專利名稱:一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)放大方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)放大方法,尤其涉及培養(yǎng)基的組分。
背景技術(shù):
大腸桿菌(Escherichia coli)作為外源蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)已用于多種蛋白的生產(chǎn),如干擾素、集落刺激因子、生長(zhǎng)因子、人血清白蛋白以及尿激酶、鏈激酶等各種蛋白(酶),它是直接表達(dá)人源蛋白極為有效的微生物之一。
用大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)的主要目的,是經(jīng)濟(jì)地獲取較高的細(xì)胞密度和高水平表達(dá)的重組蛋白,高密度發(fā)酵是進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)的重要手段之一。應(yīng)用高密度發(fā)酵不但要獲得較高的生物量,還必須要顯著提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平(重組蛋白的質(zhì)量(mg)與菌體總蛋白質(zhì)量(mg)比,以百分比例計(jì))。影響高密度發(fā)酵的因素非常多,如細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過程中生長(zhǎng)抑制物的積累、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液的pH值、補(bǔ)料方式等。高密度發(fā)酵要獲得高生物量和高水平表達(dá)產(chǎn)物,需投入幾倍于生物量的基質(zhì),以滿足細(xì)菌迅速生長(zhǎng)繁殖及大量表達(dá)基因產(chǎn)物的需要。高密度發(fā)酵對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類和含量也比一般發(fā)酵方法的要求高。但培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度過高,超過一定的限度可使生長(zhǎng)抑制物質(zhì)大量積累,使大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖和目的基因表達(dá)受到抑制,從而使生產(chǎn)效率下降。常規(guī)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物的比例對(duì)高密度發(fā)酵條件下大腸桿菌的生長(zhǎng)是不適宜的。為了獲得高密度發(fā)酵的理想結(jié)果,需要對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的配比進(jìn)行優(yōu)化,以滿足細(xì)胞旺盛的新陳代謝對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量需要。
人們對(duì)影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素的作了大量的工作,見李民,陳常慶的綜述(李民,陳常慶。重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展。生物工程進(jìn)展,2000,20(2)26-31)。作者就高密度發(fā)酵中影響重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)率的幾個(gè)因素,包括宿主菌、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、補(bǔ)料方法以及高密度發(fā)酵過程中存在的問題和對(duì)策加以討論,著重探討了高密度下大腸桿菌產(chǎn)生的有害代副產(chǎn)物--乙酸的產(chǎn)生機(jī)制、抑制作用機(jī)理,以及控制乙酸積累的技術(shù)方法。
大腸桿菌在較低的菌體密度時(shí)其重組蛋白會(huì)有較高的表達(dá),陸海等(陸海,曾慶銀等。大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白的研究。北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,23(6)1-4)研究了在大腸桿菌BL21(DE3)中重組蛋白的表達(dá)特點(diǎn),從表達(dá)載體中表達(dá)了植物ACC合成酶,經(jīng)SDS-PAGE電泳與雙波長(zhǎng)掃描分析,菌液密度OD600為0.6,IPTG的最佳濃度為0.6mmol/L,此時(shí)目的蛋白含量占全菌蛋白含量之比最高。而很低的菌體密度下,考慮到生產(chǎn)成本的劇增,其發(fā)酵工藝在工業(yè)化方面將變得沒有意義。在大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)實(shí)踐中,人們往往會(huì)花費(fèi)大量的時(shí)間、物力和財(cái)力來進(jìn)行發(fā)酵過程中的控制營(yíng)養(yǎng)要素的配比、采用不同的分批補(bǔ)料方式、不同階段采用不同的C/N比、控制乙酸生成、控制溶氧濃度和pH值、溫度等,方法繁瑣,但效果不佳。往往會(huì)發(fā)生以下的事實(shí)即在實(shí)驗(yàn)室中許多大腸桿菌重組菌株在搖瓶中其目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平尚可,但在發(fā)酵罐上的表達(dá)水平就下降了;在工業(yè)生產(chǎn)中菌體在低密度時(shí)的表達(dá)水平尚可,但在較高密度時(shí)的表達(dá)水平就下降了。
為了避免和減少以上方法的缺陷,研究開發(fā)一種新的具有廣泛通用性的大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)放大方法,將具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)放大方法,以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷,滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將固體培養(yǎng)基上的重組大腸桿菌以1-10個(gè)菌落,優(yōu)選1~3個(gè)菌落,接入體積為5~500mL,優(yōu)選10~200mL的種子培養(yǎng)基中,在溫度20~45℃,優(yōu)選30~42℃、搖床轉(zhuǎn)速50~500rpm,優(yōu)選180~250rpm條件下,搖床培養(yǎng)2~24h,優(yōu)選6~16h;所說的種子培養(yǎng)基為水溶液,可采用常規(guī)的LB培養(yǎng)基或TH培養(yǎng)基等,優(yōu)選的組分和濃度包括甘油或葡萄糖1~50g/L,酵母浸出粉(yeast extract)1~50g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)1~50g/L,氯化鈉1~20g/L,優(yōu)選4~10g/L,抗性篩選劑0.01~1g/L,優(yōu)選0.05~0.2g/L,和使溶液的pH為6.5~7.5的堿性物質(zhì)或酸性物質(zhì);堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水中的一種或幾種,酸性物質(zhì)選自鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或幾種。
所說的重組大腸桿菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、C600、DH5α、HB101、JM109、G1724,均為商業(yè)化的產(chǎn)品。
所說的酵母浸出粉、蛋白胨、酪蛋白胨、氯化鈉、抗性篩選劑可采用市售產(chǎn)品。
所說的固體培養(yǎng)基為常規(guī)的培養(yǎng)基,優(yōu)選的組分和濃度包括甘油或葡萄糖1~50g/L,進(jìn)口或國產(chǎn)的酵母浸出粉(yeast extract)1~50g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)1~50g/L,氯化鈉1~20g/L,優(yōu)選4~10g/L,抗性篩選劑0.01~1g/L,優(yōu)選0.05~0.2g/L,瓊脂1~2g/L,和使溶液的pH為6.5~7.5的堿性物質(zhì)或酸性物質(zhì);堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水中的一種或幾種,酸性物質(zhì)選自鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或幾種。
