專利名稱：金屬富勒醇及其在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型納米材料及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。具體地說，涉及通式為M@C2m(OH)x的金屬富勒醇納米顆粒及其在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用，其中，M選自Gd，La等稀土金屬，10≤X＜50。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前已成為人類死亡的主要原因。在中國，肝癌，肺癌，胃癌和乳腺癌是發(fā)病率最高的腫瘤。目前全世界每年至少有700萬人死于癌癥，其中我國約130萬。癌癥除了致人死亡外，也給家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。新抗腫瘤藥物的不斷發(fā)現(xiàn)及深入研究已使腫瘤化學(xué)治療成為學(xué)科并使腫瘤內(nèi)科學(xué)得以誕生。但是，抗腫瘤藥的研究面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，這就是多數(shù)常見實(shí)體瘤如肺癌、肝癌、結(jié)腸癌及胰腺癌等還缺乏有效藥物，不少抗腫瘤藥在臨床應(yīng)用過程中產(chǎn)生耐藥性，副作用極大。環(huán)磷酰胺、阿霉素、順鉑、紫杉醇等在起到治療作用的同時(shí)，產(chǎn)生骨髓抑制、消化道劇烈反應(yīng)、腎臟毒性等等度副作用，嚴(yán)重地限制了其臨床使用劑量。因此，新型抗腫瘤藥物研究勢在必行。
在生命科學(xué)研究中，納米顆粒已經(jīng)顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢和誘人的應(yīng)用前景，如靶向性納米藥物載體、疾病高效檢測的量子點(diǎn)、高效醫(yī)學(xué)成像以及腫瘤治療技術(shù)相關(guān)的納米材料等，已經(jīng)成為國際前沿科學(xué)問題。
富勒烯C60是一種由碳原子構(gòu)成，納米尺度的球體分子，具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用前景。Friedman等于1993年在J.Am.Chem.Soc.1156506-6509理論計(jì)算模擬了富勒烯C60衍生物可以抑制HIV病毒的活性C60是強(qiáng)疏水性球形分子，直徑為0.71nm，而HIV是末端開口的圓柱狀分子，尺寸與C60直徑相似，其活性位置表面也是強(qiáng)疏水性的，兩者有可能以共價(jià)鍵結(jié)合，從而阻止HIV病毒的生長。含有14核苷酸富勒烯衍生物和DNA的加合物可形成較穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，在光催化下可對DNA進(jìn)行選擇性的位點(diǎn)切割。
由于富勒烯及其許多衍生物是疏水性的，無法與人體內(nèi)“靶分子”作用，使得它們在生物化學(xué)領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用受到很大的限制。近年來，研究合成水溶性富勒烯衍生物方面的突破和成功，大大加速和拓寬了C60衍生物在生物方面的應(yīng)用。在水環(huán)境中，羥基衍生化的富勒烯并不是以單獨(dú)的分子形式存在的，而是通過與大分子相互作用團(tuán)聚成納米顆粒物，這些顆粒物有很好的生物親和性(Sayes CM et al，Nano Lett，2004，4(10)1881-1887.Dugan LL et al，Proc Natl Acad Sci USA 1997；949434-9439.Mirkova SM et al，NitricOxide 2004；11201-207.Chiang LY et al，J Org Chem 1994，59；3960-3968)。發(fā)表在2004年10月份Nano Lett的一篇論文中(Sayes CM et al，Nano Lett，2004，4(10)1881-1887)，Rice大學(xué)Colvin指出富勒烯的細(xì)胞毒性高度依賴于其碳籠表面是否修飾和修飾的基團(tuán)。在兩種細(xì)胞系中，不同的結(jié)構(gòu)的毒性可相差7個(gè)數(shù)量級，以富勒烯毒性最大，富勒醇(C60(OH)24)最小。富勒醇(C60(OH)24)的LD50＞5,000ppm，而富勒烯的LD50為20ppb。人們對富勒烯及其衍生物在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)的分布進(jìn)行了初步的研究。Nakamura等于1994年首先合成了14C標(biāo)記的一種富勒烯吡咯環(huán)衍生物，并研究了它在小鼠體內(nèi)的生物分布和藥物代謝，通過尾靜脈注射到SD大鼠，化合物很快分布到小鼠身體的各個(gè)器官，90-95％富集于肝臟。166Ho@C82(OH)x則顯出生物分布較廣，在肝、骨骼、脾、腎、肺的含量依次遞減，其它組織分布極低(Cagle DW et al.，Proc Natl Acad Sci 1999；965182-5187)。
