專利名稱：含有由氨基和苯基取代的環(huán)烷基和5元雜環(huán)的1-磷酸鞘氨醇激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為受體激動(dòng)劑對(duì)一種或多種S1P受體(特別是S1P1、S1P4和S1P5受體類型)具有活性的1-磷酸鞘氨醇(S1P)類似物。本發(fā)明化合物包括具有磷酸根部分的化合物和具有抗水解的磷酸根替代物例如膦酸根、α-取代的膦酸根(特別當(dāng)所述α-取代基為鹵素的情況下)以及硫代磷酸根的化合物。
在S1P受體激動(dòng)劑或其藥學(xué)上可接受的鹽的一個(gè)實(shí)施方案中，其具有下式(IIA)的一般結(jié)構(gòu)
其中，n為0、1、2或3；X選自羥基(-OH)、磷酸根(-OPO3H2)、膦酸根(-CH2PO3H2)、α-取代的膦酸根(包括-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2、-C＝OPO3H2)， 其中R1選自氫、鹵素(其中F或C1為優(yōu)選的鹵素)、(C1-C6)烷基組成的組，例如甲基、乙基和丙基，或鹵素、羥基、烷氧基、氰基取代的(C1-C6)烷基，例如三氟甲基。
R2基團(tuán)選自烷基、烯基、炔基、烷基取代的芳基、烷基取代的環(huán)烷基、芳烷基和芳烷基取代的芳基組成的組。在R2中，5-8個(gè)碳原子的鏈長度為優(yōu)選。
本發(fā)明還提供了式(II)的任何化合物的酯，例如磷酸酯，其中可添加酯官能度以形成增加口服利用度的前藥。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(II)的所述化合物可具有選自以下組的R1H、鹵素(優(yōu)選F或Cl)、甲基、三氟甲基、乙基、丙基或其他低級(jí)烷基(C1-C6)，或鹵素、羥基、烷氧基、氰基取代的低級(jí)烷基；且R2選自烷基、烯基、炔基、烷基(任選取代的芳基)、烷基(任選取代的環(huán)烷基)、芳烷基以及優(yōu)選具有5-8個(gè)碳原子長度的芳烷基(任選取代的芳基)組成的組。
S1P受體拮抗劑前藥(優(yōu)選S1P1受體類型選擇性拮抗劑)的潛在用途包括，但不限于 改變淋巴細(xì)胞運(yùn)輸，作為下述自身免疫性疾病的治療方法例如眼葡萄膜炎、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病，以及更特別地多發(fā)性硬化癥。多發(fā)性硬化癥的“治療”包括該疾病的多種形式，包括復(fù)發(fā)緩解型、慢性進(jìn)展型等，且S1P受體拮抗劑可單獨(dú)使用或聯(lián)合緩解該疾病的體征和癥狀的其他制劑使用以及預(yù)防性使用。
另外，本發(fā)明化合物可用于改變淋巴細(xì)胞運(yùn)輸，所述改變淋巴細(xì)胞運(yùn)輸是一種延長同種異體移植物存活時(shí)間的方法，例如用于實(shí)質(zhì)器官移植、移植物抗宿主疾病的治療、骨髓移植等。
另外，本發(fā)明化合物可用于抑制自分泌運(yùn)動(dòng)因子(autotaxin)。自分泌運(yùn)動(dòng)因子——一種血清磷酸二酯酶，已經(jīng)被證明可進(jìn)行終產(chǎn)物抑制。自分泌運(yùn)動(dòng)因子水解幾種底物產(chǎn)生溶血磷脂酸和1-磷酸鞘氨醇，且涉及癌癥進(jìn)展和血管發(fā)生。因此，S1P受體激動(dòng)劑前藥例如VPC01091可用于抑制自分泌運(yùn)動(dòng)因子。該活性可與對(duì)S1P受體的激動(dòng)聯(lián)合或不依賴于該活性。
另外，本發(fā)明化合物可用于抑制S1P裂解酶。S1P裂解酶是不可逆性降解S1P的細(xì)胞內(nèi)酶。S1P裂解酶的抑制破壞淋巴細(xì)胞運(yùn)輸，并伴有淋巴細(xì)胞減少。因此，S1P裂解酶抑制劑可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。因此，前藥例如VPC01091可用于抑制S1P裂解酶。該抑制作用可與S1P受體活性一致，或可不依賴于對(duì)任何S1P受體的活性。
多發(fā)性硬化癥的“治療”包括該疾病的多種形式，包括復(fù)發(fā)緩解型、慢性進(jìn)展型等，且S1P受體激動(dòng)劑可單獨(dú)使用或聯(lián)合緩解該疾病的體征和癥狀的其他制劑使用以及預(yù)防性使用。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明化合物的藥物組合物。更具體地，所述化合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)上可接受的載體、填充劑、增溶劑和穩(wěn)定劑配制成藥物組合物。例如，如本文所描述的含有本發(fā)明化合物或其類似物、衍生物或改性物的組合物用于將合適的所述化合物給藥于受治療者。
本發(fā)明化合物可用于治療疾病或病癥，包括給具有相應(yīng)需要的受治療者給予治療可接受量的式(I)的化合物，或含有治療有效量的式(I)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
低級(jí)烷基的具體取值是乙基或丙基。
鹵素的具體取值是氟或氯。
X的具體取值是羥基或OPO3H2。
α-取代的膦酸根包括-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2、-C＝OPO3H2或硫代磷酸酯根(OPO2SH2)。
R1的具體取值為氫。
R2的具體取值為具有5-8個(gè)碳原子長度的烷基。
R2的更具體的取值為庚基、辛基、壬基、-O-庚基、-C(＝O)庚基或CH3-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-。
R2中烷基的更具體的取值為辛基或-O-庚基。
R2中烷基的更具體的取值為辛基。
n的具體取值為1或2。
具有雙鍵的具體環(huán)烷基包括
本發(fā)明具體化合物具有位于環(huán)烷基環(huán)對(duì)位的R2基團(tuán)。
本發(fā)明具體化合物具有位于R2鄰位或間位的R1基團(tuán)。
