6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病的藥物組合物中的應(yīng)用此外本發(fā)明涉及香葉木素化合物在獲得旨在預(yù)防和/或治療具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。"具有血栓形成風(fēng)險的疾病"理解為在其過程中發(fā)生在血栓形成事件的任何疾病。加重動脈粥樣硬化的疾病例如高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓、肥胖癥、吸煙以及還有心房纖維性顫動，是具有動脈血栓形成風(fēng)險的主要疾病。遺傳性或獲得性凝固蛋白質(zhì)異常和矯形外科是具有靜脈血栓形成風(fēng)險的主要疾病，但是也要提;sj巴胖癥、某些激素治療、某些癌癥及其治療、懷孕和長期缺少運動的原因。最后，敗血癥性休克是具有微:循環(huán)血栓形成風(fēng)險的主要疾病。例如，在高膽固醇血癥中甘油三酯水平升高一般是心血管風(fēng)險特別加重的標(biāo)記，特別是血栓形成特別加重的標(biāo)記。在VLDL水平升高與肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放的PAI-1水平升高相關(guān)(Allison等人，Effectsofnativetriglyceride陽enrichedandoxidativelymodifledLDLonplasminogenactivatorinhibitor-1expressioninhumanendothelialcells,1999,ArteriosclerThrombVaseBio，1￡，1354-1360)(Mussoni，等人Hypertriglyceridemiaandregulationoffibinolyticactivity,1992，ArteriosclerThromb，12，19-27)。本發(fā)明還涉及香葉木素化合物作為活性成份與一種或多種可藥用賦形劑組合，在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，或具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)選涉及包含本發(fā)明的香葉木素化合物與一種或多種可藥用賦形劑組合的藥物組合物，該組合物旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病或具有血栓形成風(fēng)險的疾病。"活性成分"理解為引起藥物組合物藥效或治療性質(zhì)的任何物質(zhì)。在本發(fā)明的背景中，"賦形劑"理解為藥物活性成分所摻入其中，以幫助其制備和給藥，以及改善其稠度、形狀和體積的任何物質(zhì).此外旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，或具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物是適于口服的、腸胃外的、鼻的、經(jīng)皮或透皮的、直腸的、經(jīng)舌的、眼的或呼吸給藥的形式，特別是片劑或糖錠劑、舌下片劑、藥嚢劑(sachet)、paquet、膠嚢劑、舌下或直腸給藥劑型(glossette)、錠劑、栓劑、乳骨劑、軟骨劑、皮膚凝膠劑(dermalgel)和可飲用或可注射的安瓿劑。根據(jù)本發(fā)明的香葉木素化合物優(yōu)選用于獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，或具有血栓形成風(fēng)險的疾病的口服給藥藥物組合物。由于病人用藥簡單，用于血栓形成疾病或具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物通過口服途徑給藥特別適于具有預(yù)防目的的治療。最后，有效劑量根據(jù)性別、年齡和患者重量、給藥途徑、治療指征的特點和任何相關(guān)治療而變化，范圍從0.1mg至lg，每24小時一次或多次給藥。本發(fā)明通過下列實施例來說明但并不限于此。實施例1:PAI-1表達(dá)的體外抑制1)細(xì)胞培養(yǎng)^Mf究在人肝細(xì)胞系H印G2(ATCC，編號HB8065)上進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)于具有g(shù)lutamax-l(Gibco口)的MEM培養(yǎng)基(極限必需培養(yǎng)基)中，所述培養(yǎng)基含有10。/。FCS(胎牛血清)、1%非必需氨基酸和1%丙酮酸鈉并且補充了青霉素和鏈霉素。2)PAI-1啟動子的克隆a)通過PCR擴(kuò)增啟動子通過PCR擴(kuò)增并且亞克隆對應(yīng)于PAI-1啟動子的2.5kb的片段，其從第-2442位核苷酸延伸到第+136位核苷酸(Lopez等人，2000,Atherosclerosis,巡，359-366)。在50pl反應(yīng)終體積中，在300ng人基因組DNA(Clontech)、300jiM的dNTP(三磷酸脫氧核苷酸)(Clontech)、300nM引物存在時，將2.5單位的PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity(Invitrogen)置于這樣的培養(yǎng)基中，其補加了1.5mMMgCh和不同濃度的PCRxEnhancerSystem(Invitrogen)(促進(jìn)特別困難的序列(0-4x)擴(kuò)增)的酶特異性緩沖液。所用的一套引物(Chen等人DifferentialmechanismsofPAI-1geneactivationbytransforminggrowthfactorbetaandtumornecrosisfactoralphainendothelialcells,2001，ThrmbHaemost,絲，1563-72)如下5，-TTACGCGTGGGTTTGGGGCTGGACTTG-3，(SEQIDNo.l)，和5，畫CGAGATCTCAGAGGTGCCTTGCGATTGG-3，(SEQIDNo.2)在PerkinElmer2400儀上，該PCR程序包括升溫至94。