所說的抗性篩選劑為氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平中的一種或幾種的混合物。
(2)將步驟(1)的所獲得的培養(yǎng)液再次接入與步驟(1)相同的種子培養(yǎng)基中,按每100mL種子培養(yǎng)基接種量為0.5~10mL,優(yōu)選1~5mL,培養(yǎng)溫度20~45℃,優(yōu)選30~42℃,搖床轉(zhuǎn)速50~500rpm,優(yōu)選180~250rpm條件下,搖床培養(yǎng)2~24h,優(yōu)選4~10h;(3)將步驟(2)的培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,按每100mL種子培養(yǎng)基接種量為0.5~10mL,優(yōu)選1~5mL,培養(yǎng)溫度20~45℃,優(yōu)選30~42℃,通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘0.1~10L空氣,優(yōu)選1~2L,攪拌轉(zhuǎn)速50~2000rpm,優(yōu)選500~1000rpm培養(yǎng)2~72h,優(yōu)選8~48h,然后加入誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)3~72h,優(yōu)選3~48h,至發(fā)酵結(jié)束,獲得目標(biāo)蛋白;所說的發(fā)酵培養(yǎng)基可采用常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)基,如LB培養(yǎng)基或TH培養(yǎng)基,其中,游離氨離子的濃度為120~1000mmol/L,抗性篩選劑0.01~1g/L,優(yōu)選0.05~0.2g/L;所說的氨離子來源于氨水、氯化銨、硫酸銨、硫酸氫銨、磷酸銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、乙酸銨、草酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、檸檬酸氫二銨、檸檬酸銨等無機(jī)銨鹽和有機(jī)銨鹽中的一種或其混合物,或由氨水和相應(yīng)鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、草酸、碳酸、檸檬酸相互中和形成的銨鹽。
所說的抗性篩選劑為氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平中的一種或幾種的混合物。
所說的誘導(dǎo)劑選自異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、乳糖、色氨酸中的一種或幾種,其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0~50g/L,或40~43℃溫度誘導(dǎo);優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和濃度包括甘油或葡萄糖1~50g/L,進(jìn)口或國產(chǎn)的酵母浸出粉(yeast extract)1~50g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)1~50g/L,MgSO4·7H2O 0.1~1g/L,和使溶液的pH為6.5~7.5的堿性物質(zhì)或酸性物質(zhì);堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水中的一種或幾種,酸性物質(zhì)選自鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或幾種。
所說的重組蛋白藥物包括重組人組織型纖溶酶原激活劑(reteplase,rPA)、干擾素α-2b(INFα-2b)、抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性單鏈抗體(anti-human ovariancarcinoma anti-human CD3 bispecific single-chain antibody)、尿激酶原(proUK)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-11,rhIL-2)、重組人甲狀旁腺激素衍生物(PTH)、重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白(TRAIL)、重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rh-NGF)、重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF165)、重組人淋巴毒素α缺失體(rhLT-αΔN27)、重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhsBLyS)、青霉素G酰化酶。
本發(fā)明采用重組大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株,所用原料均為市售品。本發(fā)明所述的在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白藥物的過程中利用高濃度氨鹽脅迫發(fā)酵的工藝,可以成功地實(shí)現(xiàn)從搖瓶培養(yǎng)到發(fā)酵罐的順利放大,在較高的大腸桿菌密度時(shí)使重組蛋白能夠高水平表達(dá),其表達(dá)水平(重組蛋白的質(zhì)量(mg)與菌體總蛋白質(zhì)量(mg)比,以百分比例計(jì))、重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)量(每升發(fā)酵液菌體所產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)質(zhì)量,以mg為單位計(jì))為單純使用酵母浸出粉和/或酪蛋白胨為氮源發(fā)酵時(shí)相應(yīng)的表達(dá)水平、重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)量的2-10倍。具有高效價(jià)廉、適用蛋白質(zhì)產(chǎn)品多、操作簡(jiǎn)單、推廣性強(qiáng)的特點(diǎn),特別適用于生物工程制藥的過程的中試放大和規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明專利解決的問題是建立了一種適用蛋白質(zhì)藥物多、操作簡(jiǎn)單、推廣性強(qiáng)的大腸桿菌高效表達(dá)目的蛋白的發(fā)酵工藝,對(duì)于生物工程制藥的過程的中試放大和規(guī)模生產(chǎn)的順利進(jìn)行具有重要的實(shí)用意義。同已經(jīng)公開的重組蛋白生產(chǎn)工藝相比,本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于首次在重組大腸桿菌的培養(yǎng)和外源基因誘導(dǎo)表達(dá)的完整階段,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加超出菌體利用能力范圍的高濃度的氨鹽,從而可實(shí)現(xiàn)從搖瓶培養(yǎng)到發(fā)酵罐的順利放大,在較高的大腸桿菌密度時(shí)使重組蛋白能夠高水平表達(dá)。
圖1為實(shí)施例1的電泳圖。
圖2為實(shí)施例2的電泳圖。
圖3為實(shí)施例3的電泳圖。
在各個(gè)附圖中,0泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記,97.4kd,66.2kd,43.0kd,31.0kd,20.1kd,14.4kd為不同的蛋白分子量,kd為分子量單位千道爾頓;各圖中的1泳道為誘導(dǎo)前各個(gè)實(shí)施實(shí)例中相應(yīng)的大腸桿菌全菌體蛋白質(zhì)電泳圖;各圖中的2泳道為未采用本發(fā)明專利所述工藝發(fā)酵結(jié)束時(shí)的大腸桿菌全菌體蛋白質(zhì)電泳圖;各圖中的3泳道為采用本發(fā)明專利所述工藝發(fā)酵結(jié)束時(shí)的大腸桿菌全菌體蛋白質(zhì)電泳圖。箭頭所指的蛋白質(zhì)條帶為各個(gè)實(shí)施實(shí)例所述的相應(yīng)的重組蛋白質(zhì)藥物。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述,其目的是更好理解本發(fā)明內(nèi)容。因此,所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外,在所列實(shí)施例中如無特別說明勻采用如下材料1)菌種在各個(gè)實(shí)施實(shí)例中說明。