本發(fā)明具體化合物具有位于芐基環(huán)烷基的對(duì)位(即1，4)的R2基團(tuán)。
本發(fā)明化合物的酯的非限制性實(shí)例包括其中X基團(tuán)為下述基團(tuán)的化合物
其中Y選自O(shè)、CH2、CHOH、CHF、CF2和

成的組；以及 R9和R10獨(dú)立地選自烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基，


O-R11，

以及

組成的組； 其中，R11選自C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基以及任選取代的芳基組成的組。特別優(yōu)選的R9和R10為烷氧基，

以及
在

圖1中的流程中提供了制備VPC01091和VPC01211的合成途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用已知的對(duì)所述流程的操作方法和本文具體實(shí)施例中的詳細(xì)說明改進(jìn)的技術(shù)來制備式(I)或式(II)的其他化合物。
本發(fā)明式(II)的具體化合物為VPC01091，其中X為OH，R1為氫，R2為辛基(C8H17)，n為2，且R2基團(tuán)在苯環(huán)的對(duì)位。該式為
本發(fā)明式(II)的具體化合物為VPC02162，其中X為OH，R1為氫，R2為辛基(C8H17)，n為2，且R2基團(tuán)在苯環(huán)的間位，該式為
本發(fā)明還包括下列異構(gòu)體


以及
這些化合物可以配制為混合物并通過色譜方法分離。分離的合適條件如下柱Chiralpak AD 4.6 mmID x 250mm；流動(dòng)相Hex/EtOH/MeOH/DEA＝95/2.5/2.5/0.03；流速1mL/min；檢測器UV 220nm；柱溫40℃；或柱溫25℃。分離之后，發(fā)現(xiàn)兩種異構(gòu)體在體外未被SPHK2酶磷酸化。然而，當(dāng)測試之前磷酸化時(shí)，發(fā)現(xiàn)磷酸化的化合物為S1P受體的有效激動(dòng)劑。
本發(fā)明式(II)的另一具體化合物為VPC01211，其中X為OPO3H2，R1為氫，R2為辛基(C8H17)，n為2，且R2基團(tuán)在苯環(huán)的對(duì)位，該式為
本發(fā)明式(II)的另一具體化合物為VPC02164，其中X為OPO3H2，R1為氫，R2為辛基(C8H17)，n為2，且R2基團(tuán)在苯環(huán)的間位，該式為
在環(huán)烷基環(huán)中包括雜原子(例如N、S、O)和/或雙鍵的本發(fā)明化合物的其他實(shí)例包括以下結(jié)構(gòu)

或
具有通式(III)的式(I)或式(II)的其他化合物在下文描述。具體的變化形式在表1中描述
表1 本發(fā)明還提供了式(I)或式(II)的化合物的酯，其中所述酯的形成可將所述化合物轉(zhuǎn)化為增強(qiáng)給藥的前藥，例如增加口服利用度。另外，本發(fā)明還提供了式(I)或式(II)的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。另外，本發(fā)明提供了式(I)或式(II)所述的結(jié)構(gòu)的所有可能的異構(gòu)體，注意當(dāng)n為1時(shí)(環(huán)丁烷基)，所述化合物為對(duì)稱的，并缺少手性中心，但存在順式和反式形式。
含有本發(fā)明一種或多種化合物的藥物組合物可通過任何數(shù)目的途徑和方法給藥于需要相應(yīng)治療的受治療者，所述途徑和方法包括，但不限于局部、口服、口腔、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道、眼、肺或直腸途徑?？诜緩酵ǔ?yīng)用于需要本發(fā)明化合物的大多數(shù)情況中。優(yōu)選靜脈內(nèi)注射或輸注給藥用于急性治療。對(duì)于維持方案，口服或胃腸外，例如肌肉內(nèi)或皮下途徑為優(yōu)選。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了含有本發(fā)明化合物或其類似物、衍生物或改性形式和白蛋白的組合物，更特別地，所述組合物含有本發(fā)明化合物、藥學(xué)上可接受的載體和0.1-1.0％白蛋白。白蛋白作為緩沖劑起作用并改進(jìn)所述化合物的溶解性。一方面，不添加白蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可進(jìn)行可用于實(shí)施本發(fā)明的藥物組合物的給藥以遞送1ng/kg/天至100mg/kg/天的劑量。在另一實(shí)施方案中，可進(jìn)行可用于實(shí)施本發(fā)明的藥物組合物的給藥以遞送1ng/kg/天至100g/kg/天的劑量。
有用的藥學(xué)上可接受的載體包括，但不限于甘油、水、鹽水、乙醇和其他藥學(xué)上可接受的鹽溶液，例如磷酸鹽及有機(jī)酸鹽。這些和其他藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991，MackPublication Co.，New Jersey)中有所描述。
可以以無菌注射液或油懸浮液或溶液的形式制備、包裝或銷售藥物組合物。這種懸浮液或溶液可根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行制備，并且除活性成分外，還含有其他成分，例如本文所述的分散劑、濕潤劑或懸浮劑。這種無菌注射制劑可使用無毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑制備，例如水或1，3-丁二醇。其他可接受的稀釋劑和溶劑包括，但不限于林格氏液、等滲氯化鈉溶液、非揮發(fā)性油例如合成的單甘酯或甘油二酯。
可以配制使用本文所述任何方法鑒定的化合物并將其給藥于受治療者用于治療本文所述的任何疾病和病癥。然而，本發(fā)明化合物的用途不應(yīng)解釋為僅包括本文所述的疾病和病癥。優(yōu)選地，所述受治療者為人。
