專利名稱：：用于減少血清蛋白滲出的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于減少血清蛋白滲出的組合物，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種這樣的組合物，其通過(guò)減少皮膚和粘膜的血清蛋白的滲出來(lái)改善諸如特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性濕疹、皮膚瘙癢、特應(yīng)性鼻炎(鼻粘膜炎)、特應(yīng)性紅斑或紅皮癥、接觸性皮炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病之類的癥狀。
背景技術(shù)：
：隨著免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)的發(fā)展，為了達(dá)到對(duì)特應(yīng)性疾病具有學(xué)術(shù)性的了解的目的以及達(dá)到改善該疾病的癥狀和治療該疾病的目的，研究者作了很多嘗試，以弄清活體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制以及利用這些機(jī)制的方法。另一方面，一些研究者一直進(jìn)行著某些研究，以闡明現(xiàn)代社會(huì)文明的發(fā)展(即，飲食變化或暴露于污染物)所引起的發(fā)病原因的變化。在研究特應(yīng)性疾病的各種發(fā)現(xiàn)中，所發(fā)現(xiàn)的共同事實(shí)是有血清蛋白從患有特應(yīng)性疾病的患者的皮膚或粘膜中滲出，而這一事實(shí)與對(duì)特應(yīng)性疾病是由免疫原因所導(dǎo)致的了解無(wú)關(guān)。然而，一直沒有研究能夠明確斷定由皮膚或粘膜滲出血清蛋白是特應(yīng)性疾病發(fā)展的結(jié)果，還是皮膚或粘膜中的血清蛋白的滲出引發(fā)了特應(yīng)性疾病。公知的是，對(duì)表皮或粘膜中的血清蛋白的滲出的觀測(cè)主要采用血清白蛋白作為標(biāo)記蛋白。眾所周知，皮膚疾病患者的血清白蛋白的滲出量與該疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。血液中血白蛋白減少是由于血清蛋白從皮膚中嚴(yán)重滲出所引起的(參見文獻(xiàn)Worm等，1981.Br.J.Dermatol.104:389-396;以及Worm禾口Rossing,1980.J.Invest.Dermatol.75:302-305)?；加羞^(guò)敏性哮喘或鼻炎的患者會(huì)發(fā)展出諸如腸淋巴管擴(kuò)張(由于透過(guò)腸內(nèi)壁的白蛋白嚴(yán)重丟失所致)之類的癥狀(參見文獻(xiàn)Esenberh,1976.Ann.Allergy,36:342-350)。對(duì)于兒童而言，由嚴(yán)重的皮膚疾病所導(dǎo)致的白蛋白的丟失可使他們生長(zhǎng)緩慢(參見文獻(xiàn)Abrahamov,1986.Eur.J.Pediatr.145:223-226)，并且在淋巴管擴(kuò)張的同時(shí)，伴有尿頻(oiguria)和肢端發(fā)紺(參見文獻(xiàn)Capulong等人，1996.Pediatr.AllergyImmunol.7:100-102)。據(jù)報(bào)道，病變皮膚區(qū)域的白蛋白滲出量與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，甚至對(duì)于特應(yīng)性濕疹和接觸性皮炎也是如此(參見文獻(xiàn)David等人，1990.Br.J.Dermatol.122:485-489;以及Wijsbek等人，1991.Int,J.Microcirc.Clin.Exp.10:193-204)。據(jù)報(bào)道，人們發(fā)現(xiàn)甚至在哮喘及慢性阻塞性肺疾病患者的痰中也含有滲出的包括白蛋白的血清蛋白(參見文獻(xiàn)Schoonbrood等人，1994.Am.J.Respir.Crit.CareMed.150:1519-1527;以及Anderson&Persson1988.AgentsActionsSuppl.23:239-260)，并且還報(bào)道了在發(fā)生慢性咳嗽的情況下，在沒有顯示嗜酸紅細(xì)胞增多的跡象的情況下，也出現(xiàn)了白蛋白的滲出(參見文獻(xiàn)Pizzichini等人.，1999.Can.Respir.J.6:323-330)。血清蛋白的滲出可受化學(xué)物質(zhì)的誘發(fā)，這些化學(xué)物質(zhì)包括諸如水楊酸甲酯、苯酚、巴豆油、苯甲烴銨等之類的物質(zhì)(參見文獻(xiàn)Patrick等人，1985.Toxicol.Appl.Pharmacol.81:476-490)，以及甲苯、間二甲苯、環(huán)己烷等(參見文獻(xiàn)Iyadomi等人，1998.Ind.Health36:40-51)。