專利名稱：抗原組合物、由其制備的多克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為抗原免疫動(dòng)物的組合物，以及利用該抗原組合物制備新一代多克隆抗體以及該多克隆抗體在治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)中的用途。本發(fā)明也提出了對(duì)異常免疫反應(yīng)的免疫療法，這些異常免疫反應(yīng)包括，自身免疫性疾病，移植物-抗-宿主疾病，同種異體器官、組織、細(xì)胞移植后排異反應(yīng)、異種異體器官、組織、細(xì)胞移植后排異反應(yīng)，多發(fā)性硬化癥、糖尿病等。
背景技術(shù)：
法國(guó)的生物學(xué)家Bert在1864年的研究中首次對(duì)同種異體移植物進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究(Bert P.J Anat.Physiol 1864，185)。而首次比較明確地肯定淋巴細(xì)胞在排異反應(yīng)中占主導(dǎo)地位則是在1960年由Billingham等(Billingham R，et al.N.Y.Acad.Sci 1960，87457)和Anderson等提出(Anderson N，et al.Transpl Bull1960，793)。此后經(jīng)數(shù)十年的研究和探索，人們對(duì)人白血球、尤其是那些被抗原激活的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，在異常免疫反應(yīng)中如器官移植中的同種異體移植排異反應(yīng)、異種異體移植排異反應(yīng)、自身免疫性疾病、骨髓細(xì)胞移植，胰島細(xì)胞移植，以及骨髓細(xì)胞移植后所產(chǎn)生的移植物-抗-宿主疾病中，扮演的關(guān)鍵角色有了更深刻的認(rèn)識(shí)(Mormanand Suki.Primer on Transplantation 1998，Brent L，A History of TransplantationImmunology 1997)。特別值得注意的是，近期臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果表明單核細(xì)胞本身在淋巴細(xì)胞缺乏的情況下皆可在腎移植患者中導(dǎo)致急性排異反應(yīng)(Kirk et al.Transplantation 200，76120-9，徐何等.Journal of Immunology 2006)。隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，抗體在臨床中的治療應(yīng)用不斷擴(kuò)大，通過使用具有針對(duì)參與免疫反應(yīng)的白血球特異性抗體制劑對(duì)介入免疫反應(yīng)的宿主白血球進(jìn)行排除和調(diào)節(jié)，也許對(duì)預(yù)防和扭轉(zhuǎn)這些異常免疫反應(yīng)癥狀具有治療作用。
單克隆抗體的研發(fā)進(jìn)展相對(duì)于多克隆抗體發(fā)展更快，比如抗CD20的單克隆抗體已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床試驗(yàn)來治療淋巴瘤和器官移植的預(yù)防排異反應(yīng)(美國(guó)Biogen Idec公司)，抗CD25(白細(xì)胞介素2受體)的單克隆抗體(Zenapax，美國(guó)Roche制藥公司)已經(jīng)通過并獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局許可正式用于臨床器官移植的預(yù)防排異反應(yīng)。然而迄今為止單克隆抗體制劑并沒有顯示對(duì)介入免疫的多種類型細(xì)胞的活性具有足夠、廣泛的限制特異性。換言之，由于異常免疫反應(yīng)的發(fā)生是通過多條途徑來實(shí)現(xiàn)，而單克隆抗體由于其獨(dú)特的特異性而無法阻斷參與異常免疫反應(yīng)的多條通路，因而這些已經(jīng)用于臨床移植的單克隆抗體則僅僅是作為輔助性的免疫治療用藥(Lucienne Chatenoud.Monoclonal Antibodies in Transplantation，1995，Morman and Suki.Primer onTransplantation，1998).此外由于參與免疫反應(yīng)的白血球細(xì)胞表面所表達(dá)的抗原為復(fù)合蛋白，因此單克隆抗體并不足以完全的阻斷抗原上的多數(shù)位點(diǎn)，作為免疫療法單克隆抗體的作用顯而易見的是不夠充分的。
多克隆抗體通過抗原免疫宿主后所激發(fā)的體液免疫反應(yīng)而獲得影響，這些抗體來源于不同的B細(xì)胞克隆，因而在其中的每一種抗體則具有針對(duì)與其對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)構(gòu)的特異性，多克隆抗體的研究的歷史可以追溯到上個(gè)世紀(jì)末的1898年由Jules Bordet等所觀測(cè)到的多克隆抗體的所導(dǎo)致的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象(Metchnikoff E.Ann Inst Pasteur 1899，13737-769)。此后數(shù)十年間其研究進(jìn)展緩慢。1967年Iwasaki成功地從血清中分離提取到IgG(Iwasaki Y等Surg Gynecol Obstet，1967，1241-24)，同一年Starzl首次報(bào)告在臨床腎移植患者中使用多克隆抗體做為免疫抑制劑的結(jié)果(Starzl T等Surg GynecolObstet，1967，124301-318)。在此后的數(shù)十年中多克隆抗體在臨床上得到應(yīng)用。與單克隆抗體不同的是，多克隆抗體對(duì)免疫反應(yīng)的通路是多個(gè)位點(diǎn)阻斷，其獨(dú)特的優(yōu)越性無可質(zhì)疑，因此近十年特別是在近5年內(nèi)受到了移植界的廣泛重視。然而在其研究開發(fā)過程中受到了一定的限制，特別是在致敏源方面。目前已有的用于臨床治療免疫異常特別是治療排異反應(yīng)的多克隆抗體制劑是通過使用嬰幼兒胸腺細(xì)胞作為抗原來免疫動(dòng)物宿主包括馬或兔等，然后從動(dòng)物血清中提取相關(guān)的抗體而獲得。這些制劑的獲得由于依然是使用胸腺細(xì)胞抗原從而依舊隸屬于老一代多克隆抗體，而這些多克隆抗體制劑對(duì)與參與免疫反應(yīng)之白血球細(xì)胞并不具備特異性，但是由于對(duì)正常白血球細(xì)胞，旁觀細(xì)胞或有益細(xì)胞具有非特異性的殺傷清除作用以及異常的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用從而產(chǎn)生著明顯的副作用(Gaber AO，et al.Transplantation 1998，6629-37，Guttmann RD，et al.Transplant Proc 1997，2924S-26S，蘇澤軒等.現(xiàn)代移植學(xué)，1998年136-145頁)。因此研發(fā)新一代的多克隆抗體受到了移植界的極大關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供生產(chǎn)新一代多克隆抗體的抗原組合物。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是用所述的抗原組合物在制備治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是用所述的抗原組合物免疫動(dòng)物獲得新一代的多克隆抗體。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是該多克隆抗體在制備治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
一種抗原組合物，包括哺乳類白血球細(xì)胞和表達(dá)共刺激分子、白細(xì)胞介素受體和粘附分子的細(xì)胞系。
其中所述的表達(dá)共刺激分子、白細(xì)胞介素受體和粘附分子的細(xì)胞系是ATCCCRL-2740。所述的表達(dá)共刺激分子、白細(xì)胞介素受體和粘附分子的細(xì)胞系是ATCCCRL-10915。所述的哺乳類動(dòng)物是人。所述的白血球細(xì)胞是淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞株和單核細(xì)胞或單核細(xì)胞株。所述的細(xì)胞系是表達(dá)CD154的細(xì)胞株，或表達(dá)CD40/CD80/CD86細(xì)胞株，或表達(dá)CD54/CD58細(xì)胞株。
本發(fā)明的組合物在制備治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明的組合物作為抗原，再經(jīng)動(dòng)物免疫，取血，分離出抗全血清，純化制得，所得的多克隆抗體分子量為150,000 Dalton，所述的多克隆抗體與參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和抗原成遞細(xì)胞結(jié)合。
所述的免疫動(dòng)物是兔。所述的免疫動(dòng)物可被基因修飾從而產(chǎn)生人源化抗體。
以及利用本發(fā)明的多克隆抗體制備治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)藥物。
