專利名稱：：替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物及其差向異構(gòu)體的制作方法替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物及其差向異構(gòu)體本發(fā)明涉及替加環(huán)素(tigecycHne)的葡糖苷酸、更具體是葡糖苷酸衍生物、制備它們的方法以及含有它們的藥物組合物。替加環(huán)素(GAR-936)是甘氨酰環(huán)素類抗生素，并且是半合成四環(huán)素一一米諾環(huán)素一一的類似物。它隨著出現(xiàn)對(duì)抗生素的耐藥性的全球性威脅而被開發(fā)出。替加環(huán)素在體外和體內(nèi)均具有廣鐠抗菌活性。與四環(huán)素類抗生素類似，甘氨酰環(huán)素類抗生素通過(guò)抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)翻譯而起作用。包M加環(huán)素在內(nèi)的甘氨酰環(huán)素對(duì)多種耐抗生素的革蘭氏陽(yáng)性病原菌如耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌(Sto/^j^a^ow耐青霉素肺炎鏈球菌(ift考,ococc"s/meum卵/ae)和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(e"teiwocd)具有活性(Weiss等人，1995;Fraise等人1995)。替加環(huán)素對(duì)抗帶有兩種主要形式的四環(huán)素耐藥性一一外流和核糖體保護(hù)一一的菌抹的活性具有重要意義(Schnappinger和HHlen，1995)。四環(huán)素類抗生素很少或不經(jīng)過(guò)代謝。已有報(bào)道米諾環(huán)素在人體內(nèi)進(jìn)行9-幾基化和N-脫甲基，但是程度有限(Ndis和DeLeenheer，1982)。還有報(bào)道大部分四環(huán)素類抗生素在C4位置進(jìn)行差向異構(gòu)化，差向異構(gòu)化通常:ML認(rèn)為是降解而非代謝途徑(Remmers等人，1963)。將"C替加環(huán)素靜脈內(nèi)施用于健康男性志愿者后分析了藥物的代謝處置，并且還將^研究的結(jié)果與大鼠和狗的臨床前代謝研究所獲得的結(jié)果進(jìn)行了比較。將"C1替加環(huán)素靜脈內(nèi)施用于健康男性志愿者后，對(duì)血清、尿液和糞便中基于放射性標(biāo)記的替加環(huán)素的組分進(jìn)行了分析。將非放射性替加環(huán)素靜脈內(nèi)施用于男性志愿者后分析了人血清和尿液，報(bào)道了類似的結(jié)果，其中報(bào)道了最少的代謝。非標(biāo)記性研究與使用大鼠和狗的代謝研究的結(jié)果一致，在后者中替加環(huán)素是靜脈內(nèi)施用后血漿和尿液中主要的與化合物有關(guān)的組分。在本文中，在^^基質(zhì)中還觀察到了替加環(huán)素的差向異構(gòu)體和M3a(叔丁基氨基乙酸)。已經(jīng)表明替加環(huán)素的差向異構(gòu)體是降解物而非代謝物，并且向異構(gòu)體。血清和糞便樣品中替加環(huán)素差向異構(gòu)體的量可能被高估了，因?yàn)樵谟糜谶@些基質(zhì)的提取操作過(guò)程中大量替加環(huán)素被轉(zhuǎn)化為了差向異構(gòu)體。在大鼠和狗的血漿和尿液中還觀察到了推測(cè)是M3a的早期洗脫色鐠峰。來(lái)自本研究的在血清、尿液和糞便中檢測(cè)出的與替加環(huán)素有關(guān)的化合物顯示在流程圖l中。流程圖l.在Ajk清、尿液和糞便中檢測(cè)出的與"C1替加環(huán)素有關(guān)的化合物5OHOO替加環(huán)素Y入叔丁基氨基乙酸(M3a)S、U和F中的代謝物o69-氨基米諾環(huán)素(M3)S和U中的代謝物0OHOo替加環(huán)素差向異構(gòu)體S、U和F中的降解物,葡糖醛酸替加環(huán)素葡糖苷酸(M7)和替加環(huán)素葡糖苷酸的差向異構(gòu)體(M6)S、U和F中的代謝物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>N-乙耽基9-氨基米諾環(huán)素(M9)和N-乙跣基9-氣基米諾環(huán)素的差向異構(gòu)體(M8)羥基替加環(huán)素(Ml、M2、M4)U中的痕量代謝物S和U中的代謝物S:血清；U:尿液；F:糞便；,表示放射性標(biāo)記的位點(diǎn)在血清和糞便樣品的放射色鐠圖中既觀察到了M6(替加環(huán)素葡糖苷酸的差向異構(gòu)體)，又觀察到了M7(替加環(huán)素葡糖苷酸)。葡糖苷酸化的位置尚未知曉。代謝物及其差向異構(gòu)體的可能結(jié)構(gòu)顯示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>差向異構(gòu)體在尿液樣品的放射色鐠圖中觀察到了M7，但沒(méi)有觀察到M6。以前沒(méi)有在體外釆用AJf^^體或AJf細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中或者在體內(nèi)在大鼠、狗或人中報(bào)道替加環(huán)素的葡糖苷酸化。以前采用未標(biāo)記的替加環(huán)素并采用用于初步評(píng)價(jià)替加環(huán)素代謝的LC/MS樣品分析，對(duì)AjfcL清和尿液進(jìn)行分析。在該研究過(guò)程中，沒(méi)有特別地研究葡糖苷酸代謝物，使用["C1替加環(huán)素進(jìn)行了體內(nèi)大鼠和狗樣品的分析，沒(méi)有觀察到葡糖苷酸化。在科學(xué)文獻(xiàn)中沒(méi)有將葡糖苷酸化確定為四環(huán)素類抗生素的代謝途徑的已知報(bào)道。代謝物M6和M7可以用作替加環(huán)素的前藥。一旦施用，/S-葡糖醛酸糖苷酶可以切割M6和M7而釋放替加環(huán)素。作為M6和M7施用而非直接施用替加環(huán)素可以改變藥物的吸收、分布、代謝、排泄和/或副作用特性.此夕卜，這些化合物還可以直接用作抗微生物劑，附圖簡(jiǎn)述圖l是人單次靜脈內(nèi)施用50mg劑量"C替加環(huán)素后尿液和糞便中放射性消除的均值(ISD);圖2是隨時(shí)間推移血清中替加環(huán)素和放射性濃度的均值(ISD);圖3A顯示了在"C1替加環(huán)素給藥后1小時(shí)從受試者1提取的人血清的HPLC放射色^普?qǐng)D；圖3B顯示了在「CI替加環(huán)素給藥后8小時(shí)從受試者l提取的人血清的HPLC放射色鐠圖；圖4是在"CI替加環(huán)素給藥后8小時(shí)從受試者1提取的人血清的聯(lián)合LC/SRM色鐠圖；圖5A是在"C替加環(huán)素給藥后0-4小時(shí)從受試者4收集的人尿液的HPLC放射色i脊圖；圖5B是在["Cl替加環(huán)素給藥后24-48小時(shí)從受試者4收集的人尿液的HPLC放射色鐠圖；圖5C是在"Cl替加環(huán)素給藥后24-48小時(shí)從受試者4收集的人糞便的HPLC放射色^普?qǐng)D；圖6是于37t;在人尿液中孵育的["C]替加環(huán)素的穩(wěn)定性；圖7是在"Cl替加環(huán)素給藥后0-4小時(shí)從受試者8收集的人尿液的聯(lián)合質(zhì)謙圖；圖8是在14<:1替加環(huán)素給藥后34.2小時(shí)從受試者8收集的所提取的人糞便的HPLC放射色謙圖；圖9是替加環(huán)素的m/z586質(zhì)譜的子離子(production);圖IO是替加環(huán)素差向異構(gòu)體的m/z586質(zhì)譜的子離子；圖11是M2的m/z602質(zhì)鐠的子離子；圖12A是vMwA尿液中分離的M3a的放射色鐠圖；圖12B是^v尿液中分離的M3a的質(zhì)鐠圖；圖13是M3a的LC/MS質(zhì)i普；圖M是人血清中M3(^氨基米諾環(huán)素)的m/z4"+456SRM躍遷的LC/SRM色鐠圖；圖15是M6的M/Z762質(zhì)i普的子離子；圖16是M7的M/Z762質(zhì)^瞽的子離子；圖17是M9的M/Z515質(zhì)鐠的子離子；圖18是對(duì)替加環(huán)素葡糖苷酸所提出的結(jié)構(gòu)和質(zhì)鐠碎裂流程圖；圖19A是人尿液LC/MS分析的UV色鐠圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)；圖19B是人尿液LC/MS分析的選擇質(zhì)鐠圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)；圖19C是人尿液LC/MS分析的選擇質(zhì)譜圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)；圖20A是替加環(huán)素葡糖普酸的m/z762質(zhì)謙的子離子的滿刻度圖，(B)是M大以顯示較低強(qiáng)度的子離子的圖；圖20B是替加環(huán)素葡糖苷酸的m/z762質(zhì)語(yǔ)的子離子圖，被放大以顯示較低強(qiáng)度的子離子；圖21A是人尿液m/z762分析的子離子的LC/MS/MS色鐠圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)，該圖顯示了低強(qiáng)度的子離子；圖21B是人尿液m/z762分析的子離子的LC/MS/MS色譜圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)，該圖顯示了低強(qiáng)度的子離子；圖21C是人尿液m/z762分析的子離子的LC/MS/MS色譜圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)，該圖顯示了低強(qiáng)度的子離子；圖21D是人尿液m/z762分析的子離子的LC/MS/MS色譜圖(其中人尿液來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者)，該圖顯示了總離子色諳圖；圖22是于37X:在人血清中孵育的["C1替加環(huán)素的穩(wěn)定性；圖23A顯示了來(lái)自直接輸注從人尿液收集的HPLC級(jí)分的替加環(huán)素葡糖苷酸的子離子；圖23B是替加環(huán)素葡糖苷酸的質(zhì)譜，該圖顯示了來(lái)自直接輸注從人尿液收集的HPLC級(jí)分的m/z762質(zhì)諳的子離子；圖24A是來(lái)自>^^>^尿液中分離的替加環(huán)素葡糖苷^LC/MS分析的替加環(huán)素葡糖苷酸的LC/MS譜；圖24B是來(lái)自^A尿液中分離的替加環(huán)素葡糖苷酸LC/MS分析的替加環(huán)素葡糖苷酸m/z762質(zhì)鐠的MS2;圖24C是來(lái)自^MvA尿液中分離的替加環(huán)素葡糖苷虹C/MS分析的替加環(huán)素葡糖苷酸m/z762M86a質(zhì)鐠的MS3;圖24D顯示了來(lái)自v^wA^泉液中分離的替加環(huán)素葡糖苷酸丄C/MS分析的替加環(huán)素葡糖苷酸的子離子；圖25是來(lái)自合成的N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)的HPLC分析的UV色鐠圖；圖26A是由替加環(huán)素的m/z586的碰撞活化解離得到的MS/MS鐠所提出的碎裂流程圖；圖26B是由替加環(huán)素的m/z586的碰撞活化解離得到的MS/MSi瞽；圖27A顯示了替加環(huán)素差向異構(gòu)體的m/z586質(zhì)鐠的子離子；圖27B是替加環(huán)素差向異構(gòu)體的m/z586質(zhì)鐠；圖28A顯示了M3的m/z473質(zhì)i脊的子離子；圖28B;UVI3的m/z473質(zhì)i瞽；圖29A顯示了M7的m/z762質(zhì)鐠的子離子；圖29B是M7的m/z762質(zhì)錯(cuò)；且圖30顯示了兔血清中替加環(huán)素及其代謝物的LC/SRM色譜圖，在m/z515+498跡線中顯示了M9;圖31是兔血清的聯(lián)合LC/SRM色譜圖；且圖32是顯示了所提出的替加環(huán)素在小鼠、大鼠、兔、狗和人中的代謝途徑的流程圖?？梢源_定，用替加環(huán)素治療人可產(chǎn)生替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物及其差向異構(gòu)體。在人血清、尿液和糞便中發(fā)現(xiàn)了該代謝物及其差向異構(gòu)體，隨后對(duì)它們進(jìn)行了提取和分析。本發(fā)明的詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方面在對(duì)照實(shí)施例l-3和實(shí)施例1-10中給出，其描述了替加環(huán)素給予6名健康男性志愿者后的質(zhì)量平衡和代謝物特征。對(duì)照實(shí)施例l-3討論了在血清、尿液和糞便中的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，這些對(duì)照實(shí)驗(yàn)用于幫助確定替加環(huán)素在這些培養(yǎng)基中的相對(duì)穩(wěn)定性。另一方面，實(shí)施例1-10涉及對(duì)上述6名志愿者進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，參照流程圖l，通過(guò)血清和尿液的LC/MS分析還檢測(cè)出了代謝物M3(9-氨基米諾環(huán)素)、M8(N-乙^-9-^JjJt諾環(huán)素的差向異構(gòu)體)和M9(N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素)。因?yàn)檫@些代謝物在叔丁基氨基乙酰氨基側(cè)鏈的酰胺水解后形成，所以它們不帶有放射性標(biāo)記。