本文所述的藥物組合物的制劑可通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的或?qū)黹_發(fā)的任何方法來制備。一般來講，這些制備方法包括將活性成分引入與載體或一種或多種其他輔助成分合并，且然后，如果有必要或需要，將所述產(chǎn)物成形或包裝成所需的單劑量或多劑量單位。
盡管本文提供的藥物組合物的說明原則上是針對(duì)適于符合倫理道德地給藥于人的藥物組合物，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這些組合物通常適于給藥于所有種類的動(dòng)物。
為使所述組合物適于給藥于各種動(dòng)物的適于給藥于人的藥物組合物的改性為熟知的，且獸醫(yī)藥理學(xué)的普通技術(shù)人員可設(shè)計(jì)且僅使用普通實(shí)驗(yàn)實(shí)施這種改性。所考慮的可進(jìn)行本發(fā)明藥物組合物的給藥的受治療者包括，但不限于人和其他脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物，包括商業(yè)上有關(guān)的哺乳動(dòng)物，例如牛、豬、馬、綿羊、貓和狗。
本發(fā)明的藥物組合物可以作為單一單位劑量大體積或作為多個(gè)單一單位劑量制備、包裝或銷售。如本文所使用，“單位劑量”為含有預(yù)定量的活性成分的分離量的藥物組合物。所述活性成分的量通常等于給藥于受治療者的活性成分的劑量或這種劑量的合適部分，例如這種劑量的1/2或1/3。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分、藥學(xué)上可接受的載體以及任何其他成分的相對(duì)量，將根據(jù)其性質(zhì)、大小以及所治療的受治療者的病情且還根據(jù)給予所述組合物的途徑而不同。舉例來說，所述組合物可含有0.1％-100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分，本發(fā)明的藥物組合物還含有一種或多種其他藥物活性成分。特別考慮的其他成分包括止吐劑和清除劑例如氰化物清除劑和氰酸鹽清除劑。
本發(fā)明藥物組合物的控釋或緩釋制劑可使用傳統(tǒng)技術(shù)制備。
在某些情況中，所使用的劑型可作為一種或多種活性成分的緩釋或控釋形式使用例如羥丙基纖維素、其他聚合物基質(zhì)、凝膠、可滲透的膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒、脂質(zhì)體或微球體或它們的組合形式來提供以提供不同比例的所需釋放模式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的合適的控釋制劑(包括本文所述的那些)可容易地被選擇用于與本發(fā)明的藥物組合物一起使用。因此，本發(fā)明包括適于控釋的適于口服給藥的單一單位劑量形式，例如片劑、膠囊、軟膠囊和小膠囊。
大多數(shù)控釋制劑被設(shè)計(jì)成最初釋放迅速產(chǎn)生所需治療作用的藥物量，并逐漸和持續(xù)釋放其他量藥物以在延長的時(shí)間段維持該水平的治療作用。為了在體內(nèi)維持藥物的該恒定水平，藥物必須以將取代正被代謝并從機(jī)體排泄的藥物的量的速率從該劑型釋放。
活性成分的控釋可受多種誘因刺激，例如pH、溫度、酶、水或其他生理?xiàng)l件或化合物。
本發(fā)明藥物制劑的粉末和顆粒制劑可使用已知方法制備。這些制劑可直接給藥于受治療者，所述制劑可用于例如形成片劑、填充膠囊或通過添加水載體或油載體制備水懸浮液或油懸浮液或溶液。這些制劑各自還可以進(jìn)一步含有一種或多種分散劑或濕潤劑，懸浮劑和防腐劑。其他賦形劑，例如填充劑和甜味劑、調(diào)味劑或著色劑也可包括在這些制劑中。
如本文所使用，“油”液體是含有包含碳的液體分子并表現(xiàn)比水極性小的特征的液體。
適于口服給藥的本發(fā)明的藥物組合物的制劑可以作為離散的固體劑量單位制備、包裝或銷售，所述固體劑量單位包括，但不限于片劑、硬膠囊或軟膠囊、扁膠囊、含片、或錠劑，各自含有預(yù)定量的活性成分。適于口服給藥的其他制劑包括，但不限于粉末或顆粒制劑，水或油懸浮液、水或油溶液、糊劑、凝膠、牙膏、漱口劑、包衣、口服灌洗劑或乳劑。術(shù)語口服灌洗劑和漱口劑在本文可互換使用。
含有所述活性成分的片劑可通過例如將活性成分任選與一種或多種其他成分一起壓制或模制而制備。壓制片劑可通過于合適的裝置中將以自由流動(dòng)形式的活性成分例如粉末或顆粒制劑任選與一種或多種粘合劑、潤滑劑、賦形劑、表面活性劑和分散劑一起混合壓制而制備。模制的片劑可通過于合適的裝置中，模制活性成分、藥學(xué)上可接受的載體的混合物和至少足夠潤濕所述混合物的液體而制備。用于制備片劑的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括，但不限于惰性稀釋劑，?；瘎┖捅澜鈩?、粘合劑和潤滑劑。已知的分散劑包括，但不限于馬鈴薯淀粉和淀粉乙醇酸鈉。已知的表面活性劑包括，但不限于十二烷基硫酸鈉。已知的稀釋劑包括但不限于碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、微晶纖維素、磷酸鈣、磷酸氫鈣以及磷酸鈉。已知的粒化劑和崩解劑包括但不限于玉米淀粉和藻酸。已知的粘合劑包括，但不限于明膠、阿拉伯膠、預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基甲基纖維素。已知的潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、二氧化硅和滑石。
片劑可以為非包衣的，或可使用已知方法包衣以在受治療者胃腸道中達(dá)到延遲的崩解，由此提供活性成分的持續(xù)釋放和吸收。舉例來說，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可用于對(duì)片劑進(jìn)行包衣。還舉例來說，片劑可使用美國專利第4,256,108、4,160,452和4,265,874號(hào)所述的方法進(jìn)行包衣以形成滲透控釋的片劑。片劑還可以含有甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑或它們的某些組合，以提供藥學(xué)上美觀適口的制劑。