過去幾年，籠內(nèi)包金屬富勒烯的研究已取得很大進(jìn)展，迄今為止，三價(jià)金屬原子(Sc，Y)、堿土金屬原子(Ca，Sr，Ba)、堿金屬原子(Li，Na，K，Cs)和四價(jià)金屬原子(Zr，Hf)等已成功地被包籠到富勒烯內(nèi)，形成了單原子、雙原子、三原子金屬包籠物?；\內(nèi)包金屬富勒烯的許多優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì)使它們有可能發(fā)展成為超導(dǎo)、有機(jī)鐵磁體、非線性光學(xué)材料、功能分子開關(guān)，核磁造影劑、生物示蹤劑等新型材料(Bolskar RD et al.，J Am Chem Soc 2003；1255471-5478)。

發(fā)明內(nèi)容
我們知道，腫瘤組織較正常組織富含血管，且腫瘤組織的毛細(xì)血管壁上有許多納米尺寸的孔徑，營養(yǎng)物質(zhì)可通過這些孔徑滲透到腫瘤組織之中。假設(shè)這些血液通道恰好被同尺寸的納米粒子所堵塞，就會抑制血液的流通，使腫瘤不能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而中斷了腫瘤組織的生長。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了一種金屬富勒醇化合物，其分子直徑約為1nm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金屬富勒醇納米顆粒有很強(qiáng)的腫瘤抑制作用，當(dāng)其在溶液中形成直徑為1-200nm的顆粒時(shí)腫瘤抑制效果更佳，其作用機(jī)制不是通過對腫瘤細(xì)胞的直接殺死作用而完成的。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種金屬富勒醇。
本發(fā)明的另一目的是提供一種腫瘤抑制組合物，其中含有治療有效的金屬富勒醇顆粒和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的再一目的是提供一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包含以下方案一種金屬富勒醇，它以通式表示，通式中，M選自La，Gd等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50。
上述化合物包括一個(gè)磁性中心金屬離子M和一個(gè)由C原子構(gòu)成的納米碳籠，其表面存在許多羥基基團(tuán)，因此M@C2m(OH)x在生物體內(nèi)有很好的生物親和性。(參見圖1)同時(shí)，由于羥基基團(tuán)的存在，與金屬富勒烯比較毒性大大降低。
由于相鄰羥基的重排，實(shí)際上碳籠上O的數(shù)目與H的數(shù)目會有一些不同，因此，也可以將上述通式寫成M@C2mOxHy形式。
本發(fā)明的通式為M@C2m(OH)x(m＝41或30；10≤X＜50)的金屬富勒醇，其中M為La。
本發(fā)明的通式為的M@C2m(OH)x(m＝41或30；10≤X＜50)金屬富勒醇，其中M為Gd。
一種腫瘤抑制組合物，其中含有以通式M@C2m(OH)x表示的金屬富勒醇，通式中，M選自Gd、La等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50。
一種腫瘤抑制組合物，其中含有以通式[M@C2m(OH)x]n表示的金屬富勒醇納米顆粒，通式中，M選自Gd、La等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50；n表示團(tuán)聚成該金屬富勒醇納米顆粒的金屬富勒醇分子數(shù)，1≤n＜200。
通式為M@C2m(OH)x的金屬富勒醇通過大分子相互作用可團(tuán)聚成納米顆粒物。在溶劑環(huán)境中，可以通過選擇溶劑、控制濃度及超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒。
上述組合物還可包括溶劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。上述溶劑優(yōu)選水、生理鹽水、Tris-HCl溶液或磷酸鹽緩沖液。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑，填充劑，吸收促進(jìn)劑等。
本發(fā)明的腫瘤抑制組合物，其中，所述的組合物中金屬富勒醇在溶劑中的濃度優(yōu)選為1×10-5～1mmol/L。當(dāng)濃度高于1mmol/L時(shí)金屬富勒醇的溶解性能降低，易團(tuán)聚成較大顆粒。金屬富勒醇終濃度在1×10-5～1mmol/L之間，對細(xì)胞無明顯毒性作用。
上述腫瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮膚癌。
一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用，該金屬富勒醇以通式M@C2m(OH)x表示，通式中，M選自Gd，La等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50。所述腫瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮膚癌。