因此，這些代謝物在血清和尿液中的濃度只能由LC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行估計(jì)。才艮據(jù)這些數(shù)據(jù)，M3和M8顯示出是血清和尿液中的次要代謝物，而M9顯示出是血清中的次要代謝物但是以與M7相當(dāng)?shù)臐舛却嬖谟谀蛞褐小Ｒ呀?jīng)報(bào)道了M3存在于大鼠、狗和人的尿液和血漿(對(duì)于人是血清)中，但是以前沒(méi)有報(bào)道N-乙?；x物(M8和M9)。因?yàn)榇x物M8和M9不帶有放射性標(biāo)記，所以它們可能已經(jīng)存在于來(lái)自以前的大鼠和狗代謝研究的樣品中，但是沒(méi)有被檢測(cè)出，因?yàn)樗鼈儧](méi)有特別通過(guò)LC/MS來(lái)研究。人排泄物中放射性的平均總回收率是91.8%(±5.6，n=3),其中33.2±1.9%在尿液中排泄，58.6±4.4%在糞便中排泄(圖1)。這些數(shù)據(jù)與來(lái)自大鼠和狗的數(shù)據(jù)一致，在大鼠和狗中，在各物種中單次靜脈內(nèi)"C1替加環(huán)素給藥后有約89%(包括沖洗籠子)的劑量被回收。在大鼠中，在尿液中回收34%,在糞便中回收53%，而在狗中，在尿液中回to60/。，在糞便中回收47%。血清中的放射性比血清中的替加環(huán)素濃度降低快得多(圖2)。該差異可能是由大量未標(biāo)記的替加環(huán)素在施用["C替加環(huán)素之前就已分布到組織中所引起的，這可能已經(jīng)限制了一些組織對(duì)fq替加環(huán)素的攝取。這種"后進(jìn)先出"現(xiàn)象最可能產(chǎn)生對(duì)總放射性而言比替加環(huán)素小得多的分布容積和高得多的清除率。在前48小時(shí)內(nèi)，約50。/。的"C替加環(huán)素劑量被回收(27。/。在尿液中，24%在糞便中)。在所分析的尿液樣品中，15%的劑量作為未變化的替加環(huán)素被排泄，2.0%作為替加環(huán)素的差向異構(gòu)體被排泄，4.1。/o作為M7被排泄，6.3。/。作為M3a被排泄。在糞便勻漿樣品中，9.9%的劑量作為未變化的替加環(huán)素被排泄，5.5%作為替加環(huán)素差向異構(gòu)體被排泄，5.4。/。作為葡糖苷酸(M6+M7)被排泄，1.5。/。作為M3a被排泄。作為M3a而被排泄的放射性被認(rèn)為與形成的M3、M8和M9的量(約8。/。的劑量)相當(dāng)。但是，因?yàn)榇x物M3、M8和M9不含放射性標(biāo)記，所以它們?cè)谘?、尿液和糞便中的濃度不能被準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。使用LC/MS在尿液中檢測(cè)出了痕量的羥基替加環(huán)素代謝物(M1、M2和M4)，但是通it^射色鐠法沒(méi)有檢測(cè)出它們。以前已經(jīng)報(bào)道了這些羥基替加環(huán)素代謝物作為痕量代謝物存在于大鼠和狗的血漿和尿液以U血清和尿液中。但是，以前報(bào)道的這些代謝物在人血清和尿液中的估計(jì)濃度低于M究中放射色譜法的檢測(cè)限。報(bào)道了替加環(huán)素的N-去甲基代謝物作為痕量代謝物存在于來(lái)自以前研究的大鼠血漿和尿液以及單獨(dú)的A^液樣品中。在;Mf究中，在任何所分析的樣品中均沒(méi)有檢測(cè)出該代謝物。4^9f究?jī)H評(píng)價(jià)了"C1標(biāo)記的替加環(huán)素劑量的處置，而沒(méi)有說(shuō)明在未標(biāo)記的劑量中剩余的任意與替加環(huán)素有關(guān)的產(chǎn)物。因此，本文報(bào)道的與替加環(huán)素有關(guān)的產(chǎn)物的估計(jì)濃度預(yù)計(jì)低估了這些組分在血清、尿液和糞便中的實(shí)際濃度。實(shí)際上，^研究中總替加環(huán)素(放射性標(biāo)記的和未標(biāo)記的)在血清和尿液樣品中的濃度始終高于(通常高10至300y。)使用["Cl替加環(huán)素劑量的放射性濃度和比活性對(duì)那些相同樣品所計(jì)算的濃度。根據(jù)本研究中所用的給藥方案(多次施用未標(biāo)記的劑量，然后單次施用"q標(biāo)記的劑量)和所報(bào)道的長(zhǎng)的替加環(huán)素半衰期，這并不是無(wú)法預(yù)料的。因此，對(duì)他泉男性志愿者多次靜脈內(nèi)施用替加環(huán)素、然后單次施用[14C標(biāo)記的替加環(huán)素后，在血清、尿液和糞便中主要的放射性標(biāo)記的組分是未變化的替加環(huán)素。替加環(huán)素的主要代謝途徑是葡糖苷酸化和酰胺水解、然后N-乙?；Ｔ诟鳂悠分羞€檢測(cè)出了降解產(chǎn)物替加環(huán)素的差向異構(gòu)體。根據(jù)別處報(bào)道的總放射性濃度計(jì)算了血清、尿液和糞便中與替加環(huán)素有關(guān)的組分的濃度。使用劑量的比活性(1.00jiiCi/mg)將這些濃度轉(zhuǎn)化為ng替加環(huán)素等同物。然后使用該值、根據(jù)放射色譜圖中的放射性分布估計(jì)了特定組分的濃度。這些濃度僅反映了["ci標(biāo)記的替加環(huán)素劑量的處置，而沒(méi)有說(shuō)明在未標(biāo)記的劑量中剩余的任意與替加環(huán)素有關(guān)的產(chǎn)物。來(lái)自受試者1的在給藥后1和8小時(shí)的血清提取物的代表性HPLC放射色鐠圖顯示在圖3A和3B中。對(duì)于不同受試者和不同時(shí)間點(diǎn)，血清提取物的代謝物概況是類似的。表l顯示了放射性在血清提取物中的相對(duì)分布和與"C1替加環(huán)素有關(guān)的各組分在血清中的估計(jì)濃度。表l.由靜脈內(nèi)單次施用50mg劑量"C標(biāo)記的替加環(huán)素的健康男性受試者所提取的血清樣品中放射性的相對(duì)分布和估計(jì)濃度時(shí)間(小時(shí))受試者M(jìn)3a相對(duì)分布(X)'和估計(jì)濃度(ng-替加環(huán)素等同物/mL)^M7您愁替加環(huán)素5.2(11)NDND25.5(54)66.3(140)10.9(16)ND1.1(1.6)29.3(42)55.7(80)6.8(9.0)NDND21.8(29)70.2(92)13.5(20)NDND27.7(40)54.2(79)10.1(17)NDND20.4(35)68.1(120)12.4(13)1.2(1.3)1.8(1.9)22.1(24)61.7(66)9.8±3.20.2±0.50.5±0.824.5±3.662.7±6.617,0(22)ND3.6(4.6)24.0(31)51.0(65)17.0(12)3.8(2.7)11.6(8.1)21.6(15)42.3(30)10.9(5.6)ND5.9(3.0)22.1(11)60.4(31)24.7(15)3.5(2.1)7.7(4.5)19.2(11)43.2(26)14.9(")2.8(2.0)6.9(4.9)24.7(18)47.5(34)15.9(11)7.7(5.3)18.3(13)11.4(7.9)45.2(31)16.7±4.53.0:t2.99.0±5.320.5±4.948.3±6.712.3(9,6)3.0(2.3)■14.1(11)21.7(17)45.5(36)23.9(11)6.5(2.9)12.4(5,6)18.3(8.2)37.5(17)16.7(5.3)ND5.4(1,7)21.0(6.7)57.0(18)27.5(8.8)2.6(1.0)13.0(4.2)15.9(5."41.0(13)12.7(4.2)ND3.4(1.1)22.2(7.3)59.1(20〉21,2(10)8.0(3.8)23.2(11)10.7(5."37.0(18)19.1土6,23.4±3,3".9±7.118.3±4.446.2±9.74568均值±SD4568均值±SD14568均值±SDa.相對(duì)分布通過(guò)來(lái)自一式兩份樣品的HPLC放射色譜圖中的峰面積積分來(lái)測(cè)定。b.在括號(hào)中，作為ng-替加環(huán)素等同物/mL的相對(duì)濃度通itir清放射性濃度(作為ng-替加環(huán)素等同物/mL)乘以來(lái)自HPLC放射色譜圖的分布百分比來(lái)估計(jì)。c.檢測(cè)P艮是lng等同物/mL。d.在血清提取物中觀察到的大部分替加環(huán)素差向異構(gòu)體可能是提取操作的結(jié)果。ND.表明未檢測(cè)出代謝物并被指定為O值.根據(jù)劑量溶液的比活性、別處報(bào)道的血清放射性濃度和放射性在各樣品中的相對(duì)分布估計(jì)了濃度。對(duì)于在所有時(shí)間點(diǎn)的所有受試者，替加環(huán)素是,皮檢測(cè)出的主要的與藥物有關(guān)的組分，在1小時(shí)其占63%的^1射性，在4和8小時(shí)分別降到了48和46%(表1)。替加環(huán)素的差向異構(gòu)體是存在的含量第二多的與藥物有關(guān)的組分，其為放射性的約20%。但是，血清提取物中的大部分替加環(huán)素差向異構(gòu)體可能在提取操作過(guò)程中就已經(jīng)形成了。對(duì)提取過(guò)程中形成的差向異構(gòu)體進(jìn)行校正后，血清樣品中差向異構(gòu)體的量降至5至8。/。，替加環(huán)素的量增加至59至80%。在l小時(shí)時(shí)替加環(huán)素葡糖苷酸(M7)占低于l。/。的放射性，但是在4和8小時(shí)分別增加至9至12%。在約一半所分析的血清樣品中檢測(cè)出了替加環(huán)素差向異構(gòu)體的葡糖苷酸(M6)，其占低于4%的放射性。在所有血清樣品中均檢測(cè)出了保留時(shí)間為4-7分鐘的早期洗脫色鐠峰(M3a，叔丁基氨基乙酸)，其占10至20%的放射性，圖4顯示了在血清中檢測(cè)出的與替加環(huán)素有關(guān)的化合物的聯(lián)合LC/SRM色譜圖(使用LC/MS/MS、以所選反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式收集)，所述與替加環(huán)素有關(guān)的化合物包括9-氨基米諾環(huán)素(M3)、N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素的差向異構(gòu)體(M8)和N-乙酖基-9-氨基米諾環(huán)素(M9)。因?yàn)槭宥』被阴(J^側(cè)鏈被切割，所以這些代謝物不帶有放射性標(biāo)記，并且它們不能使用放射性流檢測(cè)來(lái)定量，根據(jù)LC/MS分析，它們是血清中的次要代謝物。在"C替加環(huán)素給藥后48小時(shí)內(nèi)約27%的放射性劑量在尿液中排泄。來(lái)自受試者4的在給藥后0-4和24-48小時(shí)收集的尿液的代表性HPLC放射色鐠圖顯示在圖5A-5C中。在受試者之間和在不同時(shí)間點(diǎn)，尿液的代謝物概況是類似的。表2提供了放射性在尿液樣品中的相對(duì)分布和與"C1替加環(huán)素有關(guān)的各組分在尿液中的估計(jì)濃度。表2.由靜脈內(nèi)單次施用50mg劑量^C標(biāo)記的替加環(huán)素的健康男性受試者的尿液樣品中放射性的相對(duì)分布和估計(jì)濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>a.相對(duì)分布通過(guò)來(lái)自一式兩份樣品的HPLC放射色鐠圖中的峰面積積分來(lái)測(cè)定。b.在括號(hào)中，作為嗎-替加環(huán)素等同物/收集物的相對(duì)濃度通過(guò)總尿液放射性(作為嗎-替加環(huán)素等同物)乘以來(lái)自HPLC放射色語(yǔ)圖的分布百分比來(lái)估計(jì)。c.檢測(cè)限是卯ng等同物/mL.(1.對(duì)于受試者6，24-48小時(shí)的收集是部分收集.ND.表明未檢測(cè)出代謝物并指定為O值，根據(jù)劑量溶液的比活性、別處報(bào)道的尿液放射性濃度和放射性在各樣品中的相對(duì)分布估計(jì)了濃度。作為與["CI替加環(huán)素有關(guān)的各種組分而在尿液和糞4更中排泄的["C1替加環(huán)素劑量的百分?jǐn)?shù)顯示在43中。表3.作為與替加環(huán)素有關(guān)的組分而排泄的"C替加環(huán)素劑量的百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>a，對(duì)于24-48小時(shí)的尿液、總尿液、糞便樣品和總項(xiàng)目，n=5，因?yàn)閺?號(hào)受試者收集的尿液和糞便是不完全的。b.糞便勻漿提取物中觀察到的大部分替加環(huán)素差向異構(gòu)體可能是提取操作的結(jié)果ND.表明未檢測(cè)出代謝物，對(duì)于所有受試者，替加環(huán)素是在尿液中排泄的主要的與藥物有關(guān)的組分(表2),在前48小時(shí)內(nèi)約15%的劑量作為未變化的藥物在尿液中排泄(表3)。被確定為替加環(huán)素差向異構(gòu)體的尿液放射性的量從0-4小時(shí)收集物中的5%;^射性增加至24-48小時(shí)收集物中的11%。一些差向異構(gòu)體可能在膀胱中就已經(jīng)形成了，如穩(wěn)定性分析所表明的，該分析表明，當(dāng)于371C在尿液中孵育時(shí)，替加環(huán)素降解為差向異構(gòu)體(圖6)。在前48小時(shí)內(nèi)總共2%的放射性劑量作為替加環(huán)素的差向異構(gòu)體在尿液中排泄。代謝物M7僅是0-4小時(shí)收集物中的次要組分，但是其在4-8、8-24和24-48小時(shí)收集的樣品中占約20%的尿液放射性。M3a占15至37。/o的尿液放射性，并Jbf目對(duì)于替加環(huán)素而言其隨時(shí)間的推移而增加。在48小時(shí)內(nèi)在尿液中排泄的代謝物M3a和M7的量分別占放射性劑量的6和4%。