所述的異常免疫反應(yīng)是指器官、組織、細(xì)胞移植后所出現(xiàn)的排異反應(yīng)以及移植物抗宿主反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎，一種炎性腸疾病，內(nèi)分泌病，神經(jīng)變性病，或一種血管疾病。所述的異常免疫反應(yīng)還包括類風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，腎病，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫、多發(fā)性硬化癥、內(nèi)向性光紊亂、老年性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化，帕金森病、亨廷頓舞蹈病，急性熱病性多神經(jīng)炎、重癥肌無力、慢性自發(fā)性脫髓鞘病、自身免疫性聽力喪失、系統(tǒng)性脈管炎，或動(dòng)脈粥樣硬化。
本發(fā)明所提供的抗原配方包括人白血球細(xì)胞(單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞，NK細(xì)胞)和高度表達(dá)某些共刺激分子和黏附分子以及白細(xì)胞介素受體的和細(xì)胞系。更具體地，白血球細(xì)胞和細(xì)胞系是人源化的白血球細(xì)胞和細(xì)胞系。該抗原配方制備多克隆抗體十分有效，該多克隆抗體與活化免疫細(xì)胞附著，以表達(dá)活化表面標(biāo)記如共刺激分子，并能治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)。
換句話說，本發(fā)明提供了一個(gè)生產(chǎn)能附著被刺激免疫細(xì)胞的多克隆抗體的方法。概括而言，該方法包括用體外操縱的白血球和細(xì)胞系免疫合適的宿主動(dòng)物。該宿主動(dòng)物已被基因修飾從而產(chǎn)生人源化抗體。用從這些宿主動(dòng)物純化免疫球蛋白生產(chǎn)的多克隆制劑，對(duì)參與異常免疫反應(yīng)的活化的白血球有高度特異性，對(duì)未活化或有利的白血球以及其它血液組分作用較小。該制劑富集作用于正向調(diào)控白血球活化分子的抗體。該方法也可用于生產(chǎn)大量的治療免疫球蛋白，注射到可能患有或正在患有同種異體移植排斥、自身免疫性疾病、移植物-宿主疾病或其它抗適應(yīng)性白血球介導(dǎo)疾病的個(gè)體。
本發(fā)明的多克隆抗體具有特異的治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)的作用。它直接作用于已確知參與異常免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，對(duì)未介入異常免疫反應(yīng)的靜息狀態(tài)或未活化的淋巴細(xì)胞有較少的排除和阻斷，因此可用于治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)。這些異常免疫反應(yīng)包括，自身免疫性疾病，移植物-抗-宿主疾病，同種異體器官、組織、細(xì)胞移植后排異反應(yīng)、異種異體器官、組織、細(xì)胞移植后排異反應(yīng)，多發(fā)性硬化癥、糖尿病等。
所述的異常免疫反應(yīng)還指器官，組織，細(xì)胞移植后所出現(xiàn)的排異反應(yīng)以及移植物抗宿主反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎，一種炎性腸疾病，內(nèi)分泌病，神經(jīng)變性病，或一種血管疾病，類風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，腎病，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫、多發(fā)性硬化癥、內(nèi)向性光紊亂、老年性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化，帕金森病、亨廷頓舞蹈病，急性熱病性多神經(jīng)炎、重癥肌無力、慢性自發(fā)性脫髓鞘病、自身免疫性聽力喪失、系統(tǒng)性脈管炎，或動(dòng)脈粥樣硬化。
發(fā)明詳述術(shù)語定義“免疫球蛋白”或“Ig” 這里定義為一組血漿球蛋白質(zhì)，功能作為抗體。免疫球蛋白包括IgA、IgG、IgM、IgE、或IgD和/或它們的亞型，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，or IgA2。IgA功能為基本抗體，存在于身體分泌物中，例如，眼淚、人乳、胃腸道分泌物，和呼吸及泌尿生殖系統(tǒng)管道的粘液。IgG功能為最常見的循環(huán)抗體。
“多克隆抗體”可與一種以上的抗原的致免疫原性決定簇結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)的不同抗體分子的混合物。本發(fā)明中術(shù)語“多克隆抗體”包括從哺乳類動(dòng)物的血液，分泌物或諸如腹腔液等其他體液以及從卵細(xì)胞中分離并純化的多克隆抗體。
“一種分離的或純化的多克隆抗體”是指從哺乳類動(dòng)物的血液，分泌物或諸如腹腔液等其他體液以及從卵細(xì)胞中分離并純化的多克隆抗體。
“可藥用載體”該術(shù)語包括任何和所有溶劑、分散作用液、涂層、抗菌和抗真菌劑、等滲和延緩吸收劑以及類似物。這些可產(chǎn)生藥理活性的溶液和試劑的使用已被廣泛接受。除非任何常規(guī)溶液和試劑與本發(fā)明的免疫球蛋白或抗原配方不相容，其治療用途應(yīng)可預(yù)測(cè)。其他補(bǔ)充性有效成分也可加入本配方組成。
“主體”或“患者”指任何根據(jù)所描述方法使用免疫球蛋白組方的哺乳動(dòng)物。更具體地講，本發(fā)明的方法用于治療人體或患者。
“治療有效時(shí)間”指免疫球蛋白組方在體內(nèi)仍然有效的時(shí)間段。
“治療有效量”指可導(dǎo)致疾病或癥狀改善或治療的使用量。
“治療”指給哺乳動(dòng)物一定有效劑量的免疫球蛋白組方，哺乳動(dòng)物的由免疫介導(dǎo)的疾病或癥狀有所改善。改善是指綜合癥狀的任何一種改善或治療，這種改善是可觀察或可測(cè)量的。因而，這里所提治療也許只能改善疾病情況，但不能完全治愈疾病。
本發(fā)明提供了能治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)的多克隆抗體。這些多克隆抗體通過由本發(fā)明提供的抗原配方生產(chǎn)。該抗原配方包括人類白血球細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核)和可表達(dá)共刺激分子、白細(xì)胞介素受體、和黏附分子的人類細(xì)胞系。本發(fā)明的多克隆抗體可用于在體外和體內(nèi)從血細(xì)胞中清除與免疫反應(yīng)相關(guān)的白細(xì)胞以及對(duì)參與免疫反應(yīng)的白細(xì)胞實(shí)施調(diào)控以達(dá)到誘導(dǎo)免疫耐受的最終目的。
因此本發(fā)明的抗體可以用于治療和預(yù)防以下疾病在骨髓、腎臟、心臟、肺、胰腺、皮膚、肝臟移植中，在T-細(xì)胞依賴性過敏和自身免疫性疾病(心肌炎、糖尿病、重癥肌無力、紅斑狼瘡、Crohn疾病、多發(fā)性硬化癥、愛滋病、腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎等)中，在白細(xì)胞介素-2受體表達(dá)腫瘤疾病譬如T細(xì)胞白血病中，所產(chǎn)生的超免疫綜合癥狀、移植物-抗-宿主病和宿主-抗-移植病。
白血球和細(xì)胞系的制備本發(fā)明包括生產(chǎn)抗參與免疫反應(yīng)的人白血球的多克隆抗體。人白血球細(xì)胞包括活化T細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系或B淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞系以及單核細(xì)胞和單核細(xì)胞系。
純化白血球可以使用任何方法從外周單核血細(xì)胞中或從脾臟和淋巴組織中獲得。例如，外周單核血細(xì)胞(PBMCs)可從新鮮血液分離。從健康個(gè)體收集外周血液倒入含有抗凝劑的血液采集袋，然后離心(例如，在600×G室溫離心5分鐘)以從血漿分離血細(xì)胞。血細(xì)胞(不含血漿)用磷酸鹽緩沖液稀釋，用密度梯度離心法(400×G，室溫離心30分鐘)，便可分離單核細(xì)胞。與單核細(xì)胞一起得到的紅血球用氯化銨緩沖液(0.83％NH4Cl-TrisHCl 20mM，pH 6.8)室溫2分鐘處理后會(huì)導(dǎo)致溶血，然后單核細(xì)胞用含約5％胎兒小牛清液的磷酸鹽緩沖液洗滌。處理后的細(xì)胞可作為健康個(gè)體的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞使用(參見Zucker-Franklin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1974，711877-1881，以及Hudson L和.Hay F所著，Prantical Immunology第三版1989年)。
淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的進(jìn)一步純化可以通過使用對(duì)各種的細(xì)胞類型(包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)的細(xì)胞表面標(biāo)記有結(jié)合的單克隆抗體。例如，利用對(duì)B細(xì)胞特異標(biāo)志CD19有直接結(jié)合的抗體可清除B細(xì)胞。PMBCs，外周血，或者外周淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞與抗體共孵，能與選擇性抗體反應(yīng)的細(xì)胞可被擯除或被保留。例如，使用直接抗B細(xì)胞特異標(biāo)記CD19，或抗原細(xì)胞標(biāo)記CD54的抗體，與抗體結(jié)合的細(xì)胞可以通過細(xì)胞分類除去，該細(xì)胞分類的原理是將細(xì)胞通過一個(gè)抗體柱。有標(biāo)記如CD19，HLA II-DR(抗IgG抗體)或CD54(貼壁分子)存在表明在制劑中可能存有B細(xì)胞和抗原細(xì)胞(Hudson L和.Hay F所著，Prantical Immunology第三版1989年)。
