專利名稱：一種纖維熔結(jié)法制備軟骨組織工程支架材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種軟骨組織工程支架材料的制備方法，特別是涉及一種采用纖維熔結(jié)的方法來(lái)制備軟骨組織工程支架材料的方法。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)(Tissue Engineering)在生物工程中是一個(gè)比較新的領(lǐng)域，得到了科學(xué)界和大眾的廣泛關(guān)注。廣義的組織工程概念是由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)于1987年正式確立的，將組織工程概念定義為應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究和開(kāi)發(fā)、修復(fù)和改善損傷組織和功能的生物替代物的一門(mén)科學(xué)。這一學(xué)科覆蓋了生物材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)工程以及移植技術(shù)的眾多學(xué)科(L.G.Cima，J.P.Vacanti，C.Vacanti，D.E.Ingber，D.Mooneyand R.Langer.Tissue engineering by cell transplantation usingdegradable polymer substrates[J].Journal of Biomechanical Engineering，1999，143-151)。
軟骨是組織工程中第一種獲得成功培養(yǎng)的組織，它給未來(lái)的組織和器官的移植帶來(lái)了無(wú)限的發(fā)展前景。
Eric和Kyriacos在其關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨再生的生物機(jī)械性能方面的探討中形象地描述了軟骨組織工程的基本路線(Eric M.Darling，Kyriacos A.Athanasiou.Biomechanical Strategies for Articular Cartilage Regeneration[J].Annals of Biomedical Engineering，2003，311114-1124)。其中，組織工程支架材料是最核心也是最基礎(chǔ)的部分之一。其必須具備良好的生物降解性，在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中，支架材料可以在類似體內(nèi)或體內(nèi)的生理環(huán)境下，材料分子鏈可以自動(dòng)斷裂，并形成小分子逐漸被機(jī)體代謝或吸收。由此種子細(xì)胞通過(guò)在支架材料上的依附生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增、再植入體內(nèi)的病損位置，成為具有母體組織或器官形狀及特性的新的組織或器官，最終達(dá)到修復(fù)重建組織或器官、恢復(fù)其功能的目的。
另外，支架材料必須具備較高的孔隙率和合適孔徑大小。這主要取決于支架材料的制備方法，目前組織工程支架材料的制備方法主要有溶劑澆鑄-粒子溶出、纖維粘接法、熱誘導(dǎo)相分離(冷凍凍干)、超臨界流體和乳液凍干等方法。但都各有優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)于支架材料的制備方法一直是研究的熱點(diǎn)之一。
有關(guān)于組織工程支架材料的制備工藝以及相關(guān)應(yīng)用多有專利報(bào)道。僅美國(guó)專利就有近400個(gè)；國(guó)內(nèi)有近40個(gè)。但是以PHBV為材料，通過(guò)纖維熔結(jié)的方法來(lái)制備組織工程支架材料的專利還未見(jiàn)有報(bào)道。在美國(guó)，公開(kāi)號(hào)為US 6,656,496的發(fā)明專利“Porous tissue scaffolding materials and uses thereof”，利用加入體積百分?jǐn)?shù)為10％到50％的10到500微米的聚合物粒子制孔，并添加了蛋白質(zhì)，交聯(lián)劑和改性劑。公開(kāi)號(hào)為US 6,337,198的發(fā)明專利“Porous polymerscaffolds for tissue engineering”，利用在聚合物溶液中加入50-500微米的水溶性顆粒，通過(guò)冷凍干燥，粒子溶出，制得了擁有內(nèi)部相連的開(kāi)放式孔的雙峰式分布聚合物連續(xù)相，包括50-500微米的大孔和在大孔間呈直線排列的小孔。以上兩種方法都是基于制備多孔支架材料最常用的方法——粒子溶出法。雖然都有了一定的改進(jìn)，但還是存在孔分布不均勻或孔隙率較低的不足。在國(guó)內(nèi)，公開(kāi)號(hào)為CN1260363A的發(fā)明專利“一種多孔絲素膜及其制備方法”中，公開(kāi)了一種用冷凍干燥法制備多孔絲素膜的方法，此法制得的都為膜狀，僅可用作創(chuàng)面覆蓋及人工皮膚，難以構(gòu)成組織工程用三維多孔支架；公開(kāi)號(hào)為CN1596995的發(fā)明專利“骨組織工程支架材料及其制備方法”，公開(kāi)了一種以磷酸二氫鍶和磷酸二氫鈣為材料，利用致孔劑經(jīng)高溫?zé)Y(jié)制得骨組織工程支架材料。加入致孔劑、發(fā)泡劑等是制備多孔材料的常用方法，但這種方法存在孔與孔的貫通性不好的弊端。