在動(dòng)物模型中，使用2,4-二硝基氟苯來(lái)進(jìn)行皮膚刺激性試驗(yàn)研究，也誘發(fā)了血清蛋白的滲出(參見文獻(xiàn)Nakamura等人，2001.Toxical.Pathol.29:200-207)。據(jù)報(bào)道，不是所有有機(jī)溶劑物質(zhì)都能誘發(fā)血清蛋白的滲出，而且滲出量根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)的不同而變化。血清蛋白的滲出易于受到具有芳香環(huán)的化學(xué)物質(zhì)的誘發(fā)，但幾乎不受到諸如丙酮之類的有機(jī)溶劑的影響。應(yīng)當(dāng)記住的是，西化的飲食習(xí)慣導(dǎo)致了特應(yīng)性疾病(參見文獻(xiàn)Weiland等人，1999.Lancet353:2040-2041;窗Mutis等人，1998.Lancet351:862-866;和Dunder等人，2001.Allergy56:425-428),研究者注意的是人們所消化的食物的成分的變化和脂類的含量的變化。進(jìn)入20世紀(jì)70年代，一些研究人員發(fā)現(xiàn)人體代謝的失衡是由于過(guò)多地?cái)z取了不飽和脂肪酸和反式油的原因，不飽和脂肪酸和反式油是植物油的主要成分，其導(dǎo)致特應(yīng)性疾病的增加。在哺乳動(dòng)物(包括人類)的肺(不同于其它組織和器官)中，具有包含高含量的二飽和脂肪酸的多種磷脂，而且存在于肺表面上的表面活性劑中尤其具有含量甚高的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)。一直已知的是，該成分在肺部起到減少表面張力的作用。表面活性劑降低肺表面的表面張力可使得在空氣被吸入肺部時(shí)呼吸變得容易，并且使得在呼出氣體時(shí)可以防止肺泡壁相互粘附或防止肺泡結(jié)構(gòu)塌陷。表面活性劑中的脂類成分由約90%的磷脂(約70%的磷脂是二飽和磷脂)和約10%的中性脂肪(大部分的中性脂肪是膽固醇)(參見綜述JonGoerke1998.Biochem.Biophy.Acta.1408:79-89;以及Vedhuizen等人，1998.Biochim.Biophys.Acta.90-108)構(gòu)成。除上述事實(shí)之外，需要進(jìn)一步考慮的科學(xué)結(jié)果之一是合成肺部表面活性劑的脂類的途徑。一個(gè)要點(diǎn)是，存在于人類肺部的大部分膽固醇是由血液供給的。在肺中合成的膽固醇僅占約1%，而其余的膽固醇應(yīng)是由血液供給的(參見文獻(xiàn)Hass禾HLongmore,1979.Biochim.Bi叩hys.Acta573:166-174)。己經(jīng)知道，構(gòu)成大部分肺部表面活性劑的磷脂是由II型上皮細(xì)胞合成和分泌的，而構(gòu)成磷脂的大部分脂肪酸是由血液中的VLDL(極低密度脂蛋白)供給的(參見文獻(xiàn)Rama等人，1997.J.Clin.Invest.99:2020-2029)。SP-A(表面活性蛋白A)是肺部?jī)?nèi)表面活性劑中的主要蛋白之一，最近30年人們一直在對(duì)其進(jìn)行研究。SP-A蛋白是由肺泡II型上皮細(xì)胞合成和分泌的，并且人們還發(fā)現(xiàn)在小腸表面、耳咽管、淚液等中也存在SP-A蛋白。SP-A蛋白的分子量為約700kDa(通過(guò)凝膠過(guò)濾分析測(cè)定)，并具有18個(gè)相同的單元，每個(gè)單元的分子量為32kDa，這18個(gè)相同的單元聚集形成一個(gè)具有特異功能的成熟蛋白。已經(jīng)知道這種蛋白有多種生理功能，并且主要可分為兩種功能。第一種功能是免疫功能，其中SP-A通過(guò)與在呼吸時(shí)進(jìn)入肺內(nèi)的細(xì)菌或病毒以及塵螨、花粉等結(jié)合來(lái)保護(hù)肺。第二種功能是參與維持肺內(nèi)的表面活性劑的動(dòng)態(tài)平衡(參見文獻(xiàn)Tino禾卩Wright1998.Biochim.Biophys.Acta.1408:241-263;Haagsman,Biochim.Biophys.Acta.1408:264-277;Crouch&Wright,2001.A麵.Rev.Physiol.63:521-524;和Haagsman禾口Diemel,2001Compar.Biochem.Physiol.129:191-108)。