2)培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基甘油或葡萄糖5g/L,進(jìn)口或國產(chǎn)的酵母浸出粉(yeast extract)5g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)10g/L,氯化鈉10g/L,瓊脂1.5g/L,和使溶液的pH為7.0的氫氧化鈉。
種子培養(yǎng)基甘油或葡萄糖5g/L,進(jìn)口或國產(chǎn)的酵母浸出粉(yeast extract)10g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)10g/L,和使溶液的pH為7.0的氫氧化鈉。
發(fā)酵培養(yǎng)基甘油或葡萄糖20g/L,進(jìn)口或國產(chǎn)的酵母浸出粉(yeast extract)26g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)26g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,和使溶液的pH為7.0的氫氧化鈉。
以上所述培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》910頁(J.薩姆布魯克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著,金動(dòng)雁,黎孟楓等譯,科學(xué)出版社,北京,2002年2月)所述的液體和固體培養(yǎng)基的配制程序進(jìn)行配制和滅菌操作。
所用試劑均為市售品。
實(shí)施例1本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人組織型纖溶酶原激活劑(rPA,reteplase)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21(DE3),質(zhì)粒為pET29a,基因片斷為(K2tPA),將其轉(zhuǎn)入pET29a,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a/K2tPA,工程菌為Escherichia coli BL21(DE3)[pET29a/K2tPA],其構(gòu)建過程可參考陳于紅等的工作(陳于紅,朱鎮(zhèn)華,劉蓓鈁,張菁,傅一工,王石泉,張巍,楊慶,劉建寧。重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因的克隆及工程菌的構(gòu)建與鑒定。南京大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,2004,40(1)1-6)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取一個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h;將此培養(yǎng)液5mL再次接入100mL的種子培養(yǎng)基中,同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)5h;將此將活化的種子液以400mL接種量加入到20L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(35g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在530mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到120mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘2L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.9,培養(yǎng)12h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到0.5mM,誘導(dǎo)36h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白15μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做濃度為12%的SDS-PAGE電泳,電泳圖見圖1。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的18%。
而以不加入硫酸銨,其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的1.5%。具體數(shù)據(jù)如表1所示表1 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人組織型纖溶酶原激活劑的結(jié)果 實(shí)施例2本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于干擾素α-2b(INFα-2b)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌DH5α,質(zhì)粒為pBV200。其構(gòu)建過程可參考曾慶,金冬雁的工作(曾慶,金冬雁。人α2b型干擾素基因的修飾合成及其在大腸桿菌中的表達(dá)。病毒學(xué)報(bào),1992,8(3)205-209)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取1個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有50mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,30℃,200rpm搖床培養(yǎng)8h,將此培養(yǎng)液4mL再次接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到120mg/L,30℃,200rpm搖床培養(yǎng)4h,將此活化的種子液按100mL接種量加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入氯化銨使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在900mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到120mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)24h。升高培養(yǎng)基溫度到42℃,誘導(dǎo)3h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟1)所得菌體蛋白15μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳,其結(jié)果見圖2。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的28%。而以不加入氯化銨,其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的10±2%。具體數(shù)據(jù)如表2所示表2 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于干擾素α-2b(INFα-2b)的結(jié)果 實(shí)施例3本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性單鏈抗體(anti-human ovarian carcinoma anti-human CD3bispecific single-chain antibody)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌G1724,構(gòu)建的重組大腸桿菌為G1724[pABM],具體工作可參見方敏、趙瑞等的工作(方敏,趙瑞??谷寺殉舶量谷薈D3雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及復(fù)性研究。