專利名稱：紫菜多糖在制備預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)保護(hù)藥物，具體地說(shuō)是紫菜多糖在制備預(yù)防和治療神 經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物方面的應(yīng)用。
技術(shù)背景紫菜屬于紅藻門，紅毛菜目，紅毛菜科紫菜屬植物。已知紫菜含有豐 富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種維生素和礦物質(zhì)，在日本素有"長(zhǎng)壽菜" 的美譽(yù)。紫菜在中醫(yī)中已有上千年的應(yīng)用歷史。《本草綱目》中記載"紫菜 主治熱氣煩塞咽喉，煮汁飲之，病癭瘤腳氣者，宜食之。凡癭結(jié)積塊之 疾，宜常食紫菜，乃能軟堅(jiān)散結(jié)，利水消腫，補(bǔ)腎養(yǎng)心之功效"。紫菜多糖是紫菜的主要成分之一，是從紫菜中提取的一種部分硫酸化 的天然線形多糖，主要由半乳糖、3，6—內(nèi)醚半乳糖和硫酸基等組成，其基 本結(jié)構(gòu)單元主要是由1， 3連接的IB —D—半乳糖與1， 4連接的a —L一 t. 乳糖一6—硫酸基組成的二糖單位以及1， 3連接的P—D—半乳糖與1， 4 連接的a—L一3， 6—內(nèi)醚半乳糖組成的二糖單位。此外部分紫菜多糖D — 半乳糖的C6位和L一半乳糖的C2外發(fā)生部分甲基化。根據(jù)報(bào)道，紫菜多糖具有多種活性，包括增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫、 抗氧化、抗輻射、抗癌等活性。張全斌等進(jìn)行了紫菜多糖對(duì)老年大鼠的抗 氧化試驗(yàn)，證明其具有抗氧化作用。到目前為止的研究，紫菜多糖還僅局限于對(duì)泛指的增強(qiáng)免疫力、抗氧 化、抗腫瘤、抗衰老等方面的研發(fā)，其對(duì)預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的 機(jī)理等研究尚未見(jiàn)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物研究無(wú) 明顯進(jìn)展，從天然植物中獲得提取物和有效成分成為該領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn) 和共識(shí)。隨著人類平均壽命的逐年增加，世界正步入全球老齡化時(shí)代。與年齡 有關(guān)的神經(jīng)退化性疾病也隨之增加，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，主要表現(xiàn)為興 奮與抑制過(guò)程減弱，大腦功能降低，記憶力減退和喪失，隨后出現(xiàn)識(shí)別功 能的進(jìn)行性減退和情緒紊亂的加重等。老年性癡呆已成為心腦血管疾病和 腫瘤之后的第四位疾病。目前，全世界65歲以上人群中老年性癡呆患病率 約為5%。而老年性癡呆因其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理，近期在防治上不可能取得突 破性進(jìn)展，故西方有專家預(yù)言，老年性癡呆將是21世紀(jì)人類第一殺手。帕金森病又稱震顫麻痹，是中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病， 帕金森病的主要病理特征是是因位于中腦部位"黑質(zhì)"中的細(xì)胞發(fā)生病理性 改變后，多巴胺的合成減少，抑制乙酰膽堿的功能降低，則乙酰膽堿的興
奮作用相對(duì)增強(qiáng)。兩者失衡的結(jié)果便出現(xiàn)了 "震顫麻痹"。最新資料表明， 中國(guó)有l(wèi) 7 0萬(wàn)帕金森病患者，其中5 5歲以上的人群中每1 0 0人就有1個(gè)帕金森病人，估計(jì)每年新增帕金森病人約1 0萬(wàn)人。老年性癡呆和帕金森病對(duì)患者、家庭和社會(huì)都帶來(lái)巨大的壓力，使得全世界對(duì)其給予眾多的關(guān)注，老年癡呆和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的治療藥物研究成為老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的-個(gè)重要課題。