T細(xì)胞使用可識(shí)別T細(xì)胞特異標(biāo)志CD3的抗體加以鑒別和保留。粒細(xì)胞和單核細(xì)胞混合物可使用對(duì)單核特異性標(biāo)志CD15的抗體加以檢測(cè)。單核細(xì)胞可使用單核特異性標(biāo)志CD14從其它細(xì)胞加以鑒別。
人細(xì)胞系，例如B細(xì)胞系和單核細(xì)胞系，將在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶為標(biāo)準(zhǔn)T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并且不斷進(jìn)行傳代培養(yǎng)以獲取免疫兔子所需的足量細(xì)胞。此外，可通過非病毒載體和/或病毒載體將特定共刺激因子，黏附因子以及白細(xì)胞介素受體基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞系，以獲取能夠高效表達(dá)某些表面蛋白標(biāo)記物的細(xì)胞系比如表達(dá)CD154細(xì)胞株，表達(dá)CD40/CD80/CD86細(xì)胞株，表達(dá)CD54/CD58/CD62E細(xì)胞株等(Yellin MJ等.Journal of Immunology 1994，152598-608，Kharbanda S等.Br.J.Haematol2002，119819-825，Baruch M等.Leuk.Lymphoma 1996，21485-495，US專利5,447,861一九九五年九月五號(hào)).。
抗體生產(chǎn)抗參與免疫反應(yīng)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的多克隆抗體可能在不同動(dòng)物中生產(chǎn)。這里，“抗體”是指具有與抗原有特異結(jié)合位點(diǎn)的血清免疫球蛋白。所有抗體都有一個(gè)相似的整體結(jié)構(gòu)，因而統(tǒng)稱為免疫球蛋白。所以，使用中“抗體”和“免疫球蛋白”可以互換。
本發(fā)明的多克隆抗體可以使用文獻(xiàn)中的方法生產(chǎn)(參見Tlaskalov-Hogenova H等Folia Piol(Praha)1980，2681-93，Wood ML和Monaco AP，Transplantation 1977，2378-86，Journal of Immunology 1977，1181456-1459，Transplantation.1980，29320-323，Horikawa S等Transplantation.1982，33138-142，Hudson L和.Hay F所著，Prantical Immunology第三版1989年)。
例如，用白血球和細(xì)胞系按一定時(shí)間免疫適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物，免疫包括首次免疫和加強(qiáng)免疫。首次免疫使用本發(fā)明的抗原組合物，即白血球和細(xì)胞系單細(xì)胞懸液，進(jìn)行皮下注射。細(xì)胞使用數(shù)量可以不同，例如首次免疫可使用50到500×106白細(xì)胞和0.001到1×109細(xì)胞系。與完全弗氏佐劑(1∶1/容量)乳化后，給予兔子皮下注射。加強(qiáng)免疫將細(xì)胞懸浮于5毫升滅菌生理鹽水中通過靜脈注射。首次免疫的總?cè)萘坎怀^1毫升，皮內(nèi)注射應(yīng)用25g 1英寸針頭在兔子背上多點(diǎn)進(jìn)行(最少10個(gè))。加強(qiáng)免疫每次使用50-100×106淋巴細(xì)胞和50到100×106單核細(xì)胞和50～100×106細(xì)胞系。
免疫的宿主動(dòng)物可能由一條相似或不同的途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。例如，在加強(qiáng)免疫中將細(xì)胞懸浮于5毫升的生理鹽水中，靜脈滴注于動(dòng)物體內(nèi)。使用50-100×106淋巴細(xì)胞和50到100×106單核細(xì)胞混合液作加強(qiáng)免疫。也可用50～100×106從培養(yǎng)細(xì)胞系得到的白血球給兔子作為加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫的次數(shù)可以不同。例如，加強(qiáng)免疫一次到大約十次。具體講，首次免疫后，兔子在第21天進(jìn)行第二次免疫，以后在第28，29，30，35和56天。
首次免疫以后，抗體可能從宿主動(dòng)物收集，時(shí)間范圍從第一、二星期到數(shù)月。例如，從兔子收集含有多克隆抗體的血清在首次免疫后的大約35天和大約56天。
其他的獲取多克隆抗體的途徑可為從免疫后的動(dòng)物血液內(nèi)和脾臟內(nèi)提取產(chǎn)生多克隆抗體的B淋巴細(xì)胞并做進(jìn)一步的體外培養(yǎng)，然后在任選地在融合到無限增殖化的細(xì)胞系如骨髓腫瘤細(xì)胞后做進(jìn)一步的培養(yǎng)來生產(chǎn)多克隆抗體(參見Takahashi M等Journal ofImmunological Methods.1987，96247-53).
本發(fā)明的抗體或免疫球蛋白制劑可用于任何需要的動(dòng)物。因而，本發(fā)明的抗體或免疫球蛋白可用于動(dòng)物如馬、山羊、牛、綿羊、雞、火雞、鼠、老鼠、貓、狗和人。更具體地，抗體或免疫球蛋白更傾向于在人體使用。
一般而言，針對(duì)待治療的哺乳動(dòng)物，最好使用與該哺乳動(dòng)物具有高度同源性序列的抗體。也就是說，“人”免疫球蛋白或人的抗體最好地被使用在人體；馬免疫球蛋白或馬抗體更好地被使用在馬；狗免疫球蛋白或狗抗體更好地被使用在狗等。
當(dāng)本發(fā)明的抗體或免疫球蛋白在人體使用時(shí)，如果長(zhǎng)期使用，最好應(yīng)用人的免疫球蛋白或人源抗體。這里術(shù)語″人的免疫球蛋白″或″人源抗體″是指一個(gè)免疫球蛋白包括人的結(jié)構(gòu)，任何一個(gè)恒定的區(qū)域與人的免疫球蛋白相應(yīng)區(qū)域完全相同。例如，人的免疫球蛋白或人的抗體可能包括幾個(gè)在人結(jié)構(gòu)區(qū)域的非人類殘基。因而，人的免疫球蛋白或人的抗體可能是至少60％到90％相同，或者至少95％相同與人的免疫球蛋白框架相同。正如描述的，這些免疫球蛋白或抗體不需要在人體本身生產(chǎn)。故免疫球蛋白或抗體可能有至少一個(gè)從非人類的CDR。因此，所有人源的免疫球蛋白或抗體的部份，除了可能CDRs，與一個(gè)或更多天然的人免疫球蛋白序列的對(duì)應(yīng)部份是根本相同的。
非人類抗體在人體可短暫使用。因此，當(dāng)一些異常當(dāng)或不受歡迎的免疫反應(yīng)產(chǎn)生時(shí)可以用非人抗體治療，特別當(dāng)免疫反應(yīng)是短期的。例如，可以用非人抗體短期治療的異常的免疫反應(yīng)包括組織排斥、移植排斥、移植物-抗-宿主疾病，同種異體移植排斥等。然而，如果長(zhǎng)期用非人抗體治療患者(長(zhǎng)于幾個(gè)星期)，也許會(huì)引起其他的免疫反應(yīng)。
如果患者長(zhǎng)期使用，人源抗體最適合。因而，人源抗體推薦在以下疾病治療中使用哮喘，支氣管炎、肺炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、少年關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、脊椎性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎，慢性肉芽腫性疾病譬如結(jié)核病、麻瘋病、肉狀瘤、和矽肺、腎炎、淀粉樣變性、強(qiáng)硬性脊椎炎、慢性支氣管炎、硬皮病、系統(tǒng)紅斑狼瘡、多肌炎、腸癰、炎性腸疾病、Crohn病、胃炎、急性腸綜合癥，潰瘍性結(jié)腸炎，預(yù)防結(jié)腸直腸癌，Sjorgen綜合癥，Reiter綜合癥，牛皮癬，骨盆炎性疾病，眼眶炎，血栓癥，月經(jīng)抽瘋，腱炎，滑囊炎，牛皮癬，濕疹，皮炎，和對(duì)環(huán)境刺激的不適當(dāng)過敏反應(yīng)譬如毒物常春藤、花粉、昆蟲蜇和某些食物，包括遺傳性過敏癥的皮炎和聯(lián)絡(luò)皮炎。本發(fā)明的抗體還可用于治療血管疾病的炎癥，偏頭痛，結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周炎，甲狀腺炎，發(fā)育不全的貧血癥，Hodgkin病，硬皮病，風(fēng)濕性熱病，型I糖尿病，重癥肌無力，肉狀瘤，腎變病綜合癥狀，Behcet綜合癥，多肌炎，齒齦炎，過敏癥，結(jié)膜炎，傷害后的脹大，心肌局部缺血等。
為了生產(chǎn)人源抗體，本發(fā)明的抗體可能在基因修飾的動(dòng)物中產(chǎn)生。此動(dòng)物已經(jīng)有人生產(chǎn)。例如，母牛已被基因改造以生產(chǎn)人源抗體。參見Robl等，美國(guó)專利申請(qǐng)出版物第20040068760號(hào)，Transgenic ungulates capable of human antibody production(Apr.8，2004)；Kuroiwa等，Cloned Transchromosomic Calves Producing Human Immunoglobulin，NatureBiotechnology vol.20(Sep.2002)；Cloned Cows Produce Human Antibodies，NewScientist.com News Service(Aug.12，2002).Human antibodies from such geneticallyaltered cattle can be obtained commercially from Hematech LLC(Westport，CT).其他動(dòng)物也被基因改造，參見Kucherlapati et al.，U.S.Patent 6,713,610，entitled Human antibodiesderived from immunized xenomice(Mar.30，2004).