發(fā)明內(nèi)容由此，本發(fā)明被設(shè)計(jì)成用于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，因此本發(fā)明的目的是提供一種用于治療和/或減輕與血清蛋白滲出相關(guān)的疾病的組合物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或減輕與血清蛋白滲出相關(guān)的疾病的組合物，該組合物包含二飽和磷脂作為有效成分。本發(fā)明所提供的二飽和磷脂優(yōu)選是從動(dòng)物、更優(yōu)選從牛和豬、最優(yōu)選是從它們的支氣管肺泡灌洗液或肺組織勻漿中提取。另外，本發(fā)明所述的二飽和磷脂優(yōu)選是二棕櫚酰磷脂酰膽堿和/或二棕櫚酰磷脂酰肌醇。此外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選還包含鈣離子和具有羧基的有機(jī)酸，該具有羧基的有機(jī)酸優(yōu)選包括(但不局限于)可代謝的有機(jī)酸，例如，乳酸、琥珀酸、富馬酸或檸檬酸。此外，如果需要的話，本發(fā)明的組合物還可包含添加劑，例如，甘油。在本發(fā)明的組合物中，二飽和磷脂優(yōu)選濃度為1mg/ml至700mg/ml。上述濃度范圍是最優(yōu)選的，這是因?yàn)樵跐舛葹閘mg/ml或更低時(shí)，二飽和磷脂的療效差或表現(xiàn)出松馳效應(yīng)，而當(dāng)濃度為700mg/ml或以上時(shí)，會(huì)使得懸浮液的粘度過(guò)高而不能均質(zhì)化，從而難以使用。此外，本發(fā)明提供了一種用于治療皮膚疾病的組合物，其含有本發(fā)明的組合物。此外，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明的組合物的化妝品組合物。本發(fā)明所述的與血清蛋白滲出相關(guān)的疾病包括(但不局限于)選自特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性濕疹、皮膚瘙癢、特應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性紅斑或紅皮癥、接觸性皮炎、哮喘及慢性阻塞性肺疾病等的疾病。以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。在本發(fā)明中，基于特應(yīng)性疾病具有共同癥狀這一事實(shí)而使用一種新型的動(dòng)物模型，所述癥狀為由于過(guò)量地?cái)z入不飽和脂肪酸和反式油而導(dǎo)致內(nèi)皮-上皮屏障功能被降低，從而使得血清蛋白從皮膚或粘膜中滲出。所發(fā)現(xiàn)的是，當(dāng)將鹽乳化的植物提取油由氣管內(nèi)引入鼠肺時(shí)，該動(dòng)物表現(xiàn)為肺內(nèi)的血清蛋白滲出。還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)由氣管內(nèi)施用在體內(nèi)可完全代謝的穩(wěn)定的生物成分(本發(fā)明的組合物)可減輕或抑制血清蛋白滲出的癥狀。而且，還發(fā)現(xiàn)，含有從動(dòng)物肺中分離的二飽和磷脂、一定濃度的鈣離子和具有羧基的有機(jī)酸的組合物對(duì)患有特應(yīng)性疾病的患者的病變皮膚區(qū)域具有有效的治療作用。在本發(fā)明中，所發(fā)現(xiàn)的是，在健康動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液或肺組織勻漿中，當(dāng)在二價(jià)陽(yáng)離子存在條件下使SP-A蛋白發(fā)生聚集而后對(duì)其進(jìn)行離心時(shí)，會(huì)形成含有理想組合的二飽和磷脂的獨(dú)特沉淀層。本發(fā)明包括一種這樣的方法，其包括以下步驟從沉淀層中除去表面活性蛋白(特別是有機(jī)溶劑可溶性蛋白質(zhì)SP-B和SP-C)和可引起人體免疫應(yīng)答的疏水性多肽、膽固醇和不飽和磷脂；進(jìn)而獲得在健康動(dòng)物肺內(nèi)存在的理想組合的二飽和磷脂級(jí)分?；赟P-A蛋白在二價(jià)陽(yáng)離子不存在的條件下會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)的非特異性疏水性相互作用這一發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將包含二飽和磷脂級(jí)分的組合物施用于患有特應(yīng)性疾病的患者的皮膚或粘膜以抑制或減少血清蛋白的滲出時(shí)，需要一定濃度的鈣離子，此外，還要將可在細(xì)胞內(nèi)被代射掉的具有羧基的有機(jī)酸(例如，檸檬酸鹽或檸檬酸)加入所述組合物中，以防止二飽和磷脂在一定濃度的鈣離子存在下發(fā)生聚集。附圖簡(jiǎn)述在下面的發(fā)明詳述中，將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的上述和其它方面的特征、情況和優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行更全面的說(shuō)明。在附圖中，圖1為使用TLC示出的從動(dòng)物肺部獲得的總脂的圖。在圖l中，*指示標(biāo)記代表二飽和磷脂級(jí)分。圖2示出在誘發(fā)鼠肺內(nèi)血清蛋白滲出后再用組合物對(duì)血清蛋白滲出進(jìn)行抑制的過(guò)程中每次柱層析得到的蛋白洗脫模式的色譜圖。在圖2中，圖(1)顯示向大鼠肺中施用鹽乳化的玉米油來(lái)誘發(fā)血清蛋白滲出所得到的大鼠肺部蛋白譜，圖(2)顯示在對(duì)之前血清蛋白的滲出己被誘發(fā)出的大鼠施用本發(fā)明的組合物之后的肺部蛋白譜，圖(3)顯示對(duì)照大鼠的肺部蛋白譜。"