含有所述活性成分的硬膠囊可使用生理上可降解的組合物例如明膠來制備。這種硬膠囊含有活性成分，并還可以含有其他成分，包括，例如惰性固體稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土。
含有所述活性成分的軟膠囊可使用生理上可降解的組合物例如明膠來制備。這種軟膠囊含有所述活性成分，其可以與水或油基質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油一起混合。
適于口服給藥的本發(fā)明的藥物組合物的液體制劑可以以液體形式或在使用前使用水或其他合適載體重溶的干制品來制備、包裝或銷售。
注射劑可以單位劑型例如安瓿或含有防腐劑的多個(gè)劑量容器制備、包裝或銷售。胃腸外給藥的制劑包括但不限于油或水載體中的懸浮劑、溶液、乳劑，糊劑和可植入的緩釋或可生物降解的制劑。所述制劑還可含有一種或多種其他成分，包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑或分散劑。在用于胃腸外給藥的制劑的一個(gè)實(shí)施方案中，以干燥形式(即粉末或顆粒)提供所述活性成分，使用合適的載體(如無菌無熱原水)重溶所述干燥形式，然后胃腸外給予所重溶的組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可以以適于口腔給藥的形式來制備、包裝或銷售。合適的制劑可以以例如片劑或錠劑形式使用給藥傳統(tǒng)方法制備，且可以含有例如0.1-20％(w/w)活性成分、含有口服可溶解或可降解的組合物的平衡液以及任選地一種或多種本文所述的其他成分?？蛇x地，適于口腔給藥的制劑可以包括粉末或霧化或噴霧溶液或含有所述活性成分的懸浮液。這些粉末、霧化或噴霧制劑，當(dāng)被分散時(shí)，優(yōu)選具有約0.1至約200納米范圍的平均顆粒或微滴大小，并還可含有一種或多種本文所述的其他成分。
如本文所使用，“其他成分”包括，但不限于一種或多種以下成分賦形劑、表面活性劑、分散劑、惰性稀釋劑、粒化劑和崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑、生理上可降解的組合物例如明膠、水載體和溶劑、油載體和溶劑、懸浮劑、分散劑或濕潤劑、乳化劑、粘滑劑、緩沖劑、鹽、增稠劑、填充劑、乳化劑、抗氧化劑、抗生素、抗真菌劑、穩(wěn)定劑和藥學(xué)上可接受的聚合或疏水材料。見Genaro，ed.，1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，通過引用并入本文。
所述化合物可以每天幾次頻繁地給藥于受治療者，或其可較不頻繁地給藥，例如每天一次，每周一次，每兩周一次，每月一次，或甚至更不頻繁，例如每幾個(gè)月一次或甚至每年一次或更不頻繁。給藥的頻率將容易地為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，且將依賴于任何數(shù)量的因素，例如，但不限于所治療的疾病的類型和嚴(yán)重性，受治療者的種類和年齡，等。
本發(fā)明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包括填充有本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分的一個(gè)或多個(gè)容器。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種用于治療需要免疫調(diào)節(jié)的受治療者的試劑盒。優(yōu)選地，所述受治療者是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一種或多種本發(fā)明的S1P類似物且還可以包括一種或多種已知的免疫抑制劑。這些藥物制劑可包裝于多種容器中，例如管形瓶、試管、微量滴定微孔板、小瓶等。其他試劑可以包括在分開的容器中并使用試劑盒提供，例如陽性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、緩沖劑、細(xì)胞培養(yǎng)基等。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括使用說明書。
盡管類似或等同于本文所述的那些方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中，本文中描述了優(yōu)選的方法和材料。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解本發(fā)明將很好地適于實(shí)踐所述目標(biāo)并獲得所提到的終點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)以及其中固有的那些。本發(fā)明可以在不背離其精神或基本性質(zhì)的情況下以其他特定形式實(shí)施。
實(shí)施例 現(xiàn)在參照下列實(shí)施例來描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅為了說明的目的，且本發(fā)明決不應(yīng)理解為限制這些實(shí)施例，而應(yīng)解釋為包括作為本文提供的教導(dǎo)結(jié)果而顯而易見的任何和所有變化形式。
實(shí)施例1(1-氨基-3-(4-辛苯基)環(huán)戊基)甲醇(6) A3-(4-碘代苯基)環(huán)戊酮(1) 在N2氛圍下將0.23g醋酸鈀(II)(0.1當(dāng)量)和0.23g氯化銻(III)(0.1當(dāng)量)添加至80mL含有0.82g(10mmol)2-環(huán)戊-1-酮、2.48g(10mmol)4-碘代苯硼酸和1.6g(20mmol)醋酸鈉的醋酸溶液。在25℃下攪拌24小時(shí)之后，過濾去除黑色沉淀并使用250mL鹽水稀釋過濾液，然后使用50mL二氯甲烷提取兩次。使用飽和的NaHCO3溶液攪拌有機(jī)提取物30min，然后使用鹽水洗滌并經(jīng)MgSO4干燥。去除溶劑得到黃色油狀物，使用快速柱(氯仿)進(jìn)一步純化得到1.92g(67％)白色固體產(chǎn)物。J.Org.Chem.，1995，60，883-888。