一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用，該藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)優(yōu)選為5×10-8～1×10-2mmol/kg/天。上述針對人的給藥量是由藥效實(shí)驗(yàn)的小鼠給藥量1×10-6～2×10-1mmol/kg/天換算得來的。
一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用，該藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)更優(yōu)選為5×10-6～1.25×10-4mmol/kg/天。上述針對人的給藥量是由藥效實(shí)驗(yàn)的小鼠給藥量1×10-4～2.5×10-3mmol/kg/天換算得來的。
上述腫瘤抑制組合物優(yōu)選通過靜脈注射、腹腔內(nèi)注射、口服或局部給藥等方式施用于需要治療的患者。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將上述腫瘤抑制組合物制成注射用溶液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺、順鉑、紫杉醇等相比，金屬富勒醇M@C2m(OH)x具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為M@C2m(OH)x分子結(jié)構(gòu)示意2為Gd@C2m的HPLC分離結(jié)果譜圖(5PBB柱)。
圖3為Gd@C82(OH)22(a)和Gd@C82(OH)12(b)的C1s電子的XPS譜。
圖4為生理鹽水溶液中[Gd@C82(OH)22]n納米顆粒的高分辨AFM圖。
圖5為Gd@82(OH)22低劑量組注射后小鼠H22肝癌的生長曲線圖。
圖6為Gd@C82(OH)22高劑量組注射后小鼠H22肝癌的生長曲線圖。
圖7為CTX組腫瘤抑制率和劑量關(guān)系曲線圖。
圖8為Gd@C82(OH)22組腫瘤抑制率和劑量關(guān)系曲線圖。
圖9為鼠肝癌H22模型不同治療組腫瘤組織病理切片照片。其中，A、B為對照組；C、D為Gd@C82(OH)22治療組；E、F為環(huán)磷酰胺治療組。
圖10為La@C82(OH)18注射后小鼠Lewis肺癌的生長曲線圖。
圖11為金屬富勒醇Gd@C82(OH)22對人肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響。
圖12為金屬富勒醇Gd@C82(OH)22誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的百分比。
圖13為金屬富勒醇Gd@C82(OH)26誘導(dǎo)鼠肝癌Rh35細(xì)胞凋亡的百分比。
圖14為金屬富勒醇Gd@C82(OH)32誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的百分比。
圖11、圖12、圖13和圖14中橫坐標(biāo)的數(shù)值為M@C82(OH)x摩爾濃度的乘方值。
圖15為金屬富勒醇La@C82(OH)20對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人采用化學(xué)合成法制備了金屬富勒醇Gd@C82(OH)x，Gd@C60(OH)x，La@C82(OH)x，La@C60(OH)x，其制備方法參考中國發(fā)明專利03146028.3。Gd@C60的合成與分離純化參考文獻(xiàn)Robert D.Bolskar等，J.AM.CHEM.SOC.2003，125，5471-5478。
采用本發(fā)明方法制備的金屬富勒醇M@C2m(OH)x，其羥基數(shù)目在10～50的范圍，在本文中當(dāng)羥基數(shù)用具體數(shù)值表示時(shí)，該數(shù)值指羥基數(shù)目的加全平均值。該值由合成金屬富勒醇反應(yīng)中NaOH溶液的濃度決定，可根據(jù)需要調(diào)節(jié)NaOH溶液的濃度，從而獲得指定羥基數(shù)目加全平均值的金屬富勒醇。當(dāng)羥基數(shù)目低于10時(shí)，金屬富勒醇的生物相容性不好；當(dāng)羥基數(shù)目高于50時(shí)，碳籠的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。
精確測定富勒醇的羥基數(shù)目至關(guān)重要，本發(fā)明中，我們利用北京同步輻射裝置X射線光電子能譜(XPS)并結(jié)合元素分析方法來確定金屬富勒烯的表面修飾后的羥基數(shù)目。
XPS實(shí)驗(yàn)在中國科學(xué)院北京同步輻射裝置上進(jìn)行。在單晶硅片上通過磁控離子濺射鍍上高純Pt作為XPS樣品測試基底。M@C82和M@C82(OH)x滴加在高純Pt基底上獲得XPS測量的薄膜，將薄膜放入8×10-10Torr的XPS樣品制備室的超高真空系統(tǒng)足夠長時(shí)間，以除去樣品上可能吸附的空氣雜質(zhì)。金屬富勒醇的C 1s光電子發(fā)射譜用于確定樣品包含的羥基數(shù)目。改變?nèi)肷涔庾幽芰浚杉瘶悠返膬r(jià)帶光電子能譜。采集樣品的部分產(chǎn)額譜以獲得樣品的吸收譜。裝置的能量分辨率約為～0.5eV。樣品在采集數(shù)據(jù)前，先進(jìn)行XPS掃描，以確保樣品表面清潔并確定儀器處于良好運(yùn)行狀態(tài)。