聚(3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯)共聚物PHBV，是天然高分子聚酯聚羥基脂肪酸酯PHA的一類。其分子結(jié)構(gòu)式為 PHBV是完全生物相容和無(wú)細(xì)胞毒性的材料。Tatiana Volova等研究了PHBV纖維作為醫(yī)用縫合線在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用性能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PHBV纖維在生理學(xué)、生物化學(xué)上對(duì)被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都沒(méi)有任何不良影響(Tatiana Volova，Ekaterina Shishatskaya，Viktor Sevastianov，Sergei Efremov，OlgaMogilnaya.Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHVfibers[J].Biochemical Engineering Journal，2003，16125-133)。這一點(diǎn)與其它可降解材料相比有著顯著的優(yōu)勢(shì)。
目前，支架材料的制備工藝研究非常多，但方法都各有利弊。例如溶劑澆鑄-粒子溶出法雖然可以對(duì)孔徑進(jìn)行有效的控制，但是孔的分布不均勻，貫通性也不夠理想，比較適合薄膜的研究。
利用纖維熔結(jié)的方法，是利用聚合物具有熔程以及在熔程中所表現(xiàn)的一系列特性，這樣在一定的溫度范圍內(nèi)，填充在模具中的纖維不會(huì)由于降低界面能量而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)的塌陷，而是在交叉點(diǎn)處纖維變得像“焊接”(熔化)起來(lái)一樣，從而形成了多孔的泡孔材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種纖維熔結(jié)法制備軟骨組織工程支架材料的方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足或缺陷，滿足生產(chǎn)和生活的需要。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種纖維熔結(jié)法制備軟骨組織工程支架材料的方法，包括如下步驟(1)熔點(diǎn)為130～180℃的聚(3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯)共聚物(PHBV)在130～180℃下進(jìn)行熔融紡絲；(2)將步驟(1)所得纖維干燥剪碎后，填充在陰陽(yáng)模模具中，在130～180℃的溫度下加熱熔結(jié)，冷卻成型，得到所需形狀的組織工程支架。作為優(yōu)選的技術(shù)方案所述的聚(3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯)共聚物(PHBV)中的聚羥基戊酸酯(PHV)的含量為3％-30％，熔點(diǎn)為130～180℃。
紡絲在微型雙螺桿共混儀中進(jìn)行，溫度為130～180℃，熔融時(shí)間為5～15min。
步驟(2)中，纖維的纖度為1～30dtex，剪碎長(zhǎng)度為0.1cm～1cm，加熱方式采用油浴加熱，熔結(jié)溫度為130～180℃，時(shí)間5～20min，自然冷卻12h。
油浴采用甘油和鄰苯二甲酸二丁酯的混合液，甘油分子式為C8H5(OH)8，鄰苯二甲酸二丁酯分子式為C6H4(COOC4H9)2。
本發(fā)明是一種通過(guò)纖維熔結(jié)的方法來(lái)制備組織工程支架材料的技術(shù)，涉及一種新型的具有良好生物相容性和降解性的生物材料——PHBV基材。以生物可降解材料——PHBV(聚羥基丁酸酯和聚羥基戊酸酯的共聚物)為基材，可通過(guò)調(diào)節(jié)PHV的含量來(lái)改變PHBV的物理化學(xué)性能以及生物降解速率。對(duì)基材進(jìn)行熔融紡絲，利用陰陽(yáng)模模具，將一定質(zhì)量、一定長(zhǎng)度基材纖維填充在模具中，在一定溫度下進(jìn)行加熱使纖維熔結(jié)，冷卻成型，從而得到一定形狀的組織工程支架材料。該支架材料適用于組織或器官的細(xì)胞培養(yǎng)與生長(zhǎng)所用載體。