因而，在某些情況下，可使用含用至少部份人輕鏈和重鏈免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因家畜(即兔子、綿羊、豬、母牛)。轉(zhuǎn)基因家畜可能這樣產(chǎn)生用人的免疫球蛋白基因替換動(dòng)物的免疫球蛋白基因位點(diǎn)或者由基因轉(zhuǎn)換修飾該動(dòng)物。
動(dòng)物宿主細(xì)胞可以被基因改造以包含人的免疫球蛋白基因。這樣動(dòng)物宿主細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞，或其他可在培養(yǎng)液中培養(yǎng)但沒有基因組重整的細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞通過引入DNA片斷并整合到宿主的基因組中而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。導(dǎo)入可以使用各種方法，包括裸露DNA以病毒載體，融合、基因槍、脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將選擇特殊方法以滿足引入大量或少量DNA的需要和整合化效率。功能免疫球蛋白輕鏈和重鏈所在位點(diǎn)可以用同源重組，或至少用人重鏈一定區(qū)域替換至少部分的宿主重鏈一定區(qū)域。如果需要，類似地，至少用人輕鏈一定區(qū)域替換至少部分的宿主輕鏈一定區(qū)域。特殊興趣點(diǎn)是，用人的V區(qū)替換最接近D區(qū)的宿主V區(qū)。
這樣，當(dāng)免疫球蛋白的部份是宿主序列，從抗血清不同區(qū)域的多變性來看，抗血清不可能導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。在動(dòng)物中，當(dāng)抗體的多樣性主要由基因轉(zhuǎn)換引起，最接近D區(qū)的V區(qū)用人的V區(qū)替換，會(huì)導(dǎo)致多數(shù)免疫球蛋白中人的V區(qū)元素的表達(dá)。就恒定區(qū)域的替換而言，必須包括大約至少3個(gè)域中(CH1，CH2，CH3)的2個(gè)，尤其特別包括CH3。
這種遺傳改變過程如下繁育同種宿主，選擇具有能應(yīng)答免疫反應(yīng)，產(chǎn)生顯著人的抗血清包括宿主糖基化，免疫球蛋白至少有人的重鏈部分功能區(qū)域的宿主。能表達(dá)帶有明顯人蛋白質(zhì)序列的免疫球蛋白的動(dòng)物被用于生產(chǎn)多克隆抗體制劑，通過與活化人淋巴細(xì)胞(如T-細(xì)胞)和細(xì)胞因子活化的人單核細(xì)胞進(jìn)行免疫而獲得。在抗血清純化后，抗血清可直接應(yīng)用或與其它試劑組合，用于與免疫相關(guān)細(xì)胞的清除或進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。
各種動(dòng)物，特別是能提供一定體積抗血清的家畜也許被使用。動(dòng)物一般是至少1公斤，也許是5公斤或更多，如果合適，更小的動(dòng)物也可能被使用。懷孕期間應(yīng)該少于12個(gè)月，通常是在1到4個(gè)月的范圍。這里所指的動(dòng)物包括食草動(dòng)物，即兔子，綿羊，牛，犬，貓，馬等。最理想的動(dòng)物是那些抗體的多樣性主要由基因轉(zhuǎn)換引起的動(dòng)物(即兔子、豬、綿羊和牛)。在這些動(dòng)物中，最接近D區(qū)的V區(qū)用人的V區(qū)替換，會(huì)導(dǎo)致多數(shù)免疫球蛋白中人的V區(qū)元素的表達(dá)。
抗體制備通過分離能表達(dá)人的序列免疫球蛋的基因修飾動(dòng)物的血液獲得。富集的免疫球蛋可以由色譜法(親合、離子交換、凝膠過濾等)，選擇性沉淀，與鹽如硫酸銨，或與有機(jī)溶劑如乙醇，或與聚合物如聚乙二醇。
在多數(shù)情況下，抗體制劑包括非修飾的免疫球蛋白。選擇性地，免疫球蛋白組分也許會(huì)被處理如酶解(即與蛋白酶、木瓜素、纖溶蛋白酶、糖苷酶、核酸酶等)，加熱，和/或者進(jìn)一步分離。而且，免疫球蛋白可能由常規(guī)冷凍干燥辦法被做成粉末。在冷凍干燥前一種或多種穩(wěn)定劑可能加入免疫球蛋白制劑?？赡苁褂玫母鞣N穩(wěn)定劑包括氨基酸如甘氨酸和賴氨酸、碳水化合物如葡萄糖，甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露醇等。
使用的抗體制劑通常包含各種多克隆抗體，其中免疫球蛋白含量從0.1到100mg/ml，多數(shù)從1到10mg/ml?？贵w制劑也許包含各種同型的免疫球蛋白?？贵w制劑也許僅包含一種同型抗體，或一定數(shù)量選擇性同型抗體。
抗體也許被溶解或被稀釋在無毒，無熱原的溶劑中供人體靜脈內(nèi)或皮下注射，例如，在消毒的鹽水緩沖液中。在有些應(yīng)用中，抗體制劑也許被直接應(yīng)用于上皮或皮下。表面或粘膜應(yīng)用中，組分化的抗體也許被溶解在一個(gè)水溶性凝膠中如KY膠等。
抗體制劑經(jīng)常被注射入血管系統(tǒng)，通常靜脈內(nèi)注射或通過插入靜脈的導(dǎo)管滴入?？贵w制劑以一定速度給與，一般范圍從大約10分鐘到約24小時(shí)，通常從大約30分鐘到大約6個(gè)小時(shí)，與患者可接受液體的速度一致。有效劑量的給與也許發(fā)生在一次注入或系列注入。根據(jù)抗體制劑的半衰期和臨床適應(yīng)癥，重復(fù)注入也許每天一次，每周一次，每月一次，或每三個(gè)月一次，在其它應(yīng)用上，抗體可皮下給予。應(yīng)用在皮膚表面時(shí)，抗體制劑應(yīng)以有效量直接使用在需治療的表面，已取得最終效果。如需要，可以重復(fù)用藥。
免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明，能與參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合的具有特異性的多克隆免疫球蛋白可用于治療異常的免疫反應(yīng)。免疫介導(dǎo)的疾病是由抗體和細(xì)胞免疫性導(dǎo)致的炎性疾病。這些免疫反應(yīng)能損壞健康器官，或者由于攻擊進(jìn)入機(jī)體的外源物質(zhì)，或由于攻擊類似外源物質(zhì)的自身組織，該過程稱為自身免疫。
這些疾病包括許多關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)，炎性腸疾病(如潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn病)，內(nèi)分泌病(如I型糖尿病和Graves病)，神經(jīng)退行性疾病(如多發(fā)性硬化癥、自我中心光譜紊亂、Alzheimer病、肌萎縮性側(cè)索硬化，帕金森氏病、Huntington病、Guillain-Barre綜合癥、重癥肌無力和慢性先天脫髓鞘病(CID))，以及血管疾病(如自身免疫性聽力喪失、系統(tǒng)脈管炎，和動(dòng)脈粥樣硬化)。這些疾病均為常見疾病，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)有重大的影響。
本發(fā)明的免疫球蛋白制劑可有效結(jié)合并中和與免疫相關(guān)的細(xì)胞的，誘發(fā)不良或異常免疫應(yīng)答的抗原。這里″抗原個(gè)體″被定義為包含任何細(xì)胞、可溶解分子或細(xì)胞表面結(jié)合分子(包括蛋白質(zhì))，它們也許與免疫反應(yīng)發(fā)展相關(guān)并能與抗體結(jié)合。以本發(fā)明的抗體制劑治療可能避免許多使用免疫增強(qiáng)藥物引起的有害副作用。
人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)包括二個(gè)主要淋巴細(xì)胞族胸腺細(xì)胞(T細(xì)胞)，和骨髓細(xì)胞(B細(xì)胞)。成熟T細(xì)胞從胸腺產(chǎn)生和在組織、淋巴管和血液之間流通。T細(xì)胞具有免疫特異性和直接介入細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(如移植排斥)。T細(xì)胞作用于或回應(yīng)各種各樣的外源結(jié)構(gòu)(抗原)。在許多情況下，這些外源抗原由于感染在宿主細(xì)胞表達(dá)。但是，外源抗原也可能在宿主受瘤或傳染影響時(shí)產(chǎn)生。雖然T細(xì)胞本身不分泌抗體，但當(dāng)B細(xì)胞分泌抗體時(shí)，他們通常為必需條件。
有各種各樣的T細(xì)胞亞型，通常由細(xì)胞表面抗原簇，功能性和外源性抗原識(shí)別加以定義。有些T細(xì)胞亞型，譬如CD8+細(xì)胞，是在免疫系統(tǒng)起調(diào)控作用的殺傷/抑制細(xì)胞，而其他，譬如CD4+細(xì)胞，則促進(jìn)炎性和體液反應(yīng)。CD是指提到細(xì)胞表面抗原分化群；其數(shù)字是用國(guó)際白血球分化會(huì)議制定的術(shù)語來確定。Immunology Today，10254(1989).免疫系統(tǒng)主要參考文獻(xiàn)見Klein，J.ImmunologyThe Science of Self-Nonself Discrimination，Wiley & Sons，N.Y.(1982).