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供紫菜多糖在制備預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物 方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明在紫菜多糖的抗衰老作用及機(jī)理方面進(jìn)行了深入而全面的研 究，最后發(fā)現(xiàn)紫菜多糖具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損害的保護(hù)作用；即紫菜多糖可在制 備預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括帕金森病或老年性癡呆。所述的紫菜多糖是從紅藻門紅毛菜目紅毛菜科紫菜屬的海洋藻類中提 取的硫酸多糖；是指含有D —半乳糖和L一半乳糖一6 —硫酸基，或者同時(shí) 還含有3， 6—內(nèi)醚一L一半乳糖的多糖。本發(fā)明所提到的紫菜多糖應(yīng)該是通 過(guò)任何可行方法獲得的一類多糖類物質(zhì)。該紫菜多糖可以是一種水提取物 或其他形式的提取物；也包括將紫菜多糖提取物經(jīng)任何方法降解制得的不 同分子量的產(chǎn)物。所述紫菜屬藻類包括條斑紫菜(戶y^oe"w^)、甘紫菜(P^7w)、岡 紫菜(/^wZw^/cw/ato)、鈹紫菜(P c/^/ ato)、長(zhǎng)紫菜(P&"tota)、壇紫 菜(i^m'to"era&)、邊紫菜(尸wwg/w7to)等中的一種或幾種。本發(fā)明另一方面提供了一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的藥學(xué)制劑，該制劑含 有上述任一種形式的紫菜多糖和藥學(xué)可接受的載體，如淀粉、氯化鈉、 微晶纖維素、山梨酸和/或甘露醇等。所述制劑包括口服給藥的劑型、非口 服給藥的注射劑型或局部給藥制劑。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1. 安全性高，可長(zhǎng)期限服用。在目前階段，老年性癡呆和帕金森病通 常是不可逆的神經(jīng)退行性疾病。為了保持患者病情不繼續(xù)惡化，病人用藥 周期較長(zhǎng)。紫菜多糖作為來(lái)源于食用海藻的一種天然海洋多糖產(chǎn)物，其高 安全性可以保證病人長(zhǎng)期用藥的需要。紫菜多糖來(lái)源于食用海藻紫菜，經(jīng) 急性毒性試驗(yàn)證明安全性非常高。2. 使用效果好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫菜多糖能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞SY5Y對(duì)抗 AP^35毒性，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用；紫菜多糖同時(shí)具有提高免疫功能 的活性，可以從多角度提高老年病人的健康狀況。


圖1為紫菜多糖對(duì)SY5Y細(xì)胞A^51損傷的保護(hù)作用。林，p〈0.001， *，p〈0. 05。圖2為紫菜多糖對(duì)小鼠避暗試驗(yàn)的影響圖2A.對(duì)錯(cuò)誤次數(shù)的影響，圖 2B.對(duì)潛伏期的影響;*， p<0.05。圖3為紫菜多糖對(duì)小鼠水迷宮試驗(yàn)的影響圖3A.對(duì)小鼠進(jìn)入盲端的錯(cuò) 誤次數(shù)的影響，圖3B.對(duì)小鼠找到平臺(tái)潛伏期的影響；*， p<0.05。圖4為紫菜多糖對(duì)小鼠海馬內(nèi)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性的影響； *， p<0. 05。圖5為紫菜多糖對(duì)小鼠海馬內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響；*, p<0. 05。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。這里想要指出的是， 下面的具體實(shí)施方式
僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā)明精 神的前提下，可以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)和公知知識(shí)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行相 應(yīng)變換，這些技術(shù)方案均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1從條斑紫菜制備紫菜多糖將100g干燥條斑紫菜加40倍量的水，12(TC提取3小時(shí)。