金屬富勒醇M@C2m(OH)x分子的粒徑約為1nm。金屬富勒醇分子可通過大分子相互作用團(tuán)聚成納米顆粒物。在溶劑環(huán)境中，可以通過超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒。本文以下實(shí)施例中所涉及的金屬富勒醇溶液均為含有直徑分布范圍在1-200nm的金屬富勒醇顆粒的溶液。
以下結(jié)合實(shí)施例和對比例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述實(shí)施例范圍之中。
實(shí)施例1Gd@C2m(OH)x的制備第一步Gd@C2m的合成將高純(＞99.999％)Gd2O3與高純石墨粉(＞99.999％)按原子比Gd∶C＝0.5～3∶100混合，壓制成模，制成石墨-金屬混合電極；或者將直徑為6～20mm石墨棒鉆空，充填氧化釓得到石墨-金屬混合電極。1000～2000℃高溫?zé)Y(jié)后，使用惰性氣體弧形放電法，合成金屬富勒烯Gd@C2m。惰性氣體為He或Ar，壓力為50～600Torr，電流為80～500A。
第二步Gd@C82和Gd@C60的分離純化a.采用高溫回流加高溫高壓兩步高效提取方法萃取分離碳納米類物質(zhì)。首先將弧形放電的煙炱在甲苯中100～200℃下回流12～24小時(shí)，再在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中100～200℃下高溫高壓(50～100MPa)提取12～24小時(shí)，以萃取碳納米類物質(zhì)。
b.使用廣泛應(yīng)用的循環(huán)式HPLC(高效液相色譜)兩步法或萃取法純化目標(biāo)所需要金屬富勒烯Gd@C82和Gd@C60，得到純度大于99.99％的目標(biāo)產(chǎn)物Gd@C82和Gd@C60。Gd@C82的產(chǎn)率為碳棒的10％；Gd@C60產(chǎn)率為碳棒的35％。HPLC分離結(jié)果譜圖參見圖2。(5PBB柱)第三步金屬富勒醇Gd@C82(OH)22的合成使用NaOH法，在甲苯溶液中將Gd@C82與濃度為35％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)過濾、離子交換層析等分離、純化過程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的產(chǎn)物Gd@C82(OH)22，冷凍干燥保存。
金屬富勒醇Gd@C82(OH)12的合成在甲苯溶液中將Gd@C82與濃度為30％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)過濾、離子交換層析等分離、純化過程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的產(chǎn)物Gd@C82(OH)12，冷凍干燥保存。
Gd@C60(OH)x的合成將300mgGd@C60懸浮液與210mg KH在20mL THF中混合后，連續(xù)攪拌15分鐘，并將1.255g二乙基溴代丙二酸一滴滴地加入混合液。攪拌40分鐘以后生成咖啡色溶液。然后過濾，除去沒有反應(yīng)的KH。將粗產(chǎn)物用四氫呋喃分離，再用己烷漂洗，低壓抽干，然后在甲苯中與NaH一起回流，并用甲醇結(jié)束反應(yīng)。用酸性離子交換柱分離純化，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值到7.0。蒸干得到Gd@C60(OH)x產(chǎn)品。
第四步金屬富勒醇顆粒[Gd@C82(OH)22]n(1≤n＜200)的合成將金屬富勒醇Gd@C82(OH)22溶解在生理鹽水中，超聲1分鐘，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒物[Gd@C82(OH)22]n，1＜n＜200。
實(shí)施例2測定Gd@C82(OH)22和Gd@C82(OH)12的羥基數(shù)Gd@C82(OH)22(a)和Gd@C82(OH)12(b)的C1s電子的XPS譜如圖3所示，C-C和C-O鍵之間的相對強(qiáng)度用于分析Gd@C82(OH)x中的羥基數(shù)目。圖2中實(shí)線的高斯擬合分析表明分子中存在兩種不同的碳原子峰位置在284.4eV的是沒有連接其它基團(tuán)的具有sp2雜化的碳原子(C-C)的結(jié)合能；位于285.3 eV的峰是羥基化的碳原子(C-OH)。
實(shí)施例3La@C2m(OH)x的制備采用與上述制備Gd@C82類似的方法制備La@C82和La@C60。
(1)金屬富勒醇La@C82(OH)18的合成使用NaOH法，在甲苯溶液介質(zhì)中將La@C82與28％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)一系列分離、純化過程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的La@C82(OH)18產(chǎn)物，冷凍干燥保存。