1H NMR(CDCl3)δ7.63(d，2H，ArH)，7.00(d，2H，ArH)，3.35(m，1H，ArCHCC)，2.7-1.8(m，6H，環(huán)戊基)； 13C NMR(CDCl3)δ218，143，138，129，95，46，42，39，31。
B.3-(4-辛-1-炔基)苯基)環(huán)戊酮(2) 將1.1g(10mmol)1-辛炔添加至裝有10mL含有1.43g(5mmol)1的THF溶液的火焰干燥的25mL燒瓶中。脫氣30min之后，在N2保護(hù)下添加2mL三乙胺、5mg CuI和10mg Pd(PPh3)4。反應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)完成，去除溶劑和揮發(fā)性試劑之后，使用氯仿將混合物進(jìn)行柱純化得到1.34g(99％)黃色油狀物。
1H NMR(CDCl3)δ7.35(d，2H，ArH)，7.15(d，2H，ArH)，3.37(m，IH，ArCHCC)，2.7-2.2(m，6H，環(huán)戊基)，1.95(m，2H，CCCH2CH2)，1.6-1.2(m，8H，CH2)，0.89(t，J＝6Hz，2H，CH3)； 13C NMR(CDCl3)δ220，143，132，127，122，91，80，46，42，39，32，31，29，29，23，20，14。
C3-(4-辛苯基)環(huán)戊酮(3) 將幾滴甲酸和催化量5％Pd/C添加入裝有10mL甲醇和1.34g(5mmol)2的25mL燒瓶中。使用H2沖洗該反應(yīng)容器3次，然后裝上H2氣囊。兩天的氫解之后，通過二氧化硅墊過濾洗滌溶質(zhì)，然后濃縮得到黃色油狀物。收集1.32g(98％)產(chǎn)物。
1H NMR(CDCl3)δ7.18(s，4H，ArH)，3.38(m，IH，ArCHCC)，2.60(t，2H，CCCH2CH2)，2.45-1.91(m，6H，環(huán)戊基)，1.64-1.15(m，12H，CH2)，0.90(t，3H，CH3)； 13C NMR(CDCl3)δ220，142，140，129，127，46，42，39，36，32，32，32，30，30，29，23，14。
D.1-氨基-3-(4-辛苯基)環(huán)戊烷腈(4) 將3.20g(11.8mmol)、1.15g(23.5mmol)氰化鈉和1.25g(23.5mmol)氯化銨添加至20mL氫氧化銨中?；旌衔锝?jīng)劇烈過夜攪拌之后，使用10mL二氯甲烷提取兩次。干燥并濃縮有機(jī)提取物得到3.30g黃色油狀物。粗產(chǎn)物在未進(jìn)一步純化的情況下用于下一步驟。J.Med.Chem.，1986，29，1988-1995。
E.1-氨基-3-(4-辛苯基)環(huán)戊烷羧酸(5) 將3.3g(11.2mmol)和50mL濃鹽酸加熱至70℃并過夜攪拌。將所得到的澄清水溶液蒸發(fā)至干燥。添加10mL水并再次干燥。重復(fù)該過程幾次。使用水和乙酮洗滌粗產(chǎn)物得到白色細(xì)粉末。得率為1.7g(45％)。
1H NMR(d6-DMSO)δ7.25-7.06(m，4H，ArH)9 3.21(m，IH，ArCHCC)，2.38-1.62(m，6H，環(huán)戊基)，1.49-1.20(m，14H，CH2)，0.81(t，J＝6Hz，3H，CH3)； 13C NMR(d6-DMSO)δ175，141，140，64，51，46，45，44，36，35，35，34，32，32，29，29，23，15。
F.(1-氨基-3-(4-辛苯基)環(huán)戊基)甲醇(6) 將63.4mg(0.2mmol)5和27mg(0.6mmol)硼氫化鈉溶解于3mLTHF。將該溶液冷卻至0℃之后，將51mg(0.2mmol)I2溶解于1mL THF并逐滴添加。然后，給該容器裝配冷凝器并在N2下回流反應(yīng)混合物5小時(shí)。使用甲醇淬滅過量的NaBH4。去除溶劑之后，添加2mL水和5mL二氯甲烷，攪拌混合物約1小時(shí)直至有機(jī)層變澄清。收集有機(jī)相，使用二氯甲烷再提取水相兩次。將合并的有機(jī)提取物進(jìn)行干燥并濃縮，得到43mg(71％)粗產(chǎn)物。于TLC上使用甲醇/氯仿(5∶95)進(jìn)一步純化得到13mg澄清油狀物。J.Org.Chem.，1993，58，3568-3571. 1H NMR(CD3OD)δ7.11(m，4H，ArH)，3.80(t，J＝7.5Hz，IH，環(huán)戊基-CH2O)，3.67(t，J＝7.5Hz，IH，環(huán)戊基-CH2O)，3.01(m，IH，ArCHCC)5 2.55(t，J＝7.5Hz，2H，ArCH2)，2.29-1.69(m，6H，環(huán)戊基)，1.57(m，2H，ArCH2CH2)，1.38-1.28(m，10H，CH2)，0.89(t，J＝7.5Hz，3H，CH3)； 13C NMR(CD3COCD3)δ141，128，127，96，45，44，43，35，35，33，33，32，32，29，29，29，23，13。
實(shí)施例2(1-氨基-3-(4-辛苯基)環(huán)戊基)甲基二氫磷酸酯(7) (1-氨基-3-(4-辛苯基)環(huán)戊基)甲基二氫磷酸酯(7) 將1mL 85％H3PO4緩慢滴加入0.5g的P2O5，中，然后在N2保護(hù)下，于100℃將酸-酐混合物加熱1小時(shí)。將另外的0.5g的P2O5和30mg 6添加入聚磷酸中并于100℃加熱5小時(shí)。冷卻至室溫后，將10mL冰水添加至反應(yīng)混合物中。產(chǎn)物作為白色固體沉淀出。收集產(chǎn)物并使用水洗滌。真空干燥之后收集31mg(82％)綠色產(chǎn)物。MS僅兩個(gè)峰M+1＝384.4與304.4(水解回6)。
