專利名稱：：針對IL-13受體α1的抗體及其用途的制作方法針對IL-13受體oil的抗體及其用途本發(fā)明涉及針對IL-13受體al(IL-13Ra(alpha)l)的人抗體，它們的生產(chǎn)方法和用途。
背景技術(shù)：
：IL-13是主要由Th2細胞而且也由肥大細胞和NK細胞產(chǎn)生的分泌的單體肽。IL-13的生物功能包括調(diào)節(jié)IgE產(chǎn)生和調(diào)節(jié)Th2發(fā)育。IL-13結(jié)合由IL-13受體al(IL-13Ral)鏈和IL-4受體a(IL-4Ra)鏈組成的受體復合體。IL-13結(jié)合主要通過STAT6引發(fā)信號轉(zhuǎn)導事件。IL-13以低親和性結(jié)合單獨的IL-13Ral并且不結(jié)合IL-4Ral。與此相反，IL-4結(jié)合單獨的IL-4Ra并且不結(jié)合單獨的IL-13Ral。已經(jīng)描述了IL-13的另一種受體IL-13Ra2。IL-13以高親和性結(jié)合該受體。該受體同樣作為docey受體。在轉(zhuǎn)基因小鼠中IL-13的可誘導的過表達導致與哮喘患者共有許多特征的表型。它們顯示出粘液組織轉(zhuǎn)化、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞富集的炎癥、蛋白酶如MMP-9、-12、-13、-2和-14、組織蛋白酶B、H、K和S的上調(diào)，并且它們還呈現(xiàn)上皮下纖維質(zhì)生成。IL-13敲除小鼠由于Th2發(fā)育的損傷而顯示出Th2細胞因子產(chǎn)生的顯著減少。這些小鼠盡管存在嗜酸性粒細胞炎癥但是不產(chǎn)生呼吸道高反應性(AHR)。通過施用IL-13恢復了AHR，表明IL-13是誘導小鼠中AHR必要且足夠的。IL-13的與哮喘有關(guān)的其他重要的生物功能包括誘導杯形細胞組織轉(zhuǎn)化和粘液產(chǎn)生。它直接作用于呼吸道上皮細胞、成纖維細胞和呼吸道平滑肌細胞并誘導這些細胞類型的每一種中不同的轉(zhuǎn)錄程序。有趣的是，IL-13降低平滑肌細胞中的a—腎上腺素能應答，促進呼吸道狹窄。IL-13啟動子多態(tài)性與變應性哮喘的增加的危險有關(guān)。IL-13基因中多態(tài)性與高血清IgE水平有關(guān)。在IL-4和IL-B基因之間基因間序列中的單核苷酸多態(tài)性與特應性哮喘有關(guān)。IL-13拮抗劑已經(jīng)用于動物模型中。例如，可溶性小鼠IL-13Rcx2-IgGFc融合蛋白已經(jīng)用于顯示在完全逆轉(zhuǎn)卵白蛋白誘導的AHR和含有粘液的細胞數(shù)目中的功效。即使在該表型完全發(fā)展后給予治療也可以得到該逆轉(zhuǎn)。此外，用IL-13融合細胞毒素分子治療小鼠導致慢性真菌誘導的變應性炎癥中呼吸道疾病的所有特征的減少?？傊?，IL-13是變態(tài)反應中效應臂的關(guān)鍵介體。IL-HRal是hemapoietin受體超家族(1型細胞因子受體超家族)的成員并且由ObiriN.I.，等人，J.Biol.Chem.,270(1995)8797-8804)和WO96/29417鑒定和描述。它是427個氨基酸的蛋白質(zhì)，包括信號序列。它的DNA和蛋白質(zhì)序列在WO97/15663和SwissProtNo.P78552中描述。IL-13Ral是以低親和性結(jié)合IL-13的糖基化蛋白質(zhì)，但是，當連接IL-4Ra成異源二聚體時，它以高親和性結(jié)合IL-13。該復合體也是IL-4的受體。針對IL-13Ral的抗體可以從WO96/29417，WO97/15663,WO03/080675，GraberP.,等人，Eur.J.Immunol.,28(1998)4286-4298;PoudrierJ.,等人，J.Immunol.,163(1999)1153-1161;PoudrierJ.,等人，Eur.J.Immunol.,30(2000)3157-3164;AikawaM.,等人，Cytokine,13(2001)75-84已知。針對IL-13Ral的抗體可以從R&DSystemsInc.USA商購。發(fā)明概述本發(fā)明包括結(jié)合IL-13Ral并且抑制IL-13生物活性的抗體，其特征是所述抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR3選自由SEQIDNO:1、3、5、7或9的重鏈CDR3序列組成的組。所述抗體優(yōu)選是人抗體。該抗體優(yōu)選特征是結(jié)合IL-13Ral的親和性為10'9M(Kd)或更小，優(yōu)選10'9至lj10'13M。優(yōu)選地，該抗體的特征是它的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列選自由SEQIDNO:l、3、5、7或9的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列組成的組。該抗體優(yōu)選特征是所述抗體的可變輕鏈氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3選自由SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR序列組成的組。該抗體優(yōu)選特征是所述抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3選自由SEQIDNO:1、3、5、7或9的重鏈CDR序列組成的組，并且所述抗體的可變輕鏈氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3選自由SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR序列組成的組。CDR序列優(yōu)選相互獨立地選擇并且通過FR(構(gòu)架)區(qū)分開?？贵w的優(yōu)選特征是包含SEQIDNO:1的CDR作為重鏈CDR和SEQIDNO:2的CDR作為輕鏈CDR，SEQIDNO:3的CDR作為重鏈CDR和SEQIDNO:4的CDR作為輕鏈CDR，SEQIDNO:5的CDR作為重鏈CDR和SEQIDNO:6的CDR作為輕鏈CDR，SEQIDNO:7的CDR作為重鏈CDR和SEQIDNO:8的CDR作為輕鏈CDR，或SEQIDNO:9的CDR作為重鏈CDR和SEQIDNO:10的CDR作為輕鏈CDR?？梢愿鶕?jù)Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的標準定義確定CDR序列。基于此，SEQIDNO:1-8的互補決定區(qū)(CDR)具有下面的序列重鏈CDR:SEQIDNO:1、3、5、7、9的CDR1(aa31-35)，SEQIDNO:1、3、5、7、9的CDR2(aa50-66)，SEQIDNO:1、3、9的CDR3(aa99-108)，SEQIDNO:5的CDR3(aa99-107)，SEQIDNO:7的CDR3(aa99-112);輕鏈CDR:SEQIDNO:2、4、6、10的CDR1(aa24-34)，SEQIDNO:8的CDRl(aa24-35)，SEQIDNO:2、4、6、10的CDR2(aa50-56)，SEQIDNO:8的CDR2(aa51隱57)和SEQIDNO:2、4、6、10的CDR3(aa89-97)，SEQIDNO:8的CDR3(aa90-97)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了抗體，其包含下面的序列作為互補決定區(qū)(CDR):a)抗體重鏈，其包含SEQIDNO:1、3、5、7或9的重鏈CDR;b)抗體輕鏈，其包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR，其中CDR彼此相互獨立地選擇?？贵w優(yōu)選的特征是包含作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:1和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:2，作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:3和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:4，作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:5和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:6，作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:7和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:8，或作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:9和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:10。該抗體優(yōu)選的特征在于包含a)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:1和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:2，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，b)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:3和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:4作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為Yl重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，c)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:5和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:6，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為yl重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，d)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:7和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:8，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為^重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，或e)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:9和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:10，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12。優(yōu)選地，抗體的特征在于與抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007禾口/或LC5002-018競爭結(jié)合IL-13Ral。優(yōu)選地，抗體的特征是包含LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018的可變區(qū)作為可變區(qū)。這些抗體的可變區(qū)在SEQIDNO:.l-lO中顯示。有用的恒定區(qū)是本領(lǐng)域中公知的。實例在SEQIDNO:11-12中顯抗體優(yōu)選是單克隆的或者重組產(chǎn)生的抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體是類別改變的人抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗體含有人Yl重鏈，其包含a)氨基酸序列Pro233Val234Ala235，其缺失Gly236和/或氨基酸序列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331，b)氨基酸序列Ala234Ala235或c)氨基酸Ala265和Ala297。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體以6nM或者更低的ICso值抑制IL-13誘導的Stat-6磷酸化，以20nM或者更低的ICso值抑制IL-13誘導的嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)產(chǎn)生和/或以10nM或者更低(IL-13)和60nM或者更低(IL-4)的IC5。值抑制IL-13或者IL-4誘導的細胞增殖，優(yōu)選TF-1細胞(ATCCCRL2003)增殖。根據(jù)實施例6到8確定IL-13誘導的Stat-6磷酸化、嗜酸細胞活化趨化因子產(chǎn)生和誘導細胞增殖。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選不結(jié)合變性的IL-13Ral(結(jié)合親和性KD為l(T6M或者更高)。該抗體優(yōu)'選特征是顯示出基本不與IL-13Ra2和IL-4Ra交叉反應(結(jié)合親和性KD為10—SM或者更高)。本發(fā)明還提供了雜交瘤細胞系，其產(chǎn)生針對IL-13Ral的拮抗性單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的雜交瘤細胞系(hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC5002-002(DSMACC2709)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-003(DSMACC2710)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC,5002-005(DSMACC2711)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-007(DSMACC2712))在2005年1月13日保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ),德國)。