(2)金屬富勒醇La@C60(OH)22的合成使用NaOH法，在甲苯溶液介質(zhì)中將La@C60與35％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)一系列分離、純化過程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的La@C60(OH)22產(chǎn)物，冷凍干燥保存。
實(shí)施例4納米顆粒的測定金屬富勒醇M@C2m(OH)x分子的粒徑約為1nm。在溶劑環(huán)境中，金屬富勒醇分子通過大分子相互作用團(tuán)聚成納米顆粒物，可以通過超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒。
采用同步輻射小角X-射線衍射(SR-SAXS)測得生理鹽水溶液中[Gd@C82(OH)22]n納米顆粒的粒徑范圍為1-200nm，平均粒徑22nm。
高分辨原子力顯微鏡(AFM，Nano IIIa SPM，Digital Instruments Inc，3A)證實(shí)生理鹽水溶液中[Gd@C82(OH)22]n納米顆粒的粒徑范圍為1-200nm，平均粒徑22.4nm存在，參見圖4。由兩種獨(dú)立的方法得到的結(jié)果一致。
實(shí)施例5含[Gd@C82OH22]n(1≤n＜200)的注射用溶液將500mg Gd@C82OH22，溶解于400ml生理鹽水中，室溫超聲1分鐘，封裝于100個(gè)玻璃管中，制成注射用溶液。
實(shí)施例6Gd@C82(OH)m組合物對小鼠肝癌腫瘤的抑制作用動物品系 昆明種雌鼠，體重為18到22g。
腫瘤模型 小鼠肝癌H22瘤株。
實(shí)驗(yàn)分組 A.陰性對照組生理鹽水(saline)；B.陽性對照組環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，臨床上普遍使用的一種抗癌藥物；C.藥物組Gd@C82(OH)m，每組5-7只小鼠。
給藥方式腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)。
CTX和Gd@C82(OH)m(m＝22或26)溶液以0.9％的生理鹽水為溶劑。
劑量設(shè)計(jì)(1×10-6～2×10-3mmol/kg小鼠)本實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)劑量組A.高劑量組CTX30mg/kg(0.1mmol/kg)，僅需在實(shí)驗(yàn)的前7天注射；Gd@C82(OH)22，2×10-4mmolGd/kg；Gd@C82(OH)26，2×10-3mmol/kg；注射體積均為0.2ml。
低劑量組CTX15mg/kg(0.05mmol/kg)；Gd@C82(OH)22，1×10-4mmol/kg；Gd@C82(OH)26，1×10-6mmol/kg；注射體積均為0.2ml。
實(shí)驗(yàn)方法每只小鼠右后肢皮下接種小鼠肝癌H22瘤株1×106癌細(xì)胞(分散于100μl的0.9％生理鹽水中)，接種24小時(shí)后開始給藥0.2ml/只；實(shí)驗(yàn)期間每24小時(shí)給藥一次，每隔一天測量接種腫瘤的后肢直徑，記錄其生長情況；同時(shí)觀察小鼠的反應(yīng)情況；當(dāng)生理鹽水組小鼠右后肢直徑長到20mm左右時(shí)，停止實(shí)驗(yàn)(正常小鼠后肢直徑為6mm)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束摘除眼球取血，使用109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑的比例為1∶9；摘取腫瘤，稱重；取臟器/器官并稱重，計(jì)算臟器系數(shù)；同時(shí)用10％的福爾馬林固定臟器/器官。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gd@C82(OH)m組合物抗肝癌H22活性如表1所示，注射Gd@C82(OH)m納米顆粒后同注射CTX一樣可以抑制小鼠的腫瘤生長，且納米材料的腫瘤抑制特性優(yōu)于臨床普遍使用的抗腫瘤藥物CTX。
高劑量組Gd@C82(OH)22對荷瘤小鼠血清總膽紅素，ALT，AST和肌苷水平的影響數(shù)據(jù)參見下頁的表2。從反映肝細(xì)胞損害最敏感的指標(biāo)是谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST的活性上分析，注射Gd@C82(OH)22納米材料可顯著抑制荷瘤鼠兩種酶的增高，并且接近正常機(jī)體的水平。而環(huán)磷酰胺組ALT水平反而增加，說明其增加動物肝的損傷。
根據(jù)公式V＝4πr3/3計(jì)算腫瘤體積，并得到抑瘤率；結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量組中0.1μmol/kg的Gd@C82(OH)22抑制腫瘤生長的效率為32.9％(圖5和圖6)，雖然比0.05mmol/kg的CTX的抑瘤率52.0％低，但是其用藥量只是CTX藥量的1/500。