高技術(shù)通訊,2002,12(11)47-50)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有30mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液2mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)5h,再將此活化的種子液500mL加入到30L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入磷酸氫二銨(20g/L)和磷酸二氫銨(23g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在500mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到120mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)12h。加入誘導(dǎo)劑色氨酸使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,誘導(dǎo)4h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳,見圖3。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的18%。
而以不加入磷酸氫二銨(20g/L)和磷酸二氫銨(23g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的5±2%。具體數(shù)據(jù)如表3所示表3 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性單鏈抗體的結(jié)果 實(shí)施例4本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于尿激酶原(proUK)的步驟如下1)菌種
宿主為大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒為pET29a,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET29a/proUK,具體工作可參見等的工作(陳于紅、傅一工。重組人尿激酶原基因的克隆及工程菌的構(gòu)建與鑒定。南京大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,2001,37(4)401-406)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取3個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有50mL的種子培養(yǎng)基中(250 mL的三角瓶),同時(shí)加入卡那霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到50mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)8h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入卡那霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到50mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)5h,再將此活化的種子液500mL加入到20L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(13.2g/L)磷酸氫二銨(10g/L)和磷酸二氫銨(11.5g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在500mmol/L,同時(shí)加入卡那霉素使得濃度達(dá)到50mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)15h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到0.5mM,誘導(dǎo)5h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的20%。
而以不加入硫酸銨(13.2g/L)磷酸氫二銨(10g/L)和磷酸二氫銨(11.5g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的6%。具體數(shù)據(jù)如表4所示表4 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于尿激酶原的結(jié)果 實(shí)施例5本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于白細(xì)胞介素-2(interleukin,rhIL-2)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌HB101,表達(dá)質(zhì)粒為pPLcMu-HiL201,具體工作可參見Devos Rene等的工作(Devos Rene,Plaetinck Geert,Cheroutre Hilde,Simons Guus,Degrave Wim,Tavernier Jan,Remaut Erik,F(xiàn)iers Walter.Molecular cloning of human interleukin 2 cDNAand its expression in E.coli..Nucleic Acids Res.,1983,11(13)4307-4323)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取3個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有50mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到120mg/L,28℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,28℃,200rpm搖床培養(yǎng)5h,再將此活化的種子液500mL加入到20L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(26.5g/L)、檸檬酸銨(4.8g/L)和磷酸二氫銨(11.5g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在550mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,28℃,400rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1.5L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)20h。升高培養(yǎng)基溫度到42℃,誘導(dǎo)4h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的31%。
而以不加入硫酸銨(26.5g/L)、檸檬酸銨(4.8g/L)和磷酸二氫銨(11.5g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的14%。具體數(shù)據(jù)如表5所示表5 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于白細(xì)胞介素-2的結(jié)果 實(shí)施例6
本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人甲狀旁腺激素衍生物(PTH)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒為pET11c,具體可參見李光富,唐家琪等的工作(李光富,唐家琪,于明明,張林元,張克勤。人甲狀旁腺素的基因表達(dá)及活性的初步研究。南京師范大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,1999,177-79)2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取3個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有50mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到120mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)8h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)5h,再將此活化的種子液500mL加入到20L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(2.65g/L)和磷酸二氫銨(11.5g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在140mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1.5L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)10h。加入誘導(dǎo)劑乳糖使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到5g/L,誘導(dǎo)8h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的35%。
