一種植物胚特異性表達啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種植物胚特異性表達啟動子及其應用。本發(fā)明的植物胚特異性表達啟動子是通過發(fā)明人所設計的引物，以水稻基因組DNA為模板，利用PCR方法從水稻中分離得到。通過該啟動子在水稻中的表達特異性實驗表明本發(fā)明的啟動子使β-葡糖苷酸酶(GUS)報告基因只在水稻種子胚中特異性表達。說明本發(fā)明的啟動子可以啟動外源基因在植物的胚中特異性的表達，適用于任何種子具有胚的植物，即單子葉植物或雙子葉植物。
【專利說明】一種植物胚特異性表達啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術和植物基因工程【技術領域】。具體而言，本發(fā)明涉及一種植物基因表達啟動子及其應用，該啟動子能夠在單子葉植物，尤其是水稻轉基因調(diào)控體系中驅(qū)動目標基因在胚中表達。
【背景技術】
[0002]生物體的生長發(fā)育、 生理過程都是生物體的眾多基因有序的、并在外界環(huán)境因子的作用下特定表達的結果?；蛘６幸?guī)律的表達保證了植物的正常生長發(fā)育。近年來，分子生物學的研究表明轉錄水平上的調(diào)控是基因表達調(diào)控中的起始步驟，也是基因表達調(diào)控的重要方式之一?；騿幼涌刂浦蛟谔囟ǖ慕M織、特定的發(fā)育階段以及一定的環(huán)境條件下表達。因而，分離、鑒定基因啟動子，了解啟動子的時空專一性表達特征及其作用機制已成為研究基因表達調(diào)控的主要內(nèi)容。
[0003]組織特異性啟動子也稱器官特異性啟動子，該類啟動子所調(diào)控的下游基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。目前，為了使外源基因在植物體內(nèi)有利、高效地發(fā)揮作用，人們開始越來越多地研究組織特異性啟動子、分析特異啟動子中的順勢作用元件及作用機制，并根據(jù)需要選擇或人工構建合適的啟動子，實現(xiàn)對外源基因表達的定時、定點、定量三維精確調(diào)控。例如，組織特異性啟動子在植物育種、植物生物反應器等研究的應用上已初見成效。獲得有組織專一性表達特性的啟動子也是尋找相關功能基因的一種有效途徑。另外，植物基因工程研究中也需要具有組織特異性高表達的啟動子，使外源目的基因能在特定的組織中高效表達。
[0004]植物種子的發(fā)育包括兩個重要的過程:胚胎發(fā)生和種子成熟。隨著胚的逐步成熟，大量貯藏產(chǎn)物，如:蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物開始合成和積累，種子逐步成熟。胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生階段決定了植物個體的發(fā)育程序與整體結構模式。目前對于種子的形態(tài)學和生理學研究已取得了一定的進展，但由于克隆種子胚特異性基因在技術上存在困難，例如，種子儲藏蛋白基因的高水平表達很容易掩蓋一些低豐度基因的信息(參見Goldberg et al.，celll989,56:149-160);缺少胚胎發(fā)育過程中的一些特殊分子或細胞標記等原因，目前在分子生物學水平上對種子胚胎發(fā)育的了解還很少。
[0005]因而，分離、獲得種子胚特異性表達啟動子，既有助于更細致地理解植物胚胎發(fā)育中形態(tài)發(fā)生與細胞分化的分子機理，又能廣泛應用于植物基因工程研究中，使外源目的基因能在特定的組織中高效表達，以實現(xiàn)對外源基因表達的定時、定點定量三維精確調(diào)控，在改良作物品質(zhì)的同時又可減少對植物的不利影響。
[0006]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，胚是水稻種子的重要組成部分，胚的發(fā)生和發(fā)育直接影響著水稻的繁殖和發(fā)育。因而分離、鑒定水稻種胚特異性啟動子，了解胚特異基因表達的時空專一性特征及其相關表達機制已成為研究水稻種胚的發(fā)生和發(fā)育的主要內(nèi)容。對水稻種胚特異性表達的啟動子的功能研究與鑒定，將有利于實現(xiàn)外源基因在轉基因植物特定組織中高效表達。近年來有關水稻種子特異性的研究逐漸增多，但由于目前已知的胚發(fā)育過程中特殊分子標記較少，具有種胚特異表達模式的功能基因的報道也不多，故對水稻種子特異性啟動子的研究仍主要集中在胚乳特異性啟動子上，像醇溶蛋白基因啟動子、球蛋白基因啟動子等，而對胚特異性啟動子的研究及報道較少。Kuwano等研究證實水稻01el8基因的啟動子驅(qū)動相關基因在種子種胚中特異表達(PlantBiotech J，2009，7:96-105)。Wu等通過對水稻中不同貯藏蛋白相關基因的表達模式分析，從中鑒定了一個在水稻種胚中表達強度較高的水稻球蛋白啟動子Glb (參見Plant CellPhysiol, 1998,39:885-889)。若選擇胚特異性高強度表達啟動子，有助于定時定向調(diào)控外源有用蛋白的合成，既節(jié)約能源，保證了植物正常生理活動不受干擾，同時又能提高外源有用蛋白在種子中的儲藏水平。 同時，利用胚特異啟動子可提高外源基因在植物胚中的表達和累積水平，也可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等因此，胚特異啟動子及其應用為揭示整個植物胚胎發(fā)育的過程和機理的研究，利用生物技術改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎，具有極大的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在水稻胚中特異性表達的啟動子以及該啟動子在植物基因工程中的應用。其中，本文中所涉及的“植物”是指單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0008]具體而言，一方面，本發(fā)明提供一種植物胚特異性表達啟動子，其特征在于，所述植物胚特異性表達啟動子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0009]序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的水稻胚特異表達啟動子,本文中稱為pEMBl或啟動子pEMBl。