A"表示含有SP-A(分子量為約700kDa)的蛋白峰，"B"表示含有血清白蛋白(約70kDa)的蛋白峰。通過(guò)比較兩個(gè)峰(A和B)的大小來(lái)評(píng)價(jià)血清蛋白滲出的抑制水平或減少水平。圖3示出在將本發(fā)明的組合物施用給特應(yīng)性皮膚疾病之后(2至4周)的結(jié)果的照片。照片的左側(cè)部分示出在施用本發(fā)明組合物之前的皮膚狀況。照片的右側(cè)部分示出在施用本發(fā)明組合物之后的結(jié)果的照片。施用本發(fā)明的組合物的時(shí)期為2至4周，最上一排照片示出患有特應(yīng)性濕疹的患者，從上面數(shù)第二排的照片示出患有特應(yīng)性皮炎(包括皮膚潰瘍)的患者，從上面數(shù)第三排的照片示出患有特應(yīng)性紅斑的患者，最后一排的照片示出患有特應(yīng)性皮炎的患者。圖4示出在施用本發(fā)明的組合物之前/之后的照片。這些結(jié)果示出了在施用本發(fā)明組合物之前的、6歲女子的患有特應(yīng)性皮膚疾病的背部的照片(左)，和在對(duì)該特應(yīng)性皮膚疾病施用本發(fā)明的組合物4周后的照片(右)。圖5示出在施用本發(fā)明的組合物之前/之后的照片。這些結(jié)果示出了在施用本發(fā)明組合物之前的、6歲女子的患有特應(yīng)性皮炎(包括皮膚潰瘍)的膝蓋胭窩的照片(左)，和在該特應(yīng)性皮炎施用本發(fā)明的組合物5周后的照片(右)。圖6示出在施用本發(fā)明的組合物之前/之后的結(jié)果。這些結(jié)果示出了在施用本發(fā)明組合物之前的、16歲女性的患有普通特應(yīng)性皮膚疾病的膝蓋胭窩的照片(左)，和在對(duì)該特應(yīng)性皮膚疾病施用本發(fā)明組合物3周后的照片(右)。圖7示出在施用本發(fā)明的組合物之前/之后的結(jié)果。這些結(jié)果示出了在施用本發(fā)明組合物之前的、10月齡女子的患有早期特應(yīng)性皮膚疾病的臉部的照片(左)，和在對(duì)該特應(yīng)性皮膚疾病施用本發(fā)明組合物3周后的照片(右)。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式下文中，將參照優(yōu)選實(shí)施方案來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。然而，應(yīng)該理解的是本文所提及的說(shuō)明僅是為了達(dá)到示意性目的的優(yōu)選實(shí)施例，而非意于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:從豬的支氣管肺泡灌洗液中提取二飽和磷脂級(jí)分(1)獲得支氣管肺泡灌洗液的方法取健康豬的肺，用含5mM氯化鈣(CaCl2)的滲透性鹽溶液灌入其中。在室溫下通過(guò)以下方式進(jìn)行灌洗用加壓泵將約0.6L的溶液注入肺之一中，然后收集從該肺中滲出的灌洗液。每個(gè)肺都用15L的鹽溶液進(jìn)行灌洗。將收集到的支氣管肺泡灌洗液立即轉(zhuǎn)移到冰水浴中，使其冷卻。(2)利用聚集現(xiàn)象從支氣管肺泡灌洗液中獲得表面活性劑的沉淀物的方法將含有鈣離子(5mM)的支氣管肺泡灌洗液在冰水浴中保持1小時(shí)，然后SP-A蛋白開始與表面活性劑中的脂類發(fā)生聚集。在具有低加速旋轉(zhuǎn)功能的離心機(jī)(Component-R，得自位于韓國(guó)的Hanil公司)中對(duì)該溶液進(jìn)行離心。在4T、離心力為4500g的條件下離心溶液35分鐘。離心后，沉淀物形成了可區(qū)分的三個(gè)層。少量的底層包含細(xì)胞和不溶性和/或變性蛋白，而量最大的中間層和少量的頂層包含表面活性脂類和表面活性蛋白。將沉淀物的中層和上層收集在一起，用有機(jī)溶劑提取，從而獲得二飽和磷脂級(jí)分。(3)用有機(jī)溶劑初步萃取取2倍體積的蒸餾水加入在上述步驟中獲得的表面活性蛋白質(zhì)和表面活性脂類的混合物中，然后使混合物懸浮。將氯仿和甲醇的混合溶劑(體積比為2:1)以與樣品相同的體積量添加到上述樣品中，并在3(TC下?lián)u動(dòng)30分鐘。將樣品在離心力為1000g下離心15分鐘，然后收集有機(jī)溶劑層，以用于進(jìn)一步的分離程序。(4)用二氧化硅柱層析提取二飽和磷脂級(jí)分用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀(得自位于日本的Eyela公司)，將溶劑從有機(jī)溶劑初步提取所得到的樣品中蒸發(fā)出來(lái)，然后樣品再溶于氯仿中。將該樣品上柱于直徑與高度之比為1:5的填充有二氧化硅(Merck公司，230-400目)的柱中。在將樣品上柱前，用純氯仿預(yù)先清洗二氧化硅柱。為了除去有機(jī)溶劑(尤其是丙酮)中所溶解的膽固醇和表面活性蛋白并獲得二飽和磷脂級(jí)分，按以下次序使用溶劑體系。