實(shí)施例3GTPγS-35結(jié)合測定 該測定說明了在分離中G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的激動(dòng)劑活性。該測定通過使用編碼各蛋白的四種質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞來促使重組GPCR(如S1P1-5受體)和異源三聚體G蛋白的三種亞單位(通常為α1、β2、γ3)各自在所述細(xì)胞中的伴隨表達(dá)。轉(zhuǎn)染后約60小時(shí)，收獲、破碎細(xì)胞，并拋棄細(xì)胞核。這允許從殘留物制備粗的微粒體。微粒體上G蛋白受體復(fù)合物的激動(dòng)劑(例如S1P)刺激導(dǎo)致α亞單位上以劑量依賴方式將GTP轉(zhuǎn)換為GDP。為檢測GTP結(jié)合的α亞單位，使用了GTP類似物(GTPγS-35)，其為放射性核素(硫-35)標(biāo)記的硫代磷酸酯，不被水解為GDP。通過過濾收集帶有附著的G蛋白的微粒體，并在液體閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)結(jié)合的GTPγS-35進(jìn)行定量。測定得到相對(duì)效力(EC50值)和最大作用(功效，Emax)。在固定量的拮抗劑的存在下于激動(dòng)劑劑量-反應(yīng)曲線中測出拮抗劑活性為右移。如果拮抗劑競爭性地起作用，可測定受體/拮抗劑對(duì)(Kj)的親和力。
在該測定中，所有VPC01091異構(gòu)體的磷酸化形式以及磷酸化的VPC01091(VPC01211，CA5-P)本身為陰性，或?yàn)镾1P3受體的反激動(dòng)劑，并相對(duì)于S1P為S1P1受體的部分激動(dòng)劑(即不完全有效)。反激動(dòng)劑為拮抗劑，即，它們將干擾激動(dòng)劑配體的結(jié)合，但不激發(fā)受體的活化。
VPC01211(CA5-P)和環(huán)己基(CA6-P)類似物為S1P1受體(圖6)的部分激動(dòng)劑，對(duì)S1P2受體(圖7和8)和S1P3受體(圖9)無活性。這些化合物為S1P4受體(圖10)的完全激動(dòng)劑和S1P5受體(圖11)的部分激動(dòng)劑。環(huán)己基化合物(CA4-9)對(duì)S1P1受體具有非常小的激動(dòng)劑活性，但具有與環(huán)戊基和環(huán)己基化合物相似的活性。
評(píng)估了1-磷酸鞘氨醇(S1P)，VPC01211(磷酸化的VPC01091)和VPC01211的四種組分異構(gòu)體對(duì)重組的人1型S1P(S1P1)受體(圖16)的作用。該測定按照Davis，M-D.，JJ.Clemens，T.L.Macdonald and K.R.Lynch(2005)“S1P Analogs as Receptor Antagonists”Journal of BiologicalChemistry，vol.280，pp.9833-9841中所述進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)中的所述化合物的效力等級(jí)次序(EC50)為異構(gòu)體1＞異構(gòu)體3＞異構(gòu)體4＞異構(gòu)體2＞S1P＞VPC01211。通過對(duì)VPC01091的各異構(gòu)體進(jìn)行化學(xué)磷酸化來制備異構(gòu)體。
評(píng)估了1-磷酸鞘氨醇(S1P)，VPC01211(磷酸化的VPC01091)和VPC01211的四種組分異構(gòu)體對(duì)重組的人3型S1P(S1P3)受體(圖17)的作用。該測定按照Davis，M.D.，JJ.Clemens，T.L.Macdonald and K.R.Lynch(2005)“S1P Analogs as Receptor Antagonists”Journal of BiologicalChemistry，vol.280，pp.9833-9841中所述進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)中的所述化合物的效力等級(jí)次序(EC50)為S1P＞異構(gòu)體2＞VPC01211＞異構(gòu)體4＞異構(gòu)體1＞異構(gòu)體3。通過對(duì)VPC01091的各異構(gòu)體進(jìn)行化學(xué)磷酸化來制備異構(gòu)體。
實(shí)施例4淋巴細(xì)胞減少測定 將前藥化合物(即伯醇，例如VPC01091)溶解于2％的羥丙基β-環(huán)糊精并通過口腔管飼法以0.01-30mg/kg體重的劑量引入小鼠。24小時(shí)(或其倍數(shù))之后，將小鼠輕柔麻醉，并從眶竇抽取0.1ml血液。使用Hemavet血液分析儀測定淋巴細(xì)胞數(shù)量(以每ml血液數(shù)千個(gè)來表示，正常為4-11千)。在直方圖中，顯示了VPC01091的四種異構(gòu)體，載體處理的小鼠的100％值為在24小時(shí)為7.5，在96小時(shí)為5。每組三只小鼠，其種系為混合的svl29 x C57BL/6。將活性化合物(如VPC01211)以20mM溶解于酸化的DMSO，并在攪拌下以1∶20稀釋于2％的羥丙基β-環(huán)糊精水溶液。將該溶液以0.01-10mg/kg體重的劑量通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射引入小鼠。
當(dāng)溶解于2％的羥丙基β-環(huán)糊精(載體)水溶液并口腔(管飼)給藥于小鼠時(shí)，VPC01091激發(fā)深度的持續(xù)長時(shí)間的淋巴細(xì)胞減少(圖3)。圖3描述了VPC01091或載體單次劑量之后的總血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。VPC01091的單ED95劑量可引起淋巴細(xì)胞減少一周或更久。每組五只小鼠，雄性，10-11周齡svl29/C57B16系。
在淋巴細(xì)胞減少測定中，VPC01091的劑量響應(yīng)曲線如圖4中給出。圖4圖示總結(jié)了于2％羥丙基β-環(huán)糊精中的VPC01091的口腔給藥，每組3只小鼠(與圖3中同系)。