從所述細胞系可得到的抗體是本發(fā)明的實施方案。本發(fā)明還提供了編碼包含本發(fā)明抗體的多肽的核酸、表達所述核酸的表達載體、用于重組產(chǎn)生所述抗體的宿主細胞。本發(fā)明還提供了重組產(chǎn)生所述抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的多肽為a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重鏈CDR的抗體重鏈和b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR的抗體輕鏈。這些多肽能夠與各自的另一抗體鏈裝配產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體對于需要皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)治療的患者顯示出益處。根據(jù)本發(fā)明的抗體具有新的和創(chuàng)造性性質(zhì)，其對于患有哮喘或者變應性疾病的患者產(chǎn)生益處。本發(fā)明還提供了治療哮喘和變應性疾病的方法。本發(fā)明還包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的用途，用于哮喘治療和生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。此外，本發(fā)明包括生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方法。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含藥物有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體和任選地用于配制用于藥物目的的抗體制劑的緩沖劑和/或佐劑。本發(fā)明還提供了包含藥用載體中的此類抗體的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物可以包括在制成品或者試劑盒中。本發(fā)明還包括載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的核酸，其能夠在原核或者真核宿主細胞中表達所述核酸。本發(fā)明還包括原核或者真核宿主細胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的載體。本發(fā)明還包括產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體的方法，其特征是在原核或者真核宿主細胞中表達根據(jù)本發(fā)明的核酸并從所述細胞回收所述抗體。本發(fā)明還包括通過此類重組方法可以得到的抗體。本發(fā)明還包括制備藥物組合物的方法，其特征是當與沒有所述抗體的測定法比較時，從針對IL-13Rctl的多種抗體中選擇針對IL-13Ral的抗體，通過重組表達產(chǎn)生所述抗體，回收所述抗體并將所述抗體與藥用緩沖劑和/或佐劑組合。優(yōu)選地，抗體具有一種或多種上述額外的性質(zhì)。發(fā)明詳述術(shù)語"IL-13Ral、鼠IL-13Ral、IL-13、IL-13Ra2和IL-4Ra，，和它們的結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域中眾所周知的并且例如通過SwissProtP78552、009030、P35225、Q14627和P24394定義。如果不另外指出，術(shù)語"IL-13Ral、IL-13、IL-13Ra2禾卩IL-4Ra"因此表示人多肽IL-13Ral、IL-13、IL-13Ra2和IL-4Ra。本文使用的術(shù)語"人抗體"包括具有可變區(qū)和恒定區(qū)(結(jié)構(gòu)域)的抗體，其可以因為它們與這些種系序列的高度序列相似性或同一性而指定為確定的人種系免疫球蛋白序列。人抗體是本領(lǐng)域中眾所周知的(vanDijk,M.A.,和vandeWinkel，J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。也可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)中產(chǎn)生人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物當免疫時能夠產(chǎn)生人抗體的全部組成成分或者人抗體的選擇部分(aselection)而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。在此類種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)移導致當抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體(見例如，Jakobovits,A.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.,等人，Nature362(1993)255-258;Bruggemann,M.,等人，YearImmunol.7(1993)33-40)。還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom，H.R.,andWinter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.,等人，J,Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);和Boemer,P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。人抗體包括多種形式的抗體，優(yōu)選單克隆抗體，包括但不限于完整抗體、抗體片段、類別改變的抗體和遺傳改造的抗體(變體或者突變抗體)只要保持根據(jù)本發(fā)明的特征性性質(zhì)。特別優(yōu)選重組人抗體。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"指都具有基本上相同的氨基酸序列的抗體分子的制備物。本文使用的術(shù)語"重組人抗體"意在包括通過重組手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如從對于人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的宿主細胞如NS0或CHO細胞或者從動物(例如小鼠)分離的抗體，或者使用轉(zhuǎn)染到此類宿主細胞的重組表達載體表達的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)進行體內(nèi)體細胞高突變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是可以分配為特定人種系VH和VL序列的序列，但是不天然存在于體內(nèi)人抗體種系所有組成成分中。術(shù)語"類別改變的抗體"指通常通過重組DNA技術(shù)制備的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體，其包含來自一種來源或者種系的可變區(qū)即結(jié)合區(qū)，和與來自不同來源或者種系的抗體的恒定區(qū)匹配的恒定區(qū)的至少一部分。此類類別改變的抗體不是天然存在的并且因此不能直接從異種移植物小鼠得到。本發(fā)明包括的"類別改變的抗體"的形式是這樣的形式，其中恒定區(qū)與野生型恒定區(qū)序列不同，導致根據(jù)本發(fā)明的具有不同性質(zhì)，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的抗體，g卩，通過改變或者突變FC而實現(xiàn)。類別改變的抗體是表達的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，所述基因包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。產(chǎn)生類別改變的抗體的方法包括常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，是本領(lǐng)域中眾所周知的(見，例如，Morrison,S丄.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855;美國專利號5,202,238禾B5,204,244)。本文使用的"可變區(qū)"(輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))指每對輕鏈和重鏈的直接參與抗體與抗原結(jié)合的部分?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)并且每個結(jié)構(gòu)域包含四個構(gòu)架(FR)區(qū)，它們的序列廣泛保守，通過三個"高變區(qū)"(或者互補決定區(qū)，CDR)連接。構(gòu)架區(qū)采取P折疊構(gòu)型并且CDR可以形成連接|3折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)保持它們的三維結(jié)構(gòu)并且與來自另一條鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合部位?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)，優(yōu)選地重鏈CDR3在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和性中起特別重要的作用，并且因此提供了本發(fā)明的另一目的。術(shù)語"高變區(qū)"或者"抗體的抗原結(jié)合部分"當在本文中使用時指抗體的負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自"互補決定區(qū)"或者"CDR"的氨基酸殘基。"構(gòu)架"或者"FR"區(qū)為不同于本文定義的高變區(qū)殘基的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N-末端到C-末端包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根據(jù)Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed"PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)的標準定義確定CDR和FR區(qū)。"恒定結(jié)構(gòu)域"不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出多種效應功能。取決于它們的重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，將抗體或者免疫球蛋白分成下面的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些的一些可以進一步分成亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3禾BIgG4、IgAl禾BIgA2。對應于免疫球蛋白的不同類別的重鏈恒定區(qū)分別稱作^S、Y、a和s。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選為IgGl型?？贵w的Fc部分直接參與補體激活、Clq結(jié)合、C3激活和Fc受體結(jié)合。對Clq的結(jié)合由FC部分中確定的結(jié)合位點引起。此類結(jié)合位點是本領(lǐng)域中己知的并且例如由Lukas,T丄，等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560;B謹house,R.,andCebra,J丄，Mol,Immunol.16(1979)907-917;Burton,D.R.,等人，Nature288(1980)338-344;Thommesen,J,E"等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.,等人，J,Immunol.164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等人，J.Virol,75(2001)12161-12168;Morgan,A.，等人，Immunology86(1995)319-324;和EP0307434描述。此類結(jié)合位點為例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根據(jù)Kabat的EU索引編號，見下文)。亞類IgGl、IgG2和IgG3的抗體通常顯示出補體激活、Clq結(jié)合和C3激活，而IgG4抗體不激活補體系幾，不結(jié)合C^并且^^栝C3。本文使用的術(shù)語"來自人來源的Fc部分"表示Fc部分，其優(yōu)選具有亞類IgGl的人抗體的Fc部分的氨基酸序列，其以這樣的方式修飾使得與人IgGl抗體相比，不能檢測到Clq結(jié)合、C3激活和/或FcR結(jié)合或者結(jié)合至少減少50%，優(yōu)選70%。"抗體的Fc部分"是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的術(shù)語并且基于抗體的木瓜蛋白酶切割定義。根據(jù)本發(fā)明的抗體含有Fc部分，優(yōu)選具有人來源的Fc部分的氨基酸序列和優(yōu)選人恒定區(qū)的所有其他部分。優(yōu)選地，F(xiàn)c部分是來自人IgGl亞類的突變的人Fc部分。最優(yōu)選地是包含具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的yl-重鏈恒定區(qū)(實例在SEQIDNO:11中顯示)(W099/51642)的Fc部分。人恒定鏈，例如，yl-重鏈由Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991),和BrUggemann,M"等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.W.,等人，MethodsEnzymol.178(1989)515-527詳細描述。