將樣品溶于氯仿中上柱后，依次使用純氯仿-純丙酮-純氯仿-氯仿與甲醇(體積比為9:1)的混合溶劑-氯仿與甲醇(體積比為4:1)的混合溶劑，并且以氯仿、甲醇和水(體積比為8:6:1)的混合溶劑作為最后的溶劑進(jìn)行洗脫?？扇苡谟袡C(jī)溶劑的表面活性蛋白和疏水多肽在操作早期階段的純丙酮和純氯仿洗脫時(shí)即被洗脫出來(lái)，而本發(fā)明所需要的二飽和磷脂級(jí)分被最后的溶劑體系洗脫下來(lái)。通過(guò)2D-TLC(二維薄膜層析法)，使用脂類標(biāo)準(zhǔn)品(可購(gòu)自Sigma公司)對(duì)該級(jí)分中的每一種磷脂成分進(jìn)行鑒定(參見圖1)。提取的二飽和磷脂中的主要成分是二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二棕櫚酰磷脂酰肌醇。(5)所提取的二飽和磷脂級(jí)分的后處理程序使從柱子提取的最終樣品通過(guò)具有3層的Whatman—號(hào)濾紙，然后用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀除去溶劑。將純乙醇添加到無(wú)溶劑的樣品中，然后用PVDF(聚偏二氟乙烯，孔徑為0.22pm，得自Millipore公司)過(guò)濾器過(guò)濾。再次使用蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉乙醇。將所得樣品用乙醇洗滌2次。剩余的痕量乙醇用冷凍干燥儀除去。將粉末狀的二飽和磷脂在-70x:下儲(chǔ)藏在填充有氮?dú)獾拿芊鈨?chǔ)藏容器中。實(shí)施例2:從牛的支氣管肺泡灌洗液中提取二飽和磷脂級(jí)分用牛代替豬，按照實(shí)施例1中所述的步驟(1)至(5)的方法從牛的支氣管肺泡灌洗液中獲得二飽和磷脂級(jí)分。實(shí)施例3:從健康豬的肺組織勻漿中獲得二飽和磷脂級(jí)分的方法U)動(dòng)物肺組織的初步勻質(zhì)化將取自健康豬的150g肺組織切成約2cmx2cm的大小。將700ml含有3mM二價(jià)陽(yáng)離子(氯化鈣)的經(jīng)冷卻的滲透性鹽溶液加入上述肺切塊中，然后用金屬葉片式攪拌器迸行勻質(zhì)化。在低轉(zhuǎn)速下進(jìn)行6次勻質(zhì)操作，每次20秒。在勻質(zhì)化過(guò)程中，要用冰水浴對(duì)攪拌器頻繁冷卻，以防止溫度升高。將肺組織在早期階段在沒有被完全勻質(zhì)化的條件下切成豆粒大小。(2)在不損失表面活性脂類的條件下從初步勻槳中除去血清的方法將所制備的初步勻漿在冰水浴中保持1小時(shí)，以便使血清易于從具有較大表面積的勻質(zhì)化組織中滲出，同時(shí)，使表面活性成分在二價(jià)離子(鈣離子，為3mM)存在的條件下聚集。將勻漿保持l小時(shí)后，用具有低加速旋轉(zhuǎn)功能的離心機(jī)在4'C、離心力為4,500g的條件下離心40分鐘。離心后，除了沉淀物和漂浮物(一些小的豆粒大小的肺組織，其為沒有被完全勻質(zhì)化的漂浮物，這是因?yàn)樗鼈兒锌諝?之外，含血清的溶液被除去。(3)將肺組織和表面活性脂類的沉淀物二次勻質(zhì)化將500mi含5mM二價(jià)陽(yáng)離子(鈣離子)的75mM氯化鈉溶液(鹽溶液濃度的一半)加入到無(wú)血清的肺組織初步勻槳中，然后用金屬葉片式攪拌器將組織進(jìn)行極微的勻質(zhì)化。在這一過(guò)程中，采用低滲溶液以容易獲得多層結(jié)構(gòu)，該多層結(jié)構(gòu)具有類似于在肺泡中的第二類表皮細(xì)胞中的表面活性脂類的貯存器的功能。勻質(zhì)化進(jìn)行6至8次，每次高速旋轉(zhuǎn)40秒，用冰水浴對(duì)攪拌器迸行經(jīng)常的冷卻，以防止在勻質(zhì)化過(guò)程中溫度的上升。將該二次勻漿樣品置于4"C保持1小時(shí)，以防止血液凝固蛋白凝固，同時(shí)，讓SP-A蛋白在鈣離子存在下與表面活性脂類發(fā)生聚集。用具有低加速旋轉(zhuǎn)功能的離心機(jī)，在4'C、離心力為4500g的條件下將樣品離心40分鐘。離心后，樣品了形成兩個(gè)顏色和質(zhì)地明顯不同的可區(qū)分的層。分離出沉淀物之上的上清層，使其經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑萃取程序，從而提取出二飽和磷脂。在將含有5mM鈣離子的鹽溶液再次加入底層中并使底層重新懸浮、然后按與上述相同的方式進(jìn)行離心時(shí)，可以提取出被結(jié)合到離心管的底層中的一定數(shù)量的表面活性脂類。收集沉淀物再次形成的頂層并使之與之前制備的樣品混合，然后使其經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑萃取程序。(4)獲得二飽和磷脂級(jí)分的方法重復(fù)實(shí)施例1中步驟(3)至(5)的方法，以從肺組織勻漿中獲得二飽和磷脂級(jí)分。實(shí)施例4:從健康牛的肺組織勻漿中獲得二飽和磷脂級(jí)分的方法除了用牛代替豬外，重復(fù)實(shí)施例3所述的方法，從而從牛的肺組織勻漿中獲得二飽和磷脂級(jí)分。試驗(yàn)例1:動(dòng)物試驗(yàn)l-l.