另外，我們還比較了抑瘤率與藥物使用量之間的關(guān)系，當(dāng)把CTX的劑量提高0.05mmol/kg時(shí)，其腫瘤抑制率提高了15％而把Gd@C82OH22納米材料的使用劑量僅提高0.1μmol/kg時(shí)，其腫瘤抑制率就提高26％(圖7和圖8)。
鼠肝癌H22模型組腫瘤組織病理切片結(jié)果以下參見圖9，Gd@C82(OH)22治療組小鼠腫瘤浸潤范圍更小，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕。HE染色切片可見腫瘤周圍形成明顯的腫瘤包繞帶(炎細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及毛細(xì)血管)?？杉せ顧C(jī)體免疫功能。
對照組腫瘤細(xì)胞向骨骼肌浸潤明顯。
環(huán)磷酰胺組腫瘤細(xì)胞大量壞死，但不能防止腫瘤細(xì)胞向骨骼肌浸潤。
表1 Gd@C82(OH)m抗肝癌H22活性數(shù)據(jù)表

(N為小鼠數(shù)量，表中數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示)表2 高劑量組Gd@C82(OH)22荷瘤小鼠血清總膽紅素，ALT，AsT和肌苷水平

注a與生理鹽水組比較P＜0.01。
實(shí)施例7Gd@C82(OH)m對人源MCF-7乳腺癌裸鼠乳腺癌模型的抑制腫瘤效果實(shí)驗(yàn)方法BALB/c雌性裸鼠(16.0±1.0g)皮下接種MCF-7細(xì)胞懸液(1×107細(xì)胞)后，飼養(yǎng)20天，把皮下產(chǎn)生的腫瘤取出，切割成3mm×3mm×3mm的腫瘤小塊重新植入BALB/c雌性裸鼠備用。接種3天后開始給藥，分別給予Gd@C82(OH)m(m＝32或12)、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、生理鹽水。
給藥方法Gd@C82(OH)322.5μmol/kg/天×13天(以Gd濃度計(jì)算)；注射液濃度為0.25μmol/ml。
Gd@C82(OH)121.0μmol/kg/天×13天，以Gd濃度計(jì)算；注射液濃度為0.1μmol/ml。
環(huán)磷酰胺第一周71.6μmol/kg/天×7天，第8-12天生理鹽水紫杉醇 第0、3、6、9、12天15.2μmol/kg/天，不給藥天注射生理鹽水生理鹽水0.2mlq.d.×13動物品系 BALB/c雌性裸鼠，Gd@C82(OH)32組 10只；Gd@C82(OH)12組 10只；環(huán)磷酰胺組 10只紫杉醇組9只；生理鹽水組 8只腫瘤模型 MCF-7人乳腺癌給藥方式腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。
CTX和Gd@C82(OH)m溶液，以0.9％的生理鹽水為溶劑。紫杉醇是商用液體制劑。
抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，Gd@C82(OH)32組在2.5μmol/kg體重給藥13天時(shí)抑瘤率可達(dá)到47％，與環(huán)磷酰胺組71.6μmol/kg體重給藥7天結(jié)果一致。Gd@C82(OH)12組在1μmol/kg體重給藥13天時(shí)抑瘤率可達(dá)到35.6％。但是環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)明顯的毒副作用，如明顯體重減輕、消瘦、動物精神狀態(tài)差。紫杉醇在15.2μmol/kg體重劑量下，每隔2天給藥，抑瘤率可達(dá)到82％，但是45％的小鼠死亡，說明紫杉醇毒性非常大。而金屬富勒醇組小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺、紫杉醇相比，帶有不同羥基數(shù)的金屬富勒醇Gd@C82(OH)32和Gd@C82(OH)12具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優(yōu)點(diǎn)。
表3 Gd@C82(OH)m抑制裸鼠移植的人源乳腺癌生長數(shù)據(jù)表

(N為小鼠數(shù)量)實(shí)施例8La@C82(OH)18組合物對小鼠Lewis肺癌模型的抑制腫瘤效果實(shí)驗(yàn)方法C57純系雌性小鼠(18.0±1.0g)皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞懸液(1×107細(xì)胞)，接種次日開始給藥，分別給予La@C82(OH)18、環(huán)磷酰胺、生理鹽水，每組10只。
給藥方式腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。
給藥方法La@C82(OH)181μmol/kg q.d.×14環(huán)磷酰胺第一周71.6μmol/kg q.d.×7，第8-14天給予生理鹽水生理鹽水0.2ml q.d.×14CTX和La@C82(OH)18溶液，均以0.9％的生理鹽水為溶劑。
抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖10，La@C82(OH)18在1μmol/kg體重給藥14天時(shí)可以明顯抑制腫瘤的生長，腫瘤的重量不明顯增加，與環(huán)磷酰胺71.6μmol/kg體重給藥7天結(jié)果基本一致。但是環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)明顯的毒副作用，如明顯體重減輕、消瘦、動物精神狀態(tài)差。而金屬富勒醇組小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺相比，金屬富勒醇La@C82(OH)18納米顆粒具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例9Gd@C60(OH)20對小鼠Lewis肺癌模型的抑制腫瘤效果實(shí)驗(yàn)方法C57純系雌性小鼠(20.0±1.0g)皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞懸液(1×107細(xì)胞)，接種次日開始給藥，分別給與Gd@C60(OH)20、生理鹽水，每組10只。Gd@C60(OH)20溶液，以0.9％的生理鹽水為溶劑。
給藥方式腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。
給藥方法Gd@C60(OH)200.5μmol/kg q.d.×18生理鹽水 0.2ml q.d.×18抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gd@C60(OH)20在0.5μmol/kg體重給藥18天時(shí)可以明顯抑制腫瘤的生長，與生理鹽水對照組相比，接種腫瘤的體積不明顯增加，抑瘤率可達(dá)到42％。
實(shí)施例10細(xì)胞毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法(1)MTT的方法分析金屬富勒醇對不同種類癌細(xì)胞存活率的影響MTT法作為四氮唑類染料之一的MTT進(jìn)入細(xì)胞后，被線粒體呼吸鏈酶(如琥珀酸脫氫酶)還原為不溶性有色產(chǎn)物，利用光吸收的方法測定有色產(chǎn)物的量，從而間接反映細(xì)胞的活性。
取對數(shù)生長期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100μl，分為6個(gè)劑量組，每組8個(gè)復(fù)孔。接種24h后，換成無血清培養(yǎng)基，每孔100μl，按劑量組濃度分別加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄上清，每孔加100μl MTT緩沖液及10μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)3h，棄上清，加DMSO150μl/孔，震蕩，自動酶標(biāo)儀測定595nm處各孔吸光值。
(2)流式細(xì)胞儀分析法碘化丙啶(PI)染色檢測凋亡細(xì)胞數(shù)將5ml濃度為105個(gè)/ml的細(xì)胞接種與25cm2培養(yǎng)瓶中，24h后換成5ml無血清培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的金屬富勒醇，24h后收取細(xì)胞，包括培養(yǎng)基中的少量細(xì)胞，收集好的細(xì)胞用生理鹽水洗兩次，然后70％乙醇4℃固定，做流式分析前，用生理鹽水洗2次，最后用生理鹽水懸起細(xì)胞，加入RNase A及碘化丙啶(PI)，終濃度分別是25ppm和50ppm，37℃水浴中放置30分鐘，用尼龍紗布過濾后上機(jī)測定。PI不能通過完整的細(xì)胞膜，但對于凋亡中晚期細(xì)胞或死細(xì)胞，PI能透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，DNA結(jié)合PI染色后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可在G1峰前出現(xiàn)一亞二倍體峰，根據(jù)此峰的百分率可檢測凋亡細(xì)胞數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果舉例[1]MTT的方法分析金屬富勒醇對人肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響Gd@C82(OH)22終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，細(xì)胞活性較未加任何藥物的細(xì)胞活性有所增加，但藥物各劑量組之間差別不大，也沒有明顯的線性關(guān)系。
流式細(xì)胞儀的方法分析金屬富勒醇Gd@C82(OH)22對人肝癌HepG2細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖12所示，細(xì)胞凋亡比例均在3.5％～7％之間，Gd@C82(OH)22的終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡比例與對照組基本一致，藥物各劑量組之間沒有顯著性差別。Gd@C82(OH)22不誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞的增值和生長沒有影響。