在本發(fā)明中優(yōu)選的恒定結(jié)構(gòu)域不提供補體結(jié)合。如本發(fā)明中使用"可變區(qū)"(輕鏈可變區(qū)(VL)，重鏈可變區(qū)(VH))指每對輕鏈和重鏈的直接參與抗體與抗原結(jié)合的區(qū)域。如本文使用的術(shù)語核酸或者核酸分子意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或者雙鏈的，但是優(yōu)選為雙鏈DNA。當核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)系時，該核酸是"可操作連接的(operablylinked)"。例如，如果前序列或者分泌前導序列的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)，那么所述DNA可操作連接該多肽的DNA;如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動子或增強子可操作連接該編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合部位位于方便翻譯的位置上，那么該核糖體結(jié)合部位可操作連接編碼序列。通常，"可操作連接"指被連接的DNA序列是順式的，并且對于分泌前導序列的情況，是連續(xù)的和讀框內(nèi)的。然而，增強子不必是連續(xù)的。通過在方便的限制性位點的連接完成連接。如果不存在此類位點，那么根據(jù)常規(guī)的實踐使用合成的寡核苷酸接頭或者連接體。如本文使用的表述"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"可互換使用并且所有此類指定包括子代。因此，單詞"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化的細胞"包括原代主題細胞和從其得到的培養(yǎng)物，無論傳代次數(shù)。還理解由于有意或者無意突變，所有子代不必在DNA含量中精確相同。包括變異子代，其具有在最初轉(zhuǎn)化的細胞中所篩選的相同的功能或者生物學活性。當意在不同的指定時，將從上下文澄清。本文使用的術(shù)語"結(jié)合IL-13Rod"指在體外測定、優(yōu)選在結(jié)合測定中抗體結(jié)合IL-13Ral，在該測定中，抗體結(jié)合到表面并且IL-13Ral的結(jié)合通過表面等離子體共振(SPR)測量。結(jié)合指IO-sm或者更小，優(yōu)選10'13到10力M的結(jié)合親和性(kd)。"不結(jié)合"指10"M或更多的Kd。根據(jù)本發(fā)明的抗體結(jié)合到人IL-13Ral并且優(yōu)選也結(jié)合小鼠IL-13Ral的細胞外結(jié)構(gòu)域?？梢酝ㄟ^BIAcore湖!j定法(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala,Sweden)研究對IL-13Rcxl的結(jié)合。通過術(shù)語ka(抗體從抗體/抗原復合體結(jié)合的速率常數(shù))、kd(解離常數(shù))和Ko(kd/ka)定義結(jié)合親和性。通過根據(jù)本發(fā)明的抗體抑制IL-13與IL-13Ral的結(jié)合。以ELISA中IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra異源二聚體的結(jié)合的ICso測量抑制。為了進行這種測定，將IL-13Ral固定并加入IL-13和IL-4Ra。根據(jù)本發(fā)明的抗體對IL-13與IL-13Ral結(jié)合的ICs。值不超過6nM。以至少三次獨立測量的平均值或者中值測量ICw值。單次ICso值可能在范圍之外。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選顯示出與選自由抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018組成的組的抗體相同的結(jié)合IL-13R(x1的表位或者由于這些抗體導致的結(jié)合的立體位阻而與IL-13Ral的結(jié)合受到抑制。可以通過SPR測定使用選自由抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002陽005、LC5002-007或LC5002-018組成的組的固定化抗體和20-50nM濃度的IL-13Ral和100nM濃度的待檢測的抗體來檢測結(jié)合抑制。信號減小50%或者以上表明抗體與選自由抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002畫005、LC5002-007或LC5002-018組成的組的抗體競爭。術(shù)語"表位"指能夠特異結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子的化學活性表面組如氨基酸或者糖側(cè)鏈組成并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在變性溶劑的存在下對前者的結(jié)合喪失，但是對后者的結(jié)合不喪失。本發(fā)明還包括結(jié)合IL-13Ral并且抑制IL-13生物活性的人抗體，其特征是對IL-13Ral結(jié)合的親和性為l(t9M(K。)或更小，優(yōu)選10一到l(t13M，對鼠IL-13Ral結(jié)合的親和性為10'7m(Kd)或更小，優(yōu)選10'8到10'9m。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體進一步通過一種或多種特征表征，所述特征選自結(jié)合參數(shù)ka、kd和KD，結(jié)合的表位與選自由抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018組成的組的抗體結(jié)合的表位相同。優(yōu)選通過重組方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。此類方法是本領(lǐng)域中眾所周知的并且包括在原核和真核細胞中表達蛋白質(zhì)和隨后分離抗體多肽并通常純化至藥用純度。對于蛋白質(zhì)表達，通過標準方法向表達載體中插入編碼輕鏈和重鏈或者其片段的核酸。在合適的原核或者真核宿主細胞像CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌細胞中進行表達并從細胞(裂解后上清液或者細胞)回收抗體?？贵w的重組產(chǎn)生是本領(lǐng)域中眾所周知的并且描述于例如Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等人，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,DrugRes.48(1998)870-880的綜述文章中?？贵w可以存在于完整細胞、細胞裂解物中或者為部分純化的或者基本純化的形式。通過標準技術(shù)進行純化以便除去其他細胞組分或者其他污染物，例如其他細胞核酸或者蛋白質(zhì)，所述技術(shù)包括堿/SDS處理、CsCl顯帶法(binding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳、和本領(lǐng)域中眾所周知的其他方f去。見Ausubel,F.,等，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。NS0細胞中的表達由例如Barnes,L.M.,等人，Cytotechnology32(2000)109-123;和Barnes,L.M.,等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬時表達由例如Durocher,Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆由Orlandi,R.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA89(1992)4285-4289;和Norderhaug,L.,等人，J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時表達系統(tǒng)(HEK293)由Schlaeger,E,J.，和Christensen,K.，inCytotechnology30(1999)71-83禾口Schlaeger,E.-J.,inJ.Immunol.Methods194(1996)191-199描述。適于原核生物的對照序列例如包括啟動子，優(yōu)選地操縱基因序列，和核糖體結(jié)合部位。已知真核細胞利用啟動子、增強子和多聚腺苷酸化信號。單克隆抗體適于通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法如蛋白ASepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或者親和層析從培養(yǎng)基分離。可以使用常規(guī)方法容易地分離編碼單克隆抗體的DNA和RNA并測序。雜交瘤細胞可以用作此類DNA和RNA的來源。一旦分離，就可以將DNA插入到表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞，如CHO細胞、HEK293細胞或者骨髓瘤細胞，否則所述宿主細胞不產(chǎn)生免疫球蛋白，以得到宿主細胞中重組單克隆抗體的合成。此外，根據(jù)本發(fā)明的抗體包括具有"保守序列修飾"的核苷酸和氨基酸序列修飾的抗體，所述修飾不影響或者改變根據(jù)本發(fā)明抗體的上述特征。可以通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)如位點定向誘變和PCR介導的誘變引入修飾。保守氨基酸替代包括其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氮酸、甲硫氨酸)、具有卩分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在人抗-IL-13Ral抗體中預測的非必需氨基酸殘基可以優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基替代?？梢曰赗iechmann,L.,等人，Nature332(1988)323-327禾卩Queen,C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033描述的分子建模通過誘變進行氨基酸替代。通過向抗體DNA中引入合適的核苷酸改變或者通過肽合成制備人IL-13Ral抗體的氨基酸序列變體。然而，如上述，此類修飾僅可以在非常有限的范圍內(nèi)進行。例如，修飾不改變上述抗體特征，如IgG同種型和表位結(jié)合，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或者方便純化。不參與保持抗-IL-13Ral抗體的適當構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基也可以一般用絲氨酸替代，以提高分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反地，可以向抗體加入半胱氨酸鍵以提高它的穩(wěn)定性(尤其當抗體是抗體片段，如Fv片段時)?？贵w的另一類型的氨基酸變體改變抗體的最初糖基化模式。改變指缺失一個和多個在抗體中發(fā)現(xiàn)的糖類部分，和/或加入一個或多個不存在于該抗體中的糖基化位點?？贵w的糖基化通常是N-連接的。N-連接的指糖類部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺一X-絲氨酸和天冬酰胺一X-蘇氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任一氨基酸)是糖類部分酶促連接到天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列的任一個的存在產(chǎn)生的潛在的糖基化位點。通過改變氨基酸序列使得它含有一個或多個上述三肽序列(對于N-連接的糖基化位點)，可以方便地完成糖基化位點向抗體的加入。通過本領(lǐng)域中已知的多種方法制備編碼抗-IL-13Ral抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括，但不限于，從天然來源(對于天然存在的氨基酸序列變體)分離或者通過寡核苷酸介導的(或者位點定向)誘變、PCR誘變和以前制備的抗-IL-13Ral抗體的變體或非變體形式的表達盒誘變來制備。另一類型的共價修飾涉及向抗體化學或者酶促偶聯(lián)糖苷。這些方法是有利的，因為它們不需要在具有N-或者O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產(chǎn)生抗體。取決于使用的偶聯(lián)方式，糖可以連接到(a)精氨酸和組氨酸，(b)自由羧基，(C)自由巰基，如半胱氨酸的自由巰基，(d)自由羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或者羥脯氨酸的自由羥基，(e)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或者色氨酸的芳族殘基，或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法在WO87/05330,和在Aplin，J.D.,和Wriston,J.C.Jr.，CRCCrit.Rev.Biochem.(1981)259-306中描述。可以化學或者酶促地除去存在于抗體上的任何糖類部分。通過將抗體暴露于三氟代甲磺酸或者等同化合物可以完成化學去糖基化。該處理導致切割除了連接糖(N-乙?；咸前坊蛘逳-乙?；肴樘前?之外的多數(shù)或者全部糖，而完整的留下抗體。化學去糖基化由Sojahr,H.T.,和Bahl,O.P.,Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和Edge,A.S.，等人Anal.Biochem.118(1981)131-137描述。通過使用如Thotakum,N.R.,和Bahl，O.R,Meth.Enzymol.138(1987)350-359描述的各種內(nèi)切和外切糖苷酶可以實現(xiàn)抗體上糖類部分的酶促切割?？