誘發(fā)動(dòng)物肺中的血清蛋白的滲出使用高壓釜分別對(duì)玉米油(可購(gòu)自Sigma公司)和鹽溶液進(jìn)行滅菌處理。將500pl(微升)玉米油和1500^鹽溶液混合，然后劇烈地渦旋以得到均勻的懸浮液。將該懸浮液經(jīng)氣管內(nèi)施予Sprague-Dawley成年大鼠的肺中，從而誘導(dǎo)出大鼠肺部中的血清蛋白的滲出。為了研究安慰劑效應(yīng)，只將無(wú)菌鹽溶液經(jīng)氣管內(nèi)施予對(duì)照大鼠。施用2周后，使用麻醉劑克他命(得自韓國(guó)Yuhan有限公司)麻醉各組大鼠，然后立即用二氧化碳?xì)怏w將大鼠無(wú)痛致死。在處死試驗(yàn)動(dòng)物后，立即取出它們的肺，用總量為50ml的鹽溶液(含3mM的氯化鈣)灌洗鼠肺，從而收集到每只動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液。l-2.血清蛋白滲出的抑制或降低效果與所施用的本發(fā)明的組合物成分的試驗(yàn)按照上述相同的方法誘發(fā)動(dòng)物滲出血清蛋白，在動(dòng)物經(jīng)過(guò)誘發(fā)血清蛋白滲出程序l周后，將實(shí)施例l-4制備的含二飽和磷脂級(jí)分的組合物經(jīng)氣管內(nèi)施予動(dòng)物。在由氣管內(nèi)施用本發(fā)明的組合物1周后，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行肺部提取和支氣管肺泡灌洗。施用給大鼠的、以抑制或者減少肺內(nèi)血清蛋白滲出的組合物中，二飽和磷脂的濃度為30mg/ml、氯化鈣的濃度為1.5mM、檸檬酸鹽(檸檬酸三鈉鹽)的濃度為7.5mM而氯化鈉的濃度為125mM，并且組合物溶液的pH調(diào)節(jié)為6.0。在施予動(dòng)物前，將上述溶液劇烈地渦旋以形成均勻的懸浮液。l-3.對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的血清蛋白滲出的誘發(fā)和抑制的分析(1)從每個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物中制備樣品使用具有低加速離心功能的離心機(jī)，在4。C、離心力為4500g的條件下，將由各個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物組獲得的支氣管肺泡灌洗液離心30分鐘。只從沉淀物中收集在二價(jià)離子(鈣離子)存在下與SP-A發(fā)生聚集的表面活性劑層。在所收集的沉淀物中加入約3倍體積的鹽溶液(包括3mM的氯化鈣)，使沉淀物再次懸浮。在相同的離心力條件下將懸浮液離心，進(jìn)而形成小球。使用相同的溶液重復(fù)兩次上述洗滌程序，以清洗小球。將最后沉淀物的懸浮液分裝到lml微型離心管中，將沉淀物的體積調(diào)節(jié)到200^1。將1ml含有10mMEDTA(乙二胺四乙酸)的10mMTris緩沖鹽溶液(pH7.4，含有10mMTris-HCl禾Q140mMNaCl)加入到200iil上述表面活性劑沉淀物中，然后將該沉淀物懸浮在溶液中。將兩性離子洗滌劑CHAPS(得自位于美國(guó)的Amresco公司)一滴一滴加到上述溶液中，同時(shí)進(jìn)行輕微的振搖，直到懸浮液被CHAPS溶解。為了使樣品溶解，使用濃度為10%(重量/體積，約162mM)的CHAPS儲(chǔ)備溶液，而樣品中CHAPS的最終濃度為約65mM。(2)分析從上述程序中制備的每個(gè)樣品(2ml)中取出lml樣品，將其上樣到裝有SephacryS-400HR樹脂的層析柱(1.5cmx20cm，得自AmershamBioscience公司)中以分析蛋白的洗脫模式。采用GradiFrac(得自Pharmacia公司)層析系統(tǒng)進(jìn)行大小排阻層析。此時(shí)，在層析操作中作為流動(dòng)相使用的緩沖液為含有5mMEDTA、lmMCHAPS和140mMNaCl的lOmMTris緩沖液(pH7.4)。從由柱中洗脫出的蛋白質(zhì)的UV吸收譜(見圖2)中，通過(guò)比較含有SP-A(分子量為約700kDa)的峰的大小(量)以及含有白蛋白(分子量為約70kDa)的峰的大小，可以分別確定血清蛋白滲出的程度和被抑制的程度。1-4.動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于從誘發(fā)血清蛋白滲出的試驗(yàn)大鼠組中獲得的樣品、從施用本發(fā)明的組合物而使血清蛋白的滲出得到抑制的大鼠組中獲得的樣品、從只施用鹽溶液的大鼠組中獲得樣品以及從未處理的對(duì)照大鼠組中獲得的樣品，從這些樣品中的蛋白洗脫譜中，分別計(jì)算分子量為約700kDa的蛋白峰的大小與分子量為約70kDa的蛋白峰的大小的比值。