本發(fā)明的有益效果是在制備過(guò)程中未使用任何有機(jī)溶劑，排除了常規(guī)方法如粒子溶出法，冷凍干燥法等所導(dǎo)致的殘留有機(jī)化學(xué)物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的不利影響。制備的支架結(jié)構(gòu)真正實(shí)現(xiàn)了三維立體結(jié)構(gòu)，成孔達(dá)到100％的貫通性，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
實(shí)施例1紡絲前將PHBV(3％PHV)粉末在干燥器中干燥24h。在微型雙螺桿共混儀中進(jìn)行紡絲前，稱取5.0gPHBV粉末待用；預(yù)熱儀器，溫度升至溫度為160℃，將PHBV粉末從加料口小心加入；熔融時(shí)間為5min，出料，并將其卷繞至卷繞機(jī)上，得到的纖維在室溫下，干燥器中干燥24h；用普通醫(yī)用剪刀將纖維剪碎至長(zhǎng)度為0.1～0.5cm。稱取4.5g剪碎后的纖維，將其填充在制備好模具中，在甘油和鄰苯二甲酸二丁酯的混合液油浴中加熱熔結(jié)，緩慢加熱至155℃，恒溫10min，取出后自然冷卻12h，小心脫模。
采用液體替代法來(lái)測(cè)材料孔隙率。將重量為4.5g的支架材料置于體積為(V1)的酒精溶液(50％)中，循環(huán)抽真空至無(wú)氣泡逸出，材料和溶液的總體積記為V2，視(V2-V1)為支架固體的體積。將含溶液的支架材料移出后，記所剩溶液體積為V3，以材料中所含溶液的體積(V1-V3)為材料孔隙所占的體積，則材料的總體積為V＝(V2-V1)+(V1-V3)＝V2-V3。由此可將支架的密度表示為d＝W/(V2-V3)?？紫堵士杀硎緸镻＝(V1-V3)/(V2-V3)。
表1PHBV(HV3％)纖維長(zhǎng)度為0.1～0.5cm的孔隙率測(cè)定

用上述纖維熔結(jié)法制得的細(xì)胞支架，經(jīng)紫外殺毒后，放入細(xì)胞培養(yǎng)液中，植入細(xì)胞即可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例2紡絲前將PHBV(30％HV)粉末在干燥器中干燥24h。在微型雙螺桿共混儀中進(jìn)行紡絲前，稱取5.0gPHBV粉末待用；預(yù)熱儀器，溫度升至溫度為160℃，將PHBV粉末從加料口小心加入；熔融時(shí)間為15min，出料，并將其卷繞至卷繞機(jī)上，得到的纖維在室溫下，干燥器中干燥24h；用普通醫(yī)用剪刀將纖維剪碎至長(zhǎng)度為0.5～1.0cm。稱取4.5g剪碎后的纖維，將其填充在制備好模具中，在甘油和鄰苯二甲酸二丁酯的混合液油浴中加熱熔結(jié)，緩慢加熱至155℃，恒溫10min，取出后自然冷卻12h，小心脫模。
采用液體替代法來(lái)測(cè)材料孔隙率。將重量為4.5g的支架材料置于體積為(V1)的酒精溶液(50％)中，循環(huán)抽真空至無(wú)氣泡逸出，材料和溶液的總體積記為V2，視(V2-V1)為支架固體的體積。將含溶液的支架材料移出后，記所剩溶液體積為V3，以材料中所含溶液的體積(V1-V3)為材料孔隙所占的體積，則材料的總體積為V＝(V2-V1)+(V1-V3)＝V2-V3。由此可將支架的密度表示為d＝W/(V2-V3)?？紫堵士杀硎緸镻＝(V1-V3)/(V2-V3)。
表2PHBV(HV3％)纖維長(zhǎng)度為0.5～1.0cm的孔隙率測(cè)定

用上述纖維熔結(jié)法制得的細(xì)胞支架，經(jīng)紫外殺毒后，放入細(xì)胞培養(yǎng)液中，植入細(xì)胞即可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例3紡絲前將PHBV(28％HV)粉末在干燥器中干燥24h。在微型雙螺桿共混儀中進(jìn)行紡絲前，稱取5.0gPHBV粉末待用；預(yù)熱儀器，溫度升至溫度為130℃，將PHBV粉末從加料口小心加入；熔融時(shí)間為10min，出料，并將其卷繞至卷繞機(jī)上，得到的纖維在室溫下，干燥器中干燥24h；用普通醫(yī)用剪刀將纖維剪碎至長(zhǎng)度為0.5～1.0cm。稱取4.5g剪碎后的纖維，將其填充在制備好模具中，在油浴中加熱熔結(jié)，油的種類采用甘油和鄰苯二甲酸二丁酯的混合液，緩慢加熱至155℃，恒溫10min，取出后自然冷卻12h，小心脫模。
采用液體替代法來(lái)測(cè)材料孔隙率。將重量為4.5g的支架材料置于體積為(V1)的酒精溶液(50％)中，循環(huán)抽真空至無(wú)氣泡逸出，材料和溶液的總體積記為V2，視(V2-V1)為支架固體的體積。將含溶液的支架材料移出后，記所剩溶液體積為V3，以材料中所含溶液的體積(V1-V3)為材料孔隙所占的體積，則材料的總體積為V＝(V2-V1)+(V1-V3)＝V2-V3。由此可將支架的密度表示為d＝W/(V2-V3)。孔隙率可表示為P＝(V1-V3)/(V2-V3)。