贵w的另一類型的共價修飾包括以美國專利號4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中給出的方法將抗體連接到多種非蛋白質(zhì)聚合物之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或者聚氧化烯。在另一方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠分離的B細胞，其表達根據(jù)本發(fā)明的人抗-IL-13Ral抗體。優(yōu)選地，分離的B細胞從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠得到，所述動物已經(jīng)用IL-13Ral抗原的純化或者富集的制備物和/或表達IL-13Ral的細胞免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或者部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。然后將分離的B細胞永生化以提供人抗IL-13Ral抗體的來源(例如，雜交瘤)。因此，本發(fā)明還提供了能夠產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個實施方案中，雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠得到的融合永生化細胞的B細胞，所述動物的基因組包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或者部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。在具體實施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物是轉(zhuǎn)基因小鼠，其基因組包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或者部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。該轉(zhuǎn)基因非人動物可以用IL-13Ral抗原的純化或者富集的制備物和/或表達IL-13Ral的細胞免疫。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生針對IL-13Ral的人單克隆抗體的IgGl同種型。通過用IL-13Ral抗原的純化或者富集的制備物和/或表達IL-13Ral的細胞免疫轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體，所述動物的基因組包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或者部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。然后得到動物的B細胞(例如，脾B細胞)并與骨髓瘤細胞融合形成分泌針對IL-13Ral的人單克隆抗體的永生的雜交瘤細胞。在優(yōu)選實施方案中，使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生針對IL-13Ral的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因小鼠在本文中稱作"HuMab"小鼠，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其編碼包括重鏈(p和Y)和K輕鏈(恒定區(qū)基因)的未重排的人免疫球蛋白基因，以及失活內(nèi)源n和k鏈基因座的定向突變(Lonberg，N.,等人，Nature368(1994)856-859)。因此，小鼠顯示出小鼠IgM或K的降低的表達，并且應答免疫，導入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變以產(chǎn)生高親和性的人lgG單克隆抗體(Lonberg,N.，等人，Nature368(1994)856-859;Lonberg,N.，HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101;Lonberg,N.，禾口Huszar,D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93;禾卩Harding,F"和Lonberg,N.,Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546)中綜述)。HuMab小鼠的制備在Taylor,L.，等人，NucleicAcidsResearch20(1992)6287-6295;Chen，J.,等人，InternationalImmunology5(1993)647-656;Tuaillon,N.,等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA90(1993)3720-3724;Choi，T.K.,等人，NatureGenetics4(1993)117-123;Chen,J.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830;Tuaillon，N.,等人，Immunol,152(1994)2912-2920;Lonberg,N,,等人，Nature368(1994)856-859;Lonberg,N.，HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101;Taylor,L.,等人，Int.Immunol,6(1994)579-591;Lonberg,N.,andHuszar,D.,Intern.Rev,Immunol.25(1995)65-93;Harding,F.,禾口Lonberg,N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546;Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述，將這些文獻的內(nèi)容完整引入本文作為參考。另外見美國專利號5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5，661，016;5,814,318;5,874,299;5,545,807;5,770,429;W098/24884;W094/25585;W093/1227;W092/22645;和WO92/03918。為了產(chǎn)生針對IL-13Rotl的完整人單克隆抗體，可以將HuMab小鼠用IL-13Ral抗原的純化或者富集的制備物和/或表達IL-13Ral的細胞根據(jù)一般方法免疫，如Lonberg,N.,等人，Nature368(1994)856-859;Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO98/24884中描述。優(yōu)選地，當?shù)谝淮蚊庖邥r，小鼠將為6—16周齡。例如，可溶的IL-13Ral抗原的純化或者富集的制備物(例如，從IL-13Ral表達細胞純化)可以用于腹膜內(nèi)免疫HuMab小鼠。對于使用IL-13Rotl抗原的純化或者富集的制備物免疫不產(chǎn)生抗體的情況，也可以用表達IL-13Ral的細胞，例如用腫瘤細胞系免疫小鼠以促進免疫應答。用多種抗原積累的經(jīng)驗表明當最初用完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(i.p.)免疫，接著每隔一周用不完全弗氏佐劑中的抗原交替i.p.或者s.c.免疫(例如，長達共6周)時，HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠最佳地應答?？梢栽诿庖叻桨傅倪^程中用通過眶后取血得到的血漿樣品監(jiān)視免疫應答?？梢酝ㄟ^ELISA篩選血漿，并且具有足夠效價的抗IL-13Ral人免疫球蛋白的小鼠可以用于對應的B細胞的永生化?？梢杂每乖o脈內(nèi)加強小鼠3到4天后處死并除去脾臟和淋巴結(jié)。預期可能需要進行每種抗原的2—3次融合。一些小鼠將用每種抗原免疫。例如，可以免疫HCo7和HCo12品種的共5到12只HuMab小鼠。HCo7小鼠在它們的內(nèi)源輕鏈(k)基因中具有JKD破壞(如Chen,j.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830中描述)，在它們的內(nèi)源重鏈基因中具有CMD破壞(如WO01/14424的實施例1中描述)，KCo5人k輕鏈轉(zhuǎn)基因(如Fishwild，D.M"等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因(如美國專利號5,770,429中描述)。HCo12小鼠在它們的內(nèi)源輕鏈(k)基因中具有JKD破壞(如Chen，J.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830中描述)，它們的內(nèi)源重鏈基因中的CMD破壞(如WO01/14424的實施例1中描述)，KCo5人K輕鏈轉(zhuǎn)基因(如Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo12人重鏈轉(zhuǎn)基因(如WO01/14424的實施例2中描述)。可以分離小鼠淋巴細胞并使用PEG基于標準方法與小鼠骨髓瘤細胞系融合以產(chǎn)生雜交瘤。然后對所得雜交瘤篩選抗原特異性抗體的產(chǎn)生。例如，將來自經(jīng)免疫的小鼠的脾臟和淋巴結(jié)來源的淋巴細胞的單個細胞混懸液用50%PEG融合到1/6的數(shù)目的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1581)。將細胞以約2x105接種在平底微量滴定板中，然后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。然后通過ELISA篩選個體細胞(well)的人抗IL-13Ral單克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，就分析培養(yǎng)基，通常在10—14天后。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，并且如果仍然對于人IgG陽性，那么可以通過有限稀釋將抗IL-13Ral單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生用于表征的抗體。因為CDR序列負責抗體一抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)架表達載體表達根據(jù)本發(fā)明的重組抗體，所述表達載體包括來自不同的人抗體的構(gòu)架序列上的根據(jù)本發(fā)明的CDR序列(見例如，Riechmann，L.，等人，Nature332(1998)323-327;Jones,P.,等人，Nature321(1986)522-525;禾卩Queen,C.,等人，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86(1989)10029-10033)。此類構(gòu)架序列可以來自包括種系人抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫。這些種系序列將與成熟的抗體基因序列不同，因為它們將不包括完全裝配的可變基因，其在B細胞成熟過程中通過V(D)J連接形成。種系基因序列還將在均勻跨越可變區(qū)的個體(individual)處不同于高親和性次級全套抗體的序列。本發(fā)明優(yōu)選包含編碼結(jié)合IL-13Ral的多肽的核酸片段，其中所述多肽抑制IL-13與IL-13Ral的結(jié)合，所述多肽選自a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重鏈CDR的抗體重鏈；b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR的抗體輕鏈。將重構(gòu)的重鏈和輕鏈可變區(qū)與啟動子、翻譯起始、恒定區(qū)、3'非翻譯區(qū)、多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列組合以形成表達載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達構(gòu)建體可以組合到單個載體中，共轉(zhuǎn)染、順序轉(zhuǎn)染或者單獨轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，然后宿主細胞融合形成表達兩條鏈的單個宿主細胞。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體的方法，其包括表達核酸，該核酸編碼a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重鏈CDR的抗體重鏈；b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR的抗體輕鏈。本發(fā)明還包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的用途，用于體外檢測IL-13Ral，優(yōu)選通過免疫學測定法檢測，所述測定法測定樣品的IL-13Ral和本發(fā)明抗體之間的結(jié)合。另一方面，本發(fā)明提供了組合物，例如，藥物組合物，其包含本發(fā)明的人單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部分韻一種或組合，與藥用載體一起配制。本文使用的"藥用載體"包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或者輸注)。"藥用鹽"指保留抗體的所希望的生物活性并且不賦予任何不希望的毒理學作用的鹽(見，例如，Berge，S.M.，等人，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。此類鹽包括在本發(fā)明中。此類鹽的實例包括酸式加成鹽和堿式加成鹽。酸式加成鹽包括衍生自無毒的無機酸的鹽，如鹽酸鹽。本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域中已知的多種方法施用。如技術(shù)人員將理解的，施用途徑和/或方式將取決于所希望的結(jié)果而變。