篩絹過(guò)濾除 去藻渣，濾液用硅藻土助濾。將所得濾液濃縮，然后將該濃縮物凍干得到 20g的凍干提取物。實(shí)施例2從壇紫菜制備紫菜多糖將100g干燥壇紫菜加40倍量的水，12(TC提取3小時(shí)。篩絹過(guò)濾除去藻渣，濾液用硅藻土助濾。將所得濾液濃縮，經(jīng)自來(lái)水流水透析2天，蒸 餾水透析1天，然后將該透析液用75%乙醇沉淀，用95%乙醇洗滌所得沉 淀兩次，烘干該沉淀得到16g烘干提取物。 實(shí)施例3低分子量紫菜多糖Pl的制備取提取的紫菜多糖5g配成1. 5%的水溶液，在該溶液中加入5mM抗壞 血酸和5mM過(guò)氧化氫，常溫反應(yīng)3小時(shí)。將該反應(yīng)液用截留分子量為3600Da 的透析袋在自來(lái)水中透析2天，在蒸餾水中透析2天，之后真空濃縮。凍 干該濃縮物得到3g分子量為35kD的紫菜多糖樣品Pl。實(shí)施例4低分子量紫菜多糖P2的制備取提取的紫菜多糖5g配成1.5%的水溶液，在該溶液中加入lOmM抗壞 血酸和10mM過(guò)氧化氫，常溫反應(yīng)3小時(shí)。將該反應(yīng)液用截留分子量為3600Da 的透析袋在自來(lái)水中透析2天，在蒸餾水中透析2天，之后真空濃縮。凍 干該濃縮物得到3g分子量為6kD的紫菜多糖樣品P2。實(shí)施例5紫菜多糖注射劑的制備取紫菜多糖50g，加入注射用水500ml，甘露醇50g，調(diào)PH值至7.0，分裝，冷凍干燥。實(shí)施例6紫菜多糖對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH—SY5Y的保護(hù)作用 本發(fā)明以細(xì)胞存活率為指標(biāo)，研究了紫菜多糖對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH— SY5Y細(xì)胞的日-淀粉樣肽(P-amyloid peptide, Ap)損傷模型的保護(hù)作用。材料SY5Y細(xì)胞株由瑞典卡羅琳斯卡研究所Bengt Winblad教授和裴 進(jìn)京博士贈(zèng)送。A 3 片斷由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院北京腦老化實(shí)驗(yàn)室合 成，高效液相色譜法純化，純度98%以上，無(wú)血清MEM配成溶液，0.22um 慮膜抽濾，一2(TC保存。紫菜多糖經(jīng)抗壞血酸和過(guò)氧化氫降解，制得分子 量分別為35KD和6KD的Pl和P2兩個(gè)樣品。試驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)條件為MEM(GibcoBRL， 41500-067)培養(yǎng)基中加入 10%胎牛血清(Hyclone， SH30070. 03) 、 15腿o1. L—'HEPES(DNN co即any)、青霉素lxl(HU丄'、鏈霉素lxl05IU. L1， 5%C02， 37。C，每周換液兩次，傳代一次。MTT代謝率測(cè)定將SY5Y細(xì)胞以密度為1X10'個(gè)細(xì)胞接種于96孔板 (Costar產(chǎn)品)，3天后分為對(duì)照組、A e 35組和A P 35 + P2組(10、 40、 80"g/ml)、 AU Pl (10、 40、 80ug/ml)藥物組，，每組8孔。接種后24小時(shí)每孔加MTT(5mg/ml)20ul， 370C孵育4小時(shí)，吸出培養(yǎng)液，每 孔加入DMS0200ii 1，振搖10分鐘，用酶標(biāo)儀(Diagnostic Pasteur LP400) 測(cè)定550nm處光密度值(0D)。結(jié)果如圖1所示，樣品Pl和P2在三個(gè)濃度時(shí)均能顯著對(duì)抗20uM A13a —35毒性，提高培養(yǎng)細(xì)胞MTT代謝率，而且隨著樣品濃度增加其活性逐漸增強(qiáng)， 結(jié)果表明紫菜多糖能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞SY5Y對(duì)抗AP 2H5毒性，具有顯著的神 經(jīng)保護(hù)作用。神經(jīng)細(xì)胞凋亡在神經(jīng)細(xì)胞損傷中起十分重要的作用，藥物可 通過(guò)干預(yù)凋亡過(guò)程阻止其進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。SH-SY5Y 細(xì)胞來(lái)源于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其形態(tài)和生理功能與正常神經(jīng)元相似，呈 錐形，且具有明顯的軸突，是目前國(guó)際上研究神經(jīng)細(xì)胞功能較好的-種細(xì) 胞。