認(rèn)為這些化合物的這種磷酸化在體內(nèi)通過2型鞘氨醇(SPHK2)催化，所述2型鞘氨醇在小鼠中由SPHK2基因編碼。當(dāng)VPC01091被引入無功能性SPHK2基因的小鼠時(shí)，未觀察到淋巴細(xì)胞減少(圖5)。
在圖18中，描述了SPHK2酶磷酸化四種VPC01091異構(gòu)體的能力。
在圖19中，圖示說明了使用VPC01091的磷酸化異構(gòu)體通過口腔管飼給藥的測定結(jié)果。記錄了在將磷酸化的VPC01091異構(gòu)體IV給藥后24小時(shí)和96小時(shí)的總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(k/μl)。
實(shí)施例5鞘氨醇激酶測定 通過將相關(guān)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞來促使小鼠或人重組酶的表達(dá)來制備重組的2型鞘氨醇激酶(SPHK2)。約60小時(shí)之后，收獲、破碎細(xì)胞并保留無微粒體(即可溶的)部分。將含有重組酶的破碎細(xì)胞懸浮液與受試化合物(VPC01091、鞘氨醇等)(5-50微摩爾)和γ-32P-ATP混合并在37℃培養(yǎng)0.5-2.0小時(shí)。將反應(yīng)混合物中的脂質(zhì)體提取成有機(jī)溶劑并通過正相的薄層色譜展示。通過放射自顯影法檢測放射性標(biāo)記的條帶，從培養(yǎng)板刮除所述條帶并通過閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行定量。在所顯示的直方圖中，鞘氨醇為15μM，VPC01091及其異構(gòu)體為50μM，培養(yǎng)時(shí)間為0.5小時(shí)。
實(shí)施例6鈣動(dòng)員測定 使用人S1P2或人S1P3受體DNA轉(zhuǎn)染倉鼠CHOK1細(xì)胞，并分離并擴(kuò)增顯示異位表達(dá)受體的克隆群體。為檢測響應(yīng)激動(dòng)劑刺激的鈣動(dòng)員，將細(xì)胞鋪入96孔培養(yǎng)板，使用鈣傳感染料Fluo-4AM上樣，并將細(xì)胞暴露于不同濃度的激動(dòng)劑3-5min。使用FlexStation熒光計(jì)檢測與細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員相關(guān)的熒光變化。重復(fù)三次檢測每一激動(dòng)劑濃度。該方案于Davis，M.D.，JJ.Clemens，T.L.Macdonald and K.R.LynchSphingosine 1-phosphate analogs asreceptor antagonists.J.Biological Chemistry 280，9833-9841(2005)中較詳細(xì)敘述。于圖7和9中描述了結(jié)果。
圖7使用S1P2受體DNA轉(zhuǎn)染的CHOK1細(xì)胞。
圖9使用S1P3受體DNA轉(zhuǎn)染的CHOK1細(xì)胞。
實(shí)施例7心率測定 使用VPC01091(靜脈內(nèi)，3mg/kg)或載體(2％羥丙基β-環(huán)糊精)對(duì)小鼠進(jìn)行給藥，并在給藥后在指定時(shí)間檢測心率。使用ECGenieTM系統(tǒng)捕捉未抑制、有意識(shí)的動(dòng)物的心率。
結(jié)果描述于圖2。
在本文中包括標(biāo)題，用于參照和有助于對(duì)某些部分進(jìn)行定位。這些標(biāo)題非意于限制其下方描述的概念的范圍，并且這些概念可以適用于整個(gè)說明書的其他部分。
所使用的但本文未描述的其他方法為臨床、醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)以及重組DNA技術(shù)的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知的并在其能力范圍內(nèi)。
本文所使用的縮略語在化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中具有其傳統(tǒng)含義。說明書中所引用的所有公布、專利和專利文件通過引用并入本文，如同各自通過引用并入本文。在任何不一致的情況中，本發(fā)明的內(nèi)容包括其中的任何定義將優(yōu)先適用。參照各具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)描述了本發(fā)明。然而，應(yīng)理解在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可做出許多變動(dòng)和修改。
權(quán)利要求
1.一種具有下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯
或
其中，R4和R7獨(dú)立地為CH或CH2；R5為C、CH或N，R6為CH、CH2、O、S或SR3；R3為氫或(C1-C10)烷基；
X選自羥基、磷酸根、膦酸根、α-取代的膦酸根；
R1選自氫、鹵素、三氟甲基、(C1-C10)烷基、被鹵素、羥基、(C1-C10)烷氧基或氰基取代的(C1-C10)烷基組成的組；且
R2選自(C1-C20)烷基、環(huán)烷基取代的烷基、(C2-C20)烯基、(C2-C20)炔基、芳基、烷基取代的芳基、芳烷基以及芳基取代的芳烷基組成的組；其中R2基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)碳原子可獨(dú)立地被非過氧化物氧、硫或NR8取代；
其中R8為氫或(C1-C10)烷基；
其中R2中的烷基、烯基和炔基任選被氧代取代；n是0、1、2或3；且
表1、2或3個(gè)任選的雙鍵。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其具有下式(II)
其中，X選自羥基、磷酸根、膦酸根、α-取代的膦酸根；
其中R1選自氫，鹵素，(C1-C6)烷基，被鹵素、羥基、烷氧基、氰基取代的(C1-C6)烷基組成的組；
R2選自烷基、烯基、炔基、烷基取代的芳基、烷基取代的環(huán)烷基、芳烷基和芳烷基取代的芳基組成的組；且n是0、1、2或3。