T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中充當(dāng)特別重要角色?？乖禺怲細(xì)胞反應(yīng)需要在T細(xì)胞表面受體和抗原攜帶細(xì)胞配基之間的多重相互作用。主要相互作用是在T細(xì)胞受體/CD3結(jié)合物和抗原呈遞細(xì)胞所表達(dá)的主要組織相容性復(fù)雜分子的結(jié)合反映，該作用使抗原肽與T細(xì)胞受體結(jié)合，因此觸發(fā)T細(xì)胞中的抗原特異信號(hào)。除該抗原特異信號(hào)外，T細(xì)胞反應(yīng)要求第二信號(hào)，。通過T細(xì)胞表面受體CD28刺激T細(xì)胞可在T細(xì)胞里產(chǎn)生共刺激信號(hào)(Harding，F(xiàn).A.(1992)Nature 356607-609)。CD28配基已在抗原攜帶細(xì)胞(APCs)中被鑒別。CD28配基包括蛋白質(zhì)B7家族成員，如B7-1(CD80)，B7-2(CD86)(Freedman，A.S.et al.(1987)J.Immunol.1373260-3267；Freeman，G.J.et al.(1989)J.Immunol.1432714-2722；Freeman，G.J.et al.(1991)J.Exp.Med.174625-631；Freeman，G.J.et al.(1993)Science 262909-911；Azuma，M.et al.(1993)Nature 36676-79；Freeman，G.J.et al.(1993)J.Exp.Med.1782185-2192).另外，B7-1和B7-2顯示與T細(xì)胞CD28相關(guān)的另一表面受體CTLA4結(jié)合(Linsley，P.S.(1991)J.Exp.Med.174561-569；Freeman，G.J.et al.(1993)Science 262909-911)。與CD28在T細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)不同，CTLA4是在T細(xì)胞活化時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生(Linsley，P.S.et al.(1992)J.Exp.Med.1761595-1604)。因此，CTLA4可能被用作T細(xì)胞活化作用的標(biāo)志物。除了B7-CD28的接合外，CD40-CD154是另外一對(duì)重要的共刺激信號(hào)。CD40由抗原呈遞細(xì)胞所表達(dá)，CD154則由活化后的CD4陽性淋巴細(xì)胞表達(dá)，在猴腎和皮膚移植模型上應(yīng)用單克隆抗體阻斷CD40-CD154可以誘導(dǎo)移植物的長(zhǎng)期存活。
T細(xì)胞是不僅對(duì)感染物的引起免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，據(jù)信也在各類慢性疾病炎性反應(yīng)的啟動(dòng)和發(fā)展中發(fā)揮中發(fā)揮重要作用。T細(xì)胞數(shù)量增加或活化狀態(tài)加強(qiáng)，特別是CD4+T細(xì)胞，會(huì)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的滑膜中發(fā)現(xiàn)(M.J.Elliott and R.N.Maini，Int.Arch.Allergy Immunol.104112-1125，1994)，在哮喘病人支氣管粘膜(C.J.Corrigan andA.B.Kay，Immunol.Today 13501-506，1992)，在多發(fā)性硬化癥患者損傷(R.Martin and H.F.McFarland，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.32121-182，1995)，在牛皮癬性損害(J.L.Jones，J.Berth-Jone，A.Fletcher and P.E.Hutchinson，J.Pathol.17477-82，1994)和在動(dòng)脈粥樣硬化的脂肪紋(R.Ross，Annu.Rev.Physiol.57791-804，1995)中發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的具體化應(yīng)用之一，在哺乳動(dòng)物(如人)使用本發(fā)明的免疫球蛋白制劑，可使導(dǎo)致異常的免疫反應(yīng)免疫學(xué)細(xì)胞被阻斷或者這些細(xì)胞在數(shù)量上被減少。因而，本發(fā)明提供了一個(gè)使用有效量多克隆抗體制劑治療或防止異常的免疫反應(yīng)的方法。多克隆抗體制劑中的抗體與活化淋巴細(xì)胞并且/或者活化單核細(xì)胞結(jié)合，但對(duì)不被介入免疫反應(yīng)的細(xì)胞基本沒有結(jié)合。這種療法能減少哺乳動(dòng)物重活化淋巴細(xì)胞和活化單核細(xì)胞的數(shù)量，因此抑制異常的免疫反應(yīng)。這種治療能避免一些使用免疫增強(qiáng)藥物所帶來的嚴(yán)重有害副作用。
異常免疫疾病包括自身免疫性疾病譬如類風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、少年關(guān)節(jié)炎、糖尿病、組織拒絕、哮喘、麻瘋病、腎炎、慢性支氣管炎、系統(tǒng)紅斑狼瘡、炎性腸疾病、Crohn疾病、胃炎、紊亂腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬、骨盆炎性疾病、軌道炎性疾病、腱炎、滑囊炎、牛皮癬、濕疹、皮炎和對(duì)環(huán)境刺激的不適當(dāng)?shù)倪^敏反應(yīng)譬如毒物常春藤、花粉、昆蟲蜇和某些食物，包括遺傳性過敏癥皮炎和接觸性皮炎。本發(fā)明的抗體組成和方法也對(duì)以下疾病產(chǎn)生的異常迎免疫反應(yīng)治療有效血管疾病，偏頭痛頭疼，結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周炎，甲狀腺炎，發(fā)育不全性貧血癥，Hodgkin病，硬皮病，風(fēng)濕性熱，重癥肌無力，腎病綜合癥，Behcet綜合癥，多肌炎，齒齦炎，過敏癥，結(jié)膜炎，傷害后脹大，心肌局部缺血等。
本發(fā)明的抗體可以用于治療和預(yù)防以下疾病在骨髓、腎臟、心臟、肺、胰腺、皮膚、肝臟移植中，在T-細(xì)胞依賴性過敏和自身免疫性疾病(心肌炎、糖尿病、重癥肌無力、紅斑狼瘡、Crohn疾病、多發(fā)性硬化癥、愛滋病、腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎等)中，在白細(xì)胞介素-2受體表達(dá)腫瘤疾病譬如T細(xì)胞白血病中，所產(chǎn)生的超免疫綜合癥狀、移植物-抗-受主病和受主-抗-移植物病。
本發(fā)明的多克隆抗體可以用于治療其他疾病自身免疫性溶血貧血癥(包括但不限于，冷球蛋白質(zhì)血癥或Coombs正面貧血癥)，自身免疫性出生血小板增多、先天血小板增多紫斑癥、自身免疫性血細(xì)胞減少癥、自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少癥、溶血貧血癥、抗磷酸脂綜合癥、皮炎(即遺傳性過敏癥的皮炎)，過敏腦脊髓炎、心肌炎、復(fù)發(fā)的多軟骨炎、風(fēng)濕性心臟病、腎小球性腎炎(如IgA腎病)，多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)炎、葡萄膜眼炎、多內(nèi)分泌腺病、紫斑癥(如Henloch-Scoenlein紫斑癥)，Reiter氏病、僵硬人綜合癥、自身免疫性肺炎、Guillain-Barre綜合癥、胰島素依賴型糖尿病頰炎，少年起始糖尿病，自身免疫炎性眼、自身免疫性甲狀腺炎、甲狀腺機(jī)能不足(如橋本甲狀腺炎)，系統(tǒng)紅斑狼瘡、Goodpasture綜合癥、天皰瘡，受體自身免疫病如(a)Graves病、(b)重癥肌無力，和(c)胰島素耐受、自身免疫性溶血貧血癥、自身免疫性血小板減少性紫斑癥、類風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)炎、谷蛋白敏感性腸病，密集沉積疾病、反膠原抗體硬皮病，復(fù)雜結(jié)締組織疾病、多肌炎/皮膚肌炎、有害貧血癥(Addison病)，先天Addison病、不育、腎小球性腎炎譬如主要腎小球性腎炎和IgA腎病，大泡性類天皰瘡、Sjogren綜合癥、糖尿病和腎上腺素能的藥物耐受(包括帶有哮喘或囊狀纖維變性腎上腺素能藥物耐受)，慢性活動(dòng)性肝炎、主要膽汁肝病、其它內(nèi)分泌腺紊亂、白斑、脈管炎、pos-MI、心切開術(shù)綜合癥、大皰性蕁麻疹、遺傳性過敏性皮炎、哮喘、炎性肌病，和其它炎性、顆粒型、退行性、萎縮性紊亂，其它紊亂如炎性皮膚疾病包括牛皮癬和硬化，炎性腸疾病(如Crohn病和潰瘍性結(jié)腸炎)，呼吸困厄綜合癥(包括成人呼吸困厄綜合癥，ARDS)，腦膜炎、腦炎、結(jié)腸炎、過敏癥如濕疹和其它介入T細(xì)胞和慢性炎性反應(yīng)的濾滲的癥狀，動(dòng)脈粥樣硬化、白血球黏附力缺陷、Reynaud綜合癥，和典型地被發(fā)現(xiàn)在結(jié)核病中由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遷延性高敏癥的相關(guān)免疫反應(yīng)、肉狀瘤、肉芽腫病和白血球滲出性疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性紊亂、多器官損傷綜合癥、抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、Lambert-Eaton肌無力綜合癥、Beheet病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、免疫復(fù)合型腎炎、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病或自身免疫性血小板增多等。
藥物學(xué)構(gòu)成本發(fā)明提供的包括白血球和細(xì)胞系混合物的抗原配方還可包括載體。
根據(jù)本發(fā)明，免疫球蛋白制劑或配方可以使用藥物學(xué)可接受的載體和/或惰性稀釋劑。同樣，本發(fā)明的包括白血球和高表達(dá)共刺激信號(hào)、白細(xì)胞介素受體、和黏附分子的細(xì)胞系混合物的抗原配方，也可使用藥物學(xué)可接受的載體和/或惰性稀釋劑以生產(chǎn)本發(fā)明的免疫球蛋白。
載體應(yīng)該是能同質(zhì)化或可食用，包括液體，半固體(如糊劑)，或固體。除了任何常規(guī)培養(yǎng)液、介質(zhì)、稀釋劑或載體對(duì)受體有害或?qū)γ庖咔虻鞍谆蚩乖苿┑闹委熜н^有影響，均適用于試藥配方。載體或稀釋劑的例子包括脂肪、油、水、鹽溶液、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、黏合劑，填充劑等，或者是它們的組合。
按照本發(fā)明，免疫球蛋白或抗原構(gòu)成是與載體以任一方便和實(shí)用方式結(jié)合，例如，溶液、懸浮液、乳劑、攙合物、膠囊、吸收等。
在應(yīng)用上，本發(fā)明的免疫球蛋白或抗原構(gòu)成是在一個(gè)適當(dāng)?shù)囊后w載體。液體載體包括水，鹽水等，含有鹽，糖，或穩(wěn)定劑。