為了通過一些施用途徑施用本發(fā)明的化合物，必須用物質(zhì)包衣該化合物或者與該化合物共同施用，以防止它的失活。例如，化合物可以在合適的載體如脂質(zhì)體或者稀釋劑中施用于受試者。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖液。藥用載體包括無菌水溶液或者分散體和無菌粉劑，其用于當時(extemporaneous)制備無菌注射液或者分散體。此類介質(zhì)和試劑用于藥學活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域中己知的。本文使用短語"腸胃外施用"和"腸胃外地施用"指不同于經(jīng)腸和局部施用的施用方式，通常通過注射施用，并且包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、目匡內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過上文的消毒步驟和通過包括多種抗細菌和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等確保預防微生物的存在。還希望在組合物中包括等滲劑，如糖、氯化鈉等等。此外，通過包括延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠可以延長可注射的藥物形式的吸收。不管所選的施用途徑，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將可以以合適的水合形式使用的本發(fā)明的化合物和/或?qū)⒈景l(fā)明的藥物組合物配制成藥用劑型。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以改變以便得到一定量的活性成分，其對于具體患者、組合物和施用方式有效實現(xiàn)所希望的治療應答而對患者沒有毒性。所選的劑量水平將依賴于多種藥物代謝動力學因素，包括所用的本發(fā)明的具體組合物或者其酯、鹽或者酰胺的活性、施用途徑、施用時間、所用的具體化合物的排泄速率、治療持續(xù)時間、與所用的具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)、所治療的患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康和以前的醫(yī)療史，和醫(yī)學領(lǐng)域中公知的類似因素。組合物必須是無菌和流體的以至于組合物可通過注射器遞送的程度。除了水，載體可以是等滲的緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇，等)和其合適的混合物。通過使用包衣如卵磷脂，對于分散體的情況通過保持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持合適的流動性。在許多情況中，在組合物中優(yōu)選包括等滲劑，如糖，多元醇，如甘露醇或山梨醇，和氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁或者明膠可以引起可注射組合物的長期吸收。提供下面的實施例、參考文獻、序列表和附圖幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實范圍在所附的權(quán)利要求書中給出。將理解可以在步驟中做出修改而不背離本發(fā)明的精神。序列表描述SEQIDNO:lSEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12HuMabLC5002-002的重鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-002的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-003的重鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-003的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-005的重鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-005的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-007的重鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-007的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-018的重鏈可變結(jié)構(gòu)域HuMabLC5002-018的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域K輕鏈恒定區(qū)yi重鏈恒定區(qū)附圖描述圖1顯示了抗-IL-13Ral抗體與固定的重組人IL-13Ral多肽的結(jié)合。包括多克隆兔抗人IL-13Ral抗體AF152(R&Dsystems)和抗-KLH作為陰性對照HuMab。圖2顯示了通過抗-IL-13Ral抗體對IL-13與固定的IL-13Ral/IL-4Ra受體結(jié)合的抑制。圖3顯示了通過抗-IL-13Ral抗體對IL-13與CHO細胞(表達IL-13Ral和IL-4Ra2)結(jié)合的阻斷。作為陽性對照，包括通過商業(yè)途徑可獲得的抗-IL-13Ral抗體(AF152，R&DSystems,Minneapolis,MN)。圖4顯示了抗-IL-13Ral抗體與hlL-13Ral的結(jié)合和與功能上相關(guān)的受體hlL-13Ra2和hlL-4Ra的結(jié)合性質(zhì)。圖5顯示了抗-IL-13Ral抗體能夠結(jié)合固定的重組鼠IL-13Ral多肽。包括多克隆山羊抗人IL-13Ral抗體AF152(R&DSystems)和抗KLH作為陰性對照HuMab。實施例實施例1雜交瘤的產(chǎn)生通過用表達人IL-13Ral的細胞免疫轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體，所述動物的基因組包含編碼本發(fā)明抗體的所有或者部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。然后得到動物的B細胞(例如，脾B細胞)并與骨髓瘤細胞融合形成永生化的雜交瘤細胞，其分泌針對IL-13Rctl的人單克隆抗體。可以使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生針對人IL-13Ral的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因小鼠在本文中稱作"HuMab"小鼠，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其編碼包括重(p和y)和k(kappa)輕鏈(恒定區(qū)基因)的未重排的人免疫球蛋白基因，以及失活內(nèi)源p和k鏈基因座的耙定的突變(LonbergN.,等人，Nature368(1994)856-859)。因此，小鼠顯示出小鼠IgM或者k的降低的表達，并且應答免疫，所引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變以產(chǎn)生高親和性人IgG單克隆抗體。為了產(chǎn)生針對人IL-13Ral的完全人單克隆抗體，可以用表達人IL-13Ral的細胞根據(jù)如Lonberg，N.，等人，Nature368(1994)856-859;Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO98/24884描述的一般方法免疫HuMab小鼠。優(yōu)選地，當首次免疫時，小鼠將是6—16周齡。例如，可以用IL-13Ral轉(zhuǎn)染的細胞腹膜內(nèi)免疫HuMab小鼠?？梢栽诿庖叻桨高^程中用通過眶后取血得到的血漿樣品監(jiān)視免疫應答?？梢酝ㄟ^ELISA和/或FACS篩選血漿。具有足夠效價的抗人IL-13Ral人免疫球蛋白的小鼠可以用于永生化對應的B細胞。可以用抗原靜脈內(nèi)加強小鼠，3到4天后處死并除去脾臟和淋巴結(jié)。例如，可以免疫HCo7或HCol2品種的HuMab小鼠。HCo7小鼠在它們的內(nèi)源輕鏈(k)基因中具有JKD破壞(如Chen等人(1993)EMBOJ.12:821-830中描述)，它們的內(nèi)源重鏈基因中的CMD破壞(如WO01/14424的實施例1中描述)，KCo5人k輕鏈轉(zhuǎn)基因(如Fishwild,D.M.，等人(1996)NatureBiotechnology14:845-851中描述)，和HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因(如US5，770，429中描述)。HCo12小鼠在它們的內(nèi)源輕鏈(K)基因中具有JKD破壞(如Chen,J.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830中描述)，它們的內(nèi)源重鏈基因中的CMD破壞(WO01/14424的實施例1中描述)、KCo5人K輕鏈轉(zhuǎn)基因(如Fishwild，D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo12人重鏈轉(zhuǎn)基因(如WO01/14424的實施例2中描述)?？梢苑蛛x小鼠淋巴細胞并且使用PEG基于標準方案與小鼠骨髓瘤細胞系融合以產(chǎn)生雜交瘤。然后對所得雜交瘤篩選抗原特異性抗體的產(chǎn)生。例如，將來自經(jīng)免疫的小鼠的脾臟和淋巴結(jié)來源的淋巴細胞的單個細胞混懸液用50%PEG融合到SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL1581)。將細胞以約0.75x107接種在平底微量滴定板中，然后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。然后通過ELISA和/或FACS篩選個體細胞(wells)的人抗IL-13Ral單克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，并且如果仍然對于人IgG陽性，那么可以通過有限稀釋將抗IL-13Rctl單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生用于表征的抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫程序?qū)⑷籋Co7小鼠(3只雄性)，品種GG2201(Medarex,SanJose,CA，USA),和2只HCo12小鼠(l只雄性和1只雌性)，品種GG2198(Medarex，SanJose,CA,USA)用1x106個HEK293細胞免疫，用IL-13Ral的表達載體轉(zhuǎn)染。在尾根部交替腹膜內(nèi)(i.p.)和皮下(s.c.)總共給予8次免疫。對于第一次免疫，將100pi1x106HEK293:IL-13Ral細胞與100^完全弗氏佐劑(CFA;DifcoLaboratories,Detroit,USA)混合。對于所有其他免疫，將PBS中的100pi細胞與100pi不完全弗氏佐劑(ICFA;Difco)混合。小鼠的加強當發(fā)現(xiàn)抗IL-13Ral的血清效價足夠時，在融合前4天和3天，將小鼠額外用200^PBS中的1xlO6HEK293:IL曙13Ral細胞靜脈內(nèi)(i,v,)加強兩次。實施例2通過ELISA測試HuMab與固定化的IL-13Ral的結(jié)合為了確定本發(fā)明的抗體結(jié)合重組IL-13Ral的能力，將IL-13Ral(R&DSystems,UK)的細胞外結(jié)構(gòu)域溶解在PBS(1嗎/ml)中并通過在4°C過夜溫育允許吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗滌緩沖液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween20)洗滌平板后，通過加入100pl溫育緩沖液(IB=PBS與1。/。croteinC和0.1%Tween20)并在室溫(RT)溫育30分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點。然后加入連續(xù)稀釋的HuMab和對照抗體(100pl/孔，在IB中稀釋)并在RT溫育1小時。再次洗滌平板，通過與以IB中1:500的最終稀釋度的過氧化物酶綴合的兔抗人k(DAKO,Denmark)溫育來檢測結(jié)合的人抗體。用過氧化物酶綴合的多克隆猴抗山羊IgG(SantaCruz;用IB以1:1000稀釋)檢測多克隆山羊抗hlL-13Ral抗體。在RT溫育1小時和隨后的洗滌步驟后，在室溫下黑暗中用隨時可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH)顯影平板。最高濃度的吸光度達到足夠的OD后在405nm測量吸光度。所有測試的針對IL-13Ralphal的抗體都能夠結(jié)合人IL-13Ral的固定化的細胞外結(jié)構(gòu)域。對于測試的多種LC抗體，測定的EC50值為0.5-2nM的范圍內(nèi)。陰性對照HuMab抗-KLH不結(jié)合IL-13Ral的固定的細胞外結(jié)構(gòu)域。包括作為陽性對照的多克隆山羊抗人IL-13Ral抗體也有效結(jié)合IL畫13Ral的固定的細胞外結(jié)構(gòu)域(圖1)。實施例3IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra異源二聚體結(jié)合的抑制(ELISA)將微量滴定板用PBS中3pg/ml的100^hlL-13Ral:hFc嵌合蛋白(R&DSystems,UK)在振蕩器上4。C過夜溫育。用WB洗滌平板后，加入連續(xù)稀釋的HuMab和對照抗體(100|il/孔；IB中稀釋液)并在RT溫育30分鐘。再次洗滌平板，然后加入IL-13(R&DSystems,UK;0.5|ig/ml;用IB稀釋)和IL-4Ra(R&DSystems,UK;0.75pg/ml;用IB稀釋)的混合液并在RT溫育1小時。洗漆平板后，加入濃度為0.4|ig/ml的100jal生物素化的抗IL-13抗體(BAF213;R&DSystems,UK)并在RT溫育1小時。洗滌平板后，通過用IB稀釋1:5000的過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(RocheDiagnosticsGmbH,DE)檢測結(jié)合的IL-13(RT下溫育1小時)。