而以不加入加入硫酸銨(2.65g/L)和磷酸二氫銨(11.5g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的14%。具體數(shù)據(jù)如表6所示表6 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人甲狀旁腺激素衍生物(PTH)的結(jié)果
實(shí)施例7本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白(TRAIL)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌DH5α,表達(dá)質(zhì)粒為pBV220,具體可參見侯登勇,張英起等的工作(侯登勇,張英起,韓葦,趙寧,顏真。TRAIL與導(dǎo)向肽融合基因的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。中國生物制品學(xué)雜志,2005,18(4)277-280)2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取1個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有100mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到120mg/L,30℃,200rpm搖床培養(yǎng)8h,取此培養(yǎng)液2mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,30℃,200rpm搖床培養(yǎng)6h,再將此活化的種子液100mL加入到3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(2.65g/L)、磷酸氫二銨(13.2g/L)、磷酸二氫銨(11.5g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在340mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,30℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)15h。升高培養(yǎng)基溫度到42℃,誘導(dǎo)4h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的25%。
而以不加入硫酸銨(2.65g/L)、磷酸氫二銨(13.2g/L)、磷酸二氫銨(11.5g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的12%。具體數(shù)據(jù)如表7所示表7 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白(TRAIL)的結(jié)果
實(shí)施例8本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rh-NGF)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌JM 109,表達(dá)質(zhì)粒為pUC 118,具體可參見尹元琴,馬萍等的工作(尹元琴,馬萍,隋承光,任常山。原核細(xì)胞中人神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的克隆。中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,32(2)97-99)2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取1個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有25mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)8h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)6h,再將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(26.5g/L)、碳酸銨(9.6g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在600mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)12h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到1mM,誘導(dǎo)5h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的25%。
而以不加入硫酸銨(2.65g/L)、磷酸氫二銨(13.2g/L)、磷酸二氫銨(11.5g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的12%。具體數(shù)據(jù)如表8所示表8 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rh-NGF)的結(jié)果
實(shí)施例9本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌DH5α,表達(dá)質(zhì)粒為pBV220,具體可參見吳松泉,劉麗等的工作(吳松泉,劉麗。重組人腫瘤壞死因子突變體的構(gòu)建和表達(dá)。溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1996,26(3)131-134)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有25mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,28℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,28℃,200rpm搖床培養(yǎng)6h,再將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(26.5g/L)、檸檬酸三銨(9.7g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在520mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,30℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)18h。升高培養(yǎng)基溫度到42℃,誘導(dǎo)3h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的20%。
而以不加入硫酸銨(26.5g/L)、檸檬酸三銨(9.7g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的7%。具體數(shù)據(jù)如表9所示表9 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)的結(jié)果 實(shí)施例10