圖7顯示了在尿液中檢測(cè)出的與替加環(huán)素有關(guān)的化合物的聯(lián)合質(zhì)鐠圖。放射性標(biāo)記的羥基替加環(huán)素代謝物(M1、M2和M4)以及M6被認(rèn)為是痕量尿液代謝物，它們?cè)谀蛞褐姓嫉陀?%的放射性。代謝物M3、M8和M9不帶有放射性標(biāo)記，因此僅能根據(jù)LC/MS分析來(lái)估計(jì)它們的相對(duì)量。根據(jù)LC/MS數(shù)據(jù)，M3和M8是次要代謝物，而M9以類似于M7的濃度存在。在放射性給藥后48小時(shí)內(nèi)，約24%的放射性在糞便中被回收。來(lái)自受試者8的給藥后約34小時(shí)內(nèi)收集的糞便提取物的代表性HPLC放射色謙圖顯示在圖8中。在受試者之間和對(duì)于收集的所有糞便樣品，糞便的代謝物概況是類似的。放射性在糞便提取物中的相對(duì)分布和與"C替加環(huán)素有關(guān)的各組分在糞便中的估計(jì)濃度顯示在^3中。靜脈內(nèi)單次施用50mg劑量"CI標(biāo)記的替加環(huán)素后從健康男性受試者提取的糞便勻漿物樣品中放射性的相對(duì)分布和估計(jì)濃度受試者l-6.741.8小時(shí)(0.56)受試者4-13.924.2小時(shí)(0.30)受試者5-7.525.2小時(shí)(0.81)受試者5-5.930.0小時(shí)(0.55)受試者7-4.232.0小時(shí)(0.20)受試者8-6.224.6小時(shí)(0.25)受試者8-4.129.8小時(shí)(0.49)受試者8-3.934.2小時(shí)(0.17)8.9(0.75)21.3(1.8)21.5(1.8)28.1(2.4)13.7(1.2)5.8(0.13)23.5(0.51)11.9(0.26)44,9(0.97)ND4.1(0.44)10.4(1.1)21.8(2.4)39.9(4.3)16.3(1.8)5.6(0.52)13.3(1.2)26.7(2.5)48.3(4.5)ND3.0(0.14)10.4(0.49)22.3(1.0)50.7(2.4)9.4(0.44)ND9.8(0.40)26.3(1.1)47.7(2.0)10.0(0.41)6.8(0.82)21.6(2.6)21.4(2.6)39.1(4.7)7.0(0.84)7.5(0.32)26.3(1.1)23.8(1.0)32.8(1.4)5.7(0.25)相對(duì)分布(y。)"和估計(jì)濃度(mg-替加環(huán)素等同物/收集物)b'eM3aM6M7f:^:d替加環(huán)素其它'和間？受收給，a.相對(duì)分布通過(guò)來(lái)自一式兩份樣品的HPLC放射色i普?qǐng)D中的峰面積積分來(lái)測(cè)定。b.在括號(hào)中，作為1^-替加環(huán)素等同物/收集物的相對(duì)濃度通過(guò)總糞便放射性(作為1^-替加環(huán)素等同物)乘以來(lái)自HPLC放射色諳圖的分布百分?jǐn)?shù)來(lái)估計(jì)。c.檢測(cè)限是0.15嗎等同物/g勻漿物.d.在糞便勻漿提取物中觀察到的大部分替加環(huán)素差向異構(gòu)體可能是提取操作的結(jié)果。e.其它色譜峰的保留時(shí)間為41至46分鐘。ND.表明未檢測(cè)出代謝物。從受試者6中沒(méi)有收到糞便樣品。根據(jù)劑量溶液的比活性、別處報(bào)道的糞侵放射性濃度和放射性在各樣品中的相對(duì)分布估計(jì)了濃度。對(duì)于所有糞便樣品，替加環(huán)素是主要的與藥物有關(guān)的組分，其占糞^^射性的28-51%(表3)。這與在48小時(shí)內(nèi)約10%的放射性劑量作為未變化的藥物在糞便中排泄(表2)是一致的。替加環(huán)素的差向異構(gòu)體是糞便提取物中主要的與藥物有關(guān)的組分，其占糞m射性的12-27%和放射性劑量的5.5%。對(duì)于血清，大量替加環(huán)素差向異構(gòu)體在提取操作過(guò)程中形成。對(duì)在提取操作過(guò)程中形成的差向異構(gòu)體進(jìn)行校正后，在所有樣品中差向異構(gòu)體的量均降至4氐于12V。，而替加環(huán)素的量增加至39至66%。代謝物M7占糞便中放射性的10-26。/。，而M6占至多90/。。在0-48小時(shí)的糞便樣品中葡糖苷酸代謝物占放射性劑量的約5.5%。M3a占糞便中放射性的4至14%,低于2V。的劑量作為M3a在糞便中排泄。在一些糞便樣品中觀察到了另外的峰，這些峰占糞^^射性的至多16%和占劑量的約2%。糞便樣品的LC/MS分析沒(méi)有檢測(cè)到任何另外的代謝物。表4給出了在血清、尿液和糞便中觀察到的與替加環(huán)素有關(guān)的化合物的匯總。表4.靜脈內(nèi)單次施用50mg劑量"CI標(biāo)記的替加環(huán)素后在人血清、尿液和糞便中觀察到的與替加環(huán)素有關(guān)的化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>人血清、尿液和糞便中被鑒定的替加環(huán)素代謝物的質(zhì)鐠數(shù)據(jù)在下文進(jìn)行討論。使用LC/MS分析對(duì)人血清、尿液和糞便以及大鼠和狗的血漿和尿液中的替加環(huán)素代謝物進(jìn)行了鑒定(表5)。這些代謝物的結(jié)構(gòu)顯示在流程圖1中?？梢灶A(yù)計(jì)，可使用標(biāo)準(zhǔn)色鐠技術(shù)來(lái)分離基本上純的M6或M7。例如，實(shí)施例7、8和9中所用的HPLC參數(shù)將預(yù)計(jì)提供基本上純的M6和M7的等分試樣。因此，另一方面，本發(fā)明提供了基本上純形式的如本文所述的替加環(huán)素代謝物，例如其純度^卯％，優(yōu)選^95%或更高的純度，例如98%。勤.在人、狗和/或大鼠中檢測(cè)出的替加環(huán)素及其代謝物的質(zhì)鐠數(shù)據(jù)匯總代謝物物種1MWM+H+的子離子M3a(叔丁基M乙酸)RD，H131132M6(替加環(huán)素葡糖苷酸的差向異構(gòu)體)H761762586,569，513,211，86M7(替加環(huán)素葡糖苷酸)H761762586，569，513，211，154，86M8(N-乙6SfeJ-9-^米諾環(huán)素的差向異構(gòu)體)H514515498，456,411,154M3(9-氨基米諾環(huán)素)R，D，H472473456M9(N-乙?；?9-IC^米諾環(huán)素)H514515498，456，411，154輕基替加環(huán)素RD，H601602585，529，472，211,154，86替加環(huán)素的差向異構(gòu)體RD，H585586569，513，456，411，211，154，86替加環(huán)素R，D，H585586569，513，482，456，411，211，154，861R=大鼠，D-狗，H-人在血清、尿液和糞便中觀察到了替加環(huán)素。研究了替加環(huán)素可靠標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)鐠特征以與代謝物進(jìn)行比較。在替加環(huán)素的LC/MS譜中，在m/z586處觀察到了質(zhì)子化的分子離子[M+H廣。由替加環(huán)素的m/z586的碰撞活化解離得到的MS/MS譜和所提出的碎裂流程圖顯示在圖9中。由m/z586失去NH3產(chǎn)生m/z569子離子。m/z513處的子離子代表從叔丁基氨基乙酰氨基(TBAAA)側(cè)鏈中失去叔丁基氨基。失去整個(gè)TBAAA側(cè)鏈和隨后失去4-二甲基氨基分別在m/z456和411處產(chǎn)生子離子。m/z211處的子離子來(lái)源于四環(huán)素環(huán)系的D環(huán)，如在碎裂圖中所表明的。m/z86離子代表叔丁基M亞甲基。在血清、尿液和糞便中觀察到了替加環(huán)素的差向異構(gòu)體。該產(chǎn)物在m/z586處產(chǎn)生M+H+。圖10中所示的m/z586質(zhì)鐠的子離子包括m/z569、513、456、411、211、154和86，對(duì)于替加環(huán)素它們也存在。根據(jù)其相對(duì)保留時(shí)間短于替加環(huán)素的相對(duì)保留時(shí)間而將其鑒定為差向異構(gòu)體。在尿液中觀察到了痕量的代謝物M1、M2和M4。這些代謝物在m/z602處產(chǎn)生[M+H廣。對(duì)M2所提出的碎裂流程圖和m/z602質(zhì)鐠的子離子顯示在圖11中。m/z529和472處的子離子分別比替加環(huán)素在m/z513和456處的相應(yīng)離子大16Da。il^明四環(huán)素環(huán)而不是叔丁基氛基乙酰^是代謝部位。在m/z211處子離子的存在(對(duì)于替加環(huán)素而言也觀察到其存在)消除了四環(huán)素的D環(huán)作為代謝部位。M1和M4與M2的質(zhì)謙數(shù)據(jù)類似，只是對(duì)于M1或M4沒(méi)有觀察到m/z211子離子。因此，Ml、M2和M4代謝物是四環(huán)素部分氧化的產(chǎn)物。在血清、尿液和糞便中觀察到了作為早期洗脫放射色語(yǔ)峰的代謝物M3a。從人尿液中分離該早期洗脫M3a峰，然后用正相HPLC進(jìn)行LC/MS分析，得到了顯示于圖12A和12B的放射色譜圖和質(zhì)譜圖。在m/zl32和173處分別觀察到了M3a的M+H+和MH+CH3CN廣，如圖13所示。it^明分子量為131。由于失去放射性標(biāo)記僅通過(guò)LC/MS在血清和尿液中觀察了痕量的代謝物M3。在m/z473處觀察到了代謝物M3的M+H廣。m/z473質(zhì)鐠的子離子包括失去NH3所產(chǎn)生的m/z456(數(shù)據(jù)未顯示)，它是與替加環(huán)素有關(guān)的化合物的特征。在血清樣品中，通過(guò)監(jiān)測(cè)m/z473^456SRM躍遷觀察到了該代謝物，如圖14所示。在狗代謝研究中，將M3鑒定為CL-318614(9-氨基米諾環(huán)素)。提出已經(jīng)通過(guò)TBAAA側(cè)鏈的酰胺7JC解產(chǎn)生了代謝物M3，而放射性標(biāo)記的叔丁基氨基乙酸(M3a)為副產(chǎn)物，在血清、尿液和糞便中觀察到了代謝物M6和M7。在m/z762處觀察到了M6和M7的[M+H廣，其比替加環(huán)素大176Da。M6和M7的質(zhì)鐠數(shù)據(jù)類似。m/z762處的質(zhì)子化的分子離子峰表明存在替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物或其相應(yīng)的差向異構(gòu)體。M6和M7的m/z762質(zhì)語(yǔ)的子離子分別顯示在圖15和16中。M6和M7在m/z586、569、513、211和86處以及對(duì)于M7在154處存在子離子。對(duì)于M6和M7，中性失去176Da產(chǎn)生m/z586，m/z586也是替加環(huán)素的[M+H+，表明是替加環(huán)素的葡糖普酸。對(duì)于替加環(huán)素，也觀察到了m/z569、513、456、211、154(對(duì)于M7觀察到了m/z154，但是對(duì)于M6沒(méi)有觀察到)和86處的子離子。根據(jù)M6比M7的HPLC保留時(shí)間早，提出代謝物M6;UVI7的差向異構(gòu)體。這與替加環(huán)素差向異構(gòu)體比替加環(huán)素的洗脫早是一致的。因此，提出M6和M7分別是替加環(huán)素差向異構(gòu)體和替加環(huán)素的葡糖苷酸。僅通過(guò)LC/MS在血清和尿液中觀察到了代謝物M8和M9。在m/z515處觀察到了M8和M9的M+H廣(MW514),其比替加環(huán)素小71Da。M8和M9的質(zhì)鐠數(shù)據(jù)類似。M9的m/z515質(zhì)鐠的子離子顯示在圖17中。由m/z515失去NH3產(chǎn)生m/z498子離子。對(duì)于替加環(huán)素，也觀察到了m/z456、411和154處的子離子，表明四環(huán)素環(huán)是完整的。對(duì)于M8和M9，缺少放射色it^與TBAAA側(cè)鏈中放射性標(biāo)記的氣基失去是一致的。形成M9的最可能的機(jī)制是酰胺水解產(chǎn)生叔丁基氨基乙酸(M3a，含有放射性標(biāo)記)和9-M米諾環(huán)素(M3，不含"C標(biāo)記)。提出9-氨基米諾環(huán)素的N-乙酰化產(chǎn)生M9。m/z456子離子和分子量(514)之間的58Da的差異與存在非放射性標(biāo)記的乙酰氨基是一致的。通過(guò)加入了合成的N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(WAY-188749)的尿液提取物的聯(lián)合色i普法確認(rèn)了這些代謝物(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)M8比M9的HPLC保留時(shí)間早，提出代謝物M8是M9的差向異構(gòu)體。這與替加環(huán)素差向異構(gòu)體比替加環(huán)素的洗脫早是一致的。因此，M8和M9分別被鑒定為N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素的差向異構(gòu)體和N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素。圖18-21涉及替加環(huán)素葡糖苷酸的另外的分析。圖18是對(duì)替加環(huán)素葡糖苷酸所提出的結(jié)構(gòu)和質(zhì)鐠碎裂流程圖，其對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)I、II差向異構(gòu)體、III和IV差向異構(gòu)體。