最后，洗滌平板并在黑暗中室溫(RT)下用隨時可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH,DE)顯影平板。45到60分鐘后測量在405nm處的吸光度?？贵wLC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018能夠抑制IL-13與異源二聚體受體的結(jié)合，最大抑制值為約50°%到80-85%。陽性對照為AF152(多克隆兔抗體)。如所預期的，陰性對照抗-KLH不抑制IL-13與異源二聚體受體的結(jié)合。對于LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018得到的ICso值為1.5nM至lJ10.1nM(圖2)。實施例4放射配體結(jié)合測定用結(jié)合緩沖液(25mMHEPES，150mMNaCl，1mMCaCl2，5mMMgCl2，禾卩0.5%牛血清白蛋白，調(diào)節(jié)到pH7.2)中表達人IL-13Ral和人IL-4Ra的CHO細胞進行125I-IL-13結(jié)合測定。將每孔lxl()S個細胞與抗體混合并預溫育15分鐘到1小時。加入.lnM125I-IL-13，并將混合物在4°C溫育4小時。從飽和結(jié)合分析、競爭性分析和確定輸入125I-IL-13達到與細胞系的平衡結(jié)合來測定用于測定法中125I-IL-13的濃度。在用1%PEI/0.5%BSA預處理的GF/C濾板上收獲樣品并在PackardTopCount閃爍計數(shù)器上計數(shù)。用PRISM使用非線性回歸曲線擬合進行數(shù)據(jù)分析(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)。所有測試的針對IL-13Ralphal的抗體都阻斷標記的IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra復合體的結(jié)合。對于抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018計算的IC5o值在0.09nM到0.32nM之間，對于AF152為84.8nM(圖3)。通過HuMab抑制人B細胞和單核細胞上IL-13誘導的CD23上調(diào)通過菲可帕克密度梯度分離外周血單核細胞(PBMC)。用RPMI洗滌細胞后，將它們重懸浮在RPMI/10%FCS中并以3xl05PBMC/孔(體積50pl)分布在96孔平底微量滴定板(ComingIncorporatedCostar)中。然后，加入RPMI/10%FCS中終濃度為0.5|ig/ml的25pi抗人CD40抗體(Immunotech)和RPMI/10%FCS中終濃度為10pg/ml的25pi抗人IgA+IgG+IgM抗體(Immunoresearch)。然后，加入連續(xù)稀釋的HuMab和對照抗體(50nl/孔；用RPMI/10%FCS稀釋)，并將細胞在培養(yǎng)箱(37。C;5%C02)中培養(yǎng)30分鐘。然后加入終濃度為0.67ng/ml的重組人IL-13(R&DSystems)(50iul/孔)并在37°C/5%C02培養(yǎng)細胞72小時。該培養(yǎng)后，離心平板并吸取培養(yǎng)基。為了貼壁細胞的脫附，加入200^Accutase(PAA)并將細胞在37°C;5%C02下溫育約5分鐘。通過反復沖洗來脫附細胞并將其轉(zhuǎn)移到圓底平板中。離心并抽出上清液后，將細胞與200pi抗畫CD23-PE、抗-CD20-FITC和抗一CD14-APC(都來自BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)的混合物溫育。將細胞在4°C溫育30分鐘，然后離心并抽出上清液。將該洗滌步驟重復一次，最后將細胞重懸浮在200piPBS/0.1。/。人血清白蛋白中并使用CellQuest軟件在FACSCalibur流式細胞儀(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego，CA)中分析。在多數(shù)情況中，獲得10000個事件并在光散射柵(gate)上選通(gate)以僅僅包括活的淋巴細胞和單核細胞。將細胞在B淋巴細胞的CD19陽性簇或者單核細胞的CD14陽性簇上預選通(pregate)并進一步分析CD23表達。對B淋巴細胞上CD23上調(diào)的抑制觀察到的ICso值對于抗體LC5002-002、LC5002-圖、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018為0.5nM到>70nM，對于AF152為13.6nM。對于人單核細胞上IL-13誘導的CD23上調(diào)的抑制發(fā)現(xiàn)了類似圖譜。在單核細胞上，對于抗體LC5002-002、LC5002畫003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018的IC5o值為0.1nM到62.8nM，對于AF152為62.9nM。實施例6應答作為刺激物的IL-13或者IL-4的TF-1增殖測定TF-1細胞(ATCC#CRL2003)生長在含有ATCC改良的RPMI,10%FBS，1X青霉素/鏈霉素,2ng/mlGM-CSF的培養(yǎng)基中。在測定前一天，將細胞在無GM-CSF的培養(yǎng)基中保持。將每孔5x103個細胞與合適濃度的抗一IL-13Ral抗體在37。C溫育1小時。然后，細胞用2ng/ml人IL-13(R&DSystems,Minneapolis,MN)或者0.1ng/ml人IL-4(R&DSystems,Minneapolis,MN)刺激并在37'C溫育48小時。將細胞用0.5^Ci31-胸苷脈沖并在37。C溫育16—18小時。用PerkinElmerFiltermate96收獲器收獲樣品到用1%PEI/0.25%BSA預處理的GFC平板上。在PerkinElmerTopcountScintillation計數(shù)器上對GFC平板計數(shù)。用非線性回歸曲線擬合在PRISM中進行數(shù)據(jù)分析(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)?？挂籏LH抗體在該測定中沒有顯示出任何抑制。對于LC5002-007也是這樣。所有其他抗體都抑制該應答，即使LC5002-007比其他抗體以更高的IC值抑制該應答。對不同抗體觀察到的ICs。值A(chǔ)F152為13.50nM，LC5002-002為9.21nM，LC5002-003為3.07nM禾口LC5002-005為0.39nM。對于IL-4誘導的TF-1細胞增殖觀察到類似的圖譜，然而，抗體的效力與IL-13誘導的應答相比降低。IL-4誘導的增殖的ICso值抗-IL4R抗體為0.02nM，AF152為74.37nM，對于抗體LC5002畫002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018在4.68nM到60nM之間。實施例7通過人肺成纖維細胞對應答IL-13的嗜曙紅粒細胞趨化因子(eotaxin)的產(chǎn)生的抑制該測定用HFL-1細胞(人肺成纖維細胞，ATCC弁CCL-153)進行。將細胞以每孔100,000個細胞的密度接種在12孔板中并在37'C培養(yǎng)72小時以達到匯合。然后將細胞在無血清的培養(yǎng)基中饑餓24小時并用抗-IL-13Ral抗體在37t:處理1小時。該處理后，用10ng/mlIL-13(R&DSystems,Minneapolis,MN)在37。C刺激細胞48小時。收集上清液并使用從R&DSystems(Cat.No.DTX00)可購買的ELISA進行嗜曙紅粒細胞趨化因子測定。用Spectromax微量板讀數(shù)儀讀數(shù)吸光度，并利用PRISM(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)分析數(shù)據(jù)。測試的抗體顯示出抑制嗜曙紅粒細胞趨化因子釋放的不同的能力。除了LC5002-007之外，所有測試的其它抗體都顯示出一定的抑制。來自3到4次不同的實驗的計算的平均ICso值對于AF152為11.5nM，對于抗體LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018在2.45nM至lj19.8nM之間。實施例8人支氣管平滑肌細胞中IL-13誘導的Stat-6磷酸化的抑制按照生產(chǎn)商的使用說明書培養(yǎng)人支氣管平滑肌細胞(BSMC;Clonetics,Cat.NoCC-2576)。將細胞在12孔組織培養(yǎng)板中生長直到它們達到匯合。將細胞在無血清的培養(yǎng)基中饑餓24小時并加入不同量的抗體。將平板溫育1小時然后用2.5ng/mlIL-13(R&DSystem)刺激。溫育15分鐘后，除去上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞并加入100nl裂解緩沖液?；旌衔镌诒焖俪曁幚聿㈦x心。裂解物用于磷酸化的Stat-6的蛋白質(zhì)印跡檢測。將等量的蛋白質(zhì)裝入SDS-凝膠，電泳并轉(zhuǎn)移到膜。使用來自SantaCruzBiotechnology的抗Stat-6抗體(Cat.No.St-11762R)和偶聯(lián)到過氧化物酶的二級抗體。用Amersham的ECLPlusSystem(CatNoRPN2132)進行檢測。在Typhoon9400Imager中進行定量。在該測定中測試的兩種HuMabs(LC50002-003和LC5002-005)都抑制IL-13誘導的Stat-6磷酸化。在該測定中發(fā)現(xiàn)的效力類似于其他功能測定。計算的ICso值為AF152為18.64nM，LC5002-003為5.98nM，和LC5002-005為1.18nM。實施例9抗hlL-13RalHuMab可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(k輕鏈和Yl重鏈)的克隆和序列分析通過標準cDNA合成/PCR程序分離編碼抗hIL-13RalHuMab的輕鏈可變區(qū)VL和重鏈可變區(qū)Vh的核昔酸序列。用GeneRacerTM試劑盒(Invitrogen)從lx106-lxl()7個雜交瘤細胞制備總RNA。來自雜交瘤的RNA用作第一鏈cDNA合成和GeneRacerTM0iig0_dT引物連接的模板。分別用與k輕鏈和Yl-重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列互補的反向輕鏈和重鏈引物和5，特異性GeneRacerTM引物進行第二鏈cDNA合成和編碼Vl和Vh的cDNA片段的進一步PCR擴增。用來自InvitrogenLifeTechnologies的TOPOTA克隆試劑盒和pCR4-TOPOTM作為克隆載體克隆PCR產(chǎn)物。通過使用EcoRI消化對合適質(zhì)粒的限制性作圖鑒定克隆的PCR產(chǎn)物，Vl和Vh的預期的/計算的DNA片段大小分別為740bp和790bp。通過雙鏈測序測定克隆的PCR片段的DNA序列。GCG(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)軟件包10.2和Vector-NTI8(InforMax,Inc)用于一般的數(shù)據(jù)處理。用GCG模塊CLUSTALW比對DNA和蛋白質(zhì)序歹U。用程序GENEDOC(版本2.1)進行序列比對。實施例10構(gòu)建抗hlL-13RalIgGlHuMab的表達質(zhì)粒將抗hIL-13RalHuMab輕鏈和重鏈編碼基因分別裝配在哺乳動物細胞表達載體中。由此，將編碼抗hlL-13RalHuMab輕鏈可變區(qū)(VO和人k輕鏈恒定區(qū)(CbSEQIDNO:ll)的基因區(qū)段與抗hIL-13RalHuMab重鏈可変區(qū)(Vh)和人Yl-重鏈恒定區(qū)(ch廣鉸鏈-ch2-ch3，SEQIDNO:12)的基因片段一樣連接。關(guān)于給予密碼子選擇的人輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息見Kabat，E.A"Wu,T.T"Perry,H.M.,Gottesman,K,S"andFoeller,C.,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.，NIHPublicationNo.91-3242。抗hlL-13RalHuMabk輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下面的元件組成來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，包括Kozak序列的合成的5'-UT，包括信號序列內(nèi)含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，克隆的抗hlL-13RalHuMab可變輕鏈cDNA，在5，末端排列唯一的Bsml限制性位點，在3'末端是剪接供體位點和唯一的Notl限制性位點，基因組人k-基因恒定區(qū)，包括內(nèi)含子2小鼠Ig-k增強子[Picard,D.,禾卩Schaffner，W.,Nature307(1984)80-82]和人免疫球蛋白k-多聚腺苷酸化("polyA")信號序列。抗hlL-13RalHuMabyl重鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下面的元件組成-來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，包括Kozak序列的合成的5'-UT，包括信號序列內(nèi)含子的經(jīng)修飾的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，克隆的抗WL-13Ral-HuMab可變重鏈cDNA，在5'末端排列唯一的Bsml限制性位點，在3'末端是剪接供體位點和唯一的Notl限制性位點，基因組人，重鏈基因恒定區(qū)，包括小鼠Igp增強子(Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378)，人Yl免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信號序列?？筯lL-13RalHuMabk輕鏈和^重鏈表達質(zhì)粒的功能元件除了抗hlL-13RalHuMabk-輕鏈或者yl重鏈表達盒外，這些質(zhì)粒還含有潮霉素抗性基因EB病毒(EBV)的復制起點oriP來自載體pUC18的復制起點，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復制，和卩內(nèi)酰胺酶基因，其賦予大腸桿菌中的氨芐青霉素抗性。