在應(yīng)用上，本發(fā)明的免疫球蛋白制劑可作為粉末。這樣粉末可能與一個(gè)半固體或固體載體完全結(jié)合或混合?；旌峡梢允褂萌我环奖愕姆绞狡┤缪心ァ榱吮Ｗo(hù)免疫球蛋白制劑的治療活性損失，如在胃內(nèi)變性， 可在混合的過程中加入穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑包括緩沖液、胃酸分泌物的拮抗劑，氨基酸如氨基乙酸和賴氨酸，碳水化合物譬如葡萄糖，甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露醇等、蛋白水解酶抑制劑等。
免疫球蛋白制劑可能被制成硬或軟明膠膠囊、片劑，或藥片。更可能的是，明膠膠囊、片劑，或藥片有腸衣包裹。腸衣涂層防止免疫球蛋白制劑在酸性環(huán)境中如胃或上腸部的變性，參見美國(guó)專利第5,629,001號(hào)。到達(dá)小腸時(shí)，堿性PH溶化涂層，免疫球蛋白被釋放，由特殊細(xì)胞，如上皮腸細(xì)胞和Peyer M細(xì)胞吸收。
其它劑型包括塞劑。塞劑是各種重量和形狀的固體劑型，通常加有藥物，插入直腸、陰道或尿道。插入后，塞劑變軟，融化或溶化在體腔液中。一般講，作為塞劑，傳統(tǒng)載體也許包括，polyalkylene甘醇、甘油三酸酯或不同組合。在某些應(yīng)用上，塞劑也許被制成包含有效成分在有關(guān)范圍內(nèi)0.5％到大約10％，理想范圍在大約1％到2％。
在其它應(yīng)用上，本發(fā)明也許使用滴眼劑、鼻液或噴劑、濕劑或吸入劑。一個(gè)無限的例子是，鼻液通常是水溶液以滴劑和噴劑形式給藥。鼻液的制劑要與鼻分泌物在眾多方面相似，以維持正常的睫狀活動(dòng)。因而，更適合的水性鼻液通常是等滲或輕微地緩沖液，維持酸堿度大約5.5到大約6.5。另外，抗菌防腐劑，與那些在眼科制劑，藥物，或適當(dāng)?shù)乃幬锓€(wěn)定劑相似，如果需要，也包括在配方中。
在配方上，使用能有效改善或者治愈疾病癥狀/綜合癥的劑型和用藥量。配方可能以各種劑型給予，如可食用液體、藥物膠囊等。根據(jù)治療主體的情況劑量可能發(fā)生一些調(diào)整。需要一定技巧來確定適當(dāng)?shù)膫€(gè)體給藥量。而且，給人使用制劑必須符合美國(guó)FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室中SFDA提出的滅菌、發(fā)熱物質(zhì)、一般安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
給與免疫球蛋白也可用靜脈注射和皮下注射。靜脈或皮下注射免疫球蛋白現(xiàn)在已普遍用于免疫缺陷、先天血小板減少性紫斑癥，和各種自身免疫性疾病病人的治療。
這里也為患者提供可治療或防止不當(dāng)或異常免疫反應(yīng)的試藥盒。這些試藥盒包括本發(fā)明的免疫球蛋白制劑和使用說明。該試藥盒包括一種有活化淋巴細(xì)胞和活化單核細(xì)胞混合物的抗原配方，和用該配方免疫動(dòng)物的使用說明。
根據(jù)發(fā)明，使用本抗體可能減少或消除對(duì)免疫增強(qiáng)藥物的需要。正如數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的抗體制劑能消耗導(dǎo)致有害免疫學(xué)反應(yīng)的各類型細(xì)胞。因此，使用本發(fā)明的制劑和方法，患者對(duì)免疫增強(qiáng)藥物的需要會(huì)減少。
我們研發(fā)、生產(chǎn)的多克隆抗體則是具備針對(duì)參與免疫反應(yīng)的白細(xì)胞更加有選擇性的多克隆抗體，從而能預(yù)防、消除或降低異常免疫反應(yīng)及其臨床癥狀。


圖1A-B說明從使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子分離的少量免疫球蛋白能抑制在混合淋巴細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞增殖。當(dāng)用高劑量體外測(cè)試時(shí)，多克隆抗體能通過與細(xì)胞表面標(biāo)志物如CD3和CD28結(jié)合而刺激淋巴細(xì)胞。但是，低劑量可阻止淋巴細(xì)胞的增殖(圖1A)。作為混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)-血管內(nèi)皮細(xì)胞的對(duì)照，用于刺激反應(yīng)物的供體血管內(nèi)皮細(xì)胞被分開測(cè)試(″對(duì)施主″對(duì)照)，并且未被刺激的自身細(xì)胞用于對(duì)自身對(duì)照。如圖顯示，以自身未刺激的細(xì)胞，沒有增殖反應(yīng)出現(xiàn)。供體血管內(nèi)皮細(xì)胞能使增殖反應(yīng)中度提高，類似于使用從非免疫兔子的IgG的反應(yīng)效果。作為對(duì)照，從正常兔血清中提取的免疫球蛋白G則不具備抑制淋巴細(xì)胞的增殖的功效(圖1B)。(圖表1A-B的橫坐標(biāo)單位c.p.m為每分鐘計(jì)數(shù)，圖1A的縱坐標(biāo)為測(cè)試抗體的濃度，圖1B的縱坐標(biāo)為陰性對(duì)照抗體的濃度).
圖2A-D說明CD14+單核細(xì)胞與使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子制備的多克隆抗體共孵，可以調(diào)節(jié)人白血球表面標(biāo)志物的表達(dá)如CD40(圖2A)，CD80(圖2B)，CD36(圖2C)，CD54(圖2D)。圖中所示的多克隆抗體為本發(fā)明的多克隆抗體，未加抗體是指未加任何抗體，正常兔IgG為從正常兔血清中提取的免疫球蛋白G，抗胸腺球蛋白(Thymoglobulin)為目前臨床上所使用的兔抗人胸腺細(xì)胞多克隆抗體阻斷功效。(圖表的橫軸表示熒光強(qiáng)度，縱軸表示檢測(cè)細(xì)胞數(shù))
圖3A-I說明活化外周血液淋巴細(xì)胞與使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子制備的多克隆抗體共孵，可以調(diào)節(jié)人白血球表面標(biāo)志物的表達(dá)如CD2(圖3A)，CD3(圖3B)，CD4(圖3C)，CD8(圖3D)，CD25(圖3.E)，CD28(圖3F)，CD154(圖3G)，白細(xì)胞介素-18受體(圖3H)和CD52(圖3I)。圖中所示的多克隆抗體為本發(fā)明的多克隆抗體，未加抗體是指未加任何抗體，正常兔IgG為從正常兔血清中提取的免疫球蛋白G，抗胸腺球蛋白(Thymoglobulin)為目前臨床上所使用的兔抗人胸腺細(xì)胞多克隆抗體阻斷功效。(圖表的橫軸表示熒光強(qiáng)度，縱軸表示檢測(cè)細(xì)胞數(shù))圖4A-C說明使用使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子(兔子2)或未活化白血球(兔子1)免疫的兔子制備的多克隆抗體處理，血樣中某些類型免疫細(xì)胞被消耗情況。(縱軸表示細(xì)胞計(jì)數(shù))圖4A使用使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子(兔子2)制備的多克隆抗體，比用未活化人的白血球(兔子1)免疫的兔子制備的多克隆抗體，在消耗白細(xì)胞血樣(WBC)時(shí)更有效。(縱軸表示細(xì)胞計(jì)數(shù))圖4B使用使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子(兔子2)制備的多克隆抗體，和用未活化的白血球(兔子1)免疫的兔子制備的多克隆抗體，在消耗淋巴細(xì)胞血樣時(shí)均有效。(縱軸表示細(xì)胞計(jì)數(shù))圖4C使用使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子(兔子2)制備的多克隆抗體，比用未活化白血球(兔子1)免疫的兔子制備的多克隆抗體，在消耗單核細(xì)胞血樣時(shí)更有效。(縱軸表示細(xì)胞計(jì)數(shù))圖5使用使用表答共刺激信號(hào)淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞免疫的兔子制備的多克隆抗體與白血球細(xì)胞共同培養(yǎng)后釋放調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的白細(xì)胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-10，和IL-13.而正常陰性對(duì)照兔免疫球蛋白則不具備誘導(dǎo)白血球細(xì)胞產(chǎn)生和釋放調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的白細(xì)胞介素的作用，而臨床上所使用的兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白Thymoglobulin則具有比較弱的誘導(dǎo)白血球細(xì)胞產(chǎn)生和釋放調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的白細(xì)胞介素的作用.(縱軸為每毫升含有白細(xì)胞介素量，具體單位為毫微克)具體實(shí)施方式
和實(shí)例本發(fā)明將由以下詳細(xì)例子說明。此說明為解釋性，但不以任何形式限制本發(fā)明。
材料和方法1.人白血球的制備用離心法從人新鮮血液中分離外周單核血細(xì)胞PBMC(具體分離條件和步驟參見Leslie Hudson和Frank C.Hay所著Practical Immunology)以及從脾臟和淋巴結(jié)中分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞(具體分離條件和步驟參見Leslie Hudson和Frank C.Hay所著Practical Immunology)。提取細(xì)胞在經(jīng)過反復(fù)的洗滌(4℃的PBS洗滌液最少三次)和離心后(每分鐘1000到1500轉(zhuǎn)，離心8到10分鐘)獲得。
2.細(xì)胞系的培養(yǎng)用于免疫動(dòng)物的人的細(xì)胞系D1.1(保藏編號(hào)為ATCCCRL-10915)和BDCM(保藏編號(hào)為ATCC CRL-2740)可直接從美國(guó)公司諸如ATCC和CAMBREX等等購得，細(xì)胞系在解凍后立即加入細(xì)胞培養(yǎng)液(2×106細(xì)胞/毫升)，細(xì)胞培養(yǎng)液由RPMI-1640和10％FCS所構(gòu)成，通過顯微鏡來觀測(cè)分化細(xì)胞，并根據(jù)細(xì)胞分化的多少(5×106細(xì)胞/毫升)來進(jìn)一步擴(kuò)張細(xì)胞培養(yǎng)，分化細(xì)胞的某些表面蛋白的表達(dá)諸如共刺激分子CD40，CD80，CD86，和CD154則通過使用熒光標(biāo)記抗CD40，CD80，CD86，和CD154單克隆抗體和細(xì)胞的結(jié)合并由流式細(xì)胞儀的檢測(cè)來確定(Yellin MJ，et al.Journal of Immunology 1994，152598-608，Kharbanda S，et al.Br.J.Haematol 2002，119819-825，Baruch M，et al.Leuk.Lymphoma 1996，21485-495，US專利5,447,861一九九五年九月五號(hào)).