C，2分鐘的起始和后續(xù)的超過35個循環(huán)的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物接著在7.5M乙酸銨和乙醇存在下于-80。C沉淀一小時。在4。C、14000轉(zhuǎn)/分鐘離心后，將沉淀重懸在70%的乙醇中并且再次在4'C，14000轉(zhuǎn)/分鐘離心。獲得的沉淀接著進(jìn)行干燥和于水。b)啟動子序列的消化擴(kuò)增的序列繼而用限制性酶BglII和MhiI分兩步進(jìn)行消化。擴(kuò)增的序列在1單位/fd酶和100jig/mlBSA(牛血清白蛋白)存在下37。C消化1小時30分鐘。每次消化后，所得產(chǎn)物在MicroBio-Spin層析柱(Bio-Rad)上系統(tǒng)地進(jìn)行純化以除去緩沖液中的鹽。c)PGL3/PAI-1質(zhì)粒的構(gòu)建將含有螢火蟲熒光素酶基因的pGL3-Basic質(zhì)粒(Promega)用限制性酶BglII和MluI按照與插入片段相同的方法進(jìn)行消化，并接著在1%低熔點瓊脂糖凝膠上純化。pGL3-Basic質(zhì)粒載體和對應(yīng)PAI-1啟動子的插入片段的連接;l依靠T4DNA連接酶(Promega的LigaFastTMRapidDNALigationSystem)進(jìn)行的。通常，在連接期間，使用相當(dāng)于載體量三倍的過量插入片段。另外，由于該插入片段是載體的一半長(2.5kb相對于4.8kb)，維持化學(xué)計量平衡需要載體質(zhì)量加倍。因此37.5ng的插入片段和25ng的pGL3-Basic載體在3個單位的T4連接酶存在時，于環(huán)境溫度進(jìn)行反應(yīng)。3)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染PGL3/PAI-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞。在有50%匯合的細(xì)胞、在每孔中沉積了Lipofectin(lmg/ml)和1.5ng的PGL3/PAI-1質(zhì)粒的平板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Lipofectii^在OPTI-MEM培養(yǎng)基(GIBCCF，中活化30分鐘，繼而與預(yù)先用培養(yǎng)基稀釋的質(zhì)粒接觸15分鐘。細(xì)胞在37°C,含有5。/。C02和95%02的氣氛中培養(yǎng)6小時。吸出轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并用滋養(yǎng)培養(yǎng)基替換過夜以穩(wěn)定細(xì)胞。在無血清的MEM培養(yǎng)基中超過24小時，誘導(dǎo)報道基因的表達(dá)。刮下細(xì)胞并在裂解緩沖液(0肌1丄11<^6^86@試劑盒，Promega)中裂解，繼而放置于-20'C。在TGFpi(lng/ml)存在時，對HepG2細(xì)胞的誘導(dǎo)階段是24小時。在該誘導(dǎo)階段期間，在TGFpl之前4小時加入PAI-1表達(dá)抑制物，且保持與細(xì)胞接觸直到24小時的誘導(dǎo)階段結(jié)束。4)啟動子活性的確定該PAI-1啟動子活性通過所產(chǎn)生的熒光素酶活性來定量確定(Dual-Luciferase試劑盒，Promega)。向每孔加入螢火蟲熒光素酶的底物——熒光素溶液。這導(dǎo)致發(fā)光。因為熒光素酶活性對光敏感，平板在黑暗中溫育10分鐘，接著開始發(fā)光計讀數(shù)以定量發(fā)射的光子(Wallac，PerkinElmer)，獲得的結(jié)果是在5秒的時期內(nèi)的平均cpm(每分鐘計數(shù))。5)結(jié)果將6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(專指化合物A)和式3(E)-苯亞甲基-4(E)-(3，4，5-三甲氧基苯亞甲基)吡咯烷-2，5-二酮的T686(參照的PAI-1表達(dá)抑制物，來自Tanabe)以10jiM的濃度在基礎(chǔ)狀態(tài)的H印G2細(xì)胞和TGFpi誘導(dǎo)后的HepG2細(xì)胞上進(jìn)行測試。PAI-1啟動子活性在對照條件下和存在抑制物時，在M狀態(tài)和i秀導(dǎo)狀態(tài)下測量。以cpm和作為對照觀齊(t的百分?jǐn)?shù)表示的活性示于表l。以cpm表示的活性抑制/對照(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表1:在6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮或T686存在時(24小時)，在^f出條件或TGFpl(1ng/ml)誘導(dǎo)條件下對PAI-1啟動子活性的測量。**，相對于在基礎(chǔ)狀態(tài)的對照p〈0.01,?！悖鄬τ谠谡T導(dǎo)狀態(tài)的對照p〈0.01。ANOVAl因子，后Duimett，s檢驗(n-6)。在基礎(chǔ)條件和TGF卩1誘導(dǎo)條件下6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲HJ^苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮和T686(10jiM)抑制PAI-1基因表達(dá)。6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(69。/。)在J^出條件下與T686(67。/o)效力相同，而在誘導(dǎo)條件下明顯更有效(相對T686的52。/0，為78%抑制作用；p<0.01，ANOVA1因子，后Newman-Keuls檢驗)。實施例2:香葉木素化合物抗血栓形成活性的體內(nèi)評估1)動物本研究在重量為250到400g之間的雄性CD大鼠(CharlesRiver實驗室)上進(jìn)行。在6-8只大鼠的幾組上進(jìn)行的實驗方法包括將每種測試化合物組與用溶劑處理大鼠的對照組進(jìn)行比較。