實施例11突變的(變體)抗hlL-13RalIgGl的表達質(zhì)粒的構(gòu)建編碼突變的抗hlL-13RalYl-重鏈的表達質(zhì)?？梢酝ㄟ^野生型表達質(zhì)粒的位點定向誘變使用QuickChange位點定向誘變試劑盒(Stratagene)產(chǎn)生并且在表l中描述。根據(jù)EU編號[Edelman,G.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85;Kabat，E.A.，Wu,T.T.,Perry,H.M.，Gottesman，K.S.,禾口Foeller，C.，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.,NIHPublicationNo.91-3242]對氨基酸編號。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施例12重組抗ML-13RalHuMab的產(chǎn)生通過在補充10%ultra-lowIgGFCS(Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco),1%v/v非必需氨基酸(Gibco)和250|ig/mlG418(RocheDiagnosticsGmbH,DE)的DMEM(Gibco)中瞬時轉(zhuǎn)染貼壁的HEK293-EBNA細胞(ATTCCRL-10852)產(chǎn)生重組HuMabs。對于轉(zhuǎn)染FugeneTM6(RocheDiagnosticsGmbH,DE)，以3:1到6:1的試劑(^)與DNA(ng)的比例使用轉(zhuǎn)染試劑。使用1:2到2:1的輕鏈與重鏈編碼質(zhì)粒的摩爾比，從兩種不同的質(zhì)粒表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈。在轉(zhuǎn)染后第4到11天收獲含有HuMab的細胞培養(yǎng)上清液。關(guān)于人抗體在例如HEK293中的重組表達的一般信息在Meissner,P.,等人，BiotechnolBioeng75(2001)197-203中給出。實施例13a)使用嵌合hlL-13Ral:hFc對HuMabsLC5002-003、-005和-007的親和分析Biacore3000儀器用于相互作用分析。作為運行和反應緩沖液，使用25。C的HBS-P(10mMHEPES,150mMNaCl，0.005%polysurfactantP，pH7.4)。捕獲分子(山羊抗人-IgG，F(xiàn)cY特異的)以20pg/ml的濃度5pl/min的流速進行胺偶聯(lián)20分鐘。以1pg/ml的濃度10pl/min的流速注射HuMabsl分鐘。通過注射500nM和30iid/min的人Y球蛋白3分鐘實現(xiàn)游離的山羊抗人IgQFCy的封閉。將分析物(hlL-13Ral:hFc嵌合蛋白)以5.63nM到90nM之間的5個濃度注射兩分鐘并用HBS-P洗滌5分鐘。通過兩次注射100mMHCl，每次1分鐘，完成表面的再生。芯片、測定形式和注射的順序和動力學數(shù)據(jù)對應于表2中的描述。從樣品曲線扣除陰性對照數(shù)據(jù)(例如，緩沖液曲線)用于校正系統(tǒng)內(nèi)在基線漂移和減小噪聲信號。用BiaEvaluation版本4.01分析傳感圖(sensorgram)禾卩計算親和性數(shù)據(jù)。通過將動力學數(shù)據(jù)擬合1:1Langmuir結(jié)合模型計算動力學數(shù)據(jù)(表2)。表2:使用hlL-13Ral:hFc對HuMabs的親和性分析?；?:1Langmuir結(jié)合模型的數(shù)據(jù)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>b)使用從hlL-13Ral:hFc嵌合蛋白切割的ML-13Ral的細胞外結(jié)構(gòu)域?qū)uMabsLC5002-003、-005和-007的親和性分析Biacore3000儀器用于相互作用分析。運行和反應緩沖液為25。C的HBS-P(10mMHEPES，150mMNaCl,0.005%polysurfactantP,pH7.4)。捕獲抗體分子(抗hFqO以100嗎/ml的濃度5pl/min的流速進行胺偶聯(lián)20分鐘。以10嗎/ml的濃度和10)il/min的流速注射HuMabs30秒。以1.56nM到100nM之間的七種濃度注射切割的hlL-13Ral分子(Mw40kDa)200秒并用HBS-P洗滌5分鐘。通過以10|ig/ml的流速兩次注射100mMHCl，每次1分鐘，完成表面的再生。芯片、測定形式和注射的順序和動力學數(shù)據(jù)對應于下面表3中的描述。通過將動力學數(shù)據(jù)擬合1:1Langmuir結(jié)合模型計算動力學數(shù)據(jù)。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>c)使用從WL-13Ral:hFc嵌合蛋白切割的hlL-13Ral的細胞外結(jié)構(gòu)域?qū)C5002-005的重組變體的比較親和分析在這些實驗中，將來自雜交瘤的最初的IgGl的親和性與重組變體IgGl-Ala-Ala的親和性比較。對于相互作用分析，使用Biacore3000儀器。運行和反應緩沖液為25°C的HBS-P(10mMHEPES，150mMNaCl,0.005%polysurfactantP,pH7.4)。捕獲抗體分子(抗Fcy)以20嗎/ml的濃度5pl/min的流速進行胺偶聯(lián)20分鐘。以10pg/ml的濃度和10pl/min的流速注射HuMabs。以1.56nM到200nM之間的八種濃度注射切割的hlL-13Ral分子(分析物)5分鐘并用HBS-P洗滌5分鐘。通過兩次注射100mMHC1，每次1分鐘，完成表面的再生。芯片、測定形式和注射的順序和動力學數(shù)據(jù)對應于表4中的描述。通過將動力學數(shù)據(jù)擬合二價分析物結(jié)合模型計算動力學數(shù)據(jù)。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實施例14通過ELISA測試HuMab與hlL-13Ra2和ML-4Ra的交叉反應性將嵌合蛋白hlL-13Ra2:hFc和hlL-4Ra:hFc(R&DSystems,UK)溶解在PBS(1pg/ml)中并通過在4°C過夜溫育允許吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗滌緩沖液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween20)洗滌平板后，通過加入100pl溫育緩沖液(IB=含有1%croteinC和0.1%Tween20的PBS)并在室溫(RT)溫育30分鐘封閉非特異性結(jié)合位點。然后加入連續(xù)稀釋的HuMab和對照抗體(IOOpl/UIB中稀釋液)并在RT溫育1小時。再次洗滌平板并通過用IB中1:500的最終稀釋度的過氧化物酶綴合的兔抗人k(DAKO，Denmark)溫育檢測結(jié)合的抗體。在RT溫育1小時和隨后的洗滌步驟后，平板在黑暗中RT下用現(xiàn)成可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH,DE)顯色。最高濃度的吸光度達到足夠的OD后在405nm測量吸光度。測試的所有針對IL-13Ralphal的抗體都能夠結(jié)合人IL-13Ral的固定化的細胞外結(jié)構(gòu)域，但是不結(jié)合hlL-13Ra2或hlL-4Rcx(圖4)。實施例15HuMab與鼠IL-13Ral的交叉反應性將嵌合的蛋白質(zhì)鼠IL-13Ral:hFc(R&DSystems,UK)溶解在PBS(1Itig/ml)中并通過在4°C過夜溫育允許吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗滌緩沖液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween20)洗滌平板后，通過加入100pl溫育緩沖液(IB=含有1%croteinC和0.1%Tween20的PBS)并在室溫(RT)溫育30分鐘封閉非特異性結(jié)合位點。然后向孔中加入連續(xù)稀釋的HuMab和對照抗體(HuMab抗-KLH和多克隆山羊抗-hlL-13Rotl(R&DSystems))(100ial/孔，在IB中的稀釋液)并在RT溫育1小時。再次洗滌平板，并通過與在IB中1:500的最終稀釋度的過氧化物酶綴合的兔抗人k(DAKO,Denmark)溫育來檢測結(jié)合的人抗體。通過過氧化物酶綴合的猴抗山羊IgG((SantaCruz;IB中1:1000)檢測與平板結(jié)合的山羊抗hlL-13Rcd抗體。在室溫溫育1小時和隨后的洗滌步驟后，平板在黑暗中RT下用現(xiàn)成可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH，DE)顯色。最高濃度的吸光度達到足夠的OD后在405nm測量吸光度(圖5)。實施例16HuMab與獼猴IL-13Ral的交叉反應性通過RT-PCR從獼猴組織分離編碼IL-13Ral的基因并轉(zhuǎn)染到鼠細胞系Ba/F3中。為了測試HuMabs是否與獼猴IL-13Ral交叉反應，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ba/F3細胞以及親本Ba/F3細胞與10|iig/mlHuMab和對照抗體溫育。使用多克隆的山羊抗hlL-13Ral(R&DSystems)作為陽性對照。包括的陰性對照為人IgGl骨髓瘤蛋白(Nordic)和正常山羊血清。使用針對綴合到FITC用于檢測HuMabs的人IgG的抗體和針對綴合到FITC用于檢測山羊抗體的針對山羊IgG的抗體通過FACS分析檢測結(jié)合的抗體。對在轉(zhuǎn)染的Ba/F3系和親本系上測試的各抗體比較平均熒光強度(MFI)。本發(fā)明的所有HuMabs都能夠結(jié)合在轉(zhuǎn)染的Ba/F3細胞中表達的獼猴IL-13Rctl。如從人和獼猴IL-13Ral之間的密切同源性預測的，多克隆的AF152抗體也結(jié)合獼猴IL-13Ral。陰性對照當用轉(zhuǎn)染的Ba/F3細胞系測試時僅顯示出MFI的可忽略不計(marginal)的增加(表5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實施例17IL-13RalHuMabs對Fcry受體的結(jié)合(NK細胞上FcyRIIIa的結(jié)合)為了測試本發(fā)明的抗體結(jié)合自然殺傷(NK)細胞上FcyRIIIa的能力，分離外周血單核細胞(PBMCs)并在20ng/ml針對FcyRIIIa的封閉性鼠抗體(抗-CD16,克隆3G8，RDI,Flanders,NJ)的存在或不存在下與20嗎/mlHuMab抗體和對照抗體溫育，以驗證通過FqRIIIa的結(jié)合。使用不結(jié)合FcyRIIIa的人IgG2和IgG4(TheBindingSite)作為陰性對照。將人IgGl和IgG3(TheBindingSite)作為用于FcyRIIIa結(jié)合的陽性對照。使用PE標記的小鼠抗人CD56(NK細胞表面標記)抗體(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)組合以FITC-標記的山羊F(ab)2抗人IgG(Fc)抗體(Protosimmimoresearch,Burlingame,CA)通過FACS分析檢測NK細胞上結(jié)合的抗體。確定20ng/ml(Bmax:MFI士標準誤差)HuMab下的最大結(jié)合。如通過580.6±245.8的Bmax(MFI)值所示的，LC5002-005能夠有效結(jié)合FqRIIIaI(與對照IgGl抗體相當)。加入針對FcyRIIIa的封閉抗體顯著減小LC5002-005與NK細胞的結(jié)合(260.4±95.90的Bmax(MFI)值)，表明對FcYRIIIa的特異結(jié)合。參考文獻列表Aikawa，M.，等人，Cytokine13(2001)75-84Aplin，J.D.,andWriston,J.C.Jr.,CRCCrit,Rev.Biochem.(1981)259-306Ausubel,F.,等人，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)Barnes,L.M.,等人，Cytotechnology32(2000)109-123Barnes,L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270Berge,S.M.，等人，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95Bruegg隱nnM.，等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361Bruggemann,M.,等人，YearImmunol.7(1993)33-40Brunhouse,R.，andCebra，J丄，Mol.Immunol.16(1979)907-917Burton,D.R.,等人，Nature288(1980)338-344Carter,P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289Chen,J.，等人，InternationalImmunology5(1993)647-656Chen,J.，等人，EMBOJ.12(1993)821-830Choi,T.K.,等人，NatureGenetics4(1993)117-123Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss(1985)p.77Durocher,Y.,等人，Nicl.Acids.Res.30(2002)E9Edelman，G.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85Edge,A.S.,等人，Anal.Biochem.118(1981)131-137EP0307434Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851Geisse,S.,等人，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282Graber,P.,等人，Eur.J,Immunol.28(1998)4286-4298Harding,F.