從各組大鼠中獲得的兩個(gè)峰的大小(量)之比列于下表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從表1所示的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，含有二飽和磷脂級(jí)分(從健康動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中提取)作為主要成分的組合物減少了試驗(yàn)大鼠中血清蛋白的滲出。與誘發(fā)出血清蛋白滲出的大鼠所得的結(jié)果相比，當(dāng)從氣管內(nèi)只施用一次本發(fā)明的組合物時(shí)，含有白蛋白作為主要蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)所形成的峰減小了約50%。表1中所示的這種減少的量代表了由大小排阻層析法所設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)簡(jiǎn)單計(jì)算而得到的值。但是，滲出物實(shí)際減少的量遠(yuǎn)大于表1所示的計(jì)算值。其原因在于當(dāng)從正常大鼠中獲得支氣管肺泡灌洗液樣品時(shí)，通常平均獲得2-3ml沉淀物(體積/只)，然而，雖然沉淀物的量會(huì)根據(jù)個(gè)體的不同而具有較大的差異，但是血清蛋白滲出被誘發(fā)的大鼠中所獲得的沉淀物的量是從正常大鼠中獲得的沉淀物的量的3-5倍。然而，在使用本發(fā)明組合物使血清蛋白的滲出得到抑制的大鼠中所獲得的沉淀物的量與從對(duì)照大鼠中所獲得的沉淀物的量相同，或是多于從對(duì)照大鼠中所獲得的沉淀物的量的(至多)約2倍。也就是說(shuō)，這是表明，與血清蛋白滲出被誘發(fā)的大鼠相比，本發(fā)明的組合物能夠大大降低沉淀物的總量。然而，這些值沒有被定量地顯示在本文中，這是由于從試驗(yàn)大鼠中獲得的沉淀物的量可受到諸如試驗(yàn)溫度、肺組織的柔度(compliancy)、檢測(cè)者的技巧等的試驗(yàn)因素的較大影響。因此，圖2和表1所顯示的血清蛋白的減少不能體現(xiàn)蛋白質(zhì)的總量。它們只顯示了含有SP-A的峰的大小與含有血清白蛋白作為主要蛋白質(zhì)級(jí)分的峰的大小之間的比值。當(dāng)測(cè)量由本發(fā)明的組合物所減少的血清蛋白的總量(參見圖2(2)的B)時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)血清蛋白減少的效果非常顯著。從上述顯示的結(jié)果來(lái)看，發(fā)現(xiàn)用于抑制或降低血清蛋白滲出的二飽和磷脂的最理想的組合物是從健康動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液中分離得到的物質(zhì)。但是，在結(jié)果中，從去血的肺組織勻漿中獲得的二飽和磷脂級(jí)分也表現(xiàn)了幾乎相同的抑制血清蛋白滲出的效果。試驗(yàn)例2:對(duì)患有特應(yīng)性皮膚疾病的自愿者的試驗(yàn)2-1.在皮膚上施用本發(fā)明的組合物(1)組合物將采用豬肺勻質(zhì)方法獲得的二飽和磷脂級(jí)分用于本試驗(yàn)，所述的勻質(zhì)方法利用了通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子(鈣離子)使表面活性劑發(fā)生聚集的現(xiàn)象，并使用了孔徑為0.22nm的PVDF(聚偏二氟乙烯，孔徑為0.2pm，得自Millipore公司)過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將所述級(jí)分凍干。將一定濃度的干態(tài)二飽和磷脂在等滲鹽溶液中乳化，然后在高壓釜中滅菌。將氯化鈣儲(chǔ)備溶液、檸檬酸鹽(檸檬酸三鈉鹽)儲(chǔ)備溶液和甘油也分別在高壓釜中滅菌。將各個(gè)經(jīng)滅菌的成分(溶液)在無(wú)菌條件下混合，使得二飽和磷脂的濃度為15mg/ml、鈣離子的濃度為1.5mM、檸檬酸鹽(檸檬酸三鈉鹽)的濃度為7.5mM和甘油的濃度為10%(體積/體積比)，并且形成的溶液的pH為6.0。將甘油加入其中使其總濃度為10%，是為了使所述溶液具有一定的粘度試驗(yàn)使用。(2)施用在皮膚上施用的方法是在每個(gè)2cmx2cm的病變皮膚區(qū)域上，向下滴加(約30^d)溶液(如上所述)，然后輕柔地摩擦溶液，直到其被皮膚完全吸收。建議每天至少施用所述溶液2次。還建議，在施用所述組合物的期間，不要使用具有濃烈香味的化妝品或香皂，其可能含有具有芳香環(huán)的化學(xué)物質(zhì)。2-2-1.初次自愿者試驗(yàn)結(jié)果(肉眼觀察)針對(duì)自愿者的試驗(yàn)是在患有特應(yīng)性皮膚疾病的8個(gè)自愿者(5至40歲，平均年齡為33歲，4名男性和4名女性)身上的15個(gè)皮膚位置上進(jìn)行的。將組合物施用于皮膚上，時(shí)間為2至4周，該時(shí)間可根據(jù)皮膚狀況的嚴(yán)重程度和改善情況而定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在施用期間，所有試驗(yàn)自愿者的特應(yīng)性皮膚疾病的癥狀都得到改善，達(dá)到了難以分清先前病變皮膚區(qū)域的邊界的程度。