圖19A的UV色鐠圖以及圖19B和19C是所選的質(zhì)鐠圖，這些圖來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者的人尿液的LC/MS分析。圖20A和20B顯示了替加環(huán)素葡糖普酸的m/z762質(zhì)鐠的子離子，其中圖20A是滿刻度圖，圖20B是放大以顯示較低強(qiáng)度的子離子的圖。圖21A-21D顯示了LC/MS/MS色i脊圖，這些圖來(lái)自施用了替加環(huán)素的受試者的人泉液m/z762分析的子離子，其中圖21A-21C是所選的低強(qiáng)度子離子的質(zhì)鐠圖，圖21D是總離子色譜圖。因此，代謝物及其差向異構(gòu)體的可能結(jié)構(gòu)包括至少一種選自如本文在前面公開的I、II差向異構(gòu)體、III和IV差向異構(gòu)體的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的化合物可以用作抗耐藥菌的治療，已經(jīng)表明當(dāng)其它抗生素失效時(shí)它們可以發(fā)揮作用。例如，其可以有效地抵抗耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌(D丄Beidenbach等人，Z)z'flgwo幼'cM/md/o/ogv/"/ecft》"sZ)/鄉(xiāng)se40:173-177(2001);H.W.Boucher等人，^4ifri附i'ci^6/fl/在CT^/wo^e/*"/^44:2225-2229(2000);尸.A5f"rf/wrfC7iVi.Af!crMiV^iVews/戰(zhàn).26:163-168(2004);D.Milatovic等人，/4wft附iciv6./4ge"ttC7^挑0說(shuō)w.47:400-404(2003);R.Patel等人，DfVig"細(xì)'cAf/c/^6i油^va/irf/"/g"i'omsZ)/sease38:177-179(2000);P丄Petersen等人，y4/ift挑fciv6.々e/iteC7^附Wto.46:2595-2601(2002);和P丄Petersen等人，4油附&^.々e"teCAe附Wto.43:738-744(1999))和抵抗帶有兩種主要形式的四環(huán)素耐藥性一_外流和核糖體保護(hù)——中任一種的有機(jī)體(C.Betriu等人，爿"ri加ici^6.^gewtoC7^附W/^i".48:323-325(2004);T.Hirata等人，爿/fftw/cro6.C7^附W/r化48:2179-2184(2004);和P.J.Petersen等人，^wriw!'Cfo6.jge"teC/ie附W/^f.43:738-744(1999))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文>^開的化合物可以用于治療多種細(xì)菌感染，例如復(fù)雜性^J^內(nèi)感染(complicatedintra-abdominalinfections,cIAI)、復(fù)雜'性皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染(complicatedskinandskinstructureinfections,cSSSI)、社區(qū)獲得性肺炎(CAP)和醫(yī)院獲得性肺炎(HAP)征候，這些細(xì)菌感染可由革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性病原體、厭氧菌以及對(duì)甲氧苯青霉素敏感的和耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌抹(MSSA和MRSA)所引起。此外，本文公開的化合物還可用于在恒溫動(dòng)物中治療或控制由具有耐TetM和TetK決定子的細(xì)菌所引起的細(xì)菌感染。本文公開的化合物還可用于治療骨和關(guān)節(jié)感染、與導(dǎo)管有關(guān)的中性白細(xì)胞減少癥、產(chǎn)科和婦科感染，或者用于治療其它耐藥的病原體，例如VRE、ESBL、腸道菌、生長(zhǎng)迅速的分枝桿菌屬(wy;co6fl"e打'a)等。因此，本文公開的實(shí)施方案是治療至少一種細(xì)菌感染的方法，該方法包括給需要其的受治療者施用包含治療有效量的至少一種本文公開的化合物及其可藥用鹽的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的化合物與替加環(huán)素相比例如可以減少惡心。如本文所用的"藥物組合物"指醫(yī)藥組合物。該藥物組合物可以含有至少一種可藥用載體。如本文所用的"可藥用賦形劑"指適于施用本文提供的化合物的藥物栽體或基質(zhì)，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適于具體施用方式的任意這類載體。例如，用于胃腸道外、皮內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用的溶液或混懸液可以包括無(wú)菌稀釋劑(例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油等)；天然存在的植物油(例如a油、椰子油、花生油、棉子油等)；合成的脂肪基質(zhì)(例如油酸乙酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇等，包括其它合成溶劑)；抗微生物劑(例如苯甲醇、尼泊金甲酯等)；抗氧化劑(例如維生素C、亞硫酸氫鈉等)；螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA)等)；緩沖劑(例如乙酸鹽、枸櫞酸鹽、磷酸鹽等)；和/或張力調(diào)節(jié)劑(例如氯化鈉、葡萄糖等)；或它們的混合物。進(jìn)一步舉例而言，當(dāng)靜脈內(nèi)施用時(shí)，適宜的栽體包括生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和含有增稠劑和增溶劑如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇等的溶l良它們的混合物。非限制性地舉例而言，本文^S開的化合物可以任選與一種或多種可藥用賦形劑組合，并且可以以例如片劑、膠嚢劑、可^t粉末、顆粒劑、含有例如約0.05至5。/。助懸劑的混懸劑、含有例如約10至50。/。蔗糖的糖漿劑和含有例如約20至50。/o乙醇的酏劑等形式口月施用，或者以在等張基質(zhì)中的無(wú)菌注射溶液或含有約0.05至5%助懸劑的混懸液形式經(jīng)胃腸道外施用。這類藥物制劑可以含有例如約25至約卯％的活性成分以及載體、更通常約5%至60%重量的載體。其它制劑在U.S.專利號(hào)5，494，卯3和5，529，9卯中進(jìn)行了討論，其公開內(nèi)容引入本文作為參考。術(shù)語(yǔ)"可藥用鹽"可以指本公開內(nèi)容中的化合物的酸加成鹽或堿加成鹽?？伤幱名}是保持母體化合物的活性并且不會(huì)對(duì)其施用的受治療者和在上下文中其所施用的受試者產(chǎn)生任何有害的或不需要的作用的任意鹽?？伤幱名}包括金屬?gòu)?fù)合物以及無(wú)機(jī)和有機(jī)酸鹽?？伤幱名}包括金屬鹽，例如鋁鹽、鈣鹽、鐵鹽、鎂鹽、錳鹽和復(fù)合鹽?？伤幱名}包括酸式鹽，例如乙酸鹽、天門冬氨酸鹽、MJ^磺酸鹽、芳基磺酸鹽、axetil、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、丁酸鹽、M酸鉤、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯苯甲酸鹽、cilexetil、枸櫞酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylic)、十二烷基磺酸鹽(estolic)、esyl、乙磺酸鹽(esylic)、甲酸鹽、富馬酸鹽、ghiceptic、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酸鹽、乙醇?；北诫纤猁}、環(huán)己磺酸鹽、己基resorcinoic、hydrabamic、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、羥萘甲酸鹽、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、馬來(lái)酸鹽、蘋果酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硝酸鹽、甲基琉酸鹽、粘酸鹽、粘康酸鹽、萘璜酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、對(duì)硝基甲磺酸鹽、樸酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、酞酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、7JC楊酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、^iJ^磺酸鹽、對(duì)MM酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、teodic、甲M酸鹽等。可藥用鹽可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。其它可藥用鹽例如可以在Stahl等人的"藥用鹽性質(zhì)、選#^用途"(iV^r附"ce"ft'cfl/Sflto:iVo/7eW/es,^/"ftVm，fl"rff/se，Wiley-VCH;第l版，2002年6月15日)中找到。在一個(gè)實(shí)施方案中，"治療有效量"指預(yù)防或改善患者的癥狀或者產(chǎn)生所需生物學(xué)結(jié)果如改善臨床癥狀、延緩疾病發(fā)作、減少和/或增加、淋巴細(xì)胞和/或抗體水平等的化合物的量。有效量可以如本文所述來(lái)確定.所選的劑量水平將取決于具體化合物的活性、施用途徑、所治療病癥的嚴(yán)重性以及所治療患者的病癥和既往病史。但是，以低于獲得所需療效所需要的水平開始施用化合物并逐漸增加劑量直至獲得所需療效在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由測(cè)定法得到的數(shù)據(jù)可以用于制定用于人的劑量范圍。對(duì)照實(shí)施例l研究了["C替加環(huán)素在于37X:孵育至24小時(shí)的對(duì)照血清中的穩(wěn)定性。在所加入的對(duì)照血清的提取物中與"C替加環(huán)素有關(guān)的放射性百分?jǐn)?shù)經(jīng)過(guò)24小時(shí)降低了約9%,即從0小時(shí)的卯％降低至24小時(shí)的81%(圖22)。0時(shí)刻的差向異構(gòu)體百分fci7。/。并且保持恒定至24小時(shí)，如對(duì)四環(huán)素類所報(bào)道的那樣(RemmersEG，SiegerGM，DoerschukAP.對(duì)四環(huán)素C.4差向異構(gòu)化的動(dòng)力學(xué)的一些觀測(cè).//^"r附5W.1963;52;752-756;NelisH，DeLeenheerA.米諾環(huán)素在人體中的代謝.Afeto61982;10:142-146)，替加環(huán)素的差向異構(gòu)體是差向異構(gòu)化的產(chǎn)物，并且認(rèn)為它不是代謝物。其它產(chǎn)物的量增加了約8%，即從0小時(shí)的3%增加至24小時(shí)的11%。其它產(chǎn)物包括早期洗脫色鐠峰(M3a，叔丁基氨基乙酸)，其保留時(shí)間為約4分鐘。以前在大鼠和狗的血漿和尿液中觀察到了該峰.對(duì)于0至24小時(shí)的受試樣品，放射性從所加入的對(duì)照中的回收率是完全的。對(duì)照實(shí)施例2當(dāng)于37t;孵育時(shí)，"C1替加環(huán)素在尿液中沒(méi)有在血清中穩(wěn)定(圖6)。14C1替加環(huán)素在所加入的對(duì)照尿液中的百分?jǐn)?shù)降低了18%,即從0小時(shí)的92%降低至24小時(shí)的74%。差向異構(gòu)體增加了16%,即放射性從0小時(shí)的7%增加至24小時(shí)的23%。其它次要產(chǎn)物經(jīng)過(guò)24小時(shí)從0時(shí)刻的1%增加至3%.在用于研究樣品的提取方法過(guò)程中，研究了"C替加環(huán)素在對(duì)照血清和糞便勻漿物中的穩(wěn)定性。在加入和提取樣品之前，"Cj替加環(huán)素在血清樣品中占94%的放射性。提取操作后，["C替加環(huán)素的量由24。/o的放射性降低至70%。在其它放射性組分、主要是替加環(huán)素的差向異構(gòu)體中有相應(yīng)的增加，替加環(huán)素的差向異構(gòu)體從提取前的4%增加至提取后的22%。包括M3a在內(nèi)的其它次要產(chǎn)物從提取前的2%增加至提取后的8%。對(duì)照實(shí)施例3將["C替加環(huán)素從對(duì)照糞便勻漿物中提取后觀察到了類似的結(jié)果。在這些樣品中，["Cl替加環(huán)素在提取前占94。/o的放射性，在提取后占68%的放射性。在替加環(huán)素的差向異構(gòu)體中有相應(yīng)的增加，其在提取前占4%的放射性，在提取后占23%的放射性。在提取過(guò)程中，M3a的量也增加了40/。，即從1%增加至5%。其它次要產(chǎn)物在提取前占小于1%的放射性，在提取后占4%的放射性。實(shí)施例實(shí)施例l在6名健康男性志愿者中進(jìn)行了開放標(biāo)記、入院病人、多劑量替加環(huán)素、單劑量"C替加環(huán)素代謝處置和質(zhì)量平衡的研究。臨床方案需要12名受試者。在這12名受試者中，6名受試者接受放射性劑量(受試者1、4、5、6、7和8,后來(lái)受試者8退出了4^研究)。