表3PHBV(HV28％)纖維長(zhǎng)度為0.5～1.0cm的孔隙率測(cè)定

用上述纖維熔結(jié)法制得的細(xì)胞支架，經(jīng)紫外殺毒后，放入細(xì)胞培養(yǎng)液中，植入細(xì)胞即可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例4紡絲前將PHBV(28％HV)粉末在干燥器中干燥24h。在微型雙螺桿共混儀中進(jìn)行紡絲前，稱取5.0gPHBV粉末待用；預(yù)熱儀器，溫度升至溫度為180℃，將PHBV粉末從加料口小心加入；熔融時(shí)間為5min，出料，并將其卷繞至卷繞機(jī)上，得到的纖維在室溫下，干燥器中干燥24h；用普通醫(yī)用剪刀將纖維剪碎至長(zhǎng)度為0.1～0.5cm。稱取4.5g剪碎后的纖維，將其填充在制備好模具中，在油浴中加熱熔結(jié)，油的種類采用甘油和鄰苯二甲酸二丁酯的混合液，緩慢加熱至155℃，恒溫10min，取出后自然冷卻12h，小心脫模。
采用液體替代法來(lái)測(cè)材料孔隙率。將重量為4.5g的支架材料置于體積為(V1)的酒精溶液(50％)中，循環(huán)抽真空至無(wú)氣泡逸出，材料和溶液的總體積記為V2，視(V2-V1)為支架固體的體積。將含溶液的支架材料移出后，記所剩溶液體積為V3，以材料中所含溶液的體積(V1-V3)為材料孔隙所占的體積，則材料的總體積為V＝(V2-V1)+(V1-V3)＝V2-V3。由此可將支架的密度表示為d＝W/(V2-V3)。孔隙率可表示為P＝(V1-V3)/(V2-V3)。
表4PHBV(HV28％)纖維長(zhǎng)度為0.1～0.5cm的孔隙率測(cè)定

用上述纖維熔結(jié)法制得的細(xì)胞支架，經(jīng)紫外殺毒后，放入細(xì)胞培養(yǎng)液中，植入細(xì)胞即可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
權(quán)利要求
1.一種纖維熔結(jié)法制備軟骨組織工程支架材料的方法，其特征在于包括如下步驟(1)熔點(diǎn)為130～180℃的聚(3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯)共聚物在130～180℃下進(jìn)行熔融紡絲；(2)將步驟(1)所得纖維干燥剪碎后，填充在陰陽(yáng)模模具中，在130～180℃的溫度下加熱熔結(jié)，冷卻成型，得到所需形狀的組織工程支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚(3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯)共聚物中的聚羥基戊酸酯的含量為3％～30％，熔點(diǎn)為130～180℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于紡絲在微型雙螺桿共混儀中進(jìn)行，溫度為130～180℃，熔融時(shí)間為5～15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，纖維的纖度為1～30dtex，剪碎長(zhǎng)度為0.1cm～1cm，采用油浴加熱，熔結(jié)溫度為130～180℃，時(shí)間5～20min，自然冷卻12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于油浴采用甘油和鄰苯二甲酸二丁酯的混合液，甘油分子式為C8H5(OH)8，鄰苯二甲酸二丁酯分子式為C6H4(COOC4H9)2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種纖維熔結(jié)法制備軟骨組織工程支架材料的方法，包括如下步驟熔點(diǎn)為130～180℃的聚(3－羥基丁酸酯－3－羥基戊酸酯)共聚物在130～180℃下進(jìn)行熔融紡絲；將所得纖維干燥剪碎后，填充在陰陽(yáng)模模具中，在130～180℃的溫度下加熱熔結(jié)，冷卻成型，得到所需形狀的組織工程支架。本發(fā)明的有益效果是在制備過(guò)程中未使用任何有機(jī)溶劑，排除了常規(guī)方法如粒子溶出法，冷凍干燥法等所導(dǎo)致的殘留有機(jī)化學(xué)物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的不利影響。制備的支架結(jié)構(gòu)真正實(shí)現(xiàn)了三維立體結(jié)構(gòu)，成孔達(dá)到100％的貫通性，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。
文檔編號(hào)A61L27/56GK1836742SQ20061002600
公開(kāi)日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者楊慶, 劉婷, 沈新元, 郯志清, 陳琳, 章悅庭 申請(qǐng)人:東華大學(xué)