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中所述R1為氟或氯。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述X是羥基或OPO3H2。
5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其中所述X是OPO3H2。
6.如權(quán)利要求4所述的化合物，其中所述X是羥基。
7.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中所述α-取代的膦酸根是-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2、-C＝OPO3H2或-OPO2SH2。
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其中所述α-取代的膦酸根是-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2，或-C＝OPO3H2。
9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述R1是氫。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述R2是具有5、6、7或8個(gè)碳原子的烷基。
11.如權(quán)利要求10所述的化合物，其中所述R2是庚基、辛基、壬基或-O-庚基。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述R2是辛基。
13.如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述n是1或2。
14.如權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述R2基團(tuán)位于所述環(huán)烷基環(huán)的對(duì)位。
15.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中所述環(huán)烷基具有下式
或
16.如權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述R1基團(tuán)位于所述R2的鄰位或間位。
17.如權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述R2基團(tuán)位于所述芐基環(huán)烷基的對(duì)位。
18.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其具有下式
或
19.一種用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的病理疾病或癥狀的方法，其中涉及1-磷酸鞘氨醇受體的活性，且所述活性的激動(dòng)是期望的，所述方法包括給藥于所述哺乳動(dòng)物有效量的如權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的化合物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述病理疾病是自身免疫性疾病。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是眼葡萄膜炎、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病或多發(fā)性硬化癥。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述病理疾病是淋巴細(xì)胞運(yùn)輸改變。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述治療是改變淋巴細(xì)胞運(yùn)輸。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述淋巴細(xì)胞運(yùn)輸提供了延長的同種異體移植物的存活時(shí)間。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述同種異體移植物用于移植。
27.一種用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的病理疾病或癥狀的方法，其中涉及S1P裂解酶活性，且S1P裂解酶的抑制是所需的，其包括給藥于所述哺乳動(dòng)物有效量的如權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的化合物。
28.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的化合物用于醫(yī)學(xué)治療的用途。
29.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的化合物用于制備用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物病理疾病或癥狀的藥物的用途，其中涉及1-磷酸鞘氨醇受體的活性。
30.如權(quán)利要求28所述的用途，其中所述藥物含有液體載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了1-磷酸鞘氨醇類似物，其為一種或多種S1P受體(特別是S1P1受體類型)的有效和選擇性的激動(dòng)劑。本發(fā)明化合物包括具有磷酸根部分的化合物和具有抗水解的磷酸根替代物例如膦酸根、α-取代的膦酸根以及硫代磷酸根的化合物。
文檔編號(hào)A61K31/425GK101119714SQ200680004868
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月14日
發(fā)明者凱文·R·林奇, 蒂莫西·L·麥克唐納 申請(qǐng)人:弗吉尼亞大學(xué)專利基金會(huì)