本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF165)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒為pET-28a,具體可參見單志新,余細(xì)勇等的工作(單志新,余細(xì)勇,林秋雄,劉嬡,楊敏,符永恒,譚虹虹,林曙光。人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF165)在大腸桿菌中的表達(dá)及鑒定。中山大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2004,25(B06)23-25)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有25mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,28℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,30℃,200rpm搖床培養(yǎng)6h,再將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(13.2g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在200mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,30℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)8h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到0.5mM,誘導(dǎo)8h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的20%。
而以不加入硫酸銨(13.2g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的7%。具體數(shù)據(jù)如表10所示表10 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF165)的結(jié)果
實(shí)施例11本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人淋巴毒素α缺失體(rhLT-αΔN27)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒為pET-23b,具體可參見劉永全,李道鋒等的工作(劉永全 李道鋒 牛曉霞 劉金毅。重組人淋巴毒素α缺失體的表達(dá)、純化及鑒定。細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,004年20卷1期2004,20(1)109-112)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有100mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,28℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入氯化銨(35g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在650mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)12h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到1mM,誘導(dǎo)8h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白10μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的35%。
而以不加入氯化銨(35g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的18%。具體數(shù)據(jù)如表11所示表11實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人淋巴毒素α缺失體(rhLT-αΔN27)的結(jié)果 實(shí)施例12
本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhsBLyS)的步驟如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21,表達(dá)質(zhì)粒為pEGX-4T-1,具體可參見張志方,張春艷等的工作(張志方,張春艷。人BLyS基因克隆,表達(dá)和抗人BLyS單克隆抗體的制備。中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(3)176-179)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有50mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,37℃,200rpm搖床培養(yǎng)4h,再將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入化學(xué)純25%氨水(20mL/L)、乙酸銨(3.8g/L)、檸檬酸氫二銨(10g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在370mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,37℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)12h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到0.5mM,誘導(dǎo)5h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的35%。
而以不加入化學(xué)純25%氨水(20mL/L)、乙酸銨(3.8g/L)、檸檬酸氫二銨(10g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的20%。具體數(shù)據(jù)如表10所示表10 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhsBLyS)的結(jié)果
實(shí)施例13本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于青霉素G?;傅牟襟E如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒為pET24a,具體可參見周政,張愛暉等的工作(周政,張愛暉。雷氏普羅威登斯菌青霉素G酰化酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)。工業(yè)微生物,2002,32(3)1-5)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有100mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,25℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,25℃,200rpm搖床培養(yǎng)4h,再將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(25g/L)、草酸銨(2.8g/L)、碳酸氫銨(4g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在490mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,25℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)15h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到1mM,誘導(dǎo)5h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的25%。
而以不加入硫酸銨(25g/L)、草酸銨(2.8g/L)、碳酸氫銨(4g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的10%。具體數(shù)據(jù)如表10所示表10 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhsBLyS)的結(jié)果
實(shí)施例14本發(fā)明所說的一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于青霉素G?;傅牟襟E如下1)菌種宿主為大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒為pET24a,具體可參見周政,張愛暉等的工作(周政,張愛暉。雷氏普羅威登斯菌青霉素G酰化酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)。工業(yè)微生物,2002,32(3)1-5)。