紫菜多糖對(duì)SY5Y細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用，表明紫菜多糖可以用于神經(jīng) 系統(tǒng)疾病如帕金森病和老年性癡呆的治療。實(shí)施例7:紫菜多糖的抗老年癡呆作用本發(fā)明以行為學(xué)和腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶為指標(biāo)，對(duì)紫 菜多糖的抗老年癡呆活性進(jìn)行了深入研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠。在試驗(yàn)前，使平均體重約為26g的雄性KM小鼠自山 獲取飼料和水一周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。材料紫菜多糖經(jīng)抗壞血酸和過(guò)氧化氫降解，制得分子量為35000Da的 Pl樣品。AP卜4。購(gòu)自Sigma公司，將其溶于無(wú)菌生理鹽水，配成lmg/ml濃度，密 封后置于37 °C培養(yǎng)箱中7天使之凝聚。試驗(yàn)方法小鼠適應(yīng)一周后，將其稱重并隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模 型組、紫菜多糖低、中、高(75、 150、 300 mg/kg)三個(gè)劑量組，陽(yáng)性對(duì) 照藥鹽酸多納哌齊(2. 5 mg/kg)組。除對(duì)照組外，向小鼠單側(cè)腦室內(nèi)注射A {3 , —,。。參照Maurice方法，以水合氯醛麻醉后，右側(cè)腦室定位(A: —2mm; L: 2匪；H: —4鵬)，垂直顱骨進(jìn)針3腿，緩慢注射3"1/只的APh。，對(duì)照組為 等量的滅菌生理鹽水。動(dòng)物于術(shù)后第二天開始給予相應(yīng)藥物，給藥量0.5 ml/20 g，對(duì)照組、 模型組灌服等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。(1) 小鼠避暗試驗(yàn)自A3卜4(1造模后第9天進(jìn)行避暗試驗(yàn)。該避暗裝置分為明(25X25X 16cm)暗(24X20X 15cm)兩個(gè)隔室，之間由一個(gè)拱門(8.9X11.4cm)相 聯(lián)，門可以由試驗(yàn)者根據(jù)需要關(guān)上或打開。隔室地板為不銹鋼柵欄(3.175im)。暗室一側(cè)的柵欄地板與刺激器相聯(lián)，并可給予電擊，明室一 側(cè)則不與刺激器相聯(lián)，故沒(méi)有電流通過(guò)。將小鼠放入明室，10s后將明暗室 之間的門打開。待小鼠(四肢)完全進(jìn)入暗室后，立即將中門關(guān)上，并給 予一次電擊(電流為0.6mA)。讓小鼠在暗室內(nèi)停留10s，將小鼠放回籠內(nèi)。 電刺激訓(xùn)練24小時(shí)后，將小鼠放回明室，中門打開，記錄5min內(nèi)小鼠進(jìn)入 暗室的次數(shù)和潛伏期。(2) 小鼠迷宮實(shí)驗(yàn)自AP卜4。造模后第12天進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，為期五天。該迷宮共有5個(gè)fif 端，試驗(yàn)第一天用一塊黑色塑料板將迷宮分成兩部分，使小鼠在只含有-個(gè)盲端的部分游泳；試驗(yàn)第二天，重新設(shè)置塑料板的位置，使小鼠在含有 三個(gè)盲端的部分游泳；試驗(yàn)第三天至第五天除掉塑料板，使小鼠游完全程。 分別記錄其找到平臺(tái)的潛伏期和到達(dá)盲端的錯(cuò)誤次數(shù)。(3) 皮層乙酰膽堿酯酶(AChE)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束之后，小鼠斷頭取腦，于冰浴中迅速剝離海馬組織，以預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿。按照試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定該組 織的乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性。 結(jié)果小鼠避暗試驗(yàn)1) 由圖2可以看出，AP模型組與對(duì)照組和紫菜多糖的三個(gè)劑量組相比 小鼠潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(p〈0.05)。