根據(jù)納A/排除標(biāo)準(zhǔn)、醫(yī)療史、體格檢查和研究方案中所述的另外的操作來(lái)選擇合格的受試者。每名受試者在第1天的早晨接受100mg負(fù)荷劑量，然后每12小時(shí)接受另外5個(gè)劑量的50mg維持劑量。在研究的第4天早晨，6名受試者接受單次50mg劑量的["C替加環(huán)素(50nCi)。通it30分鐘靜脈內(nèi)輸注來(lái)施用每個(gè)替加環(huán)素劑量。6名健康男性志愿者接受["C標(biāo)記的替加環(huán)素，平均劑量為45.9±0.9[1(:1(范圍為44.3至47.0^Ci)。在給藥時(shí)l"Cl替加環(huán)素的放射化學(xué)純度被報(bào)告為98.6。/。，其中0.4%的放射性被鑒定為替加環(huán)素差向異構(gòu)體，比活性為1.00nCi/mg,在替加環(huán)素給藥前以及在"CI標(biāo)記的劑量給藥后1、4、8、24和48小時(shí)收集血清樣品以進(jìn)行代謝物分析。對(duì)于代謝物分析，在0-4、4-8、8-24和24-48小時(shí)收集尿液樣品，在"CI標(biāo)記的劑量給藥后至48小時(shí)收集糞^更樣品。將血清和尿液樣品以及糞便勻漿物在干冰上運(yùn)送到"藥物安全和代謝生物轉(zhuǎn)化部門"(WyethResearch,Collegeville，PA)。樣品收集和樣品^4的詳情在本研究的質(zhì)量平衡(massbalance)部分中有描述。6號(hào)受試者的24-48小時(shí)的尿液和糞便樣品是不完全的，因?yàn)樵撌茉囌咄顺隽吮狙芯俊ｋm然來(lái)自該受試者的樣品用于代謝物分析，但是其樣品不被包括在質(zhì)量平衡計(jì)算中。M究的臨床部分中所用的未標(biāo)記和["q標(biāo)記的替加環(huán)素以及劑量的制備和這些批次的分析的詳情在本研究的質(zhì)量平衡部分中有描述。施用于受試者的l"C替加環(huán)素(制劑號(hào)0931854J,批號(hào)7981703)的比活性為1.00i!Ci/mg(5(^Ci/50mg劑量)。用于評(píng)價(jià)"Cj替加環(huán)素在血清、尿液和糞4更勻漿物中的穩(wěn)定性的另一批["CI替加環(huán)素(批次CFQ13389，95.3pCi/mg，97.2%放射化學(xué)純度)從AmershamPharmaciaBiotech(Buckinghamshire,英國(guó))獲得。替加環(huán)素參比標(biāo)準(zhǔn)品(批次RS738-4，純度為98.4%)、9-^米諾環(huán)素參比標(biāo)準(zhǔn)品(CL-318614，批號(hào)14800B-89A)和N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(WAY-188749,批號(hào)L23566-162)從WyethResearch(PeaiiRiver，NY)獲得。"C替加環(huán)素的結(jié)構(gòu)如下所示，放射性標(biāo)記的位置標(biāo)為(*)。丙酮、乙腈、水醋酸和甲醇由EMD化學(xué)公司(Gibbstown，NJ)獲得。乙二胺四乙酸(EDTA)和三氟乙酸由Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)獲得。乙酸銨由MallinckrodtBaker(Phillipsburg,NJ)獲得。所有試劑均是分析絲更高級(jí)別。靜脈內(nèi)單次100mg劑量施用替加環(huán)素、然后施用5個(gè)50mg劑量替加環(huán)素和單次50mg劑量的"C替加環(huán)素通常是安全和耐受良好的。所報(bào)道的最常見(jiàn)(>10%)的不^^應(yīng)是惡心(75%)、嘔吐(50%)、消化不良(17%)和注射部位炎癥(17%)。替加環(huán)素C29H39N5O8未標(biāo)記化合物的阜同位素MW-585.3實(shí)施例2使用Tri-Carb型3100TR液體閃爍計(jì)數(shù)器(PerkinElmer，Wellesley，MA)、使用UltimaGold，閃爍液(PerkinEImer)和UltimaGold標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行放射性測(cè)定以計(jì)算提取效率。通過(guò)使用放射性已知的外標(biāo)將每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)轉(zhuǎn)化為每分鐘衰變數(shù)(DPM)。通iti^射性外標(biāo)的轉(zhuǎn)化能鐠指數(shù)(tSIE)測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品的淬滅。使用T叩CountNXT放射性微板讀數(shù)器(PerkinElmer)來(lái)分析被收集到96孔深孔Luma板(PerkinElmer)中的HPLC級(jí)分。實(shí)施例3對(duì)在["C1標(biāo)記的替加環(huán)素給藥后1、4和8小時(shí)收集的單獨(dú)的血清樣品進(jìn)行分析以用于代謝物概況。對(duì)24和48小時(shí)的樣品沒(méi)有進(jìn)行分析，因?yàn)榉派湫缘臐舛忍?范圍為0至18ng等同物/mL)。為了將樣品體積減少到最小，M份血清樣品分成等體積的兩份樣品(每份約9M1)，單獨(dú)對(duì)其進(jìn)行提取和分析.將EDTA(80^L0.5MEDTA/mL樣品)加入到每份樣品中，將樣品渦旋混合。將3體積丙酮加入到每份樣品中，然后使用多管渦旋混合器將樣品混合1分鐘。在2500rpm和4。C下、在SorvallSuperT21離心機(jī)(Sorval1Inc.，Newtown，MA)中將樣品離心15分鐘。將上層液轉(zhuǎn)移到含有20^iL水醋酸的新管中。用2mL水、160inL0.2MEDTA和6mL丙酮將沉淀物重新提取2次，如前所述進(jìn)行^t作。合并來(lái)自#樣品的上層液，使用TurbovapLV型蒸發(fā)儀(Zymark，Hopkinton，MA)在氮?dú)饬飨聦⑵湔舭l(fā)至千。將殘余物在300pL乙腈/水(l:9)中重構(gòu)，在14，000rpm和室溫下使用5415C型E卯endorf離心機(jī)(BrinkmannInstruments,Westbury，NY)離心10分鐘，通過(guò)HPLC對(duì)放射性進(jìn)行分析。所選的樣品還通過(guò)LC/MS進(jìn)行了分析。在加有["C替加環(huán)素(以3ng/mL加入)并于37匸孵育的對(duì)照人血清中測(cè)定了["C1替加環(huán)素的穩(wěn)定性。使用該濃度是因?yàn)槠浣咏鼘?duì)本研究報(bào)道的C咖x值。在0、1、4、8和24小時(shí)取出等分試樣(500nL)，置于新小瓶中。加入EDTA(40pL0.5M),在14，000rpm和室溫下將樣品離心IO分鐘(Eppendorf離心機(jī)，5415C型)。將上層液轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，通過(guò)HPLC用放射性流動(dòng)檢測(cè)進(jìn)行分析。如上所述制備另外的血清樣品并提取。這樣做是為了測(cè)定提取操作對(duì)["C替加環(huán)素穩(wěn)定性的影響(如果有的話)。通過(guò)HPLC用放射性流動(dòng)檢測(cè)分析了這些樣品，如實(shí)施例6中所述。實(shí)施例4使用以前研究的并用于大鼠和狗的尿液樣品的方法如下所述提取用于代謝物分析的尿液樣品。在提取前，將在"CI替加環(huán)素給藥后不同間隔至48小時(shí)收集的尿液樣品在冰上解凍。將單獨(dú)的尿液樣品的等分試樣(lmL)轉(zhuǎn)移到干凈的管中，加入0,2MEDTA，EDTA的終濃度為40mM。pH保持恒定在4.5-5.5,將樣品混合，離心，通過(guò)HPLC放射色譜法分析上層液的代謝物，所選的樣品還通過(guò)LC/MS進(jìn)行了分析。來(lái)自8號(hào)受試者的另外的尿液用于分離代謝物M3a。使用如上所述的相同方法處理該尿液樣品。使用HPLC法并在樣品注射后2至5.5分鐘收集HPLC流出物來(lái)分離M3a峰。在氮?dú)饬飨率褂肨urbovapLV型將混合的級(jí)分濃縮。然后將樣品離心，通過(guò)LC/MS分析.在加有"Cl替加環(huán)素(以5ng/mL加入)并于37t:孵育的對(duì)照A^液中測(cè)定了"C1替加環(huán)素的穩(wěn)定性。使用該濃度是因?yàn)槠涮幱诒狙芯康?C替加環(huán)素在尿液中的濃度范圍之內(nèi)。在0、1、4、8和24小時(shí)取出等分試樣(500jxL)，置于新的小瓶中。如在對(duì)照實(shí)施例2中對(duì)血清所述對(duì)這些尿液樣品進(jìn)行處理和分析。實(shí)施例5由在["C標(biāo)記的替加環(huán)素給藥后至48小時(shí)收集的各糞便樣品制M有大于8000dpm/g的單獨(dú)的糞便樣品勻漿物，然后對(duì)其進(jìn)行分析以用于代謝物概況，糞便樣品勻漿物的制備在本研究的質(zhì)量平衡部分中有詳細(xì)描述。簡(jiǎn)言之，在ABC實(shí)驗(yàn)室(Columbia，MO)將糞便樣品按重量用3至4體積的水水進(jìn)行勻漿化，冷凍運(yùn)送到"藥物安全和代謝生物轉(zhuǎn)化部門"(WyethResearch,Collegeville，PA)。對(duì)于放射性的提取，將糞便勻漿物在水上解凍，將等分試樣(約lg)轉(zhuǎn)移到15mL管中。加入3體積丙酮，使用多管渦旋混合器將樣品混合l分鐘。在2500rpm和^C下、在SorvallS叩erT71離心機(jī)中將樣品離心15分鐘。將上層液轉(zhuǎn)移到新管中，將沉淀物用lmL水和80nJL0.5MEDTA重新混懸，如前所述重新提取。按這種方式將沉淀物總共重新提取3次，將上層液混合。使用TurbovapLV型在氮?dú)饬飨聦⑸蠈右赫舭l(fā)至干。將殘余物重新混懸于500nL水中，在14，000rpm和室溫下使用5415C型Eppendorf離心機(jī)離心10分鐘。將上層液轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，使用HPLC用放射性檢測(cè)對(duì)放射性和代謝物概況進(jìn)行分析。所選的樣品還通過(guò)LC/MS進(jìn)行了分析。在加有"Cl替加環(huán)素(以5將/g勻漿物加入)的對(duì)照人糞便勻漿物中測(cè)定了["CI替加環(huán)素在提取過(guò)程中的穩(wěn)定性。使用該濃度是因?yàn)槠涮幱趤?lái)自本研究的"C1替加環(huán)素在糞便勻漿物中的濃度范圍之內(nèi)。將樣品提取，通過(guò)HPLC用放射性流動(dòng)檢測(cè)對(duì)樣品進(jìn)行分析。實(shí)施例6如下進(jìn)行HPLC分析4吏用Waters2695AllianceSeparationModule(WatersCorp.，Milford，MA)，Waters2487型雙波長(zhǎng)UV吸收檢測(cè)器，設(shè)置在監(jiān)測(cè)器350nm,與以20秒間隔收集級(jí)分而配備的Gilson215液體處理機(jī)(Gilson，Middleton，WI)聯(lián)機(jī)。將級(jí)分收集到96孔深孔Luma板中，使用TopCountNXT進(jìn)行分析。將自動(dòng)采樣器的溫度設(shè)置在4X:。在裝配有PhenomenexSecurityGuar(P^護(hù)柱(5jLim)的PhenomenexLunaC18(2)柱(150x2.0mm，5jim;Phenomenex,Torrance,CA)上4吏用兩種流動(dòng)相A和B的線性梯度來(lái)分離替加環(huán)素和藥物衍生的產(chǎn)物.柱處于約20t:的環(huán)境溫度下。流動(dòng)相A是10mM乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B是乙腈。流動(dòng)相的流速為0,2mL/分，如下所示進(jìn)行輸送。表6:HPLC梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)施例7-9液相色譜法/質(zhì)譜法分析用于質(zhì)譜法分析的HPLC系統(tǒng)是WatersAlliance2695型HPLC系統(tǒng)。其裝配有內(nèi)裝式自動(dòng)采樣器和996型二極管陣列UV檢測(cè)器。在本研究中，在LC/MS分析中使用了3種HPLC糾。LC/MS糾1用于代謝物鑒定的大多數(shù)樣品分析和用于從尿液中分離代謝物M3a。LC/MS條件2用于所選的物M8和M9的鑒定。LC/MS條件3用于分析^A尿液中分離的極性代謝物M3a。實(shí)施例7LC/MS條件1將UV檢測(cè)器設(shè)置在監(jiān)測(cè)器340-360nm。在帶有UniguardC18保護(hù)柱(10x2mm)(ThermoHypersil-Keystone，Bellefonte，PA)的PhenomenexLunaC18(2)柱(150x2.0mm，5nm)上完成分離以用于代謝物鑒定，$組為0.2mL/分。在LC/MS樣品分析過(guò)程中，在評(píng)價(jià)代謝物之前將直至2分鐘的起始流出物^f^^中移開。流動(dòng)相A是10mM乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B是乙腈。線性流動(dòng)相梯度如下所示。表7:LC/MSHPLC梯度1時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(%)S流動(dòng)相B(%)10303022類似的HPLC條件用于收集含有代謝物M3a的級(jí)分。流動(dòng)相和線性梯度相同。