3.兔子免疫使用淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞系D1.1(保藏編號(hào)為ATCCCRL-10915，高表達(dá)CD154)，和細(xì)胞系BDCM(保藏編號(hào)為ATCC CRL-2740，高表達(dá)CD40，CD80，CD86和HLA-DR)對(duì)兔子進(jìn)行首次免疫和加強(qiáng)免疫。首次免疫使用淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1和BDCM懸液500×106/ml，與完全弗氏佐劑(1∶1/容量)乳化后，對(duì)新西蘭白兔子(雄性和雌性)多點(diǎn)進(jìn)行皮下注射。加強(qiáng)免疫將所有細(xì)胞懸浮于5毫升滅菌生理鹽水中通過靜脈注射。首次免疫的總?cè)萘坎怀^1毫升，皮內(nèi)注射應(yīng)用25g 1英寸針頭在兔子背上多點(diǎn)進(jìn)行(最少10個(gè))。首次免疫使用250×106淋巴細(xì)胞和250×106全部細(xì)胞系(50×106單核細(xì)胞、100×106細(xì)胞系D1.1、100×106細(xì)胞系BDCM)加強(qiáng)免疫每次使用100×106淋巴細(xì)胞和全部細(xì)胞系(50×106單核細(xì)胞、50×106細(xì)胞系D1.1、50×106細(xì)胞系BDCM)免疫時(shí)間第0天用淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞系(D1.1)和單核細(xì)胞以及細(xì)胞系(BDCM)首次免疫(500×106細(xì)胞).
第21天通過兔耳靜脈注射淋巴細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1以及BDCM進(jìn)行加強(qiáng)免疫(250×106細(xì)胞)第28天通過兔耳靜脈注射淋巴細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1以及BDCM進(jìn)行加強(qiáng)免疫(250×106細(xì)胞)。
第29天通過兔耳靜脈注射淋巴細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1以及BDCM進(jìn)行加強(qiáng)免疫(250×106細(xì)胞)。
第30天通過兔耳靜脈注射淋巴細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1以及BDCM進(jìn)行加強(qiáng)免疫(250×106細(xì)胞)。
第35天通過兔耳靜脈注射淋巴細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1以及BDCM進(jìn)行加強(qiáng)免疫(250×106細(xì)胞)。
第56天通過兔耳靜脈注射淋巴細(xì)胞和細(xì)胞系D1.1以及BDCM進(jìn)行加強(qiáng)免疫(250×106細(xì)胞)。
4.血液收集兔子血液在第35天注射后一個(gè)星期開始收集，連續(xù)三個(gè)星期。在第56天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。最后注射后一星期，在麻醉狀態(tài)下將靜脈導(dǎo)管通過靜脈放入到右心房?jī)?nèi)收集全血液而后經(jīng)由離心機(jī)離心分離血清(在4℃的溫度和2000轉(zhuǎn)下離心30分鐘).
5.多克隆抗體的純化根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，用蛋白質(zhì)G Sepharose 4型快流柱(AmershamBiosciences)純化血清中所含有的多克隆抗體，首先制備蛋白質(zhì)G流柱，在其制備過程中避免流柱內(nèi)殘留有氣泡，將收集到的血清稀釋兩倍后緩慢通過過蛋白質(zhì)G流柱，然后用緩沖液(PBS)洗滌蛋白質(zhì)G流柱，結(jié)合于蛋白質(zhì)G流柱上的多克隆抗體經(jīng)由低pH(3.0)洗脫液(0.1M glycine buffer)解析下來而獲得(IgG分子重量為150,000 Daltons)(Akerstrom B等.Journal of Immunology 1985 1352589-2592；Fredriksson G等.Journal ofImmunological Methods 1987，9765-70，Bjorck L等，Journal of Immunology 1984，133969-974)。
6.多克隆抗體的活性的鑒定方法(1)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)該反應(yīng)使用新鮮人外周血單核細(xì)胞反應(yīng)物(1×106/毫升)和mitomycin C(每毫升50微克)治療后的同種異體(1×106/毫升)的外周血單核細(xì)胞刺激物。反應(yīng)物和刺激物共孵5天，加以不同量(每毫升1到50微克)的用游離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞(兔子1)或高表達(dá)共刺激信號(hào)的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(兔子2)組合免疫的兔子的多克隆IgG抗體。然后在最后24小時(shí)將3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷加入反應(yīng)物和刺激物細(xì)胞。細(xì)胞收獲至玻璃纖維膜，3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷的攝取可由貝塔液體閃爍儀測(cè)量。結(jié)果顯示在圖1，單位為cpm(每分鐘計(jì)數(shù)).(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1A-B)(更加具體實(shí)驗(yàn)步驟參見Leslie Hudson和Frank C.Hay所著Practical Immunology))(2)用兔抗人白血球多克隆抗體進(jìn)行前Ex Vivo白血球清除將EDTA(1.5mg/ml)處理的新鮮血樣(1毫升)與兔抗人白血球多克隆抗體(200ug/ml)在37℃下孵育60分鐘。用未處理的血樣和用非免疫兔子免疫蛋白IgG處理的樣品作為對(duì)照。孵育后，所有血樣由臨床實(shí)驗(yàn)室做完全血液計(jì)數(shù)(CBC)測(cè)試。(見附圖4A-C)例一.淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞在異常免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵的作用，具體到臨床移植，器官移植后的排異反應(yīng)和骨髓移植后的移植物抗宿主反應(yīng)和淋巴細(xì)胞密切相關(guān)，使用可以和這些細(xì)胞結(jié)合并使之被殺傷從而被清除則可以預(yù)防或減低相關(guān)的反應(yīng)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體在加入到含有補(bǔ)體的全血中并在37℃培養(yǎng)一小時(shí)后送臨床實(shí)驗(yàn)室做完全血液計(jì)數(shù)，經(jīng)過檢測(cè)白血球細(xì)胞的計(jì)數(shù)明顯下降(見圖4A-B)。
例二.單核細(xì)胞在異常免疫反應(yīng)中皆扮演著重要角色，但對(duì)其在器官移植后的排異反應(yīng)中所起的作用一直未得到重視，而新近的研究成果表明單核細(xì)胞在器官移植后的排異反應(yīng)中以作為抗原呈遞細(xì)胞有著舉足輕重的作用，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體在加入到含有補(bǔ)體的全血中并在37℃培養(yǎng)一小時(shí)后送臨床實(shí)驗(yàn)室做完全血液計(jì)數(shù)，經(jīng)過檢測(cè)單核細(xì)胞的計(jì)數(shù)明顯下降(見圖4C)。
(3)流式細(xì)胞儀分析PBS稀釋純化(2×106/毫升)的單核細(xì)胞(未活化或活化)或淋巴細(xì)胞(未活化或活化)，與兔子的抗人多克隆抗體(100微克/毫升)在4℃(冰上)孵育60分鐘。然后將細(xì)胞(1×105)與抗人白血球表面抗原的單克隆抗體如抗CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD40、CD52、CD54，CD58，CD45RO，CD45RB，CD80，CD86，HLA-DR的單克隆抗體(PE或FITC標(biāo)記)在4℃孵育30分鐘，在4℃條件下清洗二次。樣品用FACScan(Becton Dickinson)根據(jù)細(xì)胞表面熒光強(qiáng)弱程度來進(jìn)行檢測(cè)和分析。通過此項(xiàng)檢測(cè)，可以獲得有關(guān)多克隆抗體對(duì)白細(xì)胞表面特定的蛋白分子的阻擋斷的特性從而對(duì)多克隆抗體的作用機(jī)制和機(jī)理有更加充分的了解。(見附圖2A-D，和3A-I)例一.共刺激分子CD80，/CD86/CD28，和CD154/CD40在免疫反應(yīng)的啟動(dòng)機(jī)制中扮演著極其重要的角色，抗原呈遞細(xì)胞傳遞抗原信息給T細(xì)胞并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化首先要通過組織相容性復(fù)雜分子和T細(xì)胞受體/CD3以及共刺激分子之間的相互作用來達(dá)成，當(dāng)共刺激分子蛋白和受體被多克隆抗體制劑中所含有的抗體如抗CD40，抗CD80，抗CD86所阻斷后，這些參與異常免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞由于其活化途徑被阻斷從而無法參與異常免疫反應(yīng)，而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中含有抗共刺激分子CD40，CD80，CD28和CD154抗體并可覆蓋阻斷這些蛋白分子(見圖2A，2B，3F和3G)，例二.T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體和CD3蛋白分子在和抗原呈遞細(xì)胞傳遞抗原信息的過程中扮演著舉足輕重的角色，而抗CD3單克隆抗體和CD3蛋白的結(jié)合外加補(bǔ)體系統(tǒng)的參與則可到至細(xì)胞的清除，而另外一種細(xì)胞表面蛋白CD52在和抗CD52抗體結(jié)合后皆可誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)的參與從而清除淋巴細(xì)胞，而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中含有抗CD3抗體和抗CD52抗體并可覆蓋阻斷CD3和CD52蛋白分子(見圖3B和3I)，例三.白細(xì)胞介素和T細(xì)胞表面白細(xì)胞介素受體在淋巴細(xì)胞活化和參與免疫反應(yīng)的進(jìn)程中其著至關(guān)重要的作用，而通過對(duì)白細(xì)胞介素受體的阻斷則可從某種程度上來抑制免疫反應(yīng)，而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中含有抗白細(xì)胞介素2受體CD25的抗體和抗白細(xì)胞介素18的受體IL-18R的抗體并可覆蓋阻斷這些蛋白分子(見圖3E和3H)，例四.