[0010]優(yōu)選地，所述植物胚特異性表達啟動子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0011]另一方面，本發(fā)明提供一種植物胚特異性表達啟動子，所述植物胚特異性表達啟動子的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物胚特異性表達啟動子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者，所述植物胚特異性表達啟動子的DNA序列為具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列的植物雜交的產(chǎn)物。這些啟動子序列與SEQ IDNo:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅(qū)動目標基因在植物胚中特異性表達，本文中稱之為“pEMBI”或“啟動子pEMBI”。
[0012]另一方面，本發(fā)明還提供一種表達盒，所述表達盒包含上述的植物胚特異性表達啟動子。
[0013]另一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含上述的植物胚特異性表達啟動子；
[0014]優(yōu)選地,在所述重組表達載體中，上述的植物胚特異性表達啟動子連接于待表達的基因序列的上游。優(yōu)選地，所述待表達的基因為Gus基因；所述重組表達載體為將SEQ IDNo:1所示的序列即pEMBl或啟動子pEMBl構建于pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為 pCAMBIA1391-pEMBl。[0015]另一方面，本發(fā)明還提供了一種宿主菌，所述宿主菌包含本發(fā)明提供的上述植物胚特異性表達啟動子pEMBl、上述表達盒、或上述的重組表達載體，其中，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
[0016]再一方面，本發(fā)明提供上述植物胚特異性表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。具體而言，所述應用包括如下步驟:將權利要求1-3中的一項所述的植物胚特異性表達啟動子連接于重組表達載體的待表達的基因序列上游，并且將連接于所述重組表達載體的產(chǎn)物轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0017]更具體而言，培育轉基因植物是將本發(fā)明提供的上述植物胚特異性表達啟動子連接于待表達的基因序列上游 (例如，將所述啟動子與目標基因融合，即合并到同一條DNAJf啟動子序列置于目標基因之前)，并構建在重組表達載體中，將重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。待表達的基因即目標基因包括用于改良植物品質(zhì)和積累的基因以及植物營養(yǎng)吸收相關的基因。
[0018]并且優(yōu)選地，所述應用可以用于改良植物胚性狀，所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優(yōu)選為水稻；更優(yōu)選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-pEMBl，以用于改良水稻胚形狀。
[0019]本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為(與SEQ No:1中相同):
[0020]
【權利要求】
1.一種植物胚特異性表達啟動子，其特征在于，所述植物胚特異性表達啟動子包含SEQID No:1所示的DNA序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的植物胚特異性表達啟動子，其特征在于，所述植物胚特異性表達啟動子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的DNA序列。
3.一種植物胚特異性表達啟動子，其特征在于，所述植物胚特異性表達啟動子的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物胚特異性表達啟動子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物； 或者，所述植物胚特異性表達啟動子的核苷酸序列具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列的植物雜交的產(chǎn)物。
4.一種表達盒,其特征在于,所述表達盒包含權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子。
5.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的植物胚特異性表達啟動子； 優(yōu)選地，在所述重組表達載體中，權利要求1-3中任意一項所述的植物胚特異性表達啟動子連接于待表達的基因的序列的上游。
6.根據(jù)權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于，所述待表達的基因為Gus基因； 所述重組表達載體為pCAMBIA1391-pEMBl，其中，pCAMBIA1391為被轉入的植物雙元表達載體，pEMBl為權利要求1-3中任意`一項所述的植物胚特異性表達啟動子。
7.—種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權利要求1-3中任意一項所述的植物胚特異性表達啟動子、權利要求4所述的表達盒、或權利要求5或6所述的重組表達載體，其中，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
8.—種權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述應用包括如下步驟:將權利要求1-3中的一項所述的植物胚特異性表達啟動子連接于植物雙元表達載體的待表達的基因的序列上游，并且將連接于所述重組表達載體的產(chǎn)物轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
【文檔編號】C12N1/21GK103740717SQ201310727701
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權日:2013年12月24日
【發(fā)明者】李 浩, 楊劍波, 魏鵬程, 張銀萍, 李娟 , 馬卉, 李莉, 倪大虎, 宋豐順, 楊亞春, 秦瑞英 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所