2)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取2個(gè)重組大腸桿菌單菌落接入到裝有100mL的種子培養(yǎng)基中(250mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,25℃,200rpm搖床培養(yǎng)10h,取此培養(yǎng)液5mL接入100mL的種子培養(yǎng)基中(500mL的三角瓶),同時(shí)加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到100mg/L,25℃,200rpm搖床培養(yǎng)4h,再將此活化的種子液100mL加入到4L發(fā)酵培養(yǎng)基中,加入硫酸銨(25g/L)、草酸銨(2.8g/L)、碳酸氫銨(4g/L)使發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨離子的濃度始終維持在490mmol/L,同時(shí)加入氨芐青霉素使得濃度達(dá)到100mg/L,25℃,600rpm,發(fā)酵罐通氣量設(shè)為每升發(fā)酵液每分鐘1L空氣,調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,培養(yǎng)15h。加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到1mM,誘導(dǎo)5h。
3)電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平將由步驟2)所得菌體蛋白20μg按照文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》77頁-100頁(汪家政,范明主編。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè),科學(xué)出版社,北京,2004年1月)做12%濃度的SDS-PAGE電泳。
檢測(cè)目的條帶占全菌體蛋白的25%。而以不加入硫酸銨(25g/L)、草酸銨(2.8g/L)、碳酸氫銨(4g/L),其他成分均相同作為對(duì)照的同樣操作所得到的目的條帶只占全菌體蛋白的10%。具體數(shù)據(jù)如表10所示表10 實(shí)施實(shí)例應(yīng)用于重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhsBLyS)的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)放大方法,包括對(duì)重組大腸桿菌的種子培養(yǎng)和將培養(yǎng)后的菌種的發(fā)酵培養(yǎng),其特征在于,在發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中,含有高濃度的氨離子,其濃度為120~1000mmol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所說的重組大腸桿菌為大腸桿菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、C600、DH5α、HB101、JM109、G1724。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所說的種子培養(yǎng)基為水溶液,組分和濃度包括甘油或葡萄糖1~50g/L,酵母浸出粉(yeast extract)1~50g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)1~50g/L,抗性篩選劑0.01~1g/L,溶液的pH調(diào)為6.5~7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所說的發(fā)酵培養(yǎng)基為水溶液,組分和濃度包括甘油或葡萄糖1~50g/L,酵母浸出粉(yeast extract)1~50g/L,蛋白胨(peptone)或酪蛋白胨(tryptone)1~50g/L,抗性篩選劑0.01~1g/L,MgSO4·7H2O 0.1~1g/L,其溶液的pH調(diào)為6.5~7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所說的氨離子來源于氨水、氯化銨、硫酸銨、硫酸氫銨、磷酸銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、乙酸銨、草酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、檸檬酸氫二銨、檸檬酸銨等無機(jī)銨鹽和有機(jī)銨鹽中的一種或其混合物,或由氨水和相應(yīng)鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、草酸、碳酸、檸檬酸相互中和形成的銨鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4所述的方法,其特征在于,所說的抗性篩選劑為氨芐青霉素、卡那霉素、羧芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平中的一種或幾種的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所說的重組蛋白藥物包括重組人組織型纖溶酶原激活劑(reteplase,rPA)、干擾素α-2b(INFα-2b)、抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性單鏈抗體(anti-human ovarian carcinoma_anti-human CD3bispecific single-chain antibody)、尿激酶原(proUK)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,rhIL-2)、重組人甲狀旁腺激素衍生物(PTH)、重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白(TRAIL)、重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rh-NGF)、重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF165)、重組人淋巴毒素α缺失體(rhLT-αΔN27)、重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhsBLyS)或青霉素G?;?。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氨鹽脅迫發(fā)酵應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)放大方法。在生產(chǎn)中結(jié)合本發(fā)明所述的發(fā)酵工藝,可以成功地實(shí)現(xiàn)從搖瓶培養(yǎng)到發(fā)酵罐的順利放大,使重組蛋白在高密度培養(yǎng)時(shí)能夠高水平表達(dá),其表達(dá)水平(重組蛋白的質(zhì)量(mg)與菌體總蛋白質(zhì)量(mg)比,以百分比例計(jì))、重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)量(每升發(fā)酵液菌體所生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)質(zhì)量,以mg為單位計(jì))為單純使用酵母浸出粉和/或酪蛋白胨為氮源時(shí)相應(yīng)的表達(dá)水平、重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)量的2-10倍。具有高效價(jià)廉、適用蛋白質(zhì)產(chǎn)品多、操作簡(jiǎn)單、推廣性強(qiáng)的特點(diǎn),特別適用于生物工程制藥的過程的中試放大和規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1876826SQ200610026020
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者魏東芝, 童望宇, 王恒偉, 沈亞領(lǐng) 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)