2) 小鼠迷宮試驗(yàn)由圖3可以看出，模型組和對(duì)照組相比，小鼠找到平臺(tái)的潛伏期及經(jīng)過(guò) 盲端的錯(cuò)誤次數(shù)明顯延長(zhǎng)(p<0. 05) A3卜")單側(cè)腦室注射致小鼠癡呆模型建 立成功。隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)逐漸縮短。從第三 天開始，AP h。單側(cè)腦室注射模型組與對(duì)照組和紫菜多糖的三個(gè)劑量組相比，小鼠錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，其中紫菜多糖高濃度組小鼠潛伏期與模型組 相比顯著縮短。訓(xùn)練第四天，對(duì)照組和紫菜多糖的中、高劑量組與模型組 相比潛伏期顯著縮短，而陽(yáng)性對(duì)照藥鹽酸多納哌齊未顯效，表明紫菜多糖 顯效快。訓(xùn)練第五天，紫菜多糖的三個(gè)劑量組和鹽酸多納哌齊組同模型組相比，小鼠的潛伏期明顯縮短和錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少。 3)海馬乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶分別是乙酰膽堿的分解酶和合成酶， 兩者共同調(diào)節(jié)腦內(nèi)乙酰膽堿的含量。如圖4所示，在海馬組織中，鹽酸多納 哌齊組和紫菜多糖的三個(gè)劑量組與A e卜4。單側(cè)腦室注射模型組相比乙酰膽 堿轉(zhuǎn)移酶活性升高，但沒(méi)有顯著性。如圖5所示對(duì)照組、鹽酸多納哌齊組和 紫菜多糖三個(gè)劑量組與模型組相比，乙酰膽堿酯酶活性顯著降低，而且位 得說(shuō)明的是前兩組乙酰膽堿酯酶活性比對(duì)照組低約50%，說(shuō)明中劑量的紫 菜多糖和鹽酸多納哌齊都能夠顯著抑制海馬內(nèi)乙酰膽堿的分解，從而提高 海馬內(nèi)乙酰膽堿的含量。這可能是紫菜多糖改善A 0卜,。單側(cè)腦室注射造成AD 癥狀的途徑之一。結(jié)論紫菜多糖能夠A^—4。損傷的小鼠的行為學(xué)指標(biāo)，改善小鼠的記 憶力，降低錯(cuò)誤次數(shù)。提高乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性，降低乙酰膽堿酯酶活性。 具有顯著的抗老年性癡呆作用。以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施例，然并非用以限定本發(fā)明，本領(lǐng)域技 術(shù)人員對(duì)在此公開的實(shí)施方案可進(jìn)行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進(jìn)和 變化。
權(quán)利要求
1.紫菜多糖在制備預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包 括帕金森病或老年性癡呆。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的紫菜多糖 是從紅藻門紅毛菜目紅毛菜科紫菜屬的海洋藻類中提取的硫酸多糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫菜多糖是指含有D—半乳糖和L一半乳糖一6—硫酸基，或者同時(shí)還含有3， 6—內(nèi)醚一L —半乳糖的多糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫菜屬藻類包括條斑紫菜、甘紫菜、圓紫菜、皺紫菜、長(zhǎng)紫菜、壇紫菜、邊紫菜等中的 種或幾種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為含有紫菜 多糖和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的劑型為注 射劑、口服制劑或局部給藥制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供紫菜多糖在預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的用途，其安全性高，可長(zhǎng)期限服用。
文檔編號(hào)A61K31/737GK101152207SQ20061004790
公開日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日
發(fā)明者虹 張, 張全斌, 徐祖洪, 李智恩, 牛錫珍, 綦慧敏, 趙婷婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所