所用的柱是SupelcoDiscoveryC18柱(25cmxl0mm，5pm;Supelco，BeHefonte，PA),流速為4.7mL/分。使用FC204型GHson級(jí)分收集器(Gilson)收集級(jí)分。實(shí)施例8LC/MS糾2將UV檢測(cè)器設(shè)置在監(jiān)測(cè)器210-400nm。在帶有UniguardC18保護(hù)柱(10x2mm)(ThermoHypersH-Keystone)的PhenomenexLunaC18(2)柱(250x2.0mm，5ixm)上完成分離，$組為0.2亂/分，在LC/MS樣品分析過(guò)程中，在評(píng)價(jià)代謝物之前將直至0.5分鐘的起始流出物^#^中移開。流動(dòng)相A是0.02。/o三氟乙酸水溶液(v/v)，流動(dòng)相B是0.02。/。三氟乙酸的乙腈溶液(v/v)。線性流動(dòng)相梯度如下所示。表8:LC/MSHPLC梯度2時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)7615857798297982實(shí)施例9LC羅條件3在WatersAtlantisHILICSilica柱(150x2.1mm，5pm)上完成分離。流速為0.211117分。流動(dòng)相A是0.02Q/。三氟乙酸的乙腈溶液(v/v)，流動(dòng)相B是0.02。/。三氟乙酸水溶液(v/v)。線性流動(dòng)相梯度如下所示。表9:LC應(yīng)HPLC梯度3時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)01000101000206634253466403466411000651000實(shí)施例IO質(zhì)i瞽法以正離子化模式操作MicromassQuattroUltima三聯(lián)四極質(zhì)鐠儀(Waters公司)。使用Z^噴霧界面、用電噴射離子化(ESI)進(jìn)行LC/MS分析。通過(guò)直接輸注到納噴霧界面對(duì)來(lái)自所選樣品的單獨(dú)級(jí)分進(jìn)行ESI-MS分析。質(zhì)鐠儀的設(shè)置列在下表中。表10:Microinass質(zhì)i普儀設(shè)置ESI噴霧2.75KV錐孔電壓44V掃描質(zhì)量分析器的質(zhì)量分辨率一半高度處寬度為0.7Da±0.2Da用于MS/MS的非掃描質(zhì)量分析器的質(zhì)量分辨率去溶劑化氣流錐孔氣流整體源溫(Sourceblocktemp.)去溶劑化氣體溫度碰撞氣壓碰撞補(bǔ)償(coHisionoffset)一半高度處寬度為l-2Da850-950L/hr35-45L/hr80"C250匸0.9畫l.lxl(T3mbar-30eV通過(guò)對(duì)具有替加環(huán)素特征的子離子的前體進(jìn)行LC/MS/MS分析，從而分析了尿液和糞便樣品中的替加環(huán)素代謝物。此外，根據(jù)來(lái)自以前在動(dòng)物和人中研究的結(jié)果，在LC/MS數(shù)據(jù)中尋找了可能的替加環(huán)素代謝物。通過(guò)LC/MS/MS、以可減少內(nèi)源性組分干擾的所選反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式(LC/SRM)分析了血清提取物中的替加環(huán)素和所選的代謝物。將停留時(shí)間設(shè)置在200ms進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。監(jiān)測(cè)了以下與替加環(huán)素有關(guān)的組分。表ll:替加環(huán)素代謝物的LC/SRM分析前體離子子離子化合物(m/z，標(biāo)稱質(zhì)量)(m/z，標(biāo)稱質(zhì)量)替加環(huán)素及其差向異構(gòu)體586513羥^^替加環(huán)素(M1、M2、M4)和替加環(huán)素N-氧化物60258沐472替加環(huán)素葡糖苦酸(M6和M7)762569N-乙?；?9-^jL米諾環(huán)素(M8515498和M9，不帶有放射性標(biāo)記)9-M米諾環(huán)素(M3，不帶有473456放射性標(biāo)記)對(duì)于穩(wěn)定性分析和代謝物概況，采用Flo-One分析軟件(3.65版)積分放射峰。使用MicrosoftExcel2000電子表格計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。用于LC/MS數(shù)據(jù)分析的軟件是MicromassMassLynx(4.0版，Waters公司)。實(shí)施例ll材料乙酸銨購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)和FisherScientific(Fairlawn，NJ)。HPLC級(jí)的水和溶劑購(gòu)自EMDChemicals(Gibbstown，NJ)。方法尿液樣品的制備使用VirTisSentry35XLFreezemobHe(VirTis公司，Gardiner,NY)將來(lái)自接受替加環(huán)素的受試者的尿液樣品(300mL)冷凍干燥至干.將殘余物重新混懸于水中，將容器用水洗滌。終體積為3,5mL。在14，000rpm和室溫下寸吏用5415C型Eppendorf離心機(jī)(BrinkmannInstruments,Westbury,NY)將樣品離心10分鐘。然后使用0.2或0.45/1111孔徑的(:0818『SpinXHPLC尼龍微型離心機(jī)濾器(CorningIncorporated,Corning,NY)將樣品過(guò)濾。用IECCentraGP8R型離心機(jī)(ThermoElectron公司)在2400rpm^:作下進(jìn)行過(guò)濾離心。將所得粗尿液提取物通過(guò)如下所述的具有級(jí)分收集的HPLC進(jìn)行處理。通過(guò)半制備型HPLC分離替加環(huán)素葡糖苷酸將含有替加環(huán)素葡糖苷酸的尿液提取物轉(zhuǎn)移到4mL自動(dòng)采樣器小瓶中。分離代謝物的HPLC設(shè)備包括WatersPrep4000HPLC系統(tǒng)、Waters2767樣品管理程序(SampleManager)、WatersColumnFluidicsOrganizer和Waters996二極管陣列UV檢測(cè)器(Waters公司，Milford，MA)。用DiscoveryC18柱(200xl0mm，5pm)(Supelco，Bellefonte，PA)完成分離.將UV檢測(cè)器設(shè)置在監(jiān)測(cè)器210和450nm。流動(dòng)相A是10mM乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B是乙腈。將線性流動(dòng)相如表12中所述進(jìn)行輸送。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>通過(guò)帶有FractionLynx模塊的MicromassMassLynx軟件(4.0版，Waters公司)來(lái)控制用于級(jí)分收集的HPLC設(shè)備。使用FractionLynx,根據(jù)在350nm處監(jiān)測(cè)UV吸收來(lái)收集代謝物級(jí)分。級(jí)分收集后，通過(guò)如下所述的MS來(lái)分析所選級(jí)分的等分試樣，以確定替加環(huán)素葡糖苷酸的存在。然后如上所述將含有替加環(huán)素葡糖苷酸的級(jí)分冷凍干燥至干，重新溶解，通過(guò)LC/MS分析以確定替加環(huán)素葡糖苷酸已經(jīng)被分離。液相色譜法/質(zhì)譜法用于替加環(huán)素代謝物分析的HPLC系統(tǒng)包括包含雙泵和二極管陣列UV檢測(cè)器的Agilent1100型HPLC系統(tǒng)。HPLC分離條件如以上對(duì)代謝物分離的級(jí)分收集所述，除了流速是0.2mL/分和HPLC柱的內(nèi)徑是2.1mm。在冷凍干燥之前，不用HPLC柱而是通過(guò)將級(jí)分的等分試樣直接輸注到質(zhì)譜儀中進(jìn)行代謝物級(jí)分的分析。用于代謝物鑒定的質(zhì)譜儀是FinniganLCQ離子阱質(zhì)譜儀(ThermoEiectron公司，SanJose，CA)。其裝配有電噴霧電離(ESI)界面并且在正離子化模式下進(jìn)行操作。用Xcalibur軟件(l，3版，ThermoElectron公司)分析LC/MS數(shù)據(jù)。替加環(huán)素葡糖苷酸的質(zhì)譜通itA尿液的HPLC分級(jí)收集替加環(huán)素葡糖苷酸。在m/z762處觀察到了替加環(huán)素葡糖苷酸的M+H+,其比替加環(huán)素大176Da。替加環(huán)素葡糖苷酸的m/z762質(zhì)鐠的子離子顯示在圖23A和23B中。中性失去176Da產(chǎn)生了m/z586,m/z586也是替加環(huán)素的[M+H+，表明它是替加環(huán)素的葡糖普酸。冷凍千燥和重構(gòu)后替加環(huán)素葡糖苷酸級(jí)分的LC/MS分析提供了MS和MSn語(yǔ)，它們顯示在圖24A-24D中。這些質(zhì)鐠數(shù)據(jù)也表明是替加環(huán)素葡糖苷酸。本實(shí)施例表明可以從IV施用替加環(huán)素劑量的人受試者的尿液中分離出替加環(huán)素葡糖苷酸。實(shí)施例12本實(shí)施例研究了單次靜脈內(nèi)施用替加環(huán)素后在小鼠和兔中存在的替加環(huán)素的兩種代謝途徑(母體化合物的葡糖苷酸化和9-氨基米諾環(huán)素的N-乙酰化)的可能性。收集并通過(guò)LC/MS分析來(lái)自各物種的血清樣品以確定存在或不存在這些代謝物，可能的話可估計(jì)它們的濃度。還收集了來(lái)自小鼠的尿液樣品以研究替加環(huán)素代謝物的存在。材料用于制備對(duì)小鼠和兔進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥的溶液的替加環(huán)素(批號(hào)A96559，純度100%)、替加環(huán)素參比標(biāo)準(zhǔn)品(批次RS738-4，純度98.4%)、氖化的(叔丁基-d9)替加環(huán)素(WFQ0159;用作內(nèi)標(biāo))、9-氨基米諾環(huán)素參比標(biāo)準(zhǔn)品和N-乙酰基-9-H^米諾環(huán)素由WyethResearch(PearlRiver，NY)獲得。對(duì)照兔和小鼠血清由BioreclamationInc.(Hicksville，NY)獲得。乙腈和甲醇由EMDChemicalInc.(Gibbstown，NJ)獲得。乙二胺四乙酸(EDTA)由Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)獲得。乙酸銨由MallinckrodtBaker(PhilHpsburg，NJ)獲得。所有試劑均是分析級(jí)或更高級(jí)別。小鼠和兔研究設(shè)計(jì)動(dòng)物使用15只雄性CD-1小鼠，給藥時(shí)其平均體重為31,3g。動(dòng)物自由取食和飲水。將0.5和2小時(shí)血液收集組的小鼠在標(biāo)準(zhǔn)籠中喂養(yǎng)，而將4小時(shí)血液收集組的小鼠在代謝籠中喂養(yǎng)以收集尿液。由WyethResearch的生物資源部門(CollegevilIe，PA)對(duì)小鼠進(jìn)行給藥。使用3只雌性新西蘭白兔，給藥時(shí)其體重在3.9和4.3kg之間。動(dòng)物自由取食和飲水。將動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)籠中單獨(dú)喂養(yǎng)。在WyettiResearch(Chazy，NY)對(duì)兔進(jìn)行給藥，將樣品冷凍運(yùn)送到WyethResearch生物轉(zhuǎn)化部門(CoHegeville，PA)。給藥對(duì)于小鼠和兔,通過(guò)將50mg替加環(huán)素溶解于5.0mL0.9%無(wú)菌鹽水溶液中來(lái)制備工作儲(chǔ)備液而制備靜脈內(nèi)給藥溶液。用0.9%無(wú)菌鹽水溶液將工作儲(chǔ)備液稀釋至0.5mg/mL(對(duì)于小鼠)和4mg/mL(對(duì)于兔)'通i^C靜脈將小鼠劑量(5mg/kg，10mL/kg)作為單次快速靜脈注射液來(lái)施用。通過(guò)耳緣靜脈將兔劑量(4mg/kg，lmL/kg)作為單次快速靜脈注射液來(lái)施用。樣品收集對(duì)于小鼠(11=5/時(shí)間點(diǎn))，在施用替加環(huán)素后0.5、2和4小時(shí)通過(guò)心臟穿刺收集血液(約0.7mL)。對(duì)于兔，在替加環(huán)素給藥后0.5、2和6小時(shí)通過(guò)耳靜脈收集血液(約7mL)。于室溫形成血塊和在4X:和3000rpm下離心15分鐘后分離血清。將血清轉(zhuǎn)移到新管中，于約-70匸保存直至進(jìn)行如下文"用于LC/MS分析的血清樣品制備"中所述的分析。此外，從4小時(shí)血液收集組的小鼠中收集尿液，于約-70^;*直至進(jìn)行如下文"用于LC/MS分析的尿液樣品制備"中所述的分析。N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)的純度的估計(jì)通過(guò)HPLC、用UV檢測(cè)來(lái)估計(jì)^研究中所用的N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)的純度，如下文"液相色謙法/質(zhì)鐠法分析"中所述。根據(jù)M9的色諳峰面積、作為在100ng/^L樣品中占與M9有關(guān)的組分的總UV色譜峰面積的百分比來(lái)確定M9的純度。假定M9和其它有關(guān)組分具有相同的UV摩爾吸光度并且不存在其它與M9有關(guān)的物質(zhì)。