流式細(xì)胞儀的方法分析Gd@C82(OH)26對鼠肝癌Rh35細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖13所示，Gd@C82(OH)26的終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，與未加任何誘導(dǎo)劑的對照組細(xì)胞凋亡百分比相當(dāng)，凋亡細(xì)胞的比例均在2.0％～3.5％之間，說明Gd@C82(OH)26不誘導(dǎo)鼠肝癌Rh35細(xì)胞凋亡。
流式細(xì)胞儀的方法分析Gd@C82(OH)32對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖14所示，Gd@C82(OH)32的終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，與對照組細(xì)胞凋亡百分比相當(dāng)，凋亡細(xì)胞的比例在3.0％～9％之間，表明Gd@C82(OH)32不誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞毒性較小。
MTT的方法分析金屬富勒醇對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響La@C82(OH)20終濃度在100～106nmol/L范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示，細(xì)胞存活率與未加任何藥物的對照組基本一致，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長沒有明顯的影響。
上述不同濃度的金屬富勒醇對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在10-1000000nmol/ml的濃度范圍內(nèi)，金屬富勒醇對不同類型的腫瘤細(xì)胞株的生長沒有影響，不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)細(xì)胞存活率與不加藥物的對照組一致，說明金屬富勒醇不具備直接的細(xì)胞毒性，不直接殺死細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種金屬富勒醇，其特征在于它以通式M@C2m(OH)x表示，通式中，M為La或Gd；m＝41或30；10≤X＜50。
2.一種腫瘤抑制組合物，其特征在于它包括以通式M@C2m(OH)x表示的金屬富勒醇，通式中，M為Gd或La；m＝41或30；10≤X＜50。
3.一種腫瘤抑制組合物，其特征在于它包括以通式[M@C2m(OH)x]n表示的金屬富勒醇納米顆粒，通式中，M為Gd或La；m＝41或30；10≤X＜50；n表示團(tuán)聚成所述金屬富勒醇納米顆粒的金屬富勒醇分子數(shù)，1≤n＜200。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的組合物還包括溶劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的溶劑為水、生理鹽水、Tris-HCl溶液或磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于，所述的組合物中金屬富勒醇在溶劑中的濃度為1×10-5～1mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的腫瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮膚癌。
8.一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于該金屬富勒醇以通式M@C2m(OH)x表示，通式中，M為La或Gd；m＝41或30；10≤X＜50。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的金屬富勒醇在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)為5×10-8～1×10-2mmol/kg/天。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的金屬富勒醇在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)為5×10-6～1.25×10-4mmol/kg/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金屬富勒醇及其在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。具體地說，涉及通式為M@C
文檔編號A61K31/28GK1935812SQ200610152170
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者趙宇亮, 陳春英, 邢更妹 申請人:中國科學(xué)院高能物理研究所