這些大鼠用于研究在腹主動脈上FeCl3誘導(dǎo)的動脈血栓形成模型中的抗血栓形成的效果(Tanaka等人，Z國335，anewthromboxaneA2receptorantagonist,preventsarterialthrombosisinducedbyferricchlorideinrats，2000,Eur.J.Pharmacol"401,413-418)。2)誘導(dǎo)的動脈血栓形成模型在大鼠中誘導(dǎo)動脈血栓形成之前，大鼠用測試化合物，例如6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(30mg/kg/天)通過管飼法口服給藥處理5天。通過WI內(nèi)給藥，用50mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠并在剖腹后將其腹主動脈暴露。一個8mm直徑的用氯化鐵(FeCb，50%)飽和的小丸作為病原體放置在主動脈中10分鐘以破壞內(nèi)皮并誘導(dǎo)凝塊形成。在動脈血栓形成模型建立20分鐘后，從主動脈中取出形成的血塊并稱重。3)結(jié)果大鼠腹主動脈上氯化鐵誘導(dǎo)的動脈血栓形成模型使得m^本發(fā)明的香葉木素化合物并且特別是6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲ll^苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(化合物A)作為抗血栓形成劑的功效成為可能。6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮的活性作為從主動脈中取出的凝塊重量的函數(shù)進(jìn)行評估，凝塊重量越小則活性越高。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2:相對于對照(無管飼)(11=6),作為凝塊重量函數(shù)的6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-曱氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(化合物A)活性的測量。相對于對照，6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮使得凝塊重量明顯而顯著的減少成為可能，凝塊減少達(dá)到了30%。權(quán)利要求1.式(I)的香葉木素化合物、其非對映異構(gòu)體和對映異構(gòu)體以及其與可藥用酸或堿的加成鹽在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病的藥物組合物中的應(yīng)用其中，-R1代表氫原子、丙基或烯丙基；-R2代表氫原子或丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基、(2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基或3-乙酰氧基-2-羥丙基；-R3代表氫原子、丙基或烯丙基；-R4代表氫原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基或(2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基或式-COR′4基團(tuán)，其中R′4代表直鏈或支鏈(C1-C5)烷基或苯基；-R5代表氫原子、丙基或烯丙基，及-R6代表氫原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羥基丙基或(2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基、式-COR′6基團(tuán)(其中R′6代表直鏈或支鏈(C1-C5)烷基或苯基)或式(I′)基團(tuán)條件是-基團(tuán)R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一個不是氫原子，并且-如果R1、R2和R3各自同時代表氫原子，那么R4也代表氫原子。2.式(XVII)的6，8-二烯丙基-5，7-二羥基-2-(2-烯丙基-3-羥基-4-曱氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮在獲得旨在預(yù)防和/或治療血松形成疾病的藥物組合物中的應(yīng)用3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的香葉木素化合物在獲得旨在預(yù)防和/或治療具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的香葉木素化合物在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，或具有血栓形成風(fēng)險的疾病的口服給藥藥物組合物中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的香葉木素化合物與一種或多種可藥用賦形劑組合在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，或具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。6.藥物組合物，其包含與一種或多種可藥用賦形劑組合的根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的香葉木素化合物，該組合物旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，或具有血栓形成風(fēng)險的疾病。全文摘要本發(fā)明涉及香葉木素化合物在獲得旨在預(yù)防和/或治療血栓形成疾病和具有血栓形成風(fēng)險的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。文檔編號A61P7/02GK101132788SQ200680006765公開日2008年2月27日申請日期2006年2月28日優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日發(fā)明者A·呂潘,M·維日比茨基,M-F·鮑薩德,M-O·瓦萊,P·桑塞爾維斯特里-莫雷,T·韋伯朗申請人:瑟維爾實驗室