以低于37.6分鐘的峰的相對(duì)量(總面積的2.8%)而存在的單獨(dú)組分,皮認(rèn)為是痕量組分并且不包括在本純度的估計(jì)中。在合成的物質(zhì)中，通過(guò)LC/MS僅鑒定了M9及其差向異構(gòu)體；沒(méi)有鑒定其它降解物。根據(jù)由本方法得到的M9純度的估計(jì)值來(lái)調(diào)整M9在各標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品中的實(shí)際濃度。用于LC/MS分析的尿液樣品的制備將小鼠尿液解凍，將等分試樣(lmL)轉(zhuǎn)移到新管中。使用5415C型Eppendorf離心機(jī)(BrinkmannInstruments,Westbury，NY)在14，000rpm和室溫下將樣品離心10分鐘以除去任意顆粒。然后將樣品轉(zhuǎn)移到新管中，如下文"液相色譜法/質(zhì)鐠法分析"中所述通過(guò)LC/MS進(jìn)行分析。用于LC/MS分析的血清樣品的制備將各收集時(shí)間的小鼠和兔血清樣品混合，對(duì)替加環(huán)素、其差向異構(gòu)體、替加環(huán)素葡糖苷酸(M7及其差向異構(gòu)體M6)、9-ILi米諾環(huán)素(M3)和N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9及其差向異構(gòu)體M8)進(jìn)行分析。將血清的等分試樣(500/tl)轉(zhuǎn)移到新管中，加入氘化的替加環(huán)素(終濃度為30ng/mL)作為內(nèi)標(biāo)(僅定量分析)。將EDTA(40nL0,5MEDTA)加入到各樣品中，將樣品渦旋混合。將乙腈(500^iL)加入到各樣品中，將樣品渦旋混合，通過(guò)使用5415C型Eppendorf離心機(jī)(BrinkmannInstruments)在14，000rpm和室溫下離心IO分鐘來(lái)分離變性蛋白。將上層液轉(zhuǎn)移到新管中，4吏用TurbovapLV型蒸發(fā)儀(CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA)在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)溶劑，如下文"液相色謙法/質(zhì)譜法分析"中所述通過(guò)LC/MS分析剩余的水溶液，用對(duì)照兔血清將一些兔血清樣品稀釋5或50倍以保證分析物的響應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。用兔血清制備替加環(huán)素、M3和M9的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)將內(nèi)標(biāo)以及合成的替加環(huán)素和代謝物標(biāo)準(zhǔn)品加入到對(duì)照血漿中來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。在所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品中，替加環(huán)素的濃度為O、10、20、50、100、200、500和1000ng/mL，線性范圍為5至200ng/mL。對(duì)于9-氨基米諾環(huán)素(M3)，其濃度為O、1、5、10、20、50、100和200ng/mL,線性范圍為10至200ng/mL。對(duì)于N-乙?；?9-絲米諾環(huán)素(M9)，其濃度為1.6、3.2、6.4、16、32、64和96ng/mL，線性范圍為3.2至96ng/mL。如上所述對(duì)這些樣品進(jìn)行處理和分析。將含有M7(替加環(huán)素葡糖苷酸)的人尿液樣品的等分試樣加入到混合的2小時(shí)兔血清中以確定在兔中觀察到的葡糖苷酸是否與在人中觀察到的葡糖苷酸相同。如下文"^f目色鐠法/質(zhì)鐠法分析"中所述通過(guò)LC/MS分析該樣品。液相色譜法/質(zhì)譜法分析用于質(zhì)譜法分析的HPLC系統(tǒng)是WatersAlliance2695型HPLC系統(tǒng)(Waters公司，MHford，MA)。其裝配有內(nèi)裝式自動(dòng)采樣器和996型二極管陣列UV檢測(cè)器。將UV檢測(cè)器設(shè)置在監(jiān)測(cè)器210"400nm,在裝配有KeystoneUniguardC18保護(hù)柱(10x2.1mm)(ThermoElectron公司，Bellefonte，PA)的PhenomenexLunaC18(2)柱(150x2.1mm，5pm)(Phenomenex，Torrance,CA)上完成分離以用于代謝物鑒定。柱溫為25X:,流速為0.211117分。流動(dòng)相A是10mM乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B是乙腈，使用兩種線性流動(dòng)相梯度，其顯示在^2.2.5-1和2.2，5-2中。梯度l用于代謝物的鑒定(定性分析)。梯度2用于兔血清樣品的半定量分析。在LC/MS樣品分析過(guò)程中，在評(píng)價(jià)代謝物之前將直至10分鐘的起始流出物M鐠儀中移開。梯度1和梯度2的LC/MSHPLC數(shù)據(jù)顯示在表13和14中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>所用的質(zhì)鐲長(zhǎng)是MicromassQuattroUltima三聯(lián)四WH糾(Waters公司)。其裝配有電霧化界面并且在正離子化模式下進(jìn)行操作。質(zhì)#^的設(shè)置列在表15中。表15:Micromass質(zhì)鐠儀設(shè)置ESI噴霧~~2.5kV錐孔電壓50V掃描質(zhì)量分析器的質(zhì)量分辨率一半高度處寬度為0.7Da±0.2DaMS/MS實(shí)驗(yàn)的非掃描質(zhì)量分析主古糸補(bǔ)脊?fàn)?，，n器的質(zhì)量分辨率—半肉度處寬度為l-2Da去溶劑化氣流950-1100L/hr錐孔氣流40-60L/hr整體源溫去溶劑化氣體溫度碰撞氣壓碰撞補(bǔ)償250x:1.0-1.2x103mbar國(guó)30eV還對(duì)血清提取物進(jìn)行了在所選反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式(LC/SRM)下的LC/MS/MS分析，以篩選樣品中的替加環(huán)素代謝物并獲得替加環(huán)素代謝物的估計(jì)濃度。將停留時(shí)間設(shè)置在200咖進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。SRM分析條件總結(jié)在表16中。對(duì)于定性分析，沒(méi)有使用或監(jiān)測(cè)內(nèi)標(biāo)。表16:替加環(huán)素及其代謝物的SRM分析條件<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>數(shù)據(jù)分析和計(jì)算MicromassMassLynx(4.0版，Waters公司)用于分析LC/MS數(shù)據(jù)。根據(jù)與兔血清產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比、樣品中分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比來(lái)計(jì)算血清中替加環(huán)素、9-^米諾環(huán)素(1\13)和]\-乙SL^-9-M米諾環(huán)素(M9)的濃度。N-乙酰基-9-氨基米諾環(huán)素(M9)合成標(biāo)準(zhǔn)品的純度來(lái)自合成的N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)的HPLC分析的UV色譜圖顯示在圖25中。M9及其降解物的UV色譜峰面積顯示在表17中。表17:N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)的純度的估計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>M9差向異構(gòu)體是含量最多的與化合物有關(guān)的組分，其占合成的N-乙酰基-9-氨基米諾環(huán)素(M9)的約5iy。。N-乙,-9-#^米諾環(huán)素的估計(jì)純度為32%。小鼠的血清和尿液以及兔血清中的代謝物在小鼠血清中，通過(guò)LC/MS分析觀察到了替加環(huán)素、替加環(huán)素的差向異構(gòu)體、9-氨基米諾環(huán)素(M3)和替加環(huán)素葡糖苷酸(M7及其差向異構(gòu)體M6)。沒(méi)有研究這些組分在小鼠血清中的濃度。在小鼠血清中沒(méi)有觀察到N-乙S^-9-t^米諾環(huán)素，在小鼠尿液中觀察到了相同的與替加環(huán)素有關(guān)的組分。在兔血清中，通過(guò)LC/MS分析觀察到了替加環(huán)素、替加環(huán)素的差向異構(gòu)體、9-氨基米諾環(huán)素(M3)、替加環(huán)素葡糖苷酸(M7及其差向異構(gòu)體M6)和N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)。在兔中替加環(huán)素葡糖苷酸的鑒定與在人中所觀察到的相同，使用已知含有M7的人尿液所進(jìn)行的聯(lián)合色諳法實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)證明了這一點(diǎn)。替加環(huán)素在兔血清中的估計(jì)濃度從l小時(shí)的2020ng/mL降低至2小時(shí)的1040ng/mL和6小時(shí)的287ng/mL(表18)。M3的濃度也隨時(shí)間而降低，在0.5、2和6小時(shí)其濃度分別是545、312和卯.2ng/mL。但是，M9的濃度隨時(shí)間而增加，從0.5小時(shí)的5.5ng/mL分別增加至2小時(shí)和6小時(shí)的8.1和20ng/mL。表18:靜脈內(nèi)施用替加環(huán)素后雌性新西蘭白兔的血漿樣品中替加環(huán)素、9-氨基米諾環(huán)素(]^3)和]\-乙酰基-9-氨基米諾環(huán)素(M9)的估計(jì)濃度wi…濃度(ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>通過(guò)液相色譜法/質(zhì)譜法進(jìn)行的代謝物鑒定對(duì)來(lái)自CD-1小鼠和兔的血清提取物以及對(duì)來(lái)自CD-1小鼠的尿液進(jìn)行了LC/MS分析。在這些樣品中觀察到的與替加環(huán)素有關(guān)的化合物的匯總顯示在表19中。替加環(huán)素及其代謝物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在下文進(jìn)行討論。表19:CD-1小鼠血清和尿液以及兔血清樣品中鑒定的替加環(huán)素代謝物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>a.從LC/MS數(shù)據(jù)文件UL一063005J)006和ULJ)70105—0005中得到的保留時(shí)間b.TBAAA喊丁基絲乙耽城c.M，小鼠；R兔；S，血清；U，尿液替加環(huán)素在小鼠的血清和尿液以及兔血清中觀察到了替加環(huán)素。研究了替加環(huán)素可信標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)語(yǔ)特征以與代謝物進(jìn)行比較。在替加環(huán)素的LC/MS鐠中，在m/z586處觀察到了質(zhì)子化的分子離子M+H+。由替加環(huán)素的m/z586的碰撞活化解離得到的MS/MS鐠顯示在圖26A中，所提出的碎裂流:程圖顯示在圖26B中。所提出的碎裂流程圖與由Kamel和同事對(duì)有關(guān)的四環(huán)素類抗生素所提出的流程圖(A.M.Kamel等人，通過(guò)電噴射離子化、H/D交換和多階段質(zhì)鐠法進(jìn)行的四環(huán)素的質(zhì)鐠鑒定./爿附&"加附，13:543-557，2002)—致。由m/z586失去NH3產(chǎn)生了m/z569。m/z513處的子離子表示從叔丁基氨基乙酰氨基(TBAAA)側(cè)鏈中失去叔丁基氨基。失去整個(gè)TBAAA側(cè)鏈產(chǎn)生m/z456。m/z211和154處的子離子來(lái)源于四環(huán)素環(huán)系的D環(huán)，如在圖26B的碎裂流程圖中所表明的。m/z86離子表示叔丁基M亞甲基。替加環(huán)素差向異構(gòu)體在小鼠的血清和尿液以及兔血清中觀察到了替加環(huán)素的差向異構(gòu)體，其在m/z586處產(chǎn)生M+Hl+。圖27A和27B中所示的m/z586質(zhì)譜的子離子包括m/z569、513、456和86，對(duì)于替加環(huán)素它們也存在。根據(jù)其相對(duì)保留時(shí)間短于替加環(huán)素的相對(duì)保留時(shí)間而將其鑒定為差向異構(gòu)體。代謝物M3在小鼠的血清和尿液以及兔血清中觀察到了代謝物M3。在m/z473處觀察到了代謝物M3的M+H+。M3的m/z473質(zhì)譜的子離子顯示在圖28A和28B中。m/z473質(zhì)鐠的子離子包括由分別失去甲基和NH3而產(chǎn)生的m/z458和456。對(duì)于替加環(huán)素，還觀察到了m/zl54處的子離子，it^明D環(huán)沒(méi)有變化。由m/z458失去H20和NH3產(chǎn)生m/z423.隨后失去兩個(gè)CO分子產(chǎn)生m/z367。失去CO和CH3-N-CH2兩者產(chǎn)生m/z352。