，andLonberg,N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546Hezareh,M,,等人，J.Virol.75(2001)12161-12168Hoogenboom,H.R.,andWinter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388Idusogie,E.E.,等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184Jakobovits,A.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555Jakobovits,A.，等人，Nature362(1993)255-258Jones,P.，等人，Nature321(1986)522-525Kabat,E.A.,等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,(1991)，NIHPublicationNo.91-3242Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161Lonberg,N.,等人，Nature368(1994)856-859Lonberg,N.,HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101Lonberg,N.,andHuszar，D.,Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93Love,T.W.,等人，MethodsEnzymol.178(1989)515-527Lukas,T丄，等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202Marks,J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597Meissner,P.,等人，BiotechnolBioeng75(2001)197-203Morgan,A.，等人，Immunology86(1995)319-324Morrison,S丄.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378Norderhaug,L.,等人，J.Immunol.Methods204(1997)77-87Obiri,N丄，etal,J.Biol.Chem.270(1995)8797-8804Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837Picard,D.,andSchaffner，W.,Nature307(1984)80-82Poudrier,J.,等人，J.Immunol.30(2000)3157-3164PoudrierJ.,等人，J.Immunol.,163(1999)1153-1161Queen,C"等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033Riechmann,L.,等人，Nature332(1988)323-327Schlaeger，E,J.，andChristensen,K.,Cytotechnology30(1999)71-83Schlaeger,E.-J,，J.Immunol.Methods194(1996)191-199Sojahr，H.T.，andBahl,O,P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57SwissProtNo.O0%30SwissProtNo.P24394SwissProtNo.P35225SwissProtNo.P78552SwissProtNo.Q14627Taylor,L.,等人，NucleicAcidsResearch20(1992)6287-6295Taylor,L"等人，Int.Immunol.6(1994)579-591Thommesen,J.E.,等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004Thotakura,N.R.,andBahl,O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359Tuaillon,N.,等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA90(1993)3720-3724Tuaillon,N.,等人，Immunol.152(1994)2912-2920美國專利號4,640,835美國專利號4,496,689美國專利號4,301,144美國專利號4，670，417美國專利號4,791,192美國專利號4,179,337美國專利號5,202,238美國專利號5,204,244美國專利號5,545,806美國專利號5,545,807美國專利號5,569,825美國專利號5,625,126美國專利號5,633,425美國專利號5,661,016美國專利號5，770，429美國專利號5,789,650美國專利號5，814，318美國專利號5，874，299美國專利號5,877,397vanDijk,M.A.,andvandeWinkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol5(2001)368-374Werner,R.G.，DrugRes.48(1998)870-880WO,5330WO92/22645WO92/03918WO93/1227WO94/25585WO96/29417WO97/15663WO98/24884WO01/14424WO03/08067權(quán)利要求1.抗體，其特征是所述抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR3選自由SEQIDNO1、3、5、7或9的重鏈CDR3序列組成的組。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征是所述抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR1和CDR2選自由SEQIDNO:1、3、5、7或9的重鏈CDR1和CDR2序列組成的組。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體，其特征是所述抗體的可變輕鏈氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3選自由SEQIDNO:2、4、6、8或10的可變輕鏈氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3組成的組。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3的抗體，其特征是包含人Yl-重鏈，該Yl-重鏈包含a)氨基酸序列Pro233Val234Ala235，其缺失Gly236，和/或氨基酸序列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331，b)氨基酸序列Ala234Ala235或c)氨基酸Ala加和Ala297。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的抗體，其特征是它是人抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求1到5的抗體，其特征是它對IL-13Ral的結(jié)合親和力為IO-9M(Kd)或更小，優(yōu)選10-9到l(T13M。7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的抗體，其從雜交瘤細胞系DSMACC2709、DSMACC2710、DSMACC2711或DSMACC2712獲得。8.根據(jù)權(quán)利要求1到7的抗體，其特征是包含作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:1和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:2，作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:3和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:4，作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:5和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:6，作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:7和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:8,或作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:9和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:IO。9.根據(jù)權(quán)利要求1到6的抗體，其特征是包含a)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:1，作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:2，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為Yl重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，b)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:3和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:4，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為^重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，c)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:5和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:6，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，d)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:7和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:8，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12，或e)作為重鏈可變區(qū)的SEQIDNO:9和作為輕鏈可變區(qū)的SEQIDNO:10，作為k輕鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:11和任選具有突變L234A和L235A或D265A和N297A的作為Yl重鏈恒定區(qū)的SEQIDNO:12。10.根據(jù)權(quán)利要求1到9的抗體用于生產(chǎn)藥物組合物的用途。11.藥物組合物，其包含藥學有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到9的抗體。12.重組宿主細胞，其能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1到9的重組抗體。13.生產(chǎn)包含藥學有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到9的抗體的藥物組合物的方法。14.核酸，其編碼能夠與下面定義的各自另一抗體鏈一起裝配的多肽，其中所述多肽任一個為a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重鏈CDR的抗體重鏈；b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的輕鏈CDR的抗體輕鏈，其中所述CDR相互獨立地選擇。15.包含根據(jù)權(quán)利要求14的核酸的表達載體，其能夠在原核或者真核宿主細胞中表達所述核酸。16.包含根據(jù)權(quán)利要求15的載體的原核或者真核宿主細胞。17.產(chǎn)生結(jié)合IL-13Ral并且抑制IL-13與IL-13Rctl的結(jié)合的多肽的方法，其特征是在原核或者真核宿主細胞中表達根據(jù)權(quán)利要求14的編碼重鏈的核酸和編碼輕鏈的核酸并從所述細胞回收所述多肽。18.治療需要哮喘或者抗變應性治療的患者的方法，其特征是對所述患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到9的抗體。19.制備藥物組合物的方法，其特征是通過重組表達產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1到9的抗體，回收所述抗體并將所述抗體與藥用緩沖劑和/或佐劑組合。20.雜交瘤細胞系DSMACC2709、DSMACC2710、DSMACC2711或DSMACC2712。全文摘要結(jié)合IL-13Rα1、抑制IL-13生物活性并包含可變重鏈和可變輕鏈的抗體，其特征是所述抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR3選自由SEQIDNO1、3、5、7或9的重鏈CDR3序列，該抗體用于治療哮喘和變應性疾病。文檔編號A61P37/08GK101098892SQ200680001753公開日2008年1月2日申請日期2006年1月2日優(yōu)先權(quán)日2005年1月3日發(fā)明者伊沃·格勞斯,保羅·帕倫,凱-貢納爾·施圖本勞赫,塞巴斯蒂安·諾伊曼,弗蘭克·雷貝阿斯,揚·施特拉克,揚·范德溫克爾,拉爾夫·舒馬赫,斯特凡·澤貝爾,桑德拉·韋雷科恩-韋普勒格恩,瑪麗亞·芬特斯,約爾格·雷古拉,約瑟夫·恩德爾,阿德爾伯特·格羅斯曼,馬丁·范武格特申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司