黏附蛋白分子如CD54，CD31，和CD36等在免疫反應(yīng)的初始階段以及在缺血再灌注損傷后都起著至關(guān)重要的作用，通過針對(duì)這些黏附蛋白分子的抗體的阻斷對(duì)免疫反應(yīng)，由免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥性反應(yīng)以及缺血再灌注損傷有著預(yù)防和治療的作用，而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中含有抗黏附蛋白分子CD36的抗體和抗CD54的抗體并可覆蓋阻斷這些蛋白分子(見圖2C和2D)，例五.人類血小扳在創(chuàng)傷的過程中得以活化，而活化后的血小扳則在其表面表達(dá)并可釋放共刺激分子CD154，活化之血小扳則可通過其表面所表達(dá)的CD154直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，由活化血小扳所釋放的可溶性CD154可作用于抗原抗原呈遞細(xì)胞表面的CD40從而誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞活化，，而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中含有抗共刺激分子CD154抗體并可覆蓋阻斷這些蛋白分子(見圖3G)，(4)白細(xì)胞介素檢測(cè)將人白血球細(xì)胞從全血中分離后用PBS液體清洗三次，將細(xì)胞用含有10％的胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到每毫升2×106細(xì)胞，而后加入多克隆抗體(每毫升20-50微克)，將細(xì)胞至于37度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24到72小時(shí)，收集培養(yǎng)液并同過Beadlyte human multi-plex白細(xì)胞介素檢測(cè)系統(tǒng)(cytokine detectionsystem)來檢測(cè)介入免疫調(diào)節(jié)的白細(xì)胞介素諸如干擾素-α，IL-2.IL-4，IL-10，和IL-13(Hasegawa K等.Science 2004 303685-689，George T等，Eur J.Immunol 200333502-511，Towne J等，J Biol Chem 2004 27813677-13688)。例一，白細(xì)胞介素諸如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18等在免疫反應(yīng)中起著正向或負(fù)向調(diào)控，而人白血球細(xì)胞在經(jīng)過和本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體培養(yǎng)后，經(jīng)過檢測(cè)有大量IL-2，IL-4，IL-3，IL-10，和IL-13釋放(見圖五)，而這些釋放的白細(xì)胞介素則可直接參與對(duì)免疫反映的調(diào)控從而抑制炎癥和異常免疫反應(yīng)，而這種調(diào)控機(jī)制則在免疫耐受的誘導(dǎo)中起著重要的作用.
(5)多克隆抗體作為免疫療法在異常免疫反應(yīng)中的治療例一.移植術(shù)后的排異反應(yīng)出現(xiàn)于細(xì)胞移植后如胰島移植，器官移植后如腎臟、心臟、肺、胰腺、皮膚、肝臟移植以及肢體移植后和骨髓移植后的移植物-抗-宿主病和宿主-抗-移植病，其發(fā)生機(jī)制包括了淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，和抗原呈遞細(xì)胞等等，而經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中則含有針對(duì)這些細(xì)胞的抗體，其具體表現(xiàn)為可以在補(bǔ)體系統(tǒng)的參與下清除這些細(xì)胞，此外多克隆抗體中具有特異針對(duì)性的抗共刺激分子如CD40，CD80，和CD154等等以及抗CD3，HLA class II，和T細(xì)胞受體的抗體不但可以抑制這些細(xì)胞參與排異反應(yīng)，而同時(shí)可以通過正反向的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種白細(xì)胞介素進(jìn)而對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)控并最終抑制排異反應(yīng)(見圖)，經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體中所含有的抗黏附蛋白分子如CD54，CD31，和CD36從理論上將在缺血再灌注損傷發(fā)生后通過對(duì)這些蛋白分子的阻斷可對(duì)移植器官和細(xì)胞以及受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞提供保護(hù)作用從而預(yù)防和治療缺血再灌注損傷.
例二.在其他的自體免疫性疾病中如T-細(xì)胞依賴性過敏，心肌炎、糖尿病、重癥肌無力、紅斑狼瘡、Crohn疾病、多發(fā)性硬化癥、愛滋病、腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎，以及白細(xì)胞介素-2受體表達(dá)腫瘤疾病譬如T細(xì)胞白血病中，所產(chǎn)生的超免疫綜合癥狀在其發(fā)生過程中和免疫系統(tǒng)的異常失控緊密相關(guān)，而經(jīng)本發(fā)明所生產(chǎn)的多克隆抗體對(duì)參與免疫反應(yīng)的白血細(xì)胞有相對(duì)特異的針對(duì)性，從而可以通過免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)來治療這些異常免疫反應(yīng)。
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DNA導(dǎo)入胚胎的方法美國(guó)專利5,567,607.
胚胎干細(xì)胞的保存和繁殖美國(guó)專利5,453,357.
權(quán)利要求
1.一種抗原組合物，包括哺乳類白血球細(xì)胞和表達(dá)共刺激分子、白細(xì)胞介素受體和粘附分子的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的表達(dá)共刺激分子、自細(xì)胞介素受體和粘附分子的細(xì)胞系是ATCC CRL-2740。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的表達(dá)共刺激分子、白細(xì)胞介素受體和粘附分子的細(xì)胞系是ATCC CRL-10915。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的哺乳類動(dòng)物是人。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4所述的組合物，其中所述的白血球細(xì)胞是淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞株和單核細(xì)胞或單核細(xì)胞株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的細(xì)胞系是表達(dá)CD154細(xì)胞株，或表達(dá)CD40/CD80/CD86細(xì)胞株，或表達(dá)CD54/CD58細(xì)胞株。
7.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述的組合物在制備治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
8.一種多克隆抗體，其特征是以權(quán)利要求1、2、3、4、5、6中組合物作為抗原，再經(jīng)動(dòng)物免疫，取血，分離出抗全血清，純化制得，所得的多克隆抗體分子量為150,000Daltons，所述的多克隆抗體與參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞具有特異性結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多克隆抗體，其特征是所述的免疫動(dòng)物是兔或其他哺乳動(dòng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多克隆抗體，其特征是所述的免疫動(dòng)物可被基因修飾從而產(chǎn)生人源化抗體。
11.權(quán)利要求8所述的多克隆抗體在制備治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中所述的異常免疫反應(yīng)是指器官，組織，細(xì)胞移植后所出現(xiàn)的排異反應(yīng)以及移植物抗宿主反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎，一種炎性腸疾病，內(nèi)分泌病，神經(jīng)變性病，或一種血管疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述的異常免疫反應(yīng)包括類風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，腎病，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫、多發(fā)性硬化癥、內(nèi)向性光紊亂、老年性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化，帕金森病、亨廷頓舞蹈病，急性熱病性多神經(jīng)炎、重癥肌無力、慢性自發(fā)性脫髓鞘病、自身免疫性聽力喪失、系統(tǒng)性脈管炎，或動(dòng)脈粥樣硬化。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗原組合物，該組合物包括白血球和細(xì)胞系混合物，該抗原組合物經(jīng)動(dòng)物免疫后獲得新一代的多克隆抗體，該多克隆抗體具有特異的治療和預(yù)防異常免疫反應(yīng)的作用。本發(fā)明提出了對(duì)異常免疫反應(yīng)的免疫療法，包括自身免疫性疾病，移植物－抗－宿主疾病，同種異體器官、組織、細(xì)胞移植后排異反應(yīng)，異種異體器官、組織、細(xì)胞移植后排異反應(yīng)，多發(fā)性硬化癥、糖尿病等。本發(fā)明提供的多克隆抗體直接作用于已確知參與異常免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，對(duì)未介入異常免疫反應(yīng)的靜息狀態(tài)或未活化的淋巴細(xì)胞有較少的排除和阻斷。
文檔編號(hào)A61P37/00GK101088560SQ200610087550
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2006年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月14日
發(fā)明者徐何, 于鋒, 劉子棟 申請(qǐng)人:徐何, 于鋒, 劉子棟