該碎裂行為和與米諾環(huán)素有關(guān)的化合物(A.M.Kamd等人，通過(guò)電噴射離子化、H/D交換和多階Mi普法進(jìn)行的四環(huán)素質(zhì)鐠鑒定./5WrMassSpe"nwi，13:543-557，2002)以及和將M3鑒定為9-氨基環(huán)素是一致的。通過(guò)將M3的HPLC保留時(shí)間和MS/MS鐠數(shù)據(jù)與合成的9-氨基米諾環(huán)素(數(shù)據(jù)未顯示)相匹配而得以證實(shí)。代謝物M6和M7在小鼠的血清和尿液以及兔血清中觀察到了代謝物M6和M7。在m/z762處觀察到了M6和M7的[M+H+，其比替加環(huán)素大176Da。M6和M7的質(zhì)"i普數(shù)據(jù)類似。M7的m/z762質(zhì)鐠的子離子顯示在圖29A和29B中。中性失去176Da產(chǎn)生m/z586，m/z586也是替加環(huán)素的M+H廣，表明它是替加環(huán)素的葡糖苷酸。對(duì)于替加環(huán)素，還，見(jiàn)察到了m/z569、513、456和154處的子離子，但是沒(méi)有表明結(jié)合部位。通過(guò)環(huán)C的碎裂而形成了551處的子離子，如碎裂流程圖中所表明的，il^明環(huán)A或C上的羥基是葡糖苷酸化的部位。洛索蒽醌(一種具有類似于替加環(huán)素的環(huán)A的酚環(huán)的三環(huán)化合物)被代謝為酚葡糖苷酸(RennerUD，PiperopoulosG，GebhardtR，EhningerG，ZellerKP.洛索蒽醌的氧化生物轉(zhuǎn)化(CI-941).DrugMetabDispos30:464~478，2002)。it^明環(huán)A的羥基是替加環(huán)素葡糖苷酸化的最可能的部位。根據(jù)M6比M7的HPLC保留時(shí)間早，提出代謝物M6^M7的差向異構(gòu)體。這與替加環(huán)素差向異構(gòu)體比替加環(huán)素的洗脫早是一致的(見(jiàn)上文"替加環(huán)素差向異構(gòu)體"部分)。兔血清提取物和A^液提取物的聯(lián)合色鐠表明這兩種樣品含有相同的替加環(huán)素葡糖苷酸(M7)(數(shù)據(jù)未顯示)，因此，提出M6和M7分別是替加環(huán)素差向異構(gòu)體和替加環(huán)素的葡糖苷酸。代謝物M9通過(guò)LC/SRM分析在兔血清中觀察到了代謝物M9。在小鼠的血清或尿液中沒(méi)有觀察到該代謝物。圖30顯示了兔血清中替加環(huán)素及其代謝物的單獨(dú)的LC/SRM色鐠圖，在m/z515-^498跡線中顯示了M9。兔血清的聯(lián)合LC/SRM色i脊圖顯示在圖31中，將["C1替加環(huán)素靜脈內(nèi)施用于健康男性志愿者后，替加環(huán)素是血清中主要的放射性標(biāo)記的組分。但是，在大鼠或狗中沒(méi)有觀察到替加環(huán)素在人體內(nèi)代謝的兩種途徑9-#^米諾環(huán)素的1\-乙酰化和母體化合物的葡糖苷酸化。本實(shí)施例中給出的研究考察了這些替加環(huán)素代謝途徑是否存在于小鼠和/或兔中。根據(jù)以前的代謝數(shù)據(jù)和來(lái)自本研究的數(shù)據(jù)，所提出的替加環(huán)素在小鼠、大鼠、兔、狗和人中的代謝途徑顯示在圖32中。在兔和小鼠中均觀察到了替加環(huán)素的葡糖苷酸化。存在的葡糖苷酸代謝物的量不能被測(cè)定，因?yàn)椴荒艿玫胶铣傻臉?biāo)準(zhǔn)品。在使用施用替加環(huán)素后收集的人尿液所進(jìn)行的聯(lián)合色鐠法實(shí)驗(yàn)中，表明人尿液和兔血清中的葡糖苷酸具有相同的保留時(shí)間。雖然沒(méi)有使用小鼠血清進(jìn)行聯(lián)合色鐠法，但是小鼠血清中的葡糖苷酸的保留時(shí)間與兔和人中所觀察到的相似，并且推測(cè)是M7。在兔血清中觀察到了N-乙?；?9-iJ^米諾環(huán)素(M9)，但是在小鼠血清中沒(méi)有觀察到。M9在兔血清中的估計(jì)濃度從5.5ng/mL增加至20ng/mL(給藥后0,5至6小時(shí))。這些濃度與以前報(bào)道的多次施用替加環(huán)素后M9在人血清中的濃度(3-15ng/mL)類似。此外，在兔血清中還觀察到了9-氨基米諾環(huán)素(M3)的濃度可高ii545ng/mL。雖然已經(jīng)在來(lái)自小鼠、大鼠、狗和人的血清中觀察到了該代謝物，但是在這些物種中該代謝物僅是痕量代謝物。明在兔中M3是主要的代謝物，相對(duì)于替加環(huán)素而言其濃度可一直^30%?？傊?，給小鼠和兔單次靜脈內(nèi)施用替加環(huán)素，然后在給藥后不同時(shí)間收集尿液(僅小鼠)和血液以制備血清。給雄性CD-1小鼠施用5mg/kg替加環(huán)素，在給藥后0.5、2和4小時(shí)收集血液，而在給藥后04小時(shí)收集尿液。雌性新西蘭白兔接受4mg/kg替加環(huán)素，在給藥后0.5、2和6小時(shí)收集血液。在通過(guò)LC/MS、以所選反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析之前，按時(shí)間點(diǎn)和物種將血清樣品混合。研究了替加環(huán)素(及其差向異構(gòu)體)、9-氨基米諾環(huán)素(M3)、替加環(huán)素葡糖苷酸(M7及其差向異構(gòu)體M6)和N-乙跣基-9-氨基米諾環(huán)素(M9及其差向異構(gòu)體M8)的存在。使用未確認(rèn)的LC/MS方法、合成的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)估計(jì)了M3、M9和替加環(huán)素在兔血清中的濃度。在兔血清中檢測(cè)到了替加環(huán)素、替加環(huán)素的差向異構(gòu)體、M3、M6、M7和M9。替加環(huán)素在0.5、2和6小時(shí)的血清樣品中的估計(jì)濃度分別為2020、1040和287ng/mL。M3的濃度也隨時(shí)間而降低，從0.5小時(shí)的545ng/mL降低至6小時(shí)的卯.2ng/mL。M9的估計(jì)濃度隨時(shí)間而增加，從0.5小時(shí)的5.5ng/mL增加至2小時(shí)的8.1ng/mL和6小時(shí)的20ng/mL。M6和M7的濃度不能,皮測(cè)定，因?yàn)槿鄙俸铣蓸?biāo)準(zhǔn)品。在小鼠的血清和尿液中檢測(cè)到了替加環(huán)素、替加環(huán)素的差向異構(gòu)體、M3、M6和M7。這些化合物在小鼠血清和尿液中的濃度沒(méi)有被測(cè)定。在小鼠血清或尿液中沒(méi)有觀察到M9?？傊o兔和小鼠單次靜脈內(nèi)施用替加環(huán)素后，在來(lái)自這兩個(gè)物種的血清中均觀察到了替加環(huán)素、其差向異構(gòu)體、9-氨基米諾環(huán)素(M3)和替加環(huán)素葡糖苷酸(M7及其差向異構(gòu)體M6)。此外，在兔血清中觀察到了N-乙?；?9-氨基米諾環(huán)素(M9)。在人中還觀察到了替加環(huán)素被葡糖苷酸化為M7和M3被W-乙酰化為M9，但是在大鼠或狗中沒(méi)有觀察到。這些化合物可以通過(guò)上文所述的方法來(lái)分離?？紤]到本文所公開的發(fā)明的說(shuō)明和實(shí)踐，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。該說(shuō)明和實(shí)施例僅僅應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是示例性的，本發(fā)明的真正范圍和宗旨通過(guò)隨后的權(quán)利要求進(jìn)行了說(shuō)明。權(quán)利要求1.通過(guò)用替加環(huán)素治療人而制備的替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物。2.通過(guò)用替加環(huán)素治療人而制備的替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物的差向異構(gòu)體。3.權(quán)利要求l的代謝物，在m/z762處顯示質(zhì)鐠峰。4.權(quán)利要求2的差向異構(gòu)體代謝物，在m/z762處顯示質(zhì)鐠峰。5.權(quán)利要求3的代謝物，進(jìn)一步在586、569、513、211、154和86處顯示質(zhì)^普峰。6.權(quán)利要求4的差向異構(gòu)體代謝物，進(jìn)一步在586、569、513、211和86處顯示質(zhì)鐲峰。7.制備替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物的方法，該方法包括如下步驟a.給人提供替加環(huán)素的劑量；b.從所述的人獲得血清、尿液或糞便樣品；c.提取所述樣品以獲得替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物。8.權(quán)利要求7的方法，其中代謝物在m/z762處顯示質(zhì)鐠峰。9.制備替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物的差向異構(gòu)體的方法，該方法包^下步驟a.給人提供替加環(huán)素的劑量；b.獲得糞便或血清樣品；c.提取所述樣品以獲得替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物的差向異構(gòu)體。10.權(quán)利要求7的方法，其中葡糖苷酸的差向異構(gòu)體在m/z762處顯示質(zhì)i脊峰。11.化合物，選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>差向異構(gòu)體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>差向異構(gòu)體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>12.13.可以通過(guò)從用替加環(huán)素治療的人的血清、尿液或糞便中提取得到的替加環(huán)素代謝物，其特征在于該代謝物在m/z762處顯示質(zhì)鐠峰。14.可以通過(guò)從用替加環(huán)素治療的人的血清、尿液或糞便中提取得到的替加環(huán)素代謝物，其特征在于該代謝物在762、586、569、513、211、154和86處顯示質(zhì)鐠峰。15.基本上純的形式的根據(jù)權(quán)利要求1至6和11至14中任一項(xiàng)的化合物，16.藥物組合物，包含如權(quán)利要求1至6和11至15中任一項(xiàng)所要求的化合物和可藥用栽體。17.化合物，選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>18.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>19.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，選自:差向異構(gòu)體和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>20.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>差向異構(gòu)體21.22.23.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，選自:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>24.治療至少一種細(xì)菌感染的方法，該方法包括給需要其的受治療者施用包含治療有效量的至少一種選自如下的化合物及其可藥用鹽的藥物組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>差向異構(gòu)體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>差向異構(gòu)體和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>差向異構(gòu)體。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中至少一種化合物選自I、II差向異構(gòu)體、III和IV差向異構(gòu)體。26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中至少一種細(xì)菌感染選自復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染(cIAI)、復(fù)雜性皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染(cSSSI)、社區(qū)獲得性肺炎(CAP)、醫(yī)院獲得性肺炎(HAP)征候、由具有耐TetM和TetK決定子的細(xì)菌所引起的細(xì)菌感染、骨和關(guān)節(jié)感染、與導(dǎo)管有關(guān)的中性白細(xì)胞減少癥、產(chǎn)科和婦科感染以及由VRE、ESBL、腸道菌和生長(zhǎng)迅速的分枝桿菌屬所引起的細(xì)菌感染。全文摘要已經(jīng)在用替加環(huán)素治療的人中鑒定了替加環(huán)素葡糖苷酸代謝物及其相應(yīng)的差向異構(gòu)體。質(zhì)譜數(shù)據(jù)已經(jīng)用于鑒定這些結(jié)構(gòu)。文檔編號(hào)A61K31/44GK101132799SQ200580045955公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2005年11月3日優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日發(fā)明者M(jìn)·霍夫曼,R·A·知唐,W·德邁歐申請(qǐng)人:惠氏公司