觀察發(fā)現(xiàn)，在使用本發(fā)明的組合物后約3天，由于特應(yīng)性皮膚疾病的皮膚滲出物變干而導(dǎo)致的皮膚結(jié)殼在皮膚表面上不再形成。在患有特應(yīng)性紅斑的自愿者中，在使用本發(fā)明的組合物后1周，其癥狀消失，以致于不能區(qū)分出特應(yīng)性皮膚疾病的病變區(qū)域的邊緣。對(duì)于有皮膚壞疽(皮膚潰瘍)的并發(fā)癥的病人而言，己經(jīng)證實(shí)，在施用本發(fā)明的組合物后3.5周(約25天)，傷痕完全康復(fù)(參見圖3)。2-2-2.二次自愿者的試驗(yàn)結(jié)果(肉眼觀察)另一針對(duì)自愿者的試驗(yàn)是在27位患有特應(yīng)性皮膚疾病的自愿者(0.8至42歲，平均年齡為23.4歲，13名男性和14名女性)中進(jìn)行的。將組合物施用到皮膚上，時(shí)間為2至5周。除5位自愿者(其原始病變的皮膚區(qū)域的邊界達(dá)到難以區(qū)分的程度)以外，有25位自愿者的特應(yīng)性皮膚疾病的癥狀得到改善。2位分別在面部和背部患有特應(yīng)性皮膚疾病并發(fā)癥和嚴(yán)重的痤瘡癥狀的患者，其癥狀沒有得到明顯的改善。3位由于特應(yīng)性皮膚疾病的發(fā)病時(shí)間非常長(zhǎng)而使皮膚形成了非常厚的角質(zhì)化區(qū)域的自愿者，在施用本發(fā)明的組合物期間，皮膚狀況略有改善。25位皮膚癥狀具有明顯改善的自愿者中，有3位在使用本發(fā)明的組合物過(guò)程中，由于觀察到其發(fā)生了皮膚感染，而患者本身不能抵抗感染，因此需要使用抗菌藥膏對(duì)皮膚進(jìn)行處理。顯示皮膚狀況改善結(jié)果的的照片示于圖4-7中。工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明含有二飽和磷脂的組合物在治療或減輕由皮膚和粘膜中的血清蛋白的滲出而引起的特應(yīng)性疾病等的癥狀中具有明顯的效果。權(quán)利要求1.一種用于治療和減輕表現(xiàn)為血清蛋白滲出的疾病的組合物，該組合物含有二飽和磷脂作為有效成分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的二飽和磷脂是從動(dòng)物中提取的。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的二飽和磷脂是從牛和豬中提取的。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述的二飽和磷脂是從支氣管肺泡灌洗液或肺組織勻漿中提取的。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的二飽和磷脂是以二棕櫚酰磷脂酰膽堿和/或二棕櫚酰磷脂酰肌醇作為主要構(gòu)成成分。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其還包含鈣離子和具有羧基的有機(jī)酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其還包含甘油。8.—種用于治療皮膚疾病的組合物，該組合物包含權(quán)利要求1所定義的組合物。9.一種包含權(quán)利要求1所定義的組合物的化妝品組合物。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的二飽和磷脂的濃度為lmg/ml到700mg/ml。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的與血清蛋白滲出相關(guān)的疾病選自特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性濕疹、皮膚瘙癢、特應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性紅斑或紅皮癥、接觸性皮炎、哮喘及慢性阻塞性肺疾病。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于減少血清蛋白滲出的組合物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的組合物涉及一種通過(guò)減少皮膚及粘膜中的血清蛋白滲出而改善諸如特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性濕疹、皮膚瘙癢、特應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性紅斑或紅皮癥、接觸性皮炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等之類的癥狀的組合物。文檔編號(hào)A61K31/683GK101155589SQ200680006372公開日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日發